Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Histolojik Muayene ve İmmünohistokimya için İntegral Göz Yüzey Dokusu Elde Etmek Için Bozulmamış Göz Küresinin İzolasyon

doi: 10.3791/60086 Published: October 20, 2019

Summary

Bu protokol, fare göz küresinin göz kapağı, göz yüzeyi, anterior ve posterior segmentleri ile nispeten sağlam konumda izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

Oküler yüzey (OS) üç bağlı parçadan oluşan bir epitel levhaoluşur: palpebral konjonktiva, bulbar konjonktiva ve kornea epitel. OS bozulması keratit yol açacak, konjonktivit veya her ikisi (keratokonjonktivit). Belirli genetik modifikasyonlara veya yapay operasyonlara sahip deneysel hayvan modellerinde, her bir parçanın göreceli patogenetik değişikliklerini paralel olarak değerlendirmek için OS epitel sayfasının tüm bölümlerini incelemek yararlıdır. Ancak, distorsiyon veya hasar olmadan bir bütün olarak OS doku diseksiyon, öncelikle yumuşaklık ve os incelik nedeniyle fiziksel olarak ayrı henüz hareketli göz kapakları ve göz küresi yapıştırılmış nedeniyle zor olmuştur. Ayrıca, sert kafatası / orbital kemikler tarafından oluşturulan derin göz soketi tamamen çalışma diseksiyonları için sınırlı alan bırakarak göz küresi tarafından işgal edilir. Sonuç olarak, yüz tarafında ilişkili OS dokuları ile göz küresi doğrudan diseksiyon genellikle doku hasarlarına yol açacak, özellikle palpebral ve bulbar konjonktiva. Bu protokolde, kafatası ve yörünge kemiklerini iki parçalı fare başından sırayla çıkarmak için bir yöntem tanımlanmış, göz kapakları, göz yüzeyi, lens ve retinayı tek parça halinde bırakılmıştır. OS sayfasının bütünlüğü iyi korunmuştur ve histoloji veya immünboyama ile tek bir bölümde incelenebilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Oküler yüzey palpebral konjonktiva, bulbar konjonktiva ve kornea1dahil olmak üzere bölgesel epitel sürekli bir levha oluşur. Birçok glandüler yapılar oküler yüzey epitel ile ilişkilidir ve birlikte kuruyan ve çevresel istilalar kornea yüzeyini koruyan gözyaşı film bir tabaka oluşturmak2. OS bozulması keratit yol açacak, konjonktivit veya her ikisi (keratokonjonktivit). Hem genetik faktörler hem de çevresel tahriş edici maddeler ya da etkileşimleri OS3,4'ünpatolojik değişikliklerine katkıda bulunur. Buna göre, insan işletim sistemi hastalık süreçlerini incelemek için çeşitli genetiği değiştirilmiş ve fiziksel veya kimyasal kaynaklı hayvan modelleri kullanılmıştır.

Fare işletim sistemi yapısı ve işlevi birçok yönden insanların ki benzer. Göz bezleri tarafından salgılanan gözyaşı filmi bileşenleri de fareler ve insanlar arasında benzer. Çalışmalar zenginliği insan işletim sistemihastalıklarınınmekanizmaları açıklığa kavuşturucu için fare modelleri kullanılarak yapılmıştır 5,6,7. Birçok durumda, aynı deneysel tedavi altında kapsamlı bilgi elde etmek için işletim sistemi yerel moleküler değişiklikler yerine küresel analiz etmek önemlidir. Bu nedenle, işletim sistemi her parçası aynı anda analiz edilmesini sağlamak için iyi bir bütünlük ile örnek hazırlanması gereklidir.

