Summary
이 프로토콜은 상대적으로 손상되지 않은 위치에서 눈꺼풀, 안구 표면, 전방 및 후방 세그먼트로 마우스 안구를 분리하는 방법을 설명합니다.
Abstract
안구 표면 (OS)는 세 개의 연결된 부분으로 상피 시트로 구성되어 있습니다 : 팔피 결막, 구근 결막 및 각막 상피. OS의 중단은 각막염, 결막염 또는 둘 다 (각막결막염)로 이끌어 낼 것입니다. 특정 유전자 변형 또는 인공 수술을 가진 실험 동물 모델에서, OS 상피 시트의 모든 부분을 검사하여 각 부분의 상대적인 병리학적 변화를 병렬로 평가하는 것이 유용하다. 그러나, 왜곡이나 손상없이 전체적으로 OS 조직의 해부는 물리적으로 분리아직 이동 눈꺼풀과 안구에 부착 된 OS의 부드러움과 얇음으로 인해, 도전하고있다. 또한, 단단한 두개골 /궤도 뼈에 의해 형성 된 깊은 눈 소켓은 완전히 해부를 작동하기위한 제한된 공간을 떠나 안구에 의해 점유된다. 그 결과, 안구를 얼굴 측에서 연관된 OS 조직과 직접 해부하면 종종 조직 손상, 특히 팔근과 구근 결막으로 이어질 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 이등분 마우스 머리에서 두개골과 궤도 뼈를 순차적으로 제거하고 눈꺼풀, 안구 표면, 렌즈 및 망막을 한 조각으로 모두 남기는 방법을 설명했습니다. OS 시트의 무결성은 잘 보존되었고 단일 섹션에서 역사학 또는 면스테인에 의해 검사 될 수 있었습니다.
Introduction
안구 표면은 팔모골 결막, 구근 결막 및 각막1을포함한 국부상피의 연속 시트로 구성됩니다. 많은 선 구조는 안구 표면 상피와 연관되어 있으며 함께 건조 및 환경 침입으로부터 각막 표면을 보호하는 눈물 막층을 생성한다2. OS의 중단은 각막염, 결막염 또는 둘 다 (각막결막염)로 이끌어 낼 것입니다. 유전 적 요인과 환경 자극제 또는 그 상호 작용모두 OS3,4의병리학적 변경에 기여합니다. 따라서, 다양한 유전자 조작 및 물리적 또는 화학적 유도 동물 모델이 인간 OS의 질병 과정을 연구하는 데 사용되어 왔다.
마우스 OS의 구조와 기능은 여러 면에서 인간의 구조와 기능과 유사합니다. 안구 땀샘에 의해 분비되는 눈물 막 성분은 또한 마우스와 인간 사이에서 유사합니다. 인간의 OS 질환의 해명 기전을 위해 마우스 모델을 사용하여 많은 연구가 수행되었습니다5,6,7. 많은 경우에, 동일한 실험 적인 처리의 밑에 포괄적인 정보를 얻기 위하여 OS의 현지 분자 변경 대신 글로벌분석하는 것이 중요합니다. 따라서 OS의 각 부분을 동시에 분석하려면 무결성이 좋은 샘플 준비가 필요합니다.
마우스 OS는 눈 소켓/궤도에 내장된 안구와 단단히 연관되어 있으며(여러 개의 다른 두개골 뼈로 만든 뼈 컵) 얇은 결합 조직을 통해 그것에 연결합니다. palpebral 또는 구근 결막을 손상시키지 않고 전체 안구 표면을 해부하기위한 엄청난 도전이 존재한다. 이러한 과제는 다음과 같은 경우: (i) OS는 부드럽고 얇으며 물리적으로 분리되어 있지만 움직일 수 있는 눈꺼풀과 안구에 부착되어 왜곡 및 손상에 취약합니다. (ii) 궤도 뼈와 안구 사이의 제한된 공간은 해부 작업을 제한합니다. 문제는 성인 마우스에 대 한 훨씬 더 큰. 배아 마우스에서, 궤도 뼈 골화가 완전하지 않고 주변 조직은 상대적 느슨한8. 헤드를 제거하고 이분할 수 있으며, 이어서 직접 파라포름알데히드(PFA) 고정 및 임베딩9를실시한다. 대조적으로, 산후 및 성인 마우스 궤도 뼈는 두꺼운 주변 조직으로 완전히 골화되어 고정제의 침투효율을 낮게 만듭니다. 또한, 궤도 /두개골 뼈는 단단하고 부서지기 쉽고 파라핀과 같은 부드러운 임베딩 화합물에서 절편 할 때 쉽게 부서질 수 있습니다. 뼈의 깨진 조각은 만장일치로 열등한 조직 형태로 인해 인근 조직을 찢어 버릴 것입니다.
많은 출판 된 연구는 종종 부분 안구 표면을 보였다, 이는 자신의 특정 연구 목적을 위해 충분 할 수있다10,11. 문헌의 총 검사는 해부 프로토콜12,13에대한 상세한 설명없이 입증되고 전체 그대로 안구 표면을 보여주는 몇 가지 연구를 발견했다. 이 프로토콜에서는 궤도 및 두개골 뼈가 질서 정연하게 제거되어 안구 표면과 눈꺼풀을 함께 남기고 물리적 인 손상을 최소화하는 통합 산후 눈 표면을 얻기위한 해부 방법을 자세히 설명했습니다. 우리는 OS 조직학을 추가로 검토하고 이 프로토콜로 준비된 조직 단면도를 사용하여 면역조직 화학을 수행했습니다.
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Protocol
마우스의 사용과 관련된 모든 절차는 동물 관리 및 사용위원회, 중산 안과 센터에 의해 승인되었으며, 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 성명서를 준수했습니다.
1. 안구 표면과 눈꺼풀이 있는 안구 해부
- 머리를 해부하십시오.
- 자궁 경부 탈구에 의해 산후 일 10 (P10) 및 P28 마우스 (마우스 균주에 대한 재료의 표 참조), 날카로운 가위 쌍에 의해 목에서 머리를 잘라.
- 시상 중간선을 따라 직선 가위를 한 쌍의 이분 머리는 비강에 rostrally 에서 시작(그림 1A,B).
참고 : 두개골 뼈는 마우스 노화로 굳어지며 가위를 가능한 한 중간선을 따라 자르지 않도록주의하십시오. - 이등분된 머리의 각 절반을 깨끗한 페트리 접시에 놓고 날카로운 가위를 사용하여 턱과 혀를 먼저 잘라냅니다. 시신경을 시신경을 시신경이 시신경 위치 이전에 절단하여 제거하고 두개골 벽에 부착된 후각 전구를 포함한 모든 뇌 조직을 제거합니다.
- 이제 나머지 조직은 안구와 관련된 모든 두개골 / 궤도 뼈를 가져야합니다(그림 1C,D). 혈액과 모발 파편을 청소하기 위해 PBS로 나머지 부분을 씻으하십시오.
- 4% 파라포름알데히드(PFA, 인산완충식염수[PBS], pH 7.4)를 실온(RT)에서 50 mL 원엽튜브에 회전시키는 접두사. 대략적인 고정 시간은 다음과 같습니다: P0내지 P7에 대해 ~10분; ~20 P8에 대 한 분 P28; P29 이상 ~ 30 분.
참고 : 접두사는 조직 강성을 제공하여 후속 해부를 더 쉽게 만듭니다. 또한 접두사는 해부가 완료되기 전에 너무 오래 고정되지 않은 신선한 조직을 떠나는 것을 방지합니다.
주의: PFA는 위험하며 주의해서 취급해야 합니다.
- 두개골/궤도 뼈를 제거합니다.
- 접두사 후, 해부된 머리를 PBS에서 3회 빠르게 세척하여 부러진 모발과 고정제를 더 제거하여 추가 해부를 진행한다.
주의: 해부 중 고정제에 노출되면 건강에 해가 될 수 있습니다. - 10cm 페트리 접시에 조직을 놓고 그림 1D,E에표시된 평면을 따라 두개골을 세 부분으로 자른다. 소켓의 안구는 ethmoid, 정면 및 상악 골 아래 두개골의 중간 부분에 숨겨져 있습니다(그림 1D,E).
- 4번 직선 집게 2쌍을 사용하여 전두엽과 상악골이 완전히 노출되기 위해 에트모이드 뼈를 벗겨냅니다(그림1F).
- 지리적으로 두개골 표면(상악및 정면 뼈 포함)을 4개영역(그림 1F)으로나눕니다. 곡선 된 집게의 끝을 각 영역에 수평으로 삽입하여 상악골과 정면 골격을 순차적으로 제거합니다(그림1F).
참고: 상악골은 모두 한 번에 제거할 수 없습니다. 참을성 있게 조각으로 조각을 해부. 정면 뼈는 부드러운 결합 조직을 통해 안구에 직접 연결됩니다. 안구에서 제거할 때 안구를 스트레칭하고 결막에 손상을 입히는 것을 방지하기 위해 주의하십시오. - 부분 상악골과 모든 정면 뼈를 제거 한 후, 기본 물상 및 jugal 뼈가 노출 될 것이다(그림 1G). 안구를 둘러싼 두 개의 뼈와 관련 피하 근육과 지방을 제거하고, 부착된 눈꺼풀과 피부로 안구를 다듬어 조직 부피를 줄이고 포함 시 조직 방향을 조정하는 것을 용이하게합니다(그림 1) H)를 말합니다.
- 안구 와 관련 조직을 다시 4 % PFA로 놓고 4 °C에서 하룻밤 동안 계속 수정하십시오. 고정 된 조직은 0.02 % NaN 3의 첨가와 함께 PBS에서 4 °C에서 적어도 한 달 동안 보존 될 수있습니다. 또는 조직학적 분석을 즉시 진행하십시오.
참고 : 조직을 더 오랜 기간 동안 보관해야하는 경우 70 % 에탄올에 쉽게 저장할 수 있습니다.
- 접두사 후, 해부된 머리를 PBS에서 3회 빠르게 세척하여 부러진 모발과 고정제를 더 제거하여 추가 해부를 진행한다.
2. 조직학적 분석
- 파라핀 섹션 및 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색
- 9다른 곳에 설명된 표준 프로토콜을 따라 파라핀 임베딩 및 단면화를 수행한다.
- 면역화학 (IHC)
- 자일렌으로 파라핀 절편을 왁스하고 알코올 시리즈를 통해 섹션을 재수화 (100%, 95%, 80%) 증류수 (dH2O)에 넣습니다.
- 0.01 M 구연산 완충액 (구연산 삼중 나트륨 3g, 이중 증류 H2O 당 0.4 g)의 조직 슬라이드의 마이크로 파 처리에 의한 항원 회수를 저전력 (120W)의 유리 슬라이드 항아리에 수행합니다. 에너지는 간헐적으로 총 5-10 분 동안 전달되어야하며 각 간격은 약 2 분 동안 지속됩니다.
참고 : 고전력 전자 레인지 또는 일관된 가열은 슬라이드에서 조직 섹션의 분리로 이어질 것입니다. - 유리 항아리에서 슬라이드를 골라 얼굴 조직을 사용하여 각 섹션을 둘러싼 잔류 액체를 조심스럽게 닦아내고 조직학 상자의 슬라이드 랙에 놓습니다. 방수 조직학 펜으로 각 섹션 주위에 사각형을 그립니다. 블로킹 버퍼 100 μL(0.1% 트리톤 X-100 및 10% 당나귀 혈청을 1x PBS에) 각 사각형에 놓고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
- 조심스럽게 진공으로 차단 용액을 제거하고, 차단 버퍼에서 원하는 희석으로 1 차 항체 (재료 표참조)를 추가하고 24 시간 이상 동안 4 °C에서 슬라이드를 계속 배양하십시오.
참고: IHC에 사용되는 각 1차 항체의 농도는 다양하며 파일럿 실험에서 테스트해야 합니다. - PBST (PBS에서 0.1 % 트리톤)로 조직 슬라이드를 3 회, 각각 10 분 동안 씻으십시오. 2.2.4 단계는 이차 항체를 사용하여 (재료표참조) 4', 6-디아미디노-2-페닐린들레(DAPI)와 함께 차단 완충액을 대체한다. 실온(RT)에서 적어도 4시간 이상 배양하십시오.
- 이차 항체를 제거하고 PBST 용액으로 조직 섹션을 세 번, 각각 10 분 동안 씻은 다음 깨끗한 PBS로 다시 5 분 동안 씻으하십시오.
- 잔여 PBS 주변 조직 섹션을 닦아내고 장착 매체가있는 섹션에 덮개를 장착하십시오. 형광 현미경 검사를 수행하여 이미지를 얻습니다(재료 표참조).
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Representative Results
다른 관점에서 본 주요 두개골 뼈는 그림 1A-E에설명되어 있으며 색상은 서로 다른 골격을 나타내고 있습니다. 우리는 해부 과정의 데모를 위해 4 주 된 동물을 사용했습니다. 해부 단계 1.1.1-1.1.3 및 짧은 접두사(단계 1.1.4)에 이어, 관련 안면 골격을 가진 안구는 도 1E에서입증된다. 전방(비강 및 상전)과 후방(예를 들어, 정수리)뿐만 아니라 안구 위에 주로 상악골과 정면 뼈를 가진 조직 블록을 생성한 에스모이드 뼈를 제거하기 위한 트리밍(도1F). 도 1F에서 지정된 부위에 따라 이러한 뼈를 순차적으로 제거하여 하데린 선뿐만 아니라 근본적인 물상 및 굴뼈에 노출하였다(도1G). 안구에 부착 된 하데린 선은 랜드 마크(그림 1G)로사용되며 항상 제자리에 보관해야합니다. 안구의 분리는 모든 뼈 및 주변 지방 및 근육 조직을 제거함으로써 완료되었다(도1H).
파라핀 을 삽입한 후, 안구를 단면화하고 H&E-스테인드했습니다. 대표 이미지는 그림 2에나와 있습니다. 눈꺼풀, 각막 및 결막 표면의 상대적 손상 위치는 한섹션(그림 2A)에서시각화되었으며, 그 중 일부는 그림 2B,C에서확대되었습니다. 렌즈 형태는 견고성과 취약성 때문에 유지하기 어렵다(그림 2A). 우리는 다른 산후 연령에 이 해부 방법을 적용하고 P10 안구 섹션의 H&E 조직학의 예를 보여주었습니다(그림 3). 일반적으로 마우스가 젊을수록 안구 형태가 더 잘 보존됩니다. 연속 산후 연령의 면역 염색 파라핀 섹션은 그림 4에나와 있으며, 각질 12 (K12)(그림 4A-F)및 각질 14(그림 4G-L)와함께 각막 및 전체 OS 상피를 염색하고, 각각.
그림 1: 4주 령 성인 마우스에서 안구 해부의 그림. (A-D) 상부(A), 하단(B), 측면(C) 및 중간 평면(D)에서 각각 본 두개골 조성물의 회로도 다이어그램. (A) 및 (B)의 파선은 이등분 평면을 나타냅니다. (E)정확히 일치 하는 4 주 된 나이에 이분 반 두개골 (D). (F)(D) 및 (E)에서 두 횡면 사이의 해부 된 조직의 내측 평면 보기. 안구(파선 원)는 주로 정면(Fron) 및 상악(Max) 아래에 내장되어 있습니다. 컬러 파선은 지리적으로 이등분된 평면을 4개의 영역으로 나눕니다. 에스모이드(Eth) 뼈가 제거되었습니다. (G)전두엽 뼈와 부분 상악골의 제거 후, 하데린 선(Har) 및 주갈(Jug) 및 물상(La) 뼈가 노출되었다. 원 파선은 안구 위치를 나타냅니다. (H)해부 완료 후 내부에서 볼 수 있는 고립된 안구. 화살표는 시신경을 가리킵니다(켜기). E = 눈, 나 = 비강, 사전 = Premaxilla, Max = 맥아, 라 = La = La = Lacrimal, 프론 = 정면, 알리 = 알리 - 알리스페노이드, 주갈, 팔 = 팔라틴, Pterygoid, Squ = 스쿼모살, 파 = Parietal, Eth = 이스모이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 4주 된 산후의 안구 표면 조직의 H&E 조직학. (A)눈꺼풀, 결막 및 각막은 하나의 조직 섹션에서 시각화됩니다. "b" 및 "c"의 박스화된 영역은 각각 (B) 및 (C)로 확대되었다. (B)각막 상피, 기질 및 내피. (C)잔 세포가 있는 결막. ce = 각막 상피, st = 기질, 에드 = 내피, gc = 잔 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 10일 출생 후 안구 표면 조직의 H&E 조직학. (A)P10에서 안구그대로. "b" 및 "c"의 박스화된 영역은 각각 (B) 및 (C)로 확대되었다. (B)각막. (C)결막. Ce = 각막 상피, st = 기질, ed = 내피, cj = 결막. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: P5에서 P15까지의 안구 표면의 면역 염색. 각 패널의 정사각형 영역은 오른쪽에 확대되었습니다. (A-F) 각질(12)은 각막 상피(화살표)로 구체적으로 발현되었다. (G-L) 안구 표면에서 발현된 각질(14). ac = 전방 챔버, PC = palpebral 결막. 이 수치는 이전 간행물 Guo 등14에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
온전한 안구의 준비를 위한 중요한 알림은 모든 궤도 뼈, 특히 작은 눈 소켓의 바닥 근처에 있는 juga 및 상구 뼈를 완전히 제거해야 한다는 것입니다. 남은 뼈는 계속되는 역학을 복잡하게 할 수 있습니다. 뼈의 작은 조각이 우연히 해부에서 완전히 제거되지 않은 경우, 그것은 샤프 트위즈 의 쌍을 사용하여 포함 파라핀 블록에서 선택 될 수있다. 남은 구멍은 이 수술 후 녹은 파라핀으로 채워져야 합니다.
렌즈를 다룰 때는 추가주의를 기울여야 합니다. 깨진 렌즈 조각은 일반적으로 전체 섹션을 통해 흩어져 있습니다. 이것은 현미경 검사 및 심상 분석에 상당히 영향을 미칠 것입니다. 렌즈를 제거하려고 하면 안구 표면(안면 쪽에서 수술이 수행된 경우) 또는 망막(수술이 망막의 광학 디스크 측에서 나온 경우)이 손상될 수 있습니다. 해부없이 렌즈 조직의 존재의 부정적인 영향을 감소시키는 또 다른 방법은 단면 방향을 변경하는 것입니다. 예를 들어, 안구 표면 형태를 저장하려면 파라핀 블록의 단면화가 안구 의 앞쪽에서 후방으로, 그렇지 않으면 반대 방향에서 수행되어야합니다.
PFA 고정 파라핀 절편에 대한 유용한 참고는 항원 검색이 일반적으로 K12 및 K14 항체를 사용하는 것과 같은 면역 염색에 필요하다는 것입니다. 그러나, 항원 검색이 배경 염색을 증가비 특이적 신호를 생성 할 많은 예외가있다. 따라서, 항원 회수 기술을 사용할 때는 주의해야 하며, 가능하면 사전에 파일럿 실험에서 항체를 시험해야 한다.
일반적으로 두개골 / 궤도 뼈에서 안구를 분리하는 두 가지 방법이 있습니다 : (i) 안구를 얼굴 쪽에서 직접 해부합니다. (ii) 안구를 풀기 위해 두개골/궤도 뼈 내부를 제거합니다. 첫 번째 방법의 과제는 안구가 해부를 위해 사이에 좁은 공간으로 궤도 소켓 깊숙이 가라 앉는다는 것입니다. 게다가, 가동 안구는 해부 공구가 그것을 만질 때 어떤 주어진 시점에서 결막 상피를 스트레칭할 것입니다, 의도하지 않은 손상을 만드는. 대조적으로, 두 번째 방법은 두개골 / 궤도 뼈의 해부로 시작, 이는 안구와 관련 안구 표면 조직에서 멀리, 따라서 결막 손상의 위험을 감소. 또한 해부를 수행하기 위한 공간 수축이 없습니다. 첫 번째 방법은 큰 주의를 기울였을 때 작동 할 수 있지만 두 번째 방법은 확실히 쉽고 좋습니다.
요약하자면, 우리는 산후 마우스로부터 온전한 눈꺼풀 및 관련 안구 표면을 가진 마우스 안구의 격리방법을 기술하였다. 기재된 프로토콜은 산후 마우스에서 온전한 눈꺼풀 및 관련 안구 조직을 가진 안구의 격리에 적합합니다. 이 프로토콜은 OS 또는 안구 조직의 무결성이 필요할 때 특히 유용합니다. 우리는 정상 및 병리학 조건하에서 OS에 있는 각질 마커의 검사를 위한 조직 견본을 준비하기 위하여 이 방법을 이용했습니다. 우리는 그 같은 준비에서 안구 조직이 단 하나 단면도에 OS의 다른 부분에서 단백질의 차등 규정을 보는 것을 특히 도움이 된다는 것을 결론을 내립니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 원고의 비판적 독서에 대한 룽 주 교수에게 감사하고, 기술 지원에 대한 모든 실험실 구성원. 이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단 (NSFC: 31571077)의 보조금에 의해 지원되었다; 중국 베이징, 광저우 시 과학 및 기술 혁신 프로젝트 (201707020009; 광저우, 광동성, 중국), "100 인 계획" 선 야센 대학에서 (8300-18821104; 광저우, 광동성, 중국), 중산 안과 센터에서 안과의 국가 핵심 연구소에서 연구 자금 (303060202400339; 광저우, 광동성, 중국).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
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