Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

使用具有可编程输出频率的自制伏特安度计执行 TEER 测量的简单方法

doi: 10.3791/60087 Published: October 5, 2019

Summary

在这里,我们演示如何设置具有可编程输出频率的廉价伏特安度计,该仪表可与市售的筷子电极一起使用,用于跨皮/内皮电阻测量。

Abstract

自 20 世纪 80 年代以来,一直使用过皮/内皮电阻 (TEER) 来确定体外屏障模型系统的汇合性和渗透性。在大多数情况下,筷子电极用于确定包含蜂窝单层的细胞培养过滤器插入系统的上腔和下腔之间的电阻抗。过滤膜允许细胞通过建立紧密的结点粘附、极化和相互作用。该技术已被描述与各种不同的细胞系(例如,血脑屏障的细胞,血脑脊液屏障,或胃肠道和肺肠道)。TEER 测量设备可以从不同的实验室设备供应商处轻松获得。但是,如果适当的电压计是自行组装的,则有更具成本效益和可定制的解决方案。本出版物的总体目标是建立一个可靠的具有可编程输出频率的器件,该器件可与市售的筷子电极一起使用,用于 TEER 测量。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

上皮细胞和内皮细胞作为细胞边界发挥作用,分离身体的表皮和巴索侧。如果它们通过紧密的交汇点连接,则通过副细胞空间的被动物质扩散受到限制1,从而形成选择性渗透屏障。几个人工屏障系统已经开发了2使用微血管内皮细胞(HBMEC,血脑屏障3,4,5,6,7),乔体丛上皮细胞(HIBCPP/PCPEC,血脑脊液屏障8,9,10,11,12,13,14),结肠直肠腺癌细胞(Caco-2,胃肠道模型15),或气道/肺泡细胞系(肺模型16,17)。这些系统通常由在可渗透膜上的单层生长的细胞组成(即过滤器插入系统),以便进入锥形和双侧侧。模型系统的完整性与体内条件相匹配非常重要。因此,通过测量示踪化合物在细胞层中的准细胞扩散来分析阻物功能。这些物质包括放射性标记蔗糖,染料标记的白蛋白,FITC标记的inulin,或染料标记的德克斯特兰2。然而,化学染料会使细胞无法用于进一步的实验。为了非侵入性地监测屏障系统,可以使用2、18、19测量跨皮层/跨体电阻(TEER)。由于双极电极系统受电极-电解质接口处电极极化阻抗的影响,通常使用四极测量来克服这一限制20。底铺设技术是一个四端传感(4T),最早由威廉汤姆森(主开尔文)21在1861年描述。简而言之,电流由一对载流电极注入,而第二对电压感应电极用于测量电压降20。如今,所谓的筷子电极由一对双电极组成,每个电极都含有用于测量电压的银/氯化银颗粒和用于通过电流2的银电极。电阻抗测量在锥形和双侧隔间之间,细胞层介于两者之间(图1)。在外部电极上应用频率为 12.5 Hz 的方波信号,并测量由此产生的交流电 (AC)。此外,通过第二个(内部)电极对测量整个细胞层的电位下降。然后根据欧姆定律计算电阻抗。TEER 值通过乘以阻抗和细胞层表面积进行归化,通常表示为±+ cm2

在有些系统中,电池和电极的排列方式更为复杂,但也基于 4T 测量原理,可与相同的测量设备一起使用。例如,插入过滤器的 EndOhm 系统包含一个腔室和盖,其同心电极与筷子电极的结构相同。电极的形状允许更均匀的电流密度流过膜,从而减少读数之间的变化。更复杂的(但也更准确)是一个Using室,其中一个细胞层分隔两个腔室充满了Ringer的溶液22。腔室本身可以用氧气、CO2或N2气体,并搅拌或补充实验物质。当发生穿过细胞层的电离传输时,可以通过组织附近的两个电压感应电极来测量电位差。此电压由放置在电池层旁边的两个带电电极消除。测量电流然后给出净电位传输和透皮电阻,这反映了屏障的完整性,可以确定22。TEER测量也可以应用于代表屏障组织模型23、24的片上体系统。这些系统模仿细胞的体内条件,通常由几种类型的细胞组成,它们相互堆叠在一层之上。

以下协议说明了如何设置具有可编程输出频率的具有经济高效且可靠的伏特表,与市售的测量系统相比,TEER 在 TEER 中不会产生统计显著性差异。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 用于 TEER 测量的基本伏安度计组装

  1. 准备一个标准的USB充电器作为5V D.C.电源,USB延长线,微控制器,将用作可编程方波发生器,两个标准万用表,能够测量交流电和电压作为根平均平方(True-RMS),四根带香蕉插头的电缆、带 RJ14 母连接器的电话延长线,包括六根带内四根有线 (6P4C) 的引脚、两条短电缆、一个光泽端子、一个 120 kΩ 预电阻器、线端铁圈和焊接凸耳。所需的工具包括绝缘剥离器、压接工具和焊接熨斗。
  2. 首先,将 USB 扩展连接到微控制器板。
  3. 剥去两条短电缆的端绝缘。每根电缆的焊条一面直接焊接到微控制器的引脚 0 和 2 或焊接凸耳,这些凸耳又被夹在相应的引脚上。将其他端压到导线端套圈,并将其连接到光泽端子,如图1所示。
  4. 将香蕉插头连接到万用表。剥去并压接四根电缆的另一端。
  5. 将电话延长线切成两块,并拆除并压接包含母连接器的侧面导线。检查导线和针脚的连续性。
  6. 第一个万用表将用于测量 μA 的电流(请注意,必须显式设置交流模式)。使用 120 kΩ 预电阻器将其串联到 RJ14 连接器的 5 个和 6 引脚上,对应于筷子电极的外电极对。
  7. 最后,通过光泽端子将第二个万用表连接到RJ14连接器的引脚3和4,与筷子电极的内部电极对相对应,该万用表将用于测量mV的透皮电压降。
  8. 如果需要,请将安装安装安装到机箱中。

2. 微控制器编程

  1. 根据需要修改提供的源代码(补充编码文件 1)。在给定形式中,引脚 0 和 2 将在接地和 +5 V 之间交替,振荡为 40 ms 的半时间。因此,将生成振幅为 5 V 且频率约为 12.5 Hz 的方波信号。由于微控制器的时间发射器不准确,实际值可能会有所不同。
  2. 通过USB端口将微控制器连接到台式计算机,并上传具有匹配软件25的源代码。

3. 电压示波线记录(可选)

  1. 带 1 kΩ 测试电阻的 RJ14 连接器的 5 个和 6 个旁路引脚,并连接到示波器。
  2. 检查频率、峰值电压和波形。数字化和导出数据。
  3. 如果需要,从参考设备 (EVOM) 和自组装的伏特表记录示波图进行比较。
    注: 在这种情况下,数据记录与数字存储范围 HM 208。图像是一个非常基本的数字示波器,可以在内部数字化(冻结),但必须使用模拟PM 8143 X-Y录像机进行绘制。随后对图像进行扫描。

4. 细胞培养和TEER测量

  1. 种子人类丘雷普丘帕氏菌(HIBCPP)细胞在细胞培养过滤器插入与孔径3μm在DMEM/F12(见材料表)含有10%胎儿小牛血清9。如Dinner等人9所述,在含有5%CO2的水饱和环境中在37°C下生长细胞。
  2. 当滤波器达到 70 Ω + cm2的阻抗时,将更改为无血清 DMEM/F12 并将时间点定义为第 0 天。
  3. 将电极连接到自组装伏特的 RJ14 端口,然后插入 USB 电源。将万用表分别设置为交流电压模式 (mV) 和交流电流模式 (μA)。
    1. 或者,将电极连接到市售的参考设备,然后根据制造商的说明打开。
  4. 在80%乙醇中消毒电极10分钟,在适当的介质中再平衡10分钟。
  5. 将电极放在细胞培养过滤器插入系统的两个隔间中(电极在下舱中的较长部分和上腔室中较短的部分),其中包含一个 HIBCPP 单元层,直到测量值保持不变。
  6. 对于参考设备,直接记下阻抗或根据欧姆定律 (R = U/I) 计算自组装伏特的阻抗。请注意,电极角度会影响测量值。
  7. 从第 0 天到第 4 天重复 TEER 测量(步骤 3⁄6)。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

为了比较自组装的电压计与市售的电压表的运行情况,记录了两个器件的电压示波器。

如图2 A所示,当使用1 kΩ测试电阻器进行负载工作时,参考仪器生成了振幅为80 mV、振荡时间为80 ms的方波信号,相当于12.5 Hz的频率。

相反,如果没有设置预电阻器,自组装器件的微控制器将电源电压切换到振幅为5 V的方波信号(图2B)。很明显,产生的电流会破坏任何阻隔功能,并且不适用于细胞培养实验(未显示数据)。另一个问题是,在此设置中,1 kΩ 测试电阻导致过载导致电压下降(图 2B)。此外,微控制器的有效振荡时间是60 ms(频率 = 16.7 Hz),因此由于时间发射器的不准确,与编程的延迟时间不同。如果安装了 120 kΩ 预阻器,则振幅降至 40 mV,这适用于细胞培养(图2C)。如示波图所示,信噪比受到很大影响(图2C),但不会对测量产生明显影响。

两种器件都用于确定人工血脑脊液屏障的阻抗(图2D所示的简化电路图)。在细胞培养过滤器插入物上培养HIBCPP细胞,TEER在6天内进行测量:在细胞移动到无血清条件(第1天)前一天开始,在更换培养基后4天(第4天)开始。所有测量均采用四次测量,使用四个以相同方式制备的 HIBCPP 滤波器。参考仪器和自组装伏特表的数值相似(图3)。测量是可重复的,标准偏差在相同的范围内。TEER 值范围为 20~550 Ω + cm2。使用 0.33 cm2滤波器,这相当于 83×1,660 Ω 的绝对阻抗。

Figure 1
图1:用于TEER测量的基本伏安仪的布局图。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:振荡图和测量设置。A) 商用 EVOM.(B) 无预电阻器的自组装伏特计。(C) 带 120 kΩ 预电阻器的自组装伏特计。(D) 测量设置电路图.请注意,C电极仅在使用双极系统时出现在电路中。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:在切换到无血清培养基(第-1天)、切换日(第0天)和切换后4天(第1⁄4天)之前,对细胞培养过滤器插入的HIBCPP细胞层进行TEER测量。误差条指示以相同方式制备的四个 HIBCPP 滤波器的标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。

补充编码文件 1。 请点击此处下载此文件。

补充编码文件2。 请点击此处下载此文件。

补充编码文件 3. 请点击此处下载此文件。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

在自制伏特计可用于日常操作之前,必须检查设备是否正常工作。在我们的例子中,40 ms(12.5 Hz)的半时振荡被编程,但有效振荡时间的结果是60 ms (16.7 Hz)。微控制器时间发射器的这种不准确对TEER测量没有可检测的影响。最好使用万用表之一的频率设置来确定实际频率。如果发现任何偏差,可以相应地调整源代码。此外,强烈建议检查测试电阻器或其他定义的设置是否提供正确且可重现的结果。如果使用人工细胞屏障系统,最好始终将分子通量与阻抗测量相关联。

在这种情况下,使用 120 kΩ 预电阻器限制应用电流。假设典型的 TEER 值范围为 100 Ω ±2,000 Ω,则整个单元层的电压降可以计算出为 4~83 mV。测试电阻器模拟了1 kΩ的TEER,结果电位下降被确认为40 mV(图2C)。

商用器件通常提供测量范围开关来切换预电阻器,从而将输出电流限制在不同的值。在这种情况下,安装不同的预电阻器甚至用电位计替换电阻器是可行的。

所示的设置是商用 TEER 测量仪器的一种经济高效的替代方案。使用自组装的伏特计测量的值在广泛的范围内与参考设备相当。标准偏差也是如此。方波信号中的噪声对测量没有显著影响。该协议可以支持那些受到有限财政资源限制或希望以低成本进行初步实验的科学家。

此外,微控制器可以轻松编程为不同的输出频率。这可能是有益的,因为表面阻抗由R介质、RTEER以及容量C单元层26(图2D)组成。此外,如果使用双极系统,则会出现 C电极,而四极系统中电极极化阻抗的影响减小。这意味着测量的阻抗将在低频下由 RTEER控制,在双极系统中,由电极的容量控制,而在高频时,总阻抗将收敛到介质26电阻。 27.其间,阻抗受C单元层影响,因此可通过电阻抗光谱28进行访问。

我们提供两个(未经测试)的示例代码,以了解如何针对不同的应用优化或重新编程设备。首先,通过在 12.5、500 和 5000 Hz 之间以 20 秒的间隔交替输出频率(补充编码文件 2),可以实现非常基本的阻抗光谱。在这种情况下,可以使用四极20、28或双极27电极。应用频率可以通过内置万用表(或连接到微控制器的任何显示器或 LED)显示。其次,该器件可用于测量缓冲液和介质的电导率。这通常是使用高频率在 1-110kHz 范围内的四极电极完成的。补充编码文件 3 中的代码不包含延迟时间,并且(使用我们的设备)生成的频率约为 70kHz。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

提交人没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。

Acknowledgments

作者要感谢赫尔曼·利格斯迈尔和马文·本德在电工和信息学方面的专家建议。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
120 kOhm resistor General (generic) equipment
Banana plug cables General (generic) equipment
Cables General (generic) equipment
Chopstick electrode Merck Millicell MERSSTX01
Chopstick electrode (alternative) WPI World Precision Instruments STX2
Crimping tool General tool
Digispark / ATtiny85 AZ-Delivery Vertriebs GmbH Digispark Rev.3 Kickstarter
DMEM:F12 Gibco (Thermo Fisher) 31330038
Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10270106
Filter inserts 3µm translucent Greiner Bioone 662631
HIBCPP Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten
Insulation stripper General tool
Luster terminal General (generic) equipment
Oscilloscope HAMEG Digital Storage Scope HM 208
Plotter PHILIPS PM 8143 X-Y recorder
Software Arduino https://www.arduino.cc Arduino 1.8.9
Soldering iron General tool
Soldering lugs General (generic) equipment
Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector General (generic) equipment
Test resistor Merck Millicell MERSSTX04
True-RMS multimeters VOLTCRAFT VC185
USB charger General (generic) equipment
USB extension cord General (generic) equipment
Voltohmmeter for TEER measurement WPI World Precision Instruments EVOM
Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) Merck Millicell ERS
Wire end ferrules General (generic) equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
  2. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
  3. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).
  4. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).
  5. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  6. Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).
  7. Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).
  8. Ishiwata, I., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP). Human Cell. 18, 67-72 (2005).
  9. Dinner, S., et al. A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side. Journal of Visualized Experiments. (2016).
  10. Schwerk, C., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PLoS One. 7, e30069 (2012).
  11. Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).
  12. Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).
  13. Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes. Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).
  14. Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).
  15. Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).
  16. Mathia, N. R., et al. Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats. Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).
  17. Fuchs, S., et al. Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C. Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).
  18. Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).
  19. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
  20. Yeste, J., et al. Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures. Journal of Physics D Applied Physics. 49, (37), 3754 (2016).
  21. Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. Methods of Measuring Electrical Resistance. McGraw-Hill. 100-131 (1912).
  22. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, (Suppl 2), 123-126 (2004).
  23. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).
  24. Esch, M. B., et al. On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic 'body-on-a-chip' devices. Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).
  25. Arduino IDE. Arduino Web Editor. https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019).
  26. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5 (2013).
  27. Hufnagl, M. Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. University of Vienna. (2010).
  28. Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. Dössel, O., Schlegel, W. C. 25/7, Springer. Berlin, Heidelberg. (2009).
使用具有可编程输出频率的自制伏特安度计执行 TEER 测量的简单方法
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Theile, M., Wiora, L., Russ, D., Reuter, J., Ishikawa, H., Schwerk, C., Schroten, H., Mogk, S. A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency. J. Vis. Exp. (152), e60087, doi:10.3791/60087 (2019).More

Theile, M., Wiora, L., Russ, D., Reuter, J., Ishikawa, H., Schwerk, C., Schroten, H., Mogk, S. A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency. J. Vis. Exp. (152), e60087, doi:10.3791/60087 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter