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Biology

हिस्टोलॉजिकल परीक्षा और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए इंटीग्रल ऑकुलर सतह ऊतक प्राप्त करने के लिए बरकरार नेत्रगोलक का अलगाव

doi: 10.3791/60086 Published: October 20, 2019

Summary

इस प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत बरकरार स्थिति में पलक, नेत्र सतह, पूर्वकाल और पीछे के क्षेत्रों के साथ माउस नेत्रगोलक के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन करता है।

Abstract

नेत्र सतह (ओएस) तीन जुड़े भागों के साथ एक उपकला शीट के होते हैं: palpebral कंजक्टिवा, बुलबार कंजक्टिवा और कॉर्निया उपकला। ओएस के विघटन से केराटाइटिस, नेत्रश्लेष्मलाशोथ या दोनों (केराटोकॉन्क्टिवाइटिस) हो जाएगा। कुछ आनुवंशिक संशोधनों या कृत्रिम संचालन के साथ प्रयोगात्मक पशु मॉडल में, यह समानांतर में प्रत्येक भाग के सापेक्ष pathogenetic परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए ओएस उपकला शीट के सभी भागों की जांच करने के लिए उपयोगी है। हालांकि, विरूपण या क्षति के बिना एक पूरे के रूप में ओएस ऊतक के विच्छेदन चुनौतीपूर्ण रहा है, मुख्य रूप से शारीरिक रूप से अलग अभी तक चल पलकें और पलकें और पलकें चिपका ओएस की कोमलता और पतला होने के कारण. इसके अतिरिक्त, हार्ड खोपड़ी/कक्षीय हड्डियों द्वारा बनाई गई गहरी आंख सॉकेट पूरी तरह से आंखों के द्वारा कब्जा कर लिया जाता है जिससे विच्छेदन के संचालन के लिए सीमित स्थान मिल जाता है। नतीजतन, चेहरे की ओर से जुड़े ओएस ऊतकों के साथ आंखों की गेंद के प्रत्यक्ष विच्छेदन अक्सर ऊतक नुकसान के लिए नेतृत्व करेंगे, विशेष रूप से palpebral और bulbar कंजक्टिवा. इस प्रोटोकॉल में, हमने खोपड़ी और कक्षीय हड्डियों को क्रमिक रूप से एक द्वि-सेक्टेड माउस सिर से हटाने के लिए एक विधि का वर्णन किया है, जिससे पलकें, नेत्र सतह, लेंस और रेटिना पूरी तरह से एक टुकड़े में छोड़ दिए जाते हैं। ओएस शीट की अखंडता अच्छी तरह से संरक्षित किया गया था और एक ही खंड में ऊतक विज्ञान या इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा जांच की जा सकती है।

Introduction

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नेत्र सतह में क्षेत्रीय उपकला की एक सतत शीट होती है जिसमें पैल्पेब्रल कंजक्टिवा , बुलबार कंजक्टिवा और कॉर्निया1शामिल हैं . कई ग्रंथियों की संरचना नेत्र सतह उपकला से जुड़ी होती है और साथ में आंसू की एक परत उत्पन्न करती है जो कॉर्निया की सतह को सुखाने और पर्यावरणके आक्रमण2से बचाती है . ओएस के विघटन से केराटाइटिस, नेत्रश्लेष्मलाशोथ या दोनों (केराटोकॉन्क्टिवाइटिस) हो जाएगा। आनुवंशिक कारक और पर्यावरण संबंधी परेशानियाँ या उनकी बातचीत , दोनों ही ओएस3,4के रोगात्मक परिवर्तन में योगदान देते हैं . तदनुसार, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर और शारीरिक या रासायनिक रूप से प्रेरित पशु मॉडल की एक किस्म मानव ओएस की रोग प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