Fare OS sıkıca göz çukuru / yörünge (birkaç farklı kafatası kemikleri yapılmış kemikli bir fincan) gömülü ve ince bağ dokuları ile bağlanır göz küresi ile ilişkilendirir. Palpebral veya bulbar konjonktiva zarar vermeden tüm oküler yüzeyi diseksiyon için büyük zorluklar var. Bu zorluklar aşağıdakilerden kaynaklanır: (i) işletim sistemi yumuşak ve incedir ve fiziksel olarak ayrı ama taşınabilir göz kapakları ve göz küresi için yapıştırılmış, bu nedenle bozulma ve hasara karşı savunmasızdır; ve (ii) orbital kemikler ve göz küresi arasındaki sınırlı boşluk diseksiyon operasyonlarını kısıtlar. Zorluklar yetişkin fare için çok daha büyüktür. Embriyonik farede orbital kemik kemikleşme tamamlanmaz ve çevre dokular göreceli gevşek8. Baş çıkarılabilir ve ikiye bölünebilir ve daha sonra doğrudan paraformaldehit (PFA) fiksasyona tabi tutulabilir ve9. Buna karşılık, postnatal ve yetişkin fare orbital kemikleri tamamen kalın çevre dokuları ile kemiklenir, fiksatifpene daha az verimli hale. Ayrıca, orbital / kafatası kemikleri sert ve kırılgan, kolayca parafin gibi yumuşak katıştırma bileşikleri onları kesit zaman kırık. Kırık kemik parçaları oybirliğiyle inferior doku morfolojisi ile sonuçlanan yakındaki dokuları gözyaşı olacaktır.

Birçok yayınlanan çalışmalar genellikle kısmi oküler yüzey gösterdi, hangi kendi özel araştırma amaçları için yeterli olabilir10,11. Literatür brüt bir inceleme diseksiyon protokolleri12,13ayrıntılı açıklaması olmadan gösterilen tüm bozulmamış oküler yüzey gösteren sadece birkaç çalışma bulundu . Bu protokolde, orbital ve kafatası kemiklerinin düzenli olarak çıkarıldığı, göz küresi ve göz kapakları ile birlikte el değmemiş göz yüzeyinin bırakılarak fiziksel hasarları en aza indirdiği integral postnatal göz yüzeyini elde etmek için bir diseksiyon yöntemi ayrıntılı olarak incelenmiştir. Os histolojisini daha detaylı olarak inceledik ve bu protokol ile hazırlanan doku kesitlerini kullanarak immünohistokimya uyguladık.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Farelerin kullanımı ile ilgili tüm prosedürler Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, Zhongshan Oftalmic Merkezi tarafından onaylandı ve Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanımı için ARVO Bildirimi'ne bağlı.

