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Biology

Uma aproximação simples para executar medidas de TEER usando um volt-AMPEREMETER self-made com freqüência programável da saída

doi: 10.3791/60087 Published: October 5, 2019

Summary

Aqui, demonstramos como configurar um volt-AMPEREMETER barato com frequência de saída programável que pode ser usado com eletrodos de pauzinho disponíveis comercialmente para medições de resistência elétrica transepielial/endotelial.

Abstract

A resistência elétrica transepielial/endotelial (TEER) tem sido utilizada desde a década de 1980 para determinar a confluência e a permeabilidade dos sistemas de barreira in vitro. Na maioria dos casos, os elétrodos do chopstick são usados para determinar a impedância elétrica entre o compartimento superior e mais baixo de um sistema da inserção do filtro da cultura da pilha que contem monolayers celulares. A membrana do filtro permite que as células aderem, polarizar e interagir construindo junções apertadas. Esta técnica foi descrita com uma variedade de linhas de pilha diferentes (por exemplo, pilhas da barreira do sangue-cérebro, da barreira sangue-cerebrospinal do líquido, ou do intervalo gastrintestinal e pulmonar). Os dispositivos da medida de TEER podem prontamente ser obtidos dos fornecedores diferentes do equipamento de laboratório. No entanto, há soluções mais rentáveis e personalizáveis imagináveis se um voltamômetro apropriado for automontado. O objetivo geral desta publicação é configurar um dispositivo confiável com freqüência de saída programável que pode ser usado com eletrodos de pauzinho disponíveis comercialmente para medição TEER.

Introduction

As células epiteliais e endoteliais funcionam como limites celulares, separando os lados apical e basolateral do corpo. Se forem conectados através de junções apertadas, a difusão passiva da substância através dos espaços transcelulares paracelulares é restringida1, tendo por resultado a formação de uma barreira seletivamente permeável. Vários sistemas de barreira artificial foram desenvolvidos2 usando células endoteliais microvasculares (hbmec, barreira hematoencefálica3,4,5,6,7), plexocoróide células epiteliais (hibcpp/pcpec, barreira hemato-liquórica8,9,10,11,12,13,14), células de adenocarcinoma colorretal (Caco-2, modelos gastrintestinais15), oulinhagens de células aéreas/alveolares (modelos pulmonares16,17). Estes sistemas consistem tipicamente nas pilhas crescidas em um monocamada em membranas permeáveis (isto é, sistemas da inserção do filtro) para permitir o acesso aos lados apical e basolateral. É importante que a integridade do sistema modelo corresponda às condições in vivo. Assim, várias técnicas foram desenvolvidas para analisar a função de barreira medindo a difusão paracelular de compostos traçador em toda a camada celular. Essas substâncias incluem sacarose radiomarcada, albumina rotulada com corante, inulina rotulada com FITC ou dextranos2rotulado com corante. No entanto, corantes químicos podem tornar as células inutilizáveis para outras experiências. Para monitorar os sistemas de barreira de forma não invasiva, a mensuração da resistência elétrica transepielial/transendotelial (teer) em monocamada celular pode ser utilizada2,18,19. Porque os sistemas do elétrodo bipolar são influenciados pela impedância da polarização do elétrodo na relação do elétrodo-eletrólito, as medidas tetrapolar são usadas geralmente para superar esta limitação20. A técnica de underpostura é uma detecção de quatro terminais (4T) que foi descrita pela primeira vez em 1861 por William Thomson (Lord Kelvin)21. Em suma, a corrente é injetada por um par de eletrodos de transporte atual, enquanto um segundo par de eletrodos de detecção de voltagem é usado para medir a queda de tensão20. Hoje em dia, os chamados elétrodos do chopstick consistem em um par de elétrodos dobro, cada um que contem uma pelota da prata/prata-cloreto para medir a tensão e um elétrodo de prata para passar a corrente2. A impedância elétrica é medida entre o compartimento apical e o basolateral com a camada celular entre (Figura 1). Um sinal de onda quadrada em uma freqüência de tipicamente 12,5 Hz é aplicado nos eletrodos externos e a corrente alternada resultante (AC) medida. Adicionalmente, a gota potencial através da camada da pilha é medida pelo segundo par (interno) do elétrodo. A impedância elétrica é então calculada de acordo com a lei de Ohm. Os valores de TEER são normalizados multiplicando a impedância e a área de superfície da camada celular e são tipicamente expressos em Ω cm2.

