Summary
ここでは、市販の箸電極で使用できるプログラム可能な出力周波数を備えた安価なボルトアンペメーターを設定する方法を示します。
Abstract
経上皮/内皮電気抵抗(TEER)は、1980年代からインビトロバリアモデルシステムの合流性と透過性を決定するために使用されてきました。ほとんどの場合、箸電極は、細胞培養フィルター挿入システムの上下のコンパートメント間の電気インピーダンスを決定するために使用される。フィルター膜は細胞が密着し、偏光し、堅いジャンクションを造ることによって相互作用することを可能にする。この技術は、種々の異なる細胞株(例えば、血液脳関門の細胞、血脳脊髄液関門、または消化管および肺管)で説明されている。TEER測定装置は異なった実験室装置のサプライヤーから容易に得ることができる。しかし、適切なボルタンメーターが自己組み立てされている場合に想像できる、より費用対効果の高いカスタマイズ可能なソリューションがあります。この出版物の全体的な目的は、TEER測定のために市販の箸電極と使用することができるプログラム可能な出力周波数を持つ信頼性の高いデバイスを設定することです。
Introduction
上皮細胞と内皮細胞は細胞境界として機能し、身体の頂点と側側を分離します。それらがタイトな接点を介して接続されている場合、準細胞空間を通る受動物質拡散は1に制限され、選択的に透過性の障壁が形成される。いくつかの人工バリアシステムは、微小血管内皮細胞(HBMEC、血液脳関門3、4、5、6、7)、コロイド叢を用いて2を開発した。上皮細胞(HIBCPP/PCPEC、血脳脊髄液関門8,9,10,11,12,13,14)大腸腺癌細胞(Caco-2、消化器モデル15)、または気道/肺胞細胞株(肺モデル16、17)。これらのシステムは、通常、透過性膜上の単層(すなわち、フィルタ挿入システム)で増殖した細胞から成り立ち、頂点および側側へのアクセスを可能にする。モデル システムの整合性がインビボ条件と一致することが重要です。そこで、細胞層全体のトレーサー化合物の細胞細胞拡散を測定することにより、バリア機能を解析するいくつかの技術が開発されている。これらの物質には、放射性標識されたスクロース、色素ラベルアルブミン、FITCラベル付きイヌリン、または色素標識デクトランス2が含まれる。しかし、化学染料は、さらなる実験のために細胞を使用不能にすることができます。バリアシステムを非侵襲的に監視するために、細胞単層にわたっての経上皮/経体皮電気抵抗(TEER)の測定は、2、18、19を使用することができる。双極電極システムは電極電解質界面での電極偏光インピーダンスの影響を受けるため、四極値測定は一般にこの制限20を克服するために使用される。下敷き技術は、ウィリアム・トムソン(ケルビン卿)21によって1861年に最初に記述された4端子センシング(4T)です。簡単に言えば、電流は一対の電流を運ぶ電極によって注入され、2組の電圧感知電極は電圧降下20を測定するために使用される。今日、いわゆる箸電極は二重電極のペアから成り、それぞれ電圧を測定するための銀/塩化物ペレットと電流2を通過するための銀電極を含む。電気インピーダンスは、頂点と帯状部の間のセル層との間で測定される(図1)。通常12.5Hzの周波数での正方形波信号が外極に適用され、得られた交流電流(AC)が測定されます。さらに、細胞層全体の潜在的な低下は、第2(内部)電極ペアによって測定される。電気インピーダンスはオームの法則に従って計算されます。TEER 値は、インピーダンスとセル層の表面積を乗算することによって正規化され、通常 Ω ∙ cm2として表されます。
セルや電極をより洗練された方法で配置するシステムもありますが、4T測定原理に基づいており、同じ測定装置で使用できます。EndOhmシステムは、例えば、フィルタが挿入される中で、箸電極と同じ構造を有する同心円電極のペアを有するチャンバーおよびキャップを含有する。電極の形状は、膜を横切るより均一な電流密度の流れを可能にし、それによって読み取り値間のばらつきを減らします。さらに複雑な(しかし、より正確な)は、細胞層がリンガーの溶液22で満たされた2つのチャンバーを分離するUssing室である。チャンバ自体は、酸素、CO2、またはN2でガス化し、実験物質を攪拌または補充することができる。細胞層を横切るイオン輸送が起こると、組織の近くにある2つの電圧感知電極によって電位差を測定できます。この電圧は、セル層の隣に配置された2つの電流を運ぶ電極によって取り消されます。測定された電流は、次に正味イオン輸送を与え、バリアの完全性を反映する経上皮抵抗は、22を決定することができる。TEER測定はまたバリアティッシュモデル23、24を表すボディオンチップシステムに適用することができる。これらのシステムは、細胞の生体内条件を模倣し、多くの場合、層の上に積み重ねられたいくつかのタイプの細胞で構成されています。