1. Göz küresinin sağlam göz yüzeyi ve göz kapakları ile diseksiyonu

  1. Kafasını kes.
    1. Ötanazi sonrası gün 10 (P10) ve P28 fareler (fare suşları için Malzemeler Tablosu bakınız) servikal çıkış tarafından, keskin makas bir çift tarafından boyun kapalı baş kesti.
    2. Buruna interparietal kemik rostrally başlayan sagittal orta hat boyunca düz makas bir çift ile bisect baş (Şekil 1A,B).
      NOT: Kafatası kemiği fare yaşlanma ile sertleşir, mümkün olduğunca orta hat boyunca kesme makas tutmak için dikkatli olun.
    3. Temiz bir Petri kabına ikiye bölünmüş baş Her yarısı yerleştirin, çene ve dil ilk keskin makas kullanarak kesti. Optik kiazma yeri önce beyin keserek optik sinir serbest, ve kafatası duvarına bağlı koku ampul dahil olmak üzere tüm beyin dokuları kaldırın.
    4. Şimdi kalan dokular göz küresi ile ilişkili tüm kafatası / orbital kemikler e sahip olacaktır (Şekil 1C,D). Kan ve saç enkaz temizlemek için PBS ile kalan kısmı yıkayın.
    5. Oda sıcaklığında (RT) 50 mL konik tüpte %4 paraformaldehit (PFA, fosfat tamponlu salin [PBS], pH 7.4) ile önek dokular. Yaklaşık fiksasyon süresi aşağıdaki gibidir: ~10 dk P0 için P7; ~ 20 dk P8 p28 için; ve ~ 30 min P29 ve daha büyük için.
      NOT: Önekasyon, doku sertliği sunarak sonraki diseksiyonu kolaylaştırır. Ayrıca, önekasyon diseksiyon tamamlanmadan önce çok uzun süre taze doku unfixed bırakarak önler.
      DİkKAT: PFA tehlikelidir ve dikkatli kullanılmalıdır.
  2. Kafatası/orbital kemikleri çıkarın.
    1. Önekasyondan sonra, daha fazla diseksiyona devam etmek için kırık kılları ve fiksatifleri ortadan kaldırmak için pbs'de parçalanmış başı üç kez hızlıca yıkayın.
      DİkKAT: Diseksiyon sırasında fiksatiflere maruz kalmak sağlığa zararlı olabilir.
    2. 10 cm Petri çanak doku yerleştirin, Şekil 1D, Ebelirtilen düzlemler boyunca üç parçaya kafatası kesti. Soketteki göz küresi etmoid, frontal ve maksiller kemiklerin altında kafatasının orta kısmında gizlidir(Şekil 1D,E).
    3. Frontal ve maksiller kemikleri tamamen ortaya çıkarmak için etmoid kemiği soymak için 4 numaralı düz forceps iki çift kullanın(Şekil 1F).
    4. Coğrafi olarak kafatası yüzeyini (maksiller ve frontal kemikler dahil) 4 alana(Şekil 1F)bölün. Maksiller ve frontal kemikleri sırayla çıkarmak için eğri forceps ucunu yatay olarak her alana yerleştirin (Şekil 1F).
      NOT: Maksiller kemiklerin hepsi aynı anda çıkarılamaz. Sabırla parça parça inceleyin. Frontal kemik doğrudan yumuşak bağ dokuları aracılığıyla göz küresine bağlıdır. Göz küresini germeve konjonktivaya zarar vermesini önlemek için göz küresinden çıkarırken dikkatli olun.
    5. Kısmi maksiller kemik ve tüm frontal kemik çıkarıldıktan sonra altta yatan lakrimal ve jugal kemikler ortaya çıkar (Şekil 1G). İki kemiği ve göz küresini çevreleyen ilişkili deri altı kasları ve yağları çıkarın, doku hacmini azaltmak ve katıştırma yaparken dokuyu yönlendirmeyi kolaylaştırmak için ekli göz kapakları ve deri ile göz küresini küçük bir kare şeklinde ki bloğa bökmek (Şekil 1 H).
    6. Göz küresini ve ilişkili dokuları %4 PFA'ya geri yerleştirin ve gece boyunca 4 °C'de düzeltmeye devam edin. Sabit doku% 0.02 NaN3ilave si ile PBS 4 ° C en az bir ay boyunca korunabilir. Alternatif olarak, hemen histolojik analize geçin.
      NOT: Doku daha uzun süre saklanması gerekiyorsa, kolayca% 70 etanol saklanabilir.