संरचना और माउस ओएस के समारोह में कई मायनों में मनुष्य के समान है. नेत्र ग्रंथियों द्वारा स्रावित आंसू फिल्म घटकों भी चूहों और मनुष्यों के बीच समान हैं. मानव ओएस रोगों के स्पष्ट तंत्र5,6,7 के लिए माउस मॉडलों का उपयोग करके अध्ययन ों का खजाना आयोजित किया गयाहै. कई अवसरों में, यह एक ही प्रयोगात्मक उपचार के तहत व्यापक जानकारी हासिल करने के लिए ओएस के स्थानीय आणविक परिवर्तन के बजाय वैश्विक विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, ओएस के प्रत्येक भाग को एक साथ विश्लेषण किया जा करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए अच्छी अखंडता के साथ नमूना तैयारी की जरूरत है।

माउस ओएस कसकर आंख सॉकेट में एम्बेडेड था कि eyeball के साथ संबद्ध / वहाँ palpebral या bulbar कंजक्टिवा को नुकसान पहुँचाए बिना पूरे नेत्र सतह विच्छेदन के लिए जबरदस्त चुनौतियों का अस्तित्व है. इन चुनौतियों से उतर: (i) ओएस नरम और पतली है और शारीरिक रूप से अलग अभी तक चल पलकें और नेत्रगोलक, इसलिए विरूपण और क्षति के लिए कमजोर करने के लिए चिपका; और (पप) कक्षीय हड्डियों और नेत्रगोलक के बीच सीमित स्थान विच्छेदन प्रचालनों को प्रतिबंधित करता है। चुनौतियों वयस्क माउस के लिए बहुत अधिक हैं. भ्रूणीय माउस में कक्षीय अस्थि अस्थि-विज्ञान पूर्ण नहीं होता है तथा आस-पास के ऊतक सापेक्ष शिथिल8होते हैं। सिर को हटाया जा सकता है और bisected, और फिर सीधे paraformaldehyde (पीएफए) निर्धारण और embedding9के अधीन. इसके विपरीत, प्रसवके बाद और वयस्क माउस कक्षीय हड्डियों पूरी तरह से मोटी आसपास के ऊतकों के साथ ossified हैं, fixatives के प्रवेश कम कुशल बना. इसके अलावा, कक्षीय/स्कॉल हड्डियों कठिन और भंगुर होते हैं, आसानी से टूट जाते हैं जब उन्हें नरम embedding यौगिकों जैसे पैराफिन में sectioning. हड्डियों के टूटे हुए टुकड़े सर्वसम्मति से पास के ऊतकों को फाड़ देंगे जिसके परिणामस्वरूप ऊतक आकारिकी।

कई प्रकाशित अध्ययनों में प्राय : आंशिक नेत्र सतह दिखाई दी, जो उनके विशेष अनुसंधान प्रयोजनों के लिए पर्याप्त हो सकतीहै 10,11. साहित्य की घोर जांच में केवल कुछ ही अध्ययन ों को पाया गया जो विच्छेदन प्रोटोकॉल12,13के विस्तृत विवरण के बिना संपूर्ण अक्षुण्ण नेत्र सतह को दर्शाता है . इस प्रोटोकॉल में, हमने अभिन्न प्रसवोत्तर नेत्र सतह को प्राप्त करने के लिए एक विच्छेदन विधि का विस्तृत विवरण दिया है, जिसमें कक्षीय और खोपड़ी की हड्डियों को व्यवस्थित रूप से हटा दिया गया था, जिससे अनछुए नेत्र सतह को आंखों और पलकों के साथ छोड़ दिया गया था, जिससे शारीरिक क्षति को कम किया गया था। हम आगे ओएस ऊतक विज्ञान की जांच की और इस प्रोटोकॉल के साथ तैयार ऊतक वर्गों का उपयोग कर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रदर्शन किया।

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Protocol

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चूहों के उपयोग से संबंधित सभी प्रक्रियाओं को पशु देखभाल और उपयोग समिति, झोंगशान नेत्र केंद्र द्वारा अनुमोदित किया गया था, और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए ARVO वक्तव्य का पालन किया गया।

1. बरकरार नेत्र सतह और पलकों के साथ नेत्रगोलक का विच्छेदन

  1. सिर को अलग करें।
    1. प्रसव के बाद के दिन 10 (P10) और P28 चूहों (माउस उपभेदों के लिए सामग्री की मेज देखें) गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा, तेज कैंची की एक जोड़ी द्वारा गर्दन से सिर काट दिया.
    2. सीधे कैंची की एक जोड़ी के साथ सिर को इंटरपेरिएटल हड्डी रोस्टली से नाक के लिए शुरू करने वाली सैगिटल मिडलाइन के साथ (चित्र 1ए, बी)।
      नोट: खोपड़ी हड्डी माउस उम्र बढ़ने के साथ hardens, जितना संभव हो उतना midline साथ काटने कैंची रखने के लिए सावधान रहना होगा।
    3. एक साफ पेट्री डिश में bisected सिर के प्रत्येक आधे प्लेस, तेज कैंची का उपयोग कर पहले जबड़े और जीभ काट. ऑप्टिक chiasm स्थान से पहले मस्तिष्क से काटने से ऑप्टिक तंत्रिका मुक्त, और खोपड़ी की दीवार से जुड़ी घ्राण बल्ब सहित सभी मस्तिष्क ऊतकों को हटा दें।
    4. अब शेष ऊतकों में नेत्रगोलक से संबद्ध सभी खोपड़ी/कक्षीय अस्थियां होंगी (चित्र 1ग, द)। रक्त और बालों के मलबे को साफ करने के लिए पीबीएस के साथ शेष भाग को धो लें।
    5. 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए, फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन [पीबीएस], पीएच 7.4) के साथ उपसर्ग ऊतकों को रोटेशन के साथ कमरे के तापमान (आरटी) पर 50 एमएल शंकु ट्यूब में। अनुमानित निर्धारण समय निम्नानुसार है: P0 से P7 के लिए $10 मिनट; P8 से P28 के लिए $20 मिनट; और P29 और पुराने के लिए $ 30 मिनट.
      नोट: उपसर्ग ऊतक कठोरता आगामी विच्छेदन आसान बनाने प्रदान करता है. इसके अतिरिक्त, उपसर्ग विच्छेदन पूरा होने से पहले भी लंबे समय तक unfixed ताजा ऊतक छोड़ने से बचा जाता है.
      चेतावनी: पीएफए खतरनाक है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।
  2. खोपड़ी/कक्षीय हड्डियों को निकालें।
    1. उपसर्ग के बाद, जल्दी से PBS में विच्छेदन सिर तीन बार धोने के लिए आगे टूट बाल और fixatives को खत्म करने के क्रम में आगे विच्छेदन के साथ आगे बढ़ना है.
      चेतावनी: विच्छेदन के दौरान fixatives के लिए एक्सपोजर स्वास्थ्य के लिए हानिकारक हो सकता है.
    2. ऊतक को 10 सेमी पेट्री डिश में रखें, खोपड़ी को चित्र 1डी, ईमें दर्शाए गए विमानों के साथ तीन भागों में काट दें। सॉकेट में नेत्रगोलक एथ्मोइड, ललाट और जंभिका अस्थियों के नीचे खोपड़ी के मध्य भाग में छिपा हुआ होता है(चित्र 1D,E)।
    3. एथमोइड अस्थि को पूरी तरह से ललाट तथा जंभिका अस्थियों को उजागर करने के लिए छप्पर को छीलने के लिए संख्या 4 के दो जोड़े सीधे बलचों का प्रयोग करें (चित्र 1थ्)।
    4. भौगोलिक रूप से खोपड़ी की सतह (जंभिका और ललाट हड्डियों सहित) को 4 क्षेत्रों में विभाजित करें(चित्र 1)। जंभिका तथा ललाट अस्थियों को क्रमिक रूप से निकालने के लिए वक्रित संदंश की नोक को क्षैतिज रूप से सम्मिलित करें (चित्र 1)
      नोट: जंभिका हड्डियों सभी एक समय में नहीं हटाया जा सकता है. धैर्यपूर्वक उन्हें टुकड़े-टुकड़े कर के टुकड़े काट नाका। ललाट हड्डी सीधे नरम संयोजी ऊतकों के माध्यम से नेत्रगोलक से जुड़ा हुआ है। आंखों की गेंद को खींच और कंजक्टिवा को नुकसान पहुंचाने से रोकने के लिए आंखों से निकालते समय सावधानी बरतें।
    5. आंशिक जंभिका अस्थि और सभी ललाट की हड्डी को हटाने के बाद, अंतर्निहित अश्रु और जुगल हड्डियों को उजागर किया जाएगा (चित्र 1जी) दो हड्डियों और जुड़े चमड़े के नीचे की मांसपेशियों और आंखों के चारों ओर वसा निकालें, संलग्न पलकों और त्वचा के साथ आंखों का गोला एक छोटे वर्ग आकार ब्लॉक में ट्रिम ऊतक की मात्रा को कम करने और ऊतक उन्मुख जब embedding की सुविधा (चित्र 1 H).
    6. आंखों का गोला और संबद्ध ऊतकों को 4% पीएफए में वापस रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ठीक करना जारी रखें। निश्चित ऊतक को पीबीएस में 0ण्2% एनएन3के अतिरिक्त 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम एक महीने के लिए संरक्षित किया जा सकता है . वैकल्पिक रूप से, तुरंत हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ना।
      नोट: यदि ऊतक लंबी अवधि के लिए संग्रहीत करने की जरूरत है, यह आसानी से 70% इथेनॉल में संग्रहीत किया जा सकता है.

2. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण

  1. पैराफिन अनुभाग और हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला
    1. पैराफिन एम्बेडिंग और अनुभागीकरणकरने के लिए कहीं और वर्णित मानक प्रोटोकॉल का पालन करें।
  2. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी)
    1. xylene के साथ पैराफिन वर्गों dewax और शराब श्रृंखला के माध्यम से वर्गों rehydrate (100%, 95%, 80%) आसुत जल में (घ2हे)।
    2. कम शक्ति के साथ एक गिलास स्लाइड जार में 0.01 एम साइट्रिक एसिड बफर (3 ग्राम ट्राइसोडियम साइट्रेट, 0.4 ग्राम साइट्रिक एसिड प्रति 1 एल डबल आसुत एच2ओ) में ऊतक स्लाइड के माइक्रोवेव उपचार द्वारा एंटीजन रिट्रीवल करें। ऊर्जा आवर्तक रूप के बारे में 2 मिनट स्थायी प्रत्येक अंतराल के साथ कुल 5-10 मिनट के लिए दिया जाना चाहिए.
      नोट: उच्च शक्ति माइक्रोवेव या लगातार हीटिंग स्लाइड से ऊतक वर्गों की टुकड़ी के लिए नेतृत्व करेंगे.
    3. कांच के जार से स्लाइड्स चुनें, चेहरे के ऊतकों का उपयोग करके प्रत्येक अनुभाग के आस-पास के अवशिष्ट तरल को सावधानी से पोंछें और उन्हें हिस्टोलॉजी बॉक्स में स्लाइड रैक पर रखें। एक निविड़ अंधकार हिस्टोलॉजिकल कलम के साथ प्रत्येक खंड के चारों ओर एक वर्ग ड्रा. बफर अवरुद्ध के 100 $L प्लेस (0.1% triton X-100 और 1x PBS में 10% गधा सीरम) प्रत्येक वर्ग पर, और आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट.
    4. ध्यान से वैक्यूम के साथ अवरुद्ध समाधान को दूर, प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने (सामग्री की मेजदेखें) बफर अवरुद्ध में वांछित कमजोर पड़ने के साथ, और 24 एच या उससे अधिक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड इनक्यूबेट करने के लिए जारी है।
      नोट: IHC के लिए इस्तेमाल किया प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए एकाग्रता भिन्न होता है, और पायलट प्रयोगों में बाहर का परीक्षण किया जा करने की जरूरत है.
    5. पीबीएसटी (0.1% पीबीएस में ट्राइटन) के साथ ऊतक स्लाइड को धोएं, तीन बार, 10 मिनट प्रत्येक के लिए। द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए चरण 2ण्2ण्4 का उपयोग करते हुए 4',6-diamidino-2-फेनिलिनो (DAPI) के स्थान पर ब्लॉकिंग बफर के साथ सामग्री की तालिकादेखें. कमरे के तापमान (आरटी) पर कम से कम 4 एच या उससे अधिक समय के लिए इनक्यूबेट करना जारी रखें।
    6. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें, PBST समाधान के साथ ऊतक वर्गों धोने तीन बार, 10 मिनट प्रत्येक के लिए, तो एक और 5 मिनट के लिए साफ PBS के साथ धो.
    7. ऊतक वर्गों के आसपास अवशिष्ट पीबीएस साफ, बढ़ते माध्यम के साथ वर्गों पर coverslips माउंट. चित्र प्राप्त करने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी निष्पादित करें (सामग्री की तालिकादेखें)।

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Representative Results

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विभिन्न दृष्टिकोणों से देखी गई प्रमुख खोपड़ी हड्डियों को चित्र 1ए-ईमें चित्रित किया गया था, जिसमें विभिन्न हड्डियों को दर्शाने वाले रंग थे। हम विच्छेदन प्रक्रियाओं के प्रदर्शन के लिए चार सप्ताह पुराने जानवर का इस्तेमाल किया. 1-1-1-1-1-1-1 तथा लघु उपसलग्नन (चरण 1-1-4) के बाद, संबंधित चेहरे की हड्डियों के साथ नेत्रगोलक चित्र 1म्में प्रदर्शित किए जाते हैं। इसके अलावा पूर्वकाल (नासा और premaxillary) और पीछे (जैसे, पार्श्विक) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ethmoid हड्डियों उत्पन्न ऊतक ब्लॉक मुख्य रूप से जंभिका और ललाट हड्डियों के ऊपर नेत्रगोलक के ऊपर हटाने के लिए trimming (चित्र 1एफ) चित्र 1एफ में नामित क्षेत्रों के अनुसार इन हड्डियों को अनुक्रमिक रूप से हटाने के साथ-साथ हार्डरिन ग्रंथि ( चित्र1जी) अंतर्निहित क्षुर्ण और जुगल हड्डियों को उजागर करता है । नेत्रगोलक से जुड़ी हार्डरिन ग्रंथि एक मील का पत्थर (चित्र 1जी) के रूप में कार्य करती है और इसे हर समय रखा जाना चाहिए। नेत्रगोलक का पृथक्णन सभी हड्डियों और आस-पास के वसाों तथा मांसपेशियों के ऊतकों को हटाकर पूरा किया गया (चित्र 1)

पैराफिन embedding के बाद, नेत्रगोलक काट दिया गया था और एच एंड ई दाग. प्रतिनिधि छवियाँ चित्र 2में दिखाई जाती हैं. पलकों, कॉर्निया और कंजंक्टिव सतह की सापेक्ष अक्षुण्ण स्थितियों की कल्पना एक खंड में की गई थी (चित्र 2) जिसके भागों को चित्र 2, ब्में बढ़ाया गया था . लेंस आकारिकी बनाए रखने के लिए कठिन है (चित्र 2) इसकी कठोरता और कमजोरी के कारण। हमने इस विच्छेदन पद्धति को अन्य प्रसवोत्तर युगों में लागू किया और पी 10 नेत्रगोलक खंड के एच एंड ई ऊतक विज्ञान का एक उदाहरण दिखाया (चित्र 3)। सामान्य में, छोटे माउस है, बेहतर नेत्रगोलक आकृति विज्ञान संरक्षित है. क्रमिक प्रसवोत्तर युग से प्रतिरक्षा पैराफिन वर्गों चित्र 4में दिखाए गए हैं , केरातिन 12 (K12) के साथ (चित्र 4ए-एफ) और केराटिन 14 (K14) (चित्र 4जी-एल) कॉर्निया और पूरे ओएस उपकला के साथ, क्रमशः.

Figure 1
चित्र 1: 4 सप्ताह पुराने वयस्क माउस में नेत्रगोलक विच्छेदन की मिसाल. (ए-डी) खोपड़ी संरचना का योजनाबद्ध आरेख जो क्रमशः ऊपर (ए), नीचे (बी), पार्श्व (सी) और मध्य तल (डी) से देखा जाता है। (क) और (ख) में डैश्ड रेखाएँ द्वि-संक्षिप् त विमानों का संकेत देती हैं। () 4 सप्ताह की उम्र में बिसेटेड आधा खोपड़ी जो बिल्कुल मेल खाता है (डी)। (च) (छ) (घ)और (ई) में दो अनुप्रस्थ विमानों के बीच विच्छेदित ऊतकों का मध्य तल दृश्य। नेत्रगोलक (डैश्ड सर्कल) मुख्य रूप से ललाट (फ्रॉन) और जंभिका (मैक्स) के नीचे एम्बेडेड था। रंगीन डैश्ड रेखाएं भौगोलिक रूप से बाइसेक्टेड प्लेन को 4 क्षेत्रों में विभाजित करती हैं, जिसमें आदेश या संख्या के अनुसार हड्डियों को मोटे तौर पर हटा दिया गया था। ध्यान दें कि एथमोइड (ईथ) हड्डी को हटा दिया गया है। (छ) ललाट की हड्डी और आंशिक जंभिका को हटाने के बाद, हार्डरिन ग्रंथि (हार) और जुगल (जुग) और लचर (ला) हड्डियों को उजागर किया गया। वृत्त डैश्ड रेखाएं नेत्रगोलक स्थिति को दर्शाती हैं। () विच्छेदन पूर्ण होने के बाद अंदर से देखा गया पृथक नेत्रगोलक। ऑप्टिक तंत्रिका (पर) के लिए तीर अंक। ई ] नेत्र, ना ] नाक, पूर्व ] Premaxilla, मैक्स - मैक्सिलरी, ला - lacrimal, Fron ] ललाट, अली ] Alisphenoid, जुग ] जुगल, पाल ] Palatine, Pterygoid, स्क्वेमोसल, पार ] Parital, Eth कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रसव के बाद 4 सप्ताह पुराने में नेत्र सतह ऊतक के एच एंड ई ऊतक. (ए) नेत्र, कंजक्टिवा और कॉर्निया एक ऊतक अनुभाग में विवेचित होते हैं। "b" और "c" के बॉक्स्ड क्षेत्रों को क्रमशः (B) और (C) में बढ़ाया गया. (बी) कॉर्निया उपकला, स्ट्रोमा और एन्डोथेलियम. (गब्लेटकोशिकाओं के साथ कंजक्टिवा) सी ] कॉर्निया उपकला, एसटी स्ट्रॉमा, एड ] एंडोथेलियम, जीसी ] गोब्लेट सेल। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: जन्म के दिन 10 पर नेत्र सतह ऊतक के एच एंड ई ऊतक. (क)P10 पर निष्क्रिय नेत्रगोलक. "b" और "c" के बॉक्स्ड क्षेत्रों को क्रमशः (B) और (C) में बढ़ाया गया. (बी) कॉर्निया. (सी) कंजक्टिवा। सी ] कॉर्निया उपकला, एसटी - स्ट्रोमा, एड ] एंडोथेलियम, सीजे ] कंजक्टिवा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: नेत्र सतह का रोगन P5 से P15 तक। प्रत्येक पैनल में स्क्वायर बॉक्स क्षेत्र उनके अधिकार में बढ़ाया गया था. (ए-एफ) केराटिन 12 विशेष रूप से कॉर्निया उपकला (तीर) में व्यक्त किया गया था। (जी-एल) नेत्र सतह में केराटिन 14 व्यक्त किया गया। ए सी ] अग्र कक्ष, पीसी ] palpebral कंजक्टिवा. यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन गुओ एट अल14से संशोधित किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

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बरकरार नेत्रगोलक की तैयारी के लिए एक महत्वपूर्ण अनुस्मारक यह है कि सभी कक्षीय हड्डियों को पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए, विशेष रूप से जुगा और अश्रु पूर्ण हड्डियों, जो छोटे हैं और आंख सॉकेट के नीचे के पास स्थित हैं। कोई भी बाईं ओर की हड्डियां आगामी ऊतक विज्ञान को जटिल बना सकती हैं। मामले में हड्डी का एक छोटा सा टुकड़ा पूरी तरह से दुर्घटना से विच्छेदन से नहीं हटाया गया था, यह sharptweezers की एक जोड़ी का उपयोग कर embedding पैराफिन ब्लॉक से बाहर उठाया जा सकता है. पीछे छोड़ दिया छेद इस आपरेशन के बाद पिघल पैराफिन के साथ भरा जाना चाहिए।

लेंस को संभालते समय अतिरिक्त सावधानी बरतनी चाहिए। लेंस के टूटे टुकड़े आमतौर पर पूरे अनुभाग के माध्यम से बिखरे हुए हैं. यह माइक्रोस्कोपी परीक्षा और छवि विश्लेषण को काफी प्रभावित करेगा। लेंस को हटाने के प्रयास या तो नेत्र सतह को नुकसान होगा (यदि आपरेशन चेहरे की ओर से आयोजित किया गया था) या रेटिना (यदि आपरेशन रेटिना के ऑप्टिक डिस्क की ओर से था). विच्छेदन के बिना लेंस ऊतक की उपस्थिति के नकारात्मक प्रभाव को कम करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका अनुभागीय दिशाओं को बदलने के लिए है. उदाहरण के लिए, नेत्र सतह आकृति विज्ञान को बचाने के लिए, पैराफिन ब्लॉक के अनुभागीकरण नेत्रगोलक के पूर्वकाल से पीछे की ओर किया जाना चाहिए, अन्यथा, विपरीत दिशा से।

पीएफए-फिक्स्ड पैराफिन अनुभाग के लिए बनाने के लिए एक उपयोगी नोट यह है कि एंटीजन रिट्रीवल आमतौर पर प्रतिरक्षा के लिए आवश्यक है जैसे कि K12 और K14 एंटीबॉडी का उपयोग करना। हालांकि, वहाँ कई अपवाद है कि प्रतिजन पुनर्प्राप्ति गैर विशिष्ट संकेत उत्पन्न होगा पृष्ठभूमि धुंधला बढ़ रहे हैं. इस प्रकार, एंटीजन रिट्रीवल तकनीक का उपयोग करते समय सावधानी बरतनी चाहिए, और यदि संभव हो तो पायलट प्रयोगों में एंटीबॉडी का परीक्षण करना चाहिए, पहले से।

सामान्य तौर पर, खोपड़ी/कक्षीय हड्डियों से नेत्रगोलक के अलगाव के लिए दो तरीके हैं: (i) सीधे चेहरे की ओर से नेत्रगोलक को विभाजित करना; और (पप) नेत्रगोलक को मुक्त करने के लिए अंदर की खोपड़ी/कक्षीय हड्डियों को हटा दें। पहली विधि के लिए चुनौती यह है कि नेत्रगोलक विच्छेदन के लिए बीच में एक संकीर्ण स्थान के साथ कक्षीय सॉकेट में गहरी डूब जाता है। इसके अलावा, चल नेत्रगोलक किसी भी बिंदु पर कंजक्टिवा उपकला खिंचाव होगा जब विच्छेदन उपकरण इसे स्पर्श, अनजाने नुकसान पैदा. इसके विपरीत, दूसरी विधि खोपड़ी/कक्षीय हड्डियों के विच्छेदन के साथ शुरू होती है, जो नेत्रगोलक और संबद्ध नेत्र सतह ऊतक से दूर होती है, इस प्रकार कंजक्टिवा को नुकसान पहुंचाने के जोखिम को कम करती है। इसके अलावा, विच्छेदन करने के लिए कोई स्थानिक संकीर्णता नहीं है। हालांकि पहली विधि अगर महान सावधानी लिया गया काम कर सकते हैं, दूसरा एक निश्चित रूप से आसान और बेहतर है.

संक्षेप में, हम बरकरार पलक और प्रसव के बाद चूहों से जुड़े नेत्र सतह के साथ माउस नेत्रगोलक के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन किया है. वर्णित प्रोटोकॉल बरकरार पलक और प्रसव के बाद चूहों में जुड़े नेत्र ऊतकों के साथ eyeball के अलगाव के लिए उपयुक्त है. प्रोटोकॉल विशेष रूप से उपयोगी है जब ओएस या पूरे नेत्र ऊतकों की अखंडता की आवश्यकता है. हम सामान्य और रोग की स्थिति के तहत ओएस में केराटिन मार्करों की जांच के लिए ऊतक के नमूने तैयार करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है। हम निष्कर्ष है कि इस तरह की तैयारी से नेत्र ऊतकों एक ही खंड पर ओएस के विभिन्न भागों में एक प्रोटीन के अंतर नियमों को देखने के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैं।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए प्रो Rong जू धन्यवाद, और तकनीकी सहायता के लिए सभी प्रयोगशाला के सदस्यों. यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी: 31571077) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; बीजिंग, चीन), गुआंग्झू शहर विज्ञान और प्रौद्योगिकी नवाचार परियोजना (201707020009; गुआंग्झू, गुआंग्डोंग प्रांत, चीन), "100 लोग योजना" सन यात-सेन विश्वविद्यालय (8300-18821104; गुआंग्झू, गुआंग्डोंग प्रांत, चीन), और झोंगशान नेत्र केंद्र में नेत्र विज्ञान के राज्य कुंजी प्रयोगशाला से अनुसंधान धन (303060202400339; गुआंग्झू, गुआंग्डोंग प्रांत, चीन).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1× Phosphate buffered saline (PBS) Transgen Biotech FG701-01
50ml centrifuge tube Corning 430829
Adhesive microscope slides Various
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12379 Suggested concentration 1:500 - 1,000
Alexa Fluor 568 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12380 Suggested concentration 1:500 - 1,000
Anti-K12 antibody Abcam ab124975 Suggested concentration 1:1,000
Anti-K14 antibody Abcam ab7800 Suggested concentration 1:800
Citric acid Various
Cover slide Various
Curved forceps World Precision Instruments 14127
Dissecting microscope. Olmpus SZ61
Ethyl alcohol Various
Fluorescent Microscope Zeiss AxioImager.Z2
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech 0100-01
Micro dissecting scissors-straight blade World Precision Instruments 503242
Microwave ovens Galanz P70D20TL-D4
Mouse strains C57/BL6 and Sv129 mixed
No.4 straight forceps World Precision Instruments 501978-6
Normal Goat Serum Various
Paraformaldehyde (PFA) Various Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane
Tissue culture dish Various
Trisodium citrate Various
Triton X-100 Sigma-Aldrich SLBW6818

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References

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हिस्टोलॉजिकल परीक्षा और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए इंटीग्रल ऑकुलर सतह ऊतक प्राप्त करने के लिए बरकरार नेत्रगोलक का अलगाव
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Guo, D., Liu, C. Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (152), e60086, doi:10.3791/60086 (2019).More

Guo, D., Liu, C. Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (152), e60086, doi:10.3791/60086 (2019).

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