Summary
Qui, dimostriamo come impostare un mitemetro a volt poco costoso con frequenza di uscita programmabile che può essere utilizzato con elettrodi bacchette disponibili in commercio per misurazioni transepiteliali/endoteliali di resistenza elettrica.
Abstract
La resistenza elettrica transeteliale/endoteliale (TEER) è stata utilizzata fin dagli anni '80 per determinare la confluenza e la permeabilità dei sistemi modello di barriera in vitro. Nella maggior parte dei casi, gli elettrodi delle bacchette vengono utilizzati per determinare l'impedimento elettrico tra il compartimento superiore e inferiore di un sistema di inserimento del filtro di coltura cellulare contenente monostrati cellulari. La membrana del filtro consente alle cellule di aderire, polarizzare e interagire costruendo giunzioni strette. Questa tecnica è stata descritta con una varietà di diverse linee cellulari (ad esempio, cellule della barriera emato-encefalica, barriera del liquido emato-cerebrospinale, o tratto gastrointestinale e polmonare). I dispositivi di misura TEER possono essere facilmente ottenuti da diversi fornitori di apparecchiature di laboratorio. Tuttavia, ci sono soluzioni più convenienti e personalizzabili immaginabili se un voltametro appropriato è auto-assemblato. L'obiettivo generale di questa pubblicazione è quello di creare un dispositivo affidabile con una frequenza di uscita programmabile che possa essere utilizzato con elettrodi di bacchetta disponibili in commercio per la misurazione TEER.
Introduction
Le cellule epiteliali ed endoteliali funzionano come confini cellulari, separando i lati apicali e basolaterali del corpo. Se sono collegati attraverso giunzioni strette, la diffusione passiva della sostanza attraverso gli spazi paracellulari è limitata1, con conseguente formazione di una barriera selettivamente permeabile. Diversi sistemi di barriera artificiale sono stati sviluppati2 utilizzando cellule endoteliali microvascolari (HBMEC, barriera emato-encefalica3,4,5,6,7), plexus coroide cellule epiteliali (HIBCPP/PCPEC, barriera del liquido emato-cerebrospinale8,9,10,11,12,13,14), cellule adenocarcinoma colorettali (Caco-2, modelli gastrointestinali15) o linee cellulari delle vie aeree/alveolari (modellipolmonari 16,17). Questi sistemi sono in genere costituiti da cellule coltivate in un monostrato su membrane permeabili (cioè sistemi di inserimento filtranti) per consentire l'accesso ai lati apicali e basolaterali. È importante che l'integrità del sistema modello corrisponda alle condizioni in vivo. Di conseguenza, sono state sviluppate diverse tecniche per analizzare la funzione della barriera misurando la diffusione paracellulare di composti tracciari in tutto lo strato cellulare. Queste sostanze includono saccarosio radioetichettato, albumina con etichettatura colorante, inulina etichettata FITC o dextrans2con etichettatura colorante. Tuttavia, i coloranti chimici possono rendere le cellule inutilizzabili per ulteriori esperimenti. Per monitorare in modo non invasivo i sistemi di barriera, è possibile utilizzare la misurazione della resistenza elettrica transepitelia/transendotiliale (TEER) su un mostrato cellulare2,18,19. Poiché i sistemi elettrodi bipolari sono influenzati dall'impedimento della polarizzazione degli elettrodi nell'interfaccia elettrodi-elettrolita, le misurazioni tetrapolari sono generalmente utilizzate per superare questa limitazione20. La tecnica di posa è un rilevamento a quattro terminali (4T) che è stato descritto per la prima volta nel 1861 da William Thomson (Lord Kelvin)21. In breve, la corrente viene iniettata da una coppia di elettrodi che trasportano corrente, mentre una seconda coppia di elettrodi di rilevamento della tensione viene utilizzata per misurare la caduta di tensione20. Al giorno d'oggi, i cosiddetti elettrodi di bacchetta consistono in un paio di doppi elettrodi, ciascuno contenente un pellet argento/argento-cloruro per misurare la tensione e un elettrodo d'argento per passare la corrente2. L'impementazione elettrica viene misurata tra il compartimento apicale e il compartimento basolaterale con lo strato di cella in mezzo (Figura 1). Un segnale d'onda quadra a una frequenza di typically 12,5 Hz viene applicato agli elettrodi esterni e la corrente alternata risultante (AC) misurata. Inoltre, la potenziale caduta nello strato cellulare viene misurata dalla seconda coppia di elettrodi (interni). L'impedimento elettrico viene quindi calcolato secondo la legge di Ohm. I valori di TEER sono normalizzati moltiplicando impedimento e superficie dello strato cellulare e sono in genere espressi come cm 2.
Ci sono sistemi in cui le cellule e gli elettrodi sono disposti in modo più sofisticato, ma sono anche basati sul principio di misurazione 4T e possono essere utilizzati con gli stessi dispositivi di misurazione. I sistemi EndOhm, ad esempio, in cui è inserito il filtro, contengono una camera e un cappuccio con un paio di elettrodi concentrici con la stessa struttura dell'elettrodo della bacchetta. La forma degli elettrodi consente un flusso di densità di corrente più uniforme attraverso la membrana, riducendo così la variazione tra le letture. Ancora più complessa (ma anche più precisa) è una camera Ussing, dove uno strato di cellule separa due camere piene di soluzione di Ringer22. La camera stessa può essere gassata con ossigeno, CO2o N2e mescolata o integrata con sostanze sperimentali. Quando si verifica il trasporto io-io attraverso lo strato cellulare, una differenza potenziale può essere misurata da due elettrodi di rilevamento della tensione vicino al tessuto. Questa tensione viene cancellata da due elettrodi che trasportano corrente posizionati accanto allo strato cellulare. La corrente misurata darà quindi il trasporto iollegrafico netto e la resistenza transeteliale, che riflette l'integrità della barriera, può essere determinata22. La misurazione TEER può essere applicata anche su sistemi body-on-a-chip che rappresentano modelli di tessuto di barriera23,24. Questi sistemi imitano le condizioni in vivo delle cellule e spesso consistono in diversi tipi di cellule, impilate l'una sull'altra in strati.
Il protocollo seguente spiega come impostare un misuratore di calcolo affidabile e conveniente con una frequenza di output programmabile che non produca differenze statisticamente significative nel TEER rispetto ai sistemi di misurazione disponibili in commercio.
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Protocol
1. Assemblaggio di un terrore di base per la misurazione TEER
- Preparare un caricabatterie USB standard come alimentatore 5 V D.C., un cavo di estensione USB, un microcontrollore che verrà utilizzato come un generatore di onde quadrate programmabile, due multimetri standard che sono in grado di misurare la corrente alternata e la tensione come radice media quadrata ( True-RMS), quattro cavi con spine di banana, un cavo di interno telefonico con un connettore femminile RJ14 tra cui sei pin con i quattro cavi interni (6P4C), due cavi corti, un terminale di lucentezza, un pre-resistor a 120 k, ferregole di chiusura del filo e anse di saldatura. Gli strumenti necessari sono una spogliarellista isolante, uno strumento di crimpatura e un ferro da saldatura.
- In primo luogo, collegare l'estensione USB alla scheda microcontroller.
- Rimuovere l'isolamento finale di due cavi corti. Solder un lato per cavo sia direttamente ai pin 0 e 2 del microcontrollore o alle anse di saldatura, che a loro volta sono ritagliate sui rispettivi pin. Crimare le altre estremità alle ferrulese di estremità del filo e collegarle a un terminale di lucentezza come illustrato nella Figura 1.
- Collegare i tappi di banana ai multimetri. Strisciare e crimpare l'altra estremità di ciascuno dei quattro cavi.