2. Histolojik analiz

  1. Parafin kesiti ve hematoksilin ve eozin (H&E) boyama
    1. Parafin katıştırma ve kesit yapmak için başka bir yerde9 açıklanan standart protokolü izleyin.
  2. İmmünohistokimya (IHC)
    1. Parafin kesitlerini ksilen ile dewax ve alkol serileri ile rehidrat (100%, %95, %80) distile suya (dH2O).
    2. 0,01 M sitrik asit tampon (trisodyum sitrat 3 g, 0.4 g sitrik asit 1 L çift distile H2O) düşük güç (120 W) ile bir cam slayt kavanozda doku slaytları mikrodalga tedavi ile antijen alma gerçekleştirin. Enerji aralıklı olarak toplam 5-10 dakika boyunca her aralıkta yaklaşık 2 dakika sürmelidir.
      NOT: Yüksek güçlü mikrodalga veya tutarlı ısıtma slayt doku bölümlerinin ayrılmasına yol açacaktır.
    3. Cam kavanozdan slaytları seçin, yüz dokularını kullanarak her bölümü çevreleyen artık sıvıyı dikkatlice silin ve bir histoloji kutusundaki slayt rafına yerleştirin. Su geçirmez histolojik kalem ile her bölümün etrafında bir kare çizin. Her bir karenin üzerine 100 μL bloke tamponu (1x PBS'de %0,1 triton X-100 ve %10 eşek serumu) yerleştirin ve RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. Engelleme çözeltisini vakumla dikkatlice çıkarın, tamponu bloke ederek istenilen seyreltme ile birincil antikor (Malzemeler Tablosu'nabakın) ekleyin ve slaytları 4 °C'de 24 saat veya daha uzun süre kuluçkaya yatırmaya devam edin.
      NOT: IHC için kullanılan her birincil antikor için konsantrasyon değişir ve pilot deneylerde test edilmesi gerekir.
    5. Doku slaytlarını PBST ile yıkayın (PBS'de %0.1 Triton) her biri 10 dakika boyunca üç kez. İkincil antikor kullanarak adım 2.2.4 tekrarlayın (Malzeme Tablosubakınız) ile birlikte 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) engelleme tampon yerine. Oda sıcaklığında (RT) en az 4 saat veya daha uzun süre kuluçkaya yatın.
    6. Sekonder antikor çıkarın, PBST çözeltisi ile doku bölümleri üç kez yıkayın, her biri için 10 dakika, sonra başka bir 5 dakika için temiz PBS ile yıkayın.
    7. Doku kesitlerini çevreleyen pbs artıklarını silin, montaj ortamına sahip bölümlere kapak lar monte edin. Görüntü elde etmek için floresan mikroskopi yapın (Bkz. Malzemeler Tablosu).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Farklı bakış açılarından görüntülenen ana kafatası kemikleri Şekil 1A-E'de,farklı kemikleri gösteren renklerle gösterilmiştir. Diseksiyon süreçlerini göstermek için dört haftalık bir hayvan kullandık. Diseksiyon basamakları 1.1.1-1.1.3 ve kısa bir önekasyon (adım 1.1.4) sonra, ilişkili yüz kemikleri ile göz küresi Şekil 1E'degösterilmiştir. Anterior (nazal ve premaxillary) ve posterior (örneğin, parietal) yanı sıra etmoid kemikler göz küresi üzerinde ağırlıklı olarak maksiller ve frontal kemikler ile doku bloğu oluşturulan kaldırmak için daha fazla kırpma (Şekil 1F). Bu kemiklerin Şekil 1F'de belirtilen alanlara göre sıralı olarak çıkarılması altta yatan gözyaşı ve jugal kemiklerin yanı sıra Harderin bezine de(Şekil 1G). Göz küresine bağlı Harderin bezi bir dönüm noktası olarak hizmet(Şekil 1G),ve her zaman yerinde tutulmalıdır. Göz küresinin izolasyonu tüm kemiklerin ve çevresindeki yağ ların ve kas dokularının çıkarılmasıyla tamamlanmıştır(Şekil 1H).

Parafin katıştırma sonra, göz küresi kesitli ve H & E-lekeli. Temsili görüntüler Şekil 2'degösterilmiştir. Göz kapaklarının, kornea ve konjonktiva yüzeyinin göreceli bozulmamış konumları bir bölümde(Şekil 2A)görselleştirilmiştir ve bunların bir kısmı Şekil 2B,C'debüyütülmüştür. Lens morfolojisinin(Şekil 2A)sertliği ve kırılganlığı nedeniyle bakımı zordur. Bu diseksiyon yöntemini diğer postnatal yaşlara uyguladık ve P10 göz küresi bölümünün H&E histolojisi örneğini gösterdik(Şekil 3). Genel olarak, fare ne kadar gençse, göz küresi morfolojisi o kadar iyi korunur. Seri postnatal çağlardan immünosülpara parafin kesitleri Şekil 4'te, keratin 12 (K12) (Şekil 4A-F) ve keratin 14 (K14)(Şekil 4G-L) kornea ve tüm OS epiteli ile gösterilmiştir, Sıra -sıyla.

Figure 1
Şekil 1: 4 haftalık yetişkin faregöz küresi diseksiyonu İllüstrasyonu. (A-D) Kafatası kompozisyonunun şematik diyagramı sırasıyla üst (A), alt (B), lateral (C) ve orta düzlem (D) olarak gösterilmiştir. (A) ve (B)'deki kesik çizgiler iki ye küçülen düzlemleri gösterir. (E) 4 haftalıkken ikiye bölünmüş yarım kafatası tam olarak eşleşir (D). (F) (D) ve (E) iki enine düzlem arasında parçalanmış dokunun medial düzlem görünümü. Göz küresi (kesik li daire) esas olarak frontal (Fron) ve maksiller (Max) altında gömülü idi. Renkli kesik çizgiler coğrafi olarak ikiye bölünmüş düzlemi 4 alana böler ve kemikler sipariş e göre veya sayılara göre kabaca çıkarılır. Etmoid (Etoid) kemiğinin çıkarıldığını unutmayın. (G) Frontal kemik ve parsiyel maksiller alındıktan sonra Harderin bezi (Har) ve jugal (Jug) ve lakrimal (La) kemikleri açığa çıkarıldı. Daire kesik çizgileri göz küresi konumunu gösterir. (H) Diseksiyon tamamlandıktan sonra içeriden izole göz küresi izlenir. Ok optik sinir (On) işaret eder. E = Göz, Na = Burun, Pre = Premaxilla, Max = Maxillary, La = Lacrimal, Fron = Frontal, Ali = Alisfenoid, Sürahi = Jugal, Pal = Palatine, Ptery = Pterygoid, Squ = Squamosal, Par = Parietal, Eth = Etmoid. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Postnatal 4 haftalık dönemde oküler yüzey dokusunun H&E histolojisi. (A) Göz kapağı, konjonktiva ve kornea bir doku bölümünde görselleştirilmiştir. Kutulu alanlar sırasıyla (B) ve (C)'de büyütülmüştür. (B) Kornea epiteli, stroma ve endotel. (C) Kadeh hücreleri ile konjonktiva. ce = kornea epiteli, st = stroma, ed = endotel, gc = kadeh hücresi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Doğum sonrası 10. (A) P10'da bozulmamış göz küresi. Kutulu alanlar sırasıyla (B) ve (C)'de büyütülmüştür. (B) Kornea. (C) Konjonktiva. Ce = kornea epiteli, st = stroma, ed = endotel, cj = konjonktiva. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: P5'ten P15'e oküler yüzeyin immünboyla boyanması. Her panelde kare kutulu alan sağ olarak büyütüldü. (A-F) Keratin 12 özellikle kornea epitel (ok) ifade edildi. (G-L) Keratin 14 oküler yüzeyde ifade. ac = anterior oda, pc = palpebral konjonktiva. Bu rakam bir önceki yayın Guo veark. 14değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bozulmamış göz küresi hazırlanması için önemli bir hatırlatma tüm orbital kemiklertamamen kaldırılması gerektiğini, özellikle juga ve gözyaşı kemikleri, hangi küçük ve göz soketi alt yakınında bulunan. Geriye kalan kemikler, takip eden histolojiyi zorlaştırabilir. Küçük bir kemik parçasının kazara diseksiyondan tamamen çıkarılmaması durumunda, bir çift sharptweezers kullanılarak gömme parafin bloğundan seçilebilir. Geride kalan delik bu işlemden sonra erimiş parafin ile doldurulmalıdır.

Lensi kullanırken ek dikkatli olunmalıdır. Lens kırık parçaları genellikle tüm bölüm boyunca dağınık. Bu önemli ölçüde mikroskopi muayene ve görüntü analizi etkileyecektir. Lensi çıkarma girişimleri ya göz yüzeyine (operasyon yüz tarafından yapıldıysa) ya da retinaya (ameliyat retinanın optik disk tarafındaysa) zarar verir. Diseksiyonu zedeleme olmadan lens dokusunun varlığının olumsuz etkisini azaltmak için alternatif bir yol kesit yönünü değiştirmektir. Örneğin, oküler yüzey morfolojisini kurtarmak için, parafin bloğunun kesiti göz küresinin ön kısmından arkaya, aksi takdirde ters yönden yapılmalıdır.

PfA-sabit parafin bölümü için yapmak için yararlı bir not antijen alma genellikle k12 ve K14 antikorları kullanarak gibi immünboyama için gerekli olmasıdır. Ancak, antijen alımı arka plan boyama artan spesifik olmayan sinyaller üretecek birçok istisna vardır. Bu nedenle, bir antijen alma teknolojisi kullanırken dikkatli olmalı, ve pilot deneylerde antikorları test etmeli, mümkünse, önceden.

Genel olarak, kafatası / orbital kemiklerden göz küresi izolasyon için iki yöntem vardır: (i) doğrudan yüz tarafında göz küresi incelemek; ve (ii) göz küresi serbest bırakmak için iç kafatası / orbital kemikleri çıkarın. İlk yöntem için sorun göz küresi diseksiyon için arasında dar bir boşluk ile orbital soket içine derin lavabolar olduğunu. Ayrıca, hareketli göz küresi diseksiyon araçları dokunduğunda herhangi bir noktada konjonktiva epitel germek istiyorsunuz, kasıtsız hasarlar yaratarak. Buna karşılık, ikinci yöntem kafatası / orbital kemiklerin diseksiyonu ile başlar, hangi göz küresi ve ilişkili oküler yüzey dokusu daha uzak, böylece konjonktiva zarar riskini azaltarak. Ayrıca, diseksiyonlar yapmak için hiçbir mekansal daralma vardır. Büyük uyarılar alınırsa ilk yöntem işe yarayabilir olsa da, ikincisi kesinlikle daha kolay ve daha iyidir.

Özetle, fare göz küresinin ameliyat sonrası farelerden sağlam göz kapağı ve ilişkili göz yüzeyi ile izolasyonu için bir yöntem tanımladık. Açıklanan protokol, doğum sonrası farelerde göz küresinin bozulmamış göz kapağı ve ilişkili göz dokuları ile izole edilmesi için uygundur. Protokol özellikle işletim sistemi veya tüm oküler dokuların bütünlüğü gerektiğinde yararlıdır. Bu yöntemi, normal ve patolojik koşullarda OS'de keratin belirteçlerinin incelenmesi için doku örnekleri hazırlamak için kullandık. Bu tür preparatlardan elde edilen oküler dokuların, işletim sistemi'nin farklı bölgelerindeki bir proteinin diferansiyel düzenlemelerine tek bir bölümde bakmak için özellikle yararlı olduğu sonucuna varıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar makalenin eleştirel okuma için Prof Rong Ju teşekkür ve teknik yardım için tüm laboratuvar üyeleri. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (NSFC: 31571077; Pekin, Çin), Guangzhou Şehir Bilimleri ve Teknolojileri Yenilik Projesi (201707020009; Guangzhou, Guangdong Eyaleti, Çin), Sun Yat-sen Üniversitesi'nden "100 Kişi Planı"(8300-18821104; Guangzhou, Guangdong Eyaleti, Çin) ve Zhongshan Oftalmoloji Devlet Anahtar Laboratuvarı araştırma finansmanı (303060202400339; Guangzhou, Guangdong Eyaleti, Çin).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1× Phosphate buffered saline (PBS) Transgen Biotech FG701-01
50ml centrifuge tube Corning 430829
Adhesive microscope slides Various
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12379 Suggested concentration 1:500 - 1,000
Alexa Fluor 568 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12380 Suggested concentration 1:500 - 1,000
Anti-K12 antibody Abcam ab124975 Suggested concentration 1:1,000
Anti-K14 antibody Abcam ab7800 Suggested concentration 1:800
Citric acid Various
Cover slide Various
Curved forceps World Precision Instruments 14127
Dissecting microscope. Olmpus SZ61
Ethyl alcohol Various
Fluorescent Microscope Zeiss AxioImager.Z2
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech 0100-01
Micro dissecting scissors-straight blade World Precision Instruments 503242
Microwave ovens Galanz P70D20TL-D4
Mouse strains C57/BL6 and Sv129 mixed
No.4 straight forceps World Precision Instruments 501978-6
Normal Goat Serum Various
Paraformaldehyde (PFA) Various Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane
Tissue culture dish Various
Trisodium citrate Various
Triton X-100 Sigma-Aldrich SLBW6818

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
  2. Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
  3. Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
  4. Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
  5. Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15, (4), 713-722 (2017).
  6. Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
  7. Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18, (2), 168-180 (2016).
  8. Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54, (3), 267-278 (1991).
  9. Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22, (17), 4443-4454 (2003).
  10. Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22, (12), 2992-3003 (2003).
  11. Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178, (5), 2058-2065 (2011).
  12. Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140, (3), 594-605 (2013).
  13. McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141, (23), 4628-4639 (2014).
  14. Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).
Histolojik Muayene ve İmmünohistokimya için İntegral Göz Yüzey Dokusu Elde Etmek Için Bozulmamış Göz Küresinin İzolasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, D., Liu, C. Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (152), e60086, doi:10.3791/60086 (2019).More

Guo, D., Liu, C. Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (152), e60086, doi:10.3791/60086 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter