Summary
このプロトコルは、比較的無傷の位置でまぶた、眼表面、前部および後部セグメントを用いてマウス眼球を単離する方法を説明する。
Abstract
眼表面(OS)は、パルペブラル結膜、バルバル結膜および角膜上皮の3つの接続された部分を有する上皮シートから成っている。OSの破壊は、角膜炎、結膜炎、またはその両方(角膜結膜炎)につながる。特定の遺伝子改変または人工操作を有する実験動物モデルにおいて、OS上皮シートのすべての部分を調べて、各部分の相対病因性変化を並行して評価することが有用である。しかし、OS組織全体の解剖は、主に物理的に分離しながら可動のまぶたと眼球に付貼されたOSの柔らかさと薄さのために困難であった。さらに、硬い頭蓋骨/軌道骨によって形成される深い目のソケットは、手術解剖のための限られたスペースを残して眼球によって完全に占められている。その結果、顔面側から関連するOS組織を伴う眼球の直接解剖は、しばしば組織損傷、特にパルプブラルおよびバルバル結膜につながる。このプロトコルでは、頭蓋骨と眼窩の骨を二分されたマウスヘッドから順番に取り除き、まぶた、眼表面、レンズ、網膜を一つに残す方法を説明した。OSシートの完全性は十分に保存され、単一のセクションで組織学または免疫染色によって調べることができた。
Introduction
眼表面は、パルペブラー結膜、バルバル結膜および角膜1を含む局所的な上皮の連続シートから成っている。多くの腺構造は、眼表面上皮に関連し、一緒に乾燥および環境侵食から角膜表面を保護する涙液膜の層を生成する2.OSの破壊は、角膜炎、結膜炎、またはその両方(角膜結膜炎)につながる。遺伝的要因および環境刺激物またはその相互作用の両方が、OS3,4の病理学的変化に寄与する。したがって、様々な遺伝子操作され、物理的または化学的に誘発された動物モデルが、ヒトOSの疾患プロセスを研究するために使用されてきた。
マウスOSの構造と機能は、多くの点で人間の構造と機能に似ています。眼腺によって分泌される涙液膜成分は、マウスとヒトの間でも類似している。ヒトOS疾患5,6,7のメカニズムを解明するためのマウスモデルを用いて豊富な研究が行われている。多くの場合、同じ実験的処置の下で包括的な情報を得るためには、OSの局所的な分子変化ではなく、グローバルな分析が重要です。したがって、OS の各部分を同時に分析するには、整合性の高いサンプル調製が必要です。
マウスOSは、眼窩/軌道(いくつかの異なる頭蓋骨で作られた骨のカップ)に埋め込まれた眼球と密接に関連し、薄い結合組織を介してそれに接続します。パルペブラーやバルバル結膜を損傷することなく、眼の表面全体を解剖するための途方もない課題があります。これらの課題は、(i)OSが柔らかく薄く、物理的に離動可能なまぶたと眼球に貼り付けられており、ひずみや損傷に対して脆弱です。そして(ii)眼窩骨と眼球の間の限られたスペースは解剖操作を制限する。課題は、大人のマウスのためにはるかに大きいです。胚性マウスでは、眼窩骨の骨化は完全ではなく、周囲の組織は相対的に緩い8である。頭部を除去し、二分し、次にパラホルムアルデヒド(PFA)固定および埋め込み9を直接行うことができる。対照的に、産後および成体マウスの軌道骨は、周囲の組織の厚さで完全に骨化され、固定剤の浸透効率が低下する。さらに、軌道/頭蓋骨の骨は硬く脆く、パラフィンなどの柔らかい埋め込み化合物でそれらを断面すると簡単に壊れます。骨の破片は、近くの組織を満場一致で引き裂き、その結果、劣った組織形態を引き起こす。
多くの公表された研究は、多くの場合、彼らの特定の研究目的のために十分であり得る部分的な眼表面を示しました10,11.文献の総試験は、解剖プロトコル12、13の詳細な説明なしに実証されている全体の無傷の眼表面を示すわずかな研究しか見つかりませんでした。このプロトコルでは、眼球とまぶたと一緒に手つかずの眼表面を残し、物理的な損傷を最小限に抑える、出生後の一体的な眼表面を得るための解剖方法を詳述した。さらにOS組織学を検討し、このプロトコルで調製した組織切片を用いて免疫組織化学を行った。
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Protocol
マウスの使用に関するすべての手順は、動物ケアと使用委員会、中山眼科センターによって承認され、眼科および視力研究における動物の使用に関するARVO声明に従いました。
1. 眼表面とまぶたを無傷で切除する眼球の解剖
- 頭を解剖して
- 子宮頸部脱臼により出生後10日目(P10)およびP28マウス(マウス株の材料表を参照)を安楽死させ、鋭いはさみで首から頭を切り落とす。
- 鼻に向かって鼻間骨から始まる矢状中間線に沿ってまっすぐなはさみを持つ二足歩行頭部(図1A,B)。
注:頭蓋骨はマウスの老化に伴って硬化し、ハサミが可能な限り中線に沿って切断するように注意してください。 - 二分された頭の各半分をきれいなペトリ皿に入れ、最初に鋭いはさみを使って顎と舌を切り取ります。視神経を視空の位置の前に脳から切り取って視神経を解放し、頭蓋骨壁に取り付けられた嗅球を含むすべての脳組織を取り除く。
- 残りの組織は、眼球に関連するすべての頭蓋骨/眼窩骨を有するものとする(図1C,D)。残りの部分をPBSで洗い、血液や毛髪の破片をきれいにします。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA、リン酸緩衝生理食生[PBS]、pH 7.4)を室温(RT)で50mL円錐管に回転させる接頭辞組織。おおよその固定時間は次のとおりです: P0 から P7 の場合は約 10 分です。P8~P28の場合~20分P29以上の場合は約30分です。
注:接頭辞は後続の解剖を容易にするティッシュの剛性を提供する。さらに、接頭取は、解剖が完了する前にあまりにも長い間、新鮮な組織を固定しないままにするのを避ける。
注意:PFAは危険であり、注意して取り扱う必要があります。
- 頭蓋骨/軌道骨を取り除きます。
- 接頭取後、解剖後、解剖を進めるために、解剖した頭部をPBSで3回素早く洗い、壊れた毛髪や固定剤をさらに除去します。
注意:解剖中に固定剤への暴露は、健康に有害なことができます。 - 10cmペトリ皿に組織を置き、図1D、Eに示す平面に沿って頭蓋骨を3つの部分に切断する。ソケットの眼球は、エスモイド、前頭骨、上顎骨の下の頭蓋骨の中央部に隠されています(図1D,E)。
- 4号機の2組を使用して、エスモイド骨を剥がし、前頭骨と上顎骨を完全に露出させる(図1F)。
- 頭蓋骨表面(上顎骨と前頭骨を含む)を地理的に4つの領域に分割します(図1F)。湾曲した鉗子の先端を各領域に水平方向に挿入し、上顎骨と前頭骨を順番に取り除きます(図 1F)。
注: 上顎骨を一度にすべて除去することはできません。忍耐強くそれらを一つずつ解剖する。前頭骨は柔らかい結合組織を通して眼球に直接接続される。眼球から取り外し、眼球を伸ばし、結膜を損傷するのを防ぐには注意してください。 - 部分的な上顎骨とすべての前頭骨を除去した後、下層の頭蓋骨と顎骨が露出します(図1G)。眼球を取り囲む2つの骨とそれに関連する皮下筋肉と脂肪を取り除き、まぶたと皮膚を付けた眼球を小さな正方形のブロックにトリミングして、組織の体積を減らし、埋め込むときに組織の向きを容易にする(図1) H)。
- 眼球および関連組織を4%のPFAに戻し、4°Cで一晩固定し続けます。固定組織は、0.02%のNaN3を添加してPBSの4°Cで少なくとも1ヶ月間保存することができる。または、直ちに組織学的分析に進みます。
注:組織を長期間保存する必要がある場合は、70%エタノールに容易に保存することができます。
- 接頭取後、解剖後、解剖を進めるために、解剖した頭部をPBSで3回素早く洗い、壊れた毛髪や固定剤をさらに除去します。
2. 組織学的分析
- パラフィン部とヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色
- パラフィンの埋め込みと断面化を実行するには、他の場所で説明されている標準プロトコルに従ってください。
- 免疫組織化学(IHC)
- キシレンでパラフィン片を脱ワックスし、アルコール系列(100%、95%、80%)を通してセクションを再水和する蒸留水(dH2O)に入れます。
- 0.01Mクエン酸バッファー(クエン酸三ナトリウムの3g、1L二重蒸留H2O当たり0.4gクエン酸)の組織スライドのマイクロ波処理による抗原検索を低出力(120W)のガラススライド瓶で行う。エネルギーは、約2分続く各間隔で合計5〜10分間断続的に送達されるべきである。
注:高出力マイクロ波または一貫した加熱は、スライドから組織セクションの剥離につながります。 - ガラス瓶からスライドを取り出し、顔のティッシュを使用して各セクションを囲む残留液体を慎重に拭き取り、組織学の箱のスライドラックに置きます。防水組織図ペンで各セクションの周りに正方形を描きます。ブロッキングバッファーの100 μL(0.1%トリトンX-100および1x PBSで10%ロバ血清)を各正方形に置き、RTで30分間インキュベートします。
- 真空でブロッキング溶液を慎重に取り出し、一次抗体(材料の表を参照)をブロッキングバッファーに所望の希釈で追加し、24時間以上4°Cでスライドをインキュベートし続けます。
注:IHCに使用される各一次抗体の濃度は変化し、パイロット実験でテストする必要があります。 - PBST(PBSで0.1%トリトン)でティッシュスライドを3回、それぞれ10分間洗浄します。二次抗体を用いてステップ2.2.4を繰り返し(材料の表を参照)、ブロッキングバッファーを置き換える4'、6-ジアミドノ-2-フェニリンドール(DAPI)と共に。室温(RT)で少なくとも4時間以上インキュベートを続けます。
- 二次抗体を取り出し、PBST溶液で組織切片を3回洗浄し、それぞれ10分間、さらに5分間きれいなPBSで洗浄する。
- 組織セクションを取り囲む残留PBSを拭き取り、取り付け媒体を持つセクションにカバースリップを取り付けます。蛍光顕微鏡検査を行って画像を取得する(材料の表を参照)。
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Representative Results
異なる視点から見た主要な頭蓋骨は図1A-Eに示され、異なる骨を示す色が示された。私たちは、解剖プロセスのデモンストレーションのために4週齢の動物を使用しました。解剖ステップ 1.1.1-1.1.3 と短い接頭辞 (ステップ 1.1.4) に続いて、関連する顔の骨を持つ眼球を図 1Eに示します。さらにトリミングして前(鼻および前顎)および後部(例えば、頭頂部)ならびに眼球の上に主に上顎骨および前頭骨を有する組織ブロックを生成したエスモイド骨を除去する(図1F)。図1Fの指定領域に従ってこれらの骨を順次除去し、下層の頭蓋骨およびjugal骨およびハービン腺を露出させた(図1G)。眼球に付着したハールディン腺はランドマーク(図1G)となり、常に所定の位置に保たれるべきである。眼球の分離は、すべての骨および周囲の脂肪および筋肉組織の除去によって完了した(図1 H)。
パラフィン埋め込み後、眼球を切り離し、H&E染色した。代表的な画像を図 2 に示します。まぶた、角膜および結膜表面の相対的な無傷の位置を1つのセクション(図2A)で可視化し、その一部を図2B、Cで拡大した。 レンズの形態は、剛性と脆弱性のために維持が困難です(図2A)。この解剖法を他の出生後の年齢に適用し、P10眼球部のH&Eヒスロジーの例を示した(図3)。一般に、マウスが若いほど、眼球形態が保存される方が良い。連続出生後の経常期からの免疫染色パラフィン切片を図4に示し、ケラチン12(K12)(図4A-F)およびケラチン14(K14)(図4G-L)が角膜およびOS上皮全体を染色し、それぞれ。
図1:4週齢の成人マウスにおける眼球解離の図。(A-D)上から見た頭蓋骨組成(A)、下(B)、横面(C)及び中面(D)の概略図をそれぞれ示す。(A)と(B)の破線は、二分平面を示します。(E)正確に一致する4週齢の二分半頭蓋骨(D)。(F)(D)と(E)における2つの横面間の解剖組織の中間平面図。眼球(破線状の円)は、主に前頭(フロン)と上顎(最大)の下に埋め込まれた。色付きの破線は、二分された平面を地理的に 4 つの領域に分割し、その中でボーンは順序または数値に応えて大まかに除去されます。エスモイド(Eth)骨が除去されたことに注意してください。(G)前頭骨および部分的な上顎骨を除去した後、ハーデリン腺(ハル)とジュガル(Jug)および水頭(La)骨が露出した。円の破線は眼球の位置を示します。(H)解剖完了後に内側から見た孤立眼球。矢印は視神経を指します(オン)。E = 目, Nal = プレ = プレマキシラ, 最大 = マキシラリー, ラ = ラクラル, フロン = 正面, アリ = アリスピノイド, ジャグ = ジュガル, パル = パラティネ, プテリー = プテリゴイド, スクワモサル, パル = 頭頂部, エス = エトモイド.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:生後4週目における眼表面組織のH&E組織学(A)まぶた、結膜および角膜は1つの組織セクションで視覚化される。「b」及び「c」の箱詰め領域は、それぞれ(B)及び(C)で拡大した。(B)角膜上皮、間質および内皮。(C)ゴブレット細胞を持つ結膜。ce= 角膜上皮, st = 間質, ed = 内皮, gc = ゴブレット細胞.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:出生後10日目における眼表面組織のH&E組織学(A)P10で目玉をそのまま。「b」及び「c」の箱詰め領域は、それぞれ(B)及び(C)で拡大した。(B) 角膜。(C)結膜。Ce=角膜上皮、st=間質、ed=内皮、cj=結膜。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:眼表面の免疫染色をP5からP15にする。各パネルの正方形のボックス化された領域は、右に拡大されました。(A-F)ケラチン12は、角膜上皮(矢印)で特異的に発現した。(G-L)眼表面で発現したケラチン14を示す。ac = 前室、pc = パルペブラル結膜。この図は、以前の出版物Guo et al.14から変更されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
無傷の眼球の準備のための1つの重要なリマインダーは、すべての軌道骨、特に小さく、眼窩の底の近くに位置するジュガとラクリマル骨を完全に除去しなければならないということです。残った骨は、その後のヒスロジーを複雑にする可能性があります。小さな骨が誤って解剖から完全に除去されなかった場合には、シャープトウィーザーのペアを使用して埋め込みパラフィンブロックから摘出してもよい。残された穴は、この操作の後に溶けたパラフィンで満たされるべきです。
レンズの取り扱い時には、追加の注意が必要です。レンズの破片は、通常、セクション全体に散らばっています。これは顕微鏡検査と画像解析に大きく影響します。レンズを取り外そうとすると、眼の表面(手術が顔側から行われた場合)または網膜(操作が網膜の光学ディスク側から行われた場合)のいずれかに損傷を与える。解剖なしでレンズ組織の存在の負の影響を減らす別の方法は、断面方向を変更することです。例えば、眼表面形態を保存するために、パラフィンブロックの断断面は、眼球の前部から後部に、そうでなければ、反対方向から行われるべきである。
PFA固定パラフィンセクションに役立つ注意事項は、抗原検索は通常、K12およびK14抗体を使用するなどの免疫染色に必要である。しかし、抗原検索は、バックグラウンド染色を増加させる非特異的シグナルを生成する多くの例外があります。したがって、抗原検索技術を使用する場合は注意が必要であり、可能であれば、事前にパイロット実験で抗体をテストする必要があります。
一般に、頭蓋骨/眼窩骨から眼球を分離する方法は2つあります: (i) 眼球を顔側から直接解剖する。そして(ii)眼球を解放するために、内側の頭蓋骨/軌道骨を取り除きます。最初の方法の課題は、眼球が解剖の間に狭いスペースで軌道ソケットの奥深くに沈むことです。さらに、可動眼球は、解剖ツールが触れたときに任意の時点で結膜上皮を伸ばし、意図しない損傷を引き起こした。対照的に、第2の方法は、眼球および関連する眼表面組織から遠い頭蓋骨/眼骨の解剖から始まり、したがって結膜を損傷するリスクを低減する。さらに、解剖を行うための空間的な収縮がない。最初の方法は、大きな注意が取られた場合に動作することができますが、2番目の方法は間違いなく簡単で良いです。
要約すると,出生後マウスからまぶたと関連する眼球を無傷で分離する方法について述べた.記載されたプロトコルは、無傷のまぶたと出生後マウスの関連眼組織を有する眼球の単離に適している。このプロトコルは、OSまたは眼組織全体の完全性が必要な場合に特に有用である。この方法を用いて、正常および病理学的条件下でOSのケラチンマーカーを検査するための組織サンプルを調べました。我々は、このような調製物からの眼組織は、単一のセクション上のOSの異なる部分におけるタンパク質の差動規則を見る上で特に有用であると結論付ける。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者は、原稿の批判的な読み取りのためにロン・ジュ教授に感謝し、すべてのラボメンバーは技術的な援助を受けました。この研究は、中国国立自然科学財団(NSFC:31571077)からの助成金によって支援されました。北京、中国)、広州市科学技術イノベーションプロジェクト(201707020009;広東省広州)、太陽八千大学の「100人プラン」(8300-18821104;広東省広州)、中山眼科研究所の眼科国家キー研究所からの研究資金(303060202400339;広東省広州)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
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