- Tagliare il cavo dell'interno telefonico in due pezzi e smontare e crimpare i conduttori del lato contenente il connettore femminile. Verificare la continuità dei conduttori e dei perni.
- Il primo multimetro verrà utilizzato per misurare la corrente in A (si noti che la modalità AC deve essere impostata in modo esplicito). Collegarlo in una serie con un pre-resistor a 120 k' pre-resistor a pin cinque e sei del connettore RJ14, corrispondente alla coppia di elettrodi esterna dell'elettrodo della bacchetta.
- Infine, collegare il secondo multimetro, che verrà utilizzato per misurare il calo di tensione transepiteliale in mV, attraverso il terminale di lucentezza per i pin tre e quattro del connettore RJ14, corrispondente alla coppia interna di elettrodi dell'elettrodo della bacchetta.
- Se lo si desidera, montare l'installazione in uno chassis.
2. Programmazione del microcontrollore
- Modificare il codice sorgente fornito (file di codifica supplementare 1) in base alle esigenze. Nella forma data, i perni 0 e 2 si alterneranno tra terra e 5 V con 40 ms a metà tempo di oscillazione. Pertanto, verrà generato un segnale di onda quadra con un'ampiezza di 5 V e una frequenza di circa 12,5 Hz. I valori reali possono differire a causa dell'imprecisione dell'emettitore di tempo del microcontrollore.
- Collegare il microcontrollore a un computer desktop tramite una porta USB e caricare il codice sorgente con il software corrispondente25.
3. Registrazione degli oscillogrammi di tensione (opzionale)
- Ignorare i perni cinque e sei del connettore RJ14 con un resistore di prova da 1 k e connettersi a un oscilloscopio.
- Verificare la frequenza, la tensione di picco e la forma d'onda. Digitalizzare ed esportare i dati.
- Se lo si desidera, registrare gli oscillogrammi da un dispositivo di riferimento (EVOM) e il voltametro auto-assemblato per il confronto.
NOTA: In questo caso, i dati sono stati registrati con un digital Storage Scope HM 208. Essendo un oscilloscopio digitale molto semplice, l'immagine poteva essere digitalizzata internamente (congelato), ma doveva essere tracciata utilizzando un registratore analogico PM 8143 X-Y. L'immagine è stata successivamente acquisita.
4. Coltivazione cellulare e misurazione TEER
- Seed Human Choroid Plexus Papilloma (HIBCPP) cellule sulla coltura cellulare filtrano inserti con una dimensione del poro di 3 m in DMEM/F12 (vedi Tabella dei materiali) contenenti 10% siero di vitello fetale9. Far crescere le cellule a 37 gradi centigradi in un'atmosfera satura d'acqua contenente il 5% di CO2 come descritto da Dinner et al.9.
- Quando i filtri raggiungono un impedimento di 70 cm2, passare a DMEM/F12 senza siero e definire il timepoint come Giorno 0.
- Collegare l'elettrodo alla porta RJ14 del voltametrio di voltametro autoassemblato e collegare l'alimentatore USB. Impostare i multimetri rispettivamente sulla modalità di tensione AC (mV) e sulla modalità di corrente AC (A).
- In alternativa, collegare l'elettrodo a un dispositivo di riferimento disponibile in commercio e accenderlo secondo le istruzioni del produttore.
- Sterilizzare l'elettrodo nell'80% di etanolo per 10 mequilibrat e sistemare il mezzo appropriato per altri 10 min.
- Mettere l'elettrodo in entrambi i compartimenti di un sistema di inserto del filtro di coltura cellulare (la parte più lunga dell'elettrodo nel compartimento inferiore e la parte più corta nel compartimento superiore) contenente uno strato di cella HIBCPP fino a quando i valori di misurazione rimangono costanti.
- Per un dispositivo di riferimento, notare l'impedimento diretto o calcolare l'impedimento secondo la legge di Ohm (R - U/I) per il voltametro auto-assemblato. Tenere presente che l'angolo dell'elettrodo influisce sulle misurazioni.
- Ripetere la misura TEER (passaggi 3-6) dal giorno 0 al giorno 4.
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Representative Results
Per confrontare il funzionamento di un voltametro auto-assemblato con la sua controparte disponibile in commercio, è stato registrato un oscillogramma di tensione di entrambi i dispositivi.
Come mostrato nella Figura 2A, lo strumento di riferimento ha generato un segnale di onda quadra con un'ampiezza di 80 mV e un tempo di oscillazione di 80 ms, che corrisponde a una frequenza di 12,5 Hz, quando si opera a carico con un test resistor di 1 k.
Al contrario, il microcontrollore del dispositivo auto-assemblato ha commutato la tensione di alimentazione in un segnale di onda quadra con un'ampiezza di 5 V (Figura 2B) se non è stato impostato alcun pre-reresistor. È diventato evidente che la corrente risultante distrugge qualsiasi funzione di barriera e non è applicabile per gli esperimenti di coltura cellulare (dati non mostrati). Un altro problema è che, in questa configurazione un test resistore 1 k , ha causato un sovraccarico con un conseguente declino di tensione (Figura 2B). Inoltre, il tempo di oscillazione effettivo del microcontrollore era di 60 ms (frequenza - 16,7 Hz) e quindi differiva dal tempo di ritardo programmato a causa dell'imprecisione dell'emettitore di tempo. Se è stato installato un preresistor di 120 k, l'ampiezza è diminuita ad un valore di 40 mV, che era adatto per lacolturacellulare ( Figura 2C). Come si è visto nell'oscillogramma, il rapporto segnale-rumore è stato notevolmente alterato (Figura 2C) ma non ha influenzato notevolmente le misurazioni.
Entrambi i dispositivi sono stati utilizzati per determinare l'impedimento di una barriera fluida artificiale sangue-cerebrospinale (diagramma a circuito semplificato mostrato nella Figura 2D). Le cellule HIBCPP sono state coltivate con inserti di filtro per coltura cellulare e TEER è stato misurato in 6 giorni: a partire da un giorno prima che le cellule venissero spostate in condizioni prive di siero (Giorno -1) e fino a 4 giorni dopo aver cambiato il mezzo (Giorno 4). Tutte le misurazioni sono state effettuate in quadruplicati utilizzando quattro filtri HIBCPP preparati nello stesso modo. Valori simili sono stati ottenuti per lo strumento di riferimento e il voltametro auto-assemblato (Figura 3). Le misurazioni erano riproducibili e le deviazioni standard erano all'interno dello stesso intervallo. I valori di TEER variavano a partire da 20-550 , cm 2. Utilizzando filtri di 0,33 cm2, questo equivale ad un'impedibile assoluta di 83,1660 gradi.
Figura 1: Diagramma di layout di un modificatore volt-amperemetro di base per la misurazione TEER. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Oscillogrammi e impostazione della misura. (A) EVOM disponibile in commercio. (B) Voltametrio auto-assemblato senza pre-resistore. (C) Voltametrio auto-assemblato con 120 k pre-resistor. (D) Diagramma del circuito di impostazione delle misurazioni. Si noti chel'elettrodo C appare nei circuiti elettrici solo quando si utilizzano sistemi bipolari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: misurazioni TEER dei livelli di cella HIBCPP sulla coltura cellulare che vengono inserite prima di passare al supporto di coltura senza siero (giorno -1), il giorno della commutazione (Giorno 0) e fino a 4 giorni dopo (Giorni 1 -4). Le barre di errore indicano la deviazione standard dei quattro filtri HIBCPP preparati nello stesso modo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File di codifica supplementare 1. Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 2. Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 3. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Prima che un voltametro autoprodotto possa essere utilizzato in una routine quotidiana, è essenziale controllare il dispositivo per il corretto funzionamento. Nel nostro caso, un mezzo tempo di oscillazione di 40 ms (12,5 Hz) è stato programmato, ma il tempo di oscillazione effettivo si è rivelato essere 60 ms (16,7 Hz). Questa imprecisione dell'emettitore di tempo del microcontrollore non ha avuto alcun impatto rilevabile sulle misurazioni TEER. Potrebbe essere meglio determinare la frequenza effettiva utilizzando l'impostazione di frequenza di uno dei multimetri. Se viene rilevata una deviazione, il codice sorgente può essere regolato di conseguenza. Inoltre, si consiglia vivamente di verificare se un resistore di prova o altre configurazioni definite danno risultati corretti e riproducibili. Se si lavora con sistemi di barriera cellulare artificiale, potrebbe essere meglio correlare sempre il flusso molecolare con la misurazione dell'impedimento.