次のプロトコルでは、市販の測定システムと比較して TEER に統計的に有意な差を生じさせない、プログラマブルな出力周波数を持つ費用対効果の高い信頼性の高いボルタンメーターを設定する方法について説明します。
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Protocol
1. TEER測定のための基本的なボルトアンペメーターのアセンブリ
- 5 V D.C.電源、USB 延長コード、プログラム可能な正方形波ジェネレータとして使用されるマイクロコントローラ、2 つの標準マルチメータとして標準の USB 充電器を準備し、電流と電圧をルート平均平方として測定できます(True-RMS)、バナナプラグ付き4本のケーブル、内側4本有線(6P4C)を備えた6本のピンを含むRJ14メスコネクタを備えた内線コード、2本の短いケーブル、光沢端子、120 kΩプリ抵抗器、ワイヤエンドフェルール、およびはんだ付けラグ。必要なツールは、絶縁ストリッパー、圧着ツール、およびはんだ付け鉄です。
- まず、USB拡張機能をマイクロコントローラボードに接続します。
- 2本の短いケーブルの端絶縁を取り除きます。ケーブルごとに片面をマイクロコントローラのピン0と2に直接、またははんだ付けラグに向けます。もう一方の端をワイヤエンドフェルールに圧着し、図 1に示すように光沢端子に接続します。
- バナナプラグをマルチメーターにリンクします。4 本のケーブルのもう一方の端を取り除き、圧着します。
- 内線コードを2枚切り、メスコネクタを含む側の導体を解体し、圧着します。導体とピンの連続性を確認します。
- 最初のマルチメータは、μAで電流を測定するために使用されます(ACモードを明示的に設定する必要があります)。箸電極の外側の電極ペアに対応するRJ14コネクタの5と6をピンに120 kΩプリ抵抗を持つシリーズで接続します。
- 最後に、mVにおける経上皮電圧降下を測定するために使用される第2のマルチメータをリンクし、光沢端子を介してRJ14コネクタの3および4をピンにし、箸電極の内部電極対に対応する。
- 必要に応じて、シャーシに取り付けます。
2. マイクロコントローラのプログラミング
- 必要に応じて、提供されたソース コード (補足コード ファイル 1) を変更します。指定された形式では、ピン 0 と 2 は、振動の 40 ミリ秒の半分の時間で地面と +5 V の間で交互になります。これにより、振幅5V、周波数約12.5Hzの正方形波信号が発生します。実際の値は、マイクロコントローラのタイムエミッタの精度が不正確なため、異なる場合があります。
- USBポートを介してデスクトップコンピュータにマイクロコントローラを接続し、一致するソフトウェア25でソースコードをアップロードします。
3. 電圧オシログラムの記録(オプション)
- 1 kΩテスト抵抗を備えたRJ14コネクタの5と6ピンをバイパスし、オシロスコープに接続します。
- 周波数、ピーク電圧、波形を確認します。データをデジタル化およびエクスポートします。
- 必要に応じて、比較のために参照装置(EVOM)と自己組み立てボルタンメータからオシログラムを記録します。
注:この場合、データはデジタル記憶域スコープHM 208で記録された。非常に基本的なデジタルオシロスコープである、画像は内部的にデジタル化(凍結)することができましたが、アナログPM 8143 X-Yレコーダーを使用してプロットする必要があります。その後、画像がスキャンされました。
4. 細胞培養とTEER測定
- 細胞培養フィルター上の種子ヒトコロイド叢パピローマ(HIBCPP)細胞は、10%の胎児子牛血清9を含有するDMEM/F12(材料の表を参照)で3μmの細孔サイズの挿入物を挿入する。Dinner etal.9. で説明したように、5% CO2を含む水飽和雰囲気で 37 °C で細胞を成長させる。
