Summary
Este protocolo descreve um método para o isolamento do globo ocular do rato com pálpebra, superfície ocular, segmentos anterior e posterior em posição relativamente intacta.
Abstract
A superfície ocular (OS) consiste em uma folha epitelial com três partes conectadas: conjuntiva palpebral, conjuntiva bulbar e epitélio corneano. O rompimento do ósmio conduziria ao keratitis, à conjuntivite ou aos ambos (Keratoconjunctivitis). Em modelos animais experimentais com certas modificações genéticas ou operações artificiais, é útil examinar todas as partes da folha epitelial do so para avaliar as alterações patogenéticas relativas de cada parte em paralelo. Entretanto, a dissecção do tecido do ósmio como um todo sem distorção ou dano foi desafiando, primeiramente devido à suavidade e à magreza do ósmio afixada às pálpebras e ao globo ocular fisicamente separados contudo móveis. Adicionalmente, o soquete profundo do olho dado forma pelos ossos duros do crânio/orbital é ocupado inteiramente pelo globo ocular que sae do espaço limitado para dissecções operando-se. Em conseqüência, a dissecção direta do globo ocular com OS tecidos associados do ósmio do lado facial conduziria frequentemente aos danos do tecido, especial a conjuntiva palpebral e bulbar. Neste protocolo, nós descrevemos um método para remover o crânio e os ossos orbitais sequencialmente de uma cabeça de rato cortada pelo, deixando as pálpebras, a superfície da ocular, a lente e o retina completamente em uma parte. A integridade da folha do sistema operacional foi bem preservada e pode ser examinada por histologia ou imunocoloração em uma única seção.
Introduction
A superfície da ocular consiste em uma folha contínua do epitélio regionalizada que inclui a conjuntiva palpebral, a conjuntiva bulbar e a córnea1. Muitas estruturas glandulares estão associadas ao epitélio da superfície ocular e, juntas, geram uma camada de película lacrimal protegendo a superfície da córnea da secagem e das invasões ambientais2. O rompimento do ósmio conduziria ao keratitis, à conjuntivite ou aos ambos (Keratoconjunctivitis). Tanto os fatores genéticos quanto os irritantes ambientais ou suas interações contribuem para alterações patológicas do sistema operacional3,4. Assim, uma variedade de modelos animais geneticamente modificados e fisicamente ou quimicamente induzida têm sido usados para estudar os processos de doença do sistema operacional humano.
A estrutura e a função do ósmio do rato são similares àquela dos seres humanos em muitas maneiras. Os componentes da película do rasgo secretado pelas glândulas da ocular são igualmente similares entre ratos e seres humanos. Uma riqueza de estudos foi conduzida usando modelos do rato para elucidar mecanismos de doenças humanas do ósmio5,6,7. Em muitas ocasiões, é fundamental analisar global em vez de mudanças moleculares locais do sistema operacional para obter informações abrangentes o mesmo tratamento experimental. Portanto, a preparação da amostra com boa integridade é necessária para garantir que cada parte do sistema operacional seja analisada simultaneamente.
O ósmio do rato associa firmemente com o globo ocular que foi encaixado no soquete/órbita do olho (um copo ósseo feito de diversos ossos diferentes do crânio) e conecta-lhe com os tecidos conexivos finos. Existem enormes desafios para dissecação da superfície ocular inteira sem danificar a conjuntiva palpebral ou bulbar. Estes desafios descem de: (i) o OS é macio e fino e afixado às pálpebras e ao globo ocular fisicamente separados contudo móveis, conseqüentemente vulneráveis para a distorção e os danos; e (II) o espaço limitado entre os ossos orbitais e o globo ocular restringem as operações de dissecção. Os desafios são muito maiores para o rato adulto. No rato embrionário, a ossificação orbital do osso não é completa e os tecidos circunvizinhos são frouxos relativos8. A cabeça pode ser removida e cortada e, em seguida, submetida diretamente à fixação de paraformaldeído (PFA) e incorporação9. Pelo contraste, os ossos orbitais pós-natal e adultos do rato são totalmente ossificados com os tecidos circunvizinhos grossos, fazendo a penetração dos fixadores menos eficientes. Além disso, os ossos orbitais/crânio são duros e quebradiços, facilmente quebrados quando seccionando-os nos compostos de incorporação macios tais como a parafina. Os pedaços quebrados de ossos, por unanimidade, rasgar os tecidos próximos, resultando em morfologia do tecido inferior.
Muitos estudos publicados mostraram frequentemente a superfície parcial da ocular, que pode ser suficiente para suas finalidades particulares da pesquisa10,11. Uma examinação bruta das literaturas encontrou somente poucos estudos que mostram a superfície intacta inteira da ocular que está sendo demonstrada sem descrição detalhada de protocolos12,13da dissecção. Neste protocolo, nós detalhamos um método da dissecção para obter a superfície pós-natal integral da ocular, em que os ossos orbitais e do crânio foram removidos ordenadamente, deixando a superfície intocada da ocular junto com o globo ocular e as pálpebras, minimizando os danos físicos. Nós examinamos mais a histologia do ósmio e executámos immunohistochemistry usando as seções do tecido preparadas com este protocolo.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo o uso de camundongos foram aprovados pelo Comitê de cuidado e uso de animais, centro Oftalmico de Zhongshan, e aderiram à declaração de ARVO para o uso de animais em pesquisa Oftaltrônica e visão.
1. dissecção do globo ocular com superfície ocular intacta e pálpebras
- Dissecar a cabeça.
- Eutanizar dia pós-natal 10 (P10) e P28 camundongos (veja a tabela de materiais para cepas de mouse) por luxação cervical, corte a cabeça do pescoço por um par de tesouras afiadas.
- Cabeça de Bisect com um par de tesouras retas ao longo do midline sagital que começa no osso interparietal rostralmente ao nasal (Figura 1a, B).
Nota: o osso do crânio endurece com o envelhecimento do rato, tenha cuidado para manter as tesouras de corte ao longo da linha média, tanto quanto possível. - Coloc cada metade da cabeça cortada pelo em um prato de Petri limpo, corte a maxila e a lingüeta primeiramente usando tesouras afiadas. Livre o nervo ótico cortando o fora do cérebro antes da posição ótica do quiasma óptico, e remova todos os tecidos do cérebro que incluem o bulbo olfactory Unido à parede do crânio.
- Agora os tecidos restantes devem ter todos os ossos do crânio/orbital associados com o globo ocular (Figura 1C, D). Lave a parte restante com PBS para limpar o sangue e os restos de cabelo.
- Prefixo de tecidos com paraformaldeído a 4% (PFA, em solução salina tamponada com fosfato [PBS], pH 7,4) em um tubo cônico de 50 mL à temperatura ambiente (RT) com rotação. O tempo aproximado da fixação é como segue: ~ 10 minutos para P0 a P7; ~ 20 min para P8 para P28; e ~ 30 min para P29 e mais velhos.
Nota: a pré-fixação oferece rigidez tecidual tornando a dissecção subsequente mais fácil. Adicionalmente, a pré-fixação evita deixar o tecido fresco desfixado demasiado por muito tempo antes que a dissecção esteja completa.
Cuidado: o PFA é perigoso e deve ser manuseado com cuidado.
- Remover crânio/ossos orbitais.
- Após a pré-fixação, lave rapidamente a cabeça dissecada em PBS três vezes para eliminar ainda mais os pêlos quebrados e fixativos, a fim de prosseguir com a dissecção mais.
PRECAUÇÃO: a exposição a fixadores durante a dissecção pode ser prejudicial para a saúde. - Coloque o tecido em um prato de Petri de 10 cm, corte o crânio em três partes ao longo dos planos indicados na Figura 1D, E. O globo ocular no soquete está escondido na parte média do crânio os ossos etmóide, frontal e maxilar (Figura 1D, e).
- Use dois pares do fórceps reto no. 4 para descascar fora o osso etmoidal para expor inteiramente os ossos frontais e Maxillary (Figura 1F).
- Divida geograficamente a superfície do crânio (incluindo os ossos maxilar e frontal) em 4 áreas (Figura 1F). Insira a ponta do fórceps curvo horizontalmente em cada área para remover os ossos maxilar e frontal sequencialmente (Figura 1F).
Nota: os ossos maxilares não podem ser removidos ao mesmo tempo. Dissecar-lhes pacientemente a peça por peça. O osso frontal é conectado diretamente ao globo ocular através dos tecidos conectivos macios. Tome cuidado ao removê-lo do globo ocular para evitar esticar o globo ocular e danificar a conjuntiva. - Após a remoção do osso maxilar parcial e de todo o osso frontal, os ossos lacrimal e jugal subjacentes estariam expostos (Figura 1G). Remova os dois ossos e os músculos e as gorduras subcutaneous associados que cercam o globo ocular, apare o globo ocular com as pálpebras e a pele Unidas em um bloco pequeno da quadrado-forma para reduzir o volume do tecido e para facilitar orientar o tecido ao incorporar (Figura 1 H).
- Coloque o globo ocular e os tecidos associados de volta em 4% PFA e continuar a fixar durante a noite a 4 ° c. O tecido fixo pode ser preservado por pelo menos um mês a 4 ° c em PBS com adição de 0, 2% NaN3. Alternativamente, proceder à análise histológica imediatamente.
Nota: se o tecido precisa de ser armazenado por períodos mais longos, pode prontamente ser armazenado no etanol de 70%.
- Após a pré-fixação, lave rapidamente a cabeça dissecada em PBS três vezes para eliminar ainda mais os pêlos quebrados e fixativos, a fim de prosseguir com a dissecção mais.
2. análise histológica
- Secção de parafina e coloração de hematoxilina e eosina (H & E)
- Siga o protocolo padrão descrito em outros lugares9 para realizar a incorporação e corte de parafina.
- Imunoistoquímica (IHC)
- Depilar as secções de parafina com xileno e reidratar as secções através da série alcoólica (100%, 95%, 80%) em água destilada (dH2O).
- Realize a recuperação do antígeno pelo tratamento da microonda das corrediças do tecido no amortecedor do ácido cítrico de 0, 1 M (3 g do citrato trissódico, 0,4 g de ácido cítrico por 1 L dobro destilado H2O) em um frasco de vidro da corrediça com baixa potência (120 W). A energia deve ser entregada intermitentemente para o total 5-10 min com cada intervalo que dura aproximadamente 2 minutos.
Nota: a microonda de alta potência ou o aquecimento consistente conduziriam ao destacamento de seções do tecido da corrediça. - Escolha as lâminas do frasco de vidro, limpe com cuidado o líquido residual que circunda cada seção usando os tecidos faciais e coloc os na cremalheira de corrediça em uma caixa da histologia. Desenhe um quadrado ao redor de cada seção com uma caneta histológica à prova d' água. Coloque 100 μL de tampão de bloqueio (0,1% Triton X-100 e 10% de soro de burro em 1X PBS) em cada quadrado, e incubar por 30 min em RT.
- Remova com cuidado a solução de obstrução com vácuo, adicione o anticorpo preliminar (veja a tabela dos materiais) com diluição desejada no amortecedor de obstrução, e continue a incubar as corrediças em 4 ° c por 24 h ou mais por muito tempo.
Nota: a concentração para cada anticorpo primário utilizado para o IHC varia e tem de ser testada em experimentos piloto. - Lave as lâminas de tecido com PBST (0,1% Triton em PBS) três vezes, por 10 min cada. Repita a etapa 2.2.4 usando o anticorpo secundário (veja a tabela de materiais) junto com 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) que substitui o amortecedor de obstrução. Continuar a incubar durante pelo menos 4 h ou mais à temperatura ambiente (RT).
- Remova o anticorpo secundário, seções do tecido da lavagem com solução de PBST três vezes, por 10 minutos cada um, a seguir lave com PBS limpo por outros 5 minutos.
- Limpe as secções de tecido do PBS residual, monte coberturas em secções com suporte de montagem. Realizar microscopia fluorescente para obter imagens (ver a tabela de materiais).
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Representative Results
Os principais ossos do crânio vistos a partir de diferentes perspectivas foram ilustrados na Figura 1A-E, com cores que denitavam diferentes ossos. Utilizamos animais de quatro semanas de idade para demonstração dos processos de dissecção. Depois das etapas de dissecção 1.1.1-1.1.3 e de uma pré-fixação curta (etapa 1.1.4), o globo ocular com os ossos faciais associados é demonstrado na Figura 1e. Aparar mais para remover o anterior (nasal e premaxillary) e posterior (por exemplo, parietal) assim como os ossos etmoidal geraram o bloco do tecido com principalmente os ossos Maxillary e frontais sobre o globo ocular (Figura 1F). A remoção seqüencial destes ossos de acordo com áreas designadas na Figura 1F expôs os ossos lacrimal e jugal subjacentes assim como a glândula de Harderin (Figura 1G). A glândula de Harderin unida ao globo ocular serviu como um marco (Figura 1G), e deve ser mantida no lugar em todas as vezes. A isolação do globo ocular foi terminada pela remoção de todos os ossos e pelas gorduras e pelos tecidos circunvizinhos do músculo (Figura 1H).
Após a incorporação da parafina, o globo ocular foi seccionado e H & E-manchado. As imagens representativas são mostradas na Figura 2. As posições intactas relativas das pálpebras, da superfície corneana e conjuntival foram visualizadas em uma seção (Figura 2A), partes das quais foram ampliadas na Figura 2B, C. A morfologia da lente é difícil de manter (Figura 2a) devido à sua rigidez e fragilidade. Aplicou-se este método de dissecção para outras idades pós-natal e mostrou um exemplo de histologia de H & E da seção do globo ocular P10 (Figura 3). Em geral, quanto mais jovem o mouse é, melhor a morfologia do globo ocular é preservada. As secções de parafina imunomanchadas das idades pós-natais seriadas são mostradas na Figura 4, com queratina 12 (K12) (Figura 4A-F) e queratina 14 (K14) (Figura 4G-L) manchando a córnea e todo o epitélio do so, Respectivamente.
Figura 1: ilustração da dissecção do globo ocular no rato adulto idoso de 4 semanas. (A-D) O diagrama esquemático da composição do crânio visto de cima (A), inferior (B), lateral (C) e plano médio (D), respectivamente. Linhas tracejadas em (A) e (B) indicam planos bissecados. (E) bisected-metade do crânio na idade de 4 semanas de idade que corresponde exatamente (D). (F) visão do plano medial do tecido dissecado entre os dois planos transversais em (D) E (e). O globo ocular (círculo tracejado) foi incorporado principalmente embaixo do frontal (Fron) e maxilar (máx.). As linhas tracejadas coloridas dividem geograficamente o plano cortada pelo em 4 áreas, em que os ossos foram removidos aproximadamente como por a ordem ou os números. Note-se que o osso etmóide (ETH) foi removido. (G) após a remoção do osso frontal e maxilar parcial, Harderin glândula (Har) e Jugal (jarro) e lacrimal (la) ossos foram expostos. As linhas tracejadas do círculo indicam a posição do globo ocular. (H) globo ocular isolado visto do interior após a dissecção terminada. Seta aponta para o nervo óptico (on). E = olho, na = nasal, pré = pré-maxila, máx = maxilar, la = lacrimal, Fron = frontal, ali = Alisfenóide, jarro = jugal, PAL = Palatino, Ptery = pterigóide, PA = Squamosal, par = parietal, ETH = etmóide. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Histologia de H &Amp; E do tecido ocular na superfície pós-natal de 4 semanas de idade. (A) pálpebra, conjuntiva e córnea são visualizadas em uma seção de tecido. As áreas encaixotadas de "b" e "c" foram amplificadas em (B) e (C), respectivamente. (B) epitélio da córnea, estroma e endotélio. (C) a conjuntiva com células de cálice. CE = epitélio da córnea, St = estroma, Ed = endotélio, GC = célula de cálice. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Histologia de H &Amp; E do tecido da superfície ocular no dia pós-natal 10. (A) globo ocular intacto em P10. As áreas encaixotadas de "b" e "c" foram amplificadas em (B) e (C), respectivamente. B) a córnea. (C) a conjuntiva. CE = epitélio da córnea, St = estroma, Ed = endotélio, CJ = conjuntiva. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imunocoloração da superfície ocular de P5 a P15. A área quadrada-encaixotada em cada painel foi ampliada em sua direita. (A-F) A queratina 12 foi expressa especificamente no epitélio da córnea (setas). (G-L) A queratina 14 expressa na superfície ocular. AC = câmara anterior, PC = conjuntiva palpebral. Este número foi modificado de uma publicação anterior Guo et al.14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um lembrete crítico para a preparação do globo ocular intacto é que todos os ossos orbitais devem ser removidos completamente, especialmente os ossos da juga e lacrimal, que são pequenos e localizados perto do fundo do soquete do olho. Qualquer osso esquerdo pode complicar a histologia que se seguiu. No caso de um pequeno pedaço de osso não foi completamente removido da dissecção por acidente, ele pode ser retirado do bloco de parafina incorporação usando um par de sharptweezers. O furo deixado para trás deve ser enchido com a parafina derretida após esta operação.
Cuidado adicional deve ser exercido quando manusear a lente. As partes quebradas da lente são espalhadas geralmente através da seção inteira. Isto afetará consideravelmente a examinação da microscopia e a análise da imagem. As tentativas de remover a lente danificariam ou a superfície da ocular (se a operação foi conduzida do lado facial) ou o retina (se a operação era do lado do disco ótico do retina). Uma maneira alternativa de reduzir o impacto negativo da presença de tecido da lente sem dissecção é mudar direções de corte. Por exemplo, para conservar a morfologia da superfície da ocular, o corte do bloco da parafina deve ser executado do anterior do globo ocular ao posterior, se não, do sentido oposto.
Uma nota útil a fazer para a seção PFA-fixa da parafina é que a recuperação do antígeno é geralmente necessária para a imunocoloração tal como a utilização de anticorpos K12 e k14. Entretanto, há muitas exceções que a recuperação do antígeno geraria sinais não específicos que aumentam a mancha do fundo. Assim, deve-se ter cautela ao usar a tecnologia de recuperação de antígeno, e deve testar anticorpos em experimentos piloto, se possível, de antemão.
Em geral, existem dois métodos para isolamento do globo ocular a partir do crânio/ossos orbitais: (i) dissecar diretamente o globo ocular do lado facial; e (II) remover o crânio interno/ossos orbitais para libertar o globo ocular. O desafio para o primeiro método é que o globo ocular afunda profundamente na tomada orbital com um espaço estreito no meio para a dissecção. Além disso, o globo ocular móvel esticaria o epitélio da conjuntiva em todo o ponto dado quando as ferramentas da dissecção o tocam, criando danos não intencionais. Pelo contrário, o segundo método começa com a dissecção do crânio/ossos orbitais, que são mais distantes do globo ocular e do tecido de superfície ocular associado, reduzindo assim o risco de danificar a conjuntiva. Além disso, não há constrições espaciais para a realização de dissecções. Mesmo que o primeiro método pode funcionar se grandes cauções foram tomadas, o segundo é definitivamente mais fácil e melhor.
Em resumo, nós descrevemos um método para a isolação do globo ocular do rato com pálpebra intacta e a superfície associada da ocular dos ratos pós-natal. O protocolo descrito é apropriado para a isolação do globo ocular com pálpebra intacta e os tecidos associados da ocular em ratos pós-natal. O protocolo é especialmente útil quando a integridade do sistema operacional ou tecidos oculares inteiros é necessária. Nós usamos este método para preparar amostras do tecido para a examinação de marcadores da queratina no ósmio circunstâncias normais e patológicas. Nós concluímos que os tecidos da ocular de tais preparações são particularmente úteis para olhar os regulamentos diferenciais de uma proteína em partes diferentes do ósmio em uma única seção.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Prof. Rong Ju a leitura crítica do manuscrito e todos os membros do laboratório para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de ciências naturais da China (NSFC: 31571077; Pequim, China), o Guangzhou City Sciences and Technologies Innovation Project (201707020009; Guangzhou, província de Guangdong, China), "plano de 100 pessoas" da Universidade de Sun Yat-Sen (8300-18821104; Guangzhou, província de Guangdong, China), e financiamento da pesquisa do laboratório chave do estado do ophthalmology no centro ophthalmic de Zhongshan (303060202400339; Guangzhou, província de Guangdong, China).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
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