In questo caso, la corrente applicata è stata limitata utilizzando un pre-resistor 120 k. Supponendo che i valori tipici di TEER siano compresi tra 100 , la caduta di tensione attraverso lo strato cellulare può essere calcolata a 4x83 mV. Un TEER di 1 kè è stato simulato da un resistore di prova e la conseguente caduta potenziale è stata confermata per essere 40 mV (Figura 2C).
I dispositivi disponibili in commercio spesso forniscono un interruttore dell'intervallo di misurazione per attivare/disattivare il pre-resistore e quindi limitare la corrente di uscita a valori diversi. In questo caso, è possibile installare diversi pre-resistori o anche sostituire il resistore con un potenziatore.
L'impostazione illustrata rappresenta un'alternativa conveniente agli strumenti disponibili in commercio per la misurazione TEER. I valori che sono stati misurati con il voltametro auto-assemblato erano paragonabili al dispositivo di riferimento su un'ampia gamma. Lo stesso vale per le deviazioni standard. Il rumore nel segnale dell'onda quadra non ha influenzato in modo particolare le misurazioni. Il protocollo può supportare gli scienziati che sono limitati da risorse finanziarie limitate o che vogliono eseguire esperimenti preliminari a basso costo.
Inoltre, il microcontrollore può essere facilmente programmato a diverse frequenze di uscita. Questo può essere utile, in quanto l'apparente impedimento è costituito da Rmedio, RTEER, così come la capacità Ccella livello26 (Figura 2D). Inoltre,l'elettrodo C appare se si utilizzano sistemi bipolari, mentre l'influenza dell'impedimento di polarizzazione degli elettrodi è ridotta nei sistemi tetrapolari. Ciò significa che l'impedimento misurato sarà dominato da RTEER a basse frequenze e, nei sistemi bipolari, dalla capacità degli elettrodi, mentre ad alte frequenze l'impedimento totale converge alla resistenza del mezzo26, 27. Nel mezzo, l'impedimenti è influenzato dallostrato di celluleC , che è quindi accessibile utilizzando la spettroscopia di impeditura elettrica28.
Forniamo due codici di esempio (non testati) per dare un'idea di come il dispositivo potrebbe essere ottimizzato o riprogrammato per diverse applicazioni. In primo luogo, una spettroscopia impedibile molto semplice potrebbe essere realizzata alternando la frequenza di uscita in intervalli di 20 secondi tra 12,5, 500 e 5000 Hz (file di codifica supplementare 2). In questo caso, potrebbe essere utilizzato un elettrodo tetrapolare20,28 obipolare 27. La frequenza applicata potrebbe essere indicata dal multimetro di compilazione (o da qualsiasi display o LED collegato al microcontrollore). In secondo luogo, il dispositivo potrebbe essere utilizzato per misurare la conduttività di buffer e supporti. Questo viene in genere fatto utilizzando elettrodi tetrapolari con alte frequenze in una gamma di 1-110kHz. Il codice nel file di codifica supplementare 3 non contiene tempi di ritardo e (con il nostro dispositivo) generato una frequenza di circa 70kHz.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Herman Liggesmeyer e Marvin Bende per la loro consulenza di esperti in elettrotecnica e informatica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
References
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