- フィルタが 70 Ω ∙ cm2のインピーダンスに達すると、血清フリーの DMEM/F12 に変更し、タイムポイントを 0 日目として定義します。
- 電極を自己組み立てボルタンメータのRJ14ポートに接続し、USB電源を差し込みます。マルチメータをそれぞれAC電圧モード(mV)とAC電流モード(μA)に設定します。
- または、電極を市販のリファレンスデバイスに接続し、製造元の指示に従って電源を入れます。
- 80%エタノールで電極を10分間殺菌し、別の10分間適切な培地で平衡化する。
- 測定値が一定になるまでHIBCPPセル層を含むセル培養フィルタ挿入システムの両方のコンパートメント(下部区画の電極の長い部分と上部のコンパートメントの短い部分)に電極を入れます。
- リファレンスデバイスの場合は、インピーダンスを直接メモするか、自己組み立てボルタンメータのオームの法則(R = U/I)に従ってインピーダンスを計算します。電極角度は測定に影響を与えます。
- 0 日目から 4 日目まで、TEER 測定 (手順 3-6) を繰り返します。
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Representative Results
自己組立ボルタンメーターの動作を市販のボルタンメーターと比較するために、両方のデバイスの電圧オシログラムを記録した。
図2Aに示すように、基準機器は、1 kΩテスト抵抗でオンロードを動作させる場合、12.5 Hzの周波数に相当する80mVの振幅と80ミリ秒の振動時間を持つ正方形波信号を生成しました。
対照的に、自己組立装置のマイクロコントローラは、プリ抵抗が設定されていない場合、電源電圧を5V(図2B)の振幅で正方形波信号に切り替えた。得られた電流はバリア機能を破壊し、細胞培養実験には適用されないことが明らかになった(データは示されていない)。さらに問題は、このセットアップでは1 kΩのテスト抵抗が電圧の低下を伴う過負荷を引き起こしたことです(図2B)。さらに、マイクロコントローラの有効発振時間は60ms(周波数=16.7Hz)であり、時間エミッタの不正確さのためにプログラムされた遅延時間とは異なっていた。120 kΩプリ抵抗器を取り付ける場合、振幅は40mVに減少し、細胞培養に適していました(図2C)。オシログラムに見られるように、信号対雑音比はかなり損なわれました(図2C)が顕著に測定に影響を与えなかった。
両方の装置を用い、人工血頭脳液関門のインピーダンスを決定した(図2Dに示す簡略回路図)。HIBCPP細胞を細胞培養フィルターインサートで培養し、TEERを6日間にわたって測定した:細胞を無血清状態に移動する1日前(-1)から、培地を変化させた後4日まで(4日目)。すべての測定は、同じ方法で調製された4つのHIBCPPフィルターを使用して四重化で行われました。リファレンス計測器と自己組み立てボルタンメータについても同様の値が得られました(図3)。測定は再現可能であり、標準偏差は同じ範囲内であった。TEER 値は 20-550 Ω ∙ cm2の範囲でした。0.33 cm2フィルターを使用すると、83−1,660 Ω の絶対インピーダンスに相当します。
図1:TEER測定のための基本的なボルトアンパーメータのレイアウト図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:オシログラムと測定のセットアップ。(A)市販のEVOM。(B)予備抵抗なしの自己組み立てボルタンメーター。(C)120 kΩプリ抵抗を備えた自己組み立てボルタンメーター。(D)測定設定の回路図。なお、C電極はバイポーラシステムを使用する場合にのみ電気回路に現れます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:細胞培養フィルター上のHIBCPP細胞層のTEER測定は、無血清培養培地(Day-1)に切り替える前に、切り替え日(0日目)、及び最大4日後(1−4日)に切り替える。誤差余数は、同じ方法で調製された4つのHIBCPPフィルタの標準偏差を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足的なコーディング ファイル 1. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足的なコーディングファイル 2. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足的なコーディングファイル 3. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
自作のボルタンメーターを毎日のルーチンで使用する前に、適切な機能のためにデバイスをチェックすることが不可欠です。我々の場合、40ミリ秒(12.5Hz)の振動の半分の時間がプログラムされましたが、有効振動時間は60ミリ秒(16.7 Hz)であることが判明しました。マイクロコントローラの時間エミッタのこの不正確さは、TEER測定に検出可能な影響を与えなかった。マルチメータのいずれかの周波数設定を使用して、実際の周波数を決定するのが最善の場合があります。偏差が見つかった場合は、それに応じてソースコードを調整できます。さらに、テスト抵抗またはその他の定義済みの設定が正しく再現可能な結果を与えるかどうかを確認することを強くお勧めします。人工細胞バリアシステムを使用する場合は、常に分子フラックスとインピーダンス測定を相関させるのが最善かもしれません。
この場合、適用電流は120kΩプリ抵抗を用いて制限された。一般的なTEER値が100 Ω−2,000 Ωの範囲であると仮定すると、セル層全体の電圧降下は4−83 mVと計算できます。1 kΩのTEERを試験抵抗でシミュレートし、結果として得られる潜在的な低下が40mVであることが確認されました(図2C)。
市販のデバイスは、多くの場合、プリ抵抗を切り替える測定範囲スイッチを提供し、出力電流を異なる値に制限します。この場合、異なるプリ抵抗を取り付けたり、抵抗器をポテンショメータに置き換えたりすることが可能です。
示されているセットアップは、TEER測定用の市販機器に代わる費用対効果の高い代替手段です。自己組み立てボルタンメータで測定した値は、広い範囲にわたって基準装置に匹敵した。標準偏差についても同じことが言える。正方形波信号のノイズは、特に測定に影響を与えなかった。このプロトコルは、限られた財源によって制限されている科学者や、低コストで予備実験を行いたい科学者をサポートできます。
さらに、マイクロコントローラは、異なる出力周波数に簡単にプログラムすることができます。これは、見かけのインピーダンスがR培地、RTEER、ならびに容量C細胞層26(図2D)からなるように有益でありうる。さらに、バイポーラ系を使用するとC電極が現れ、一方、電極偏光インピーダンスからの影響は四極系では減少する。これは、測定されたインピーダンスが低周波数でRTEERによって支配され、バイポーラシステムでは、電極の容量によって、高周波では、総インピーダンスが媒体26の抵抗に収束することを意味し、 27.その間に、インピーダンスはC細胞層の影響を受け、電気インピーダンス分光法28を使用してアクセス可能である。
2 つの (テストされていない) サンプル コードを提供して、デバイスをさまざまなアプリケーションに最適化または再プログラムする方法を示します。まず、12.5、500、5000 Hzの間で20秒間隔で出力周波数を交互に行うことで、非常に基本的なインピーダンス分光法を実現することができました(補足コーディングファイル2)。この場合、四極20、28またはバイポーラ27電極を使用することができる。適用された周波数は、ビルトインマルチメータ(またはマイクロコントローラに接続された任意のディスプレイまたはLED)によって表示することができます。第二に、このデバイスは、バッファとメディアの導電性を測定するために使用することができる。これは通常、1-110kHzの範囲で高周波の四極電極を使用して行われます。補足的なコーディングファイル3のコードには遅延時間が含まれず、(私たちのデバイスで)約70kHzの周波数を生成しました。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益やその他の利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、ヘルマン・リッジスマイヤーとマーヴィン・ベンデに、電気技術と情報学に関する専門家のアドバイスに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
References
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