Há os sistemas em que as pilhas e os elétrodos são arranjados em uma maneira mais sofisticada, mas são baseados igualmente no princípio de medição 4T e podem ser usados com os mesmos dispositivos da medida. Os sistemas de EndOhm, por exemplo, em que o filtro é introduzido, contêm uma câmara e um tampão com um par de elétrodos concêntricos com a mesma estrutura que o elétrodo do chopstick. A forma dos eletrodos permite um fluxo de densidade de corrente mais uniforme em toda a membrana, reduzindo assim a variação entre as leituras. Ainda mais complexo (mas também mais preciso) é uma câmara Ussing, onde uma camada celular separa duas câmaras preenchidas com solução de Ringer22. A própria câmara pode ser gaseificada com oxigénio, CO2ou N2, e agitada ou suplementada com substâncias experimentais. Porque o transporte do íon através da camada da pilha ocorre, uma diferença potencial pode ser medida por dois elétrodos tensão-detectando perto do tecido. Esta voltagem é cancelada por dois eletrodos de transporte de corrente colocados ao lado da camada celular. A corrente medida dará então o transporte de íons líquidos e a resistência transepitelial, que reflete a integridade da barreira, pode ser determinada22. A medida de teer pode igualmente ser aplicada nos sistemas Body-on-a-chip que representam os modelos de barreira-tecido23,24. Estes sistemas imitam in vivo as condições das células e muitas vezes consistem em vários tipos de células, empilhadas em cima umas das outras em camadas.

O protocolo a seguir explica como configurar um voltamômetro econômico e confiável com frequência de saída programável que não produz diferenças estatisticamente significativas no TEER em comparação com os sistemas de medição disponíveis comercialmente.

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Protocol

1. montagem de um volt-AMPEREMETER básico para a medida do TEER

  1. Prepare um carregador USB padrão como a fonte de alimentação de 5 V DC, um cabo de extensão USB, um microcontrolador que será usado como um gerador de onda quadrada programável, dois multímetros padrão que são capazes de medir corrente alternada e tensão como raiz média quadrada ( True-RMS), quatro cabos com plugues da banana, um cabo de extensão do telefone com um conector fêmea RJ14 que inclui seis pinos com os quatro internos prendidos (6P4C), dois cabos curtos, um terminal do brilho, um 120 kΩ Pre-resistor, ferrules da extremidade do fio, e lugs de solda. As ferramentas exigidas são um descascador da isolação, uma ferramenta de friso, e um ferro de solda.
  2. Primeiro, conecte a extensão USB à placa do microcontrolador.
  3. Tira o isolamento final de dois cabos curtos. Soldar um lado por cabo ou diretamente aos pinos 0 e 2 do microcontrolador ou aos talões de solda, que por sua vez são cortados nos respectivos pinos. Friso as outras extremidades para a extremidade do fio virolas e conectá-los a um terminal de brilho como representado na Figura 1.
  4. Ligue os plugues de banana para os multímetros. Tira e friso a outra extremidade de cada um dos quatro cabos.
  5. Corte o cabo de extensão do telefone em duas partes e desmontar e friso os condutores do lado que contém o conector fêmea. Verifique a continuidade dos condutores e pinos.
  6. O primeiro multímetro será usado para medir a corrente em μA (note que o modo AC tem de ser definido explicitamente). Conecte-o em uma série com um pré-resistor de 120 kΩ para pinos cinco e seis do conector RJ14, correspondendo ao par de eletrodos externo do eletrodo de pauzinho.
  7. Finalmente, vincular o segundo multímetro, que será usado para medir a queda de tensão transepielial em mV, através do terminal de brilho para pinos três e quatro do conector RJ14, correspondendo ao par eletrodo interno do eletrodo pauzinho.
  8. Se desejar, monte a instalação em um chassi.

2. programar o microcontrolador

  1. Modifique o código-fonte fornecido (arquivo de codificação suplementar 1) conforme necessário. Na forma dada, os pinos 0 e 2 alternarão entre o solo e + 5 V com 40 MS de meia-hora de oscilação. Assim, um sinal de onda quadrada com uma amplitude de 5 V e uma frequência de aproximadamente 12,5 Hz será gerado. Os valores reais podem diferir devido à imprecisão do emissor de tempo do microcontrolador.
  2. Conecte o microcontrolador a um computador desktop através de uma porta USB e carregue o código-fonte com o software correspondente25.

3. gravação de oscilosgramas de tensão (opcional)

  1. Contorne os pinos cinco e seis do conector RJ14 com um resistor de teste de 1 kΩ e conecte-se a um osciloscópio.
  2. Verifique a frequência, a tensão de pico e a forma de onda. Digitalize e exporte os dados.
  3. Se desejado, oscilogramas de registro de um dispositivo de referência (EVOM) e o voltamômetro automontado para comparação.
    Nota: neste caso, os dados foram gravados com um escopo de armazenamento digital HM 208. Sendo um osciloscópio digital muito básico, a imagem pode ser digitalizada internamente (congelada), mas teve que ser plotada usando um gravador analógico PM 8143 X-Y. A imagem foi posteriormente digitalizada.

4. cultivo da pilha e medida de TEER

  1. Células de papiloma do plexo coróide humano de semente (HIBCPP) em inserções de filtro de cultura celular com um tamanho de poros de 3 μm em DMEM/F12 (ver tabela de materiais) contendo 10% de soro de bezerro fetal9. Cresça as células a 37 ° c em uma atmosfera saturada de água contendo 5% de CO2 , conforme descrito por Dinner et al.9.
  2. Quando os filtros atingem uma impedância de 70 Ω ∙ cm2, mude para DMEM/F12 sem soro e defina o temporal como dia 0.
  3. Conecte o eletrodo à porta RJ14 do voltamômetro automontado e conecte a fonte de alimentação USB. Defina os multímetros para o modo de tensão AC (mV) e o modo de corrente AC (μA), respectivamente.
    1. Alternativamente, conecte o eletrodo a um dispositivo de referência disponível comercialmente e ative de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Esterilizar o eletrodo em etanol a 80% por 10 min e equilibrar no meio apropriado por mais 10 min.
  5. Coloque o eletrodo em ambos os compartimentos de um sistema de inserção de filtro de cultura celular (a parte mais longa do eletrodo no compartimento inferior e a parte mais curta no compartimento superior) contendo uma camada de células HIBCPP até que os valores de medição permaneçam constantes.
  6. Para um dispositivo de referência, anote a impedância diretamente ou Calcule a impedância de acordo com a lei de Ohm (R = U/I) para o voltamômetro automontado. Esteja ciente de que o ângulo do eletrodo afeta as medições.
  7. Repita a medida de TEER (etapas 3 − 6) do dia 0 até o dia 4.

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Representative Results

Para comparar a operação de um voltamômetro automontado com sua contraparte comercialmente disponível, foi registrado um oscilosgrama de tensão de ambos os dispositivos.

Como mostrado na Figura 2a, oinstrumento de referência gerou um sinal de onda quadrada com uma amplitude de 80 MV e um tempo de oscilação de 80 MS, que corresponde a uma frequência de 12,5 Hz, quando operando em carga com um resistor de teste de 1 kΩ.

Por outro lado, o microcontrolador do dispositivo automontado comutou a tensão de alimentação para um sinal de onda quadrada com uma amplitude de 5 V (Figura 2B) se nenhum Pre-resistor foi ajustado dentro. Tornou-se evidente que a corrente resultante destrói qualquer função de barreira e não é aplicável para experimentos de cultura celular (dados não mostrados). Uma outra edição é que, nesta configuração um resistor de teste de 1 kΩ causou uma sobrecarga com um declínio resultante da tensão (Figura 2B). Adicionalmente, o tempo efetivo de oscilação do microcontrolador foi de 60 MS (frequência = 16,7 Hz) e, assim, diferiu do tempo de retardo programado devido à imprecisão do emissor do tempo. Se um pré-lançamento de 120 kΩ foi instalado, a amplitude diminuiu para um valor de 40 mV, o que foi adequado para a cultura celular (Figura 2C). Como visto no oscilosgrama, a relação sinal-ruído foi consideravelmente prejudicada (Figura 2C), mas não afetou visivelmente as medições.

Ambos os dispositivos foram utilizados para determinar a impedância de uma barreira hemato-cefalorraquidiano artificial (diagrama de circuito simplificado mostrado na Figura 2D). As pilhas de HIBCPP foram cultivadas em inserções do filtro da cultura de pilha e TEER foi medido sobre 6 dias: começar um dia antes que as pilhas fossem movidas para condições soro-livres (dia-1) e até 4 dias após ter mudado o meio (dia 4). Todas as medições foram feitas em quadruplicados, utilizando-se quatro filtros HIBCPP preparados da mesma maneira. Valores semelhantes foram obtidos para o instrumento de referência e o voltamômetro automontado (Figura 3). As medidas foram reprodutíveis, e os desvios padrão estavam dentro do mesmo intervalo. Os valores de TEER variaram de 20 − 550 Ω cm2. Usando 0,33 cm2 filtros, isto iguora a uma impedância absoluta de 83 − 1660 Ω.

Figure 1
Figura 1: diagrama de layout de um volt-AMPEREMETER básico para medição de TEER. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Oscilosgramas e configuração de medição. (A) evom comercialmente disponível. (B) voltamômetro automontado sem pré-resistor. (C) voltamômetro automontado com 120 kΩ pré-resistor. (D) diagrama de circuito de configuração de medição. Observe que oeletrodo C só aparece nos circuitos elétricos quando os sistemas bipolares são usados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: medidas de TEER de camadas de pilha de HIBCPP em inserções do filtro da cultura de pilha antes de comutar ao meio de cultura soro-livre (dia-1), no dia da comutação (dia 0), e até 4 dias após (dias 1 − 4). As barras de erro indicam o desvio padrão dos quatro filtros HIBCPP que foram preparados da mesma maneira. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo de codificação suplementar 1. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo. 

Arquivo de codificação suplementar 2. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo. 

Arquivo de codificação suplementar 3. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo. 

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Discussion

Antes que um voltamômetro self-made possa ser usado em uma rotina diária, é essencial verific o dispositivo para a função apropriada. No nosso caso, uma meia-hora de oscilação de 40 MS (12,5 Hz) foi programada, mas o tempo de oscilação efetivo acabou por ser de 60 MS (16,7 Hz). Esta imprecisão do emissor de tempo do microcontrolador não teve nenhum impacto detectável em medidas de TEER. Talvez seja melhor determinar a freqüência real usando a configuração de freqüência de um dos multímetros. Se algum desvio for encontrado, o código-fonte pode ser ajustado de acordo. Além disso, é altamente recomendável verificar se um resistor de teste ou outras configurações definidas dão resultados corretos e reprodutíveis. Se trabalhar com sistemas de barreira celular artificial, pode ser melhor correlacionar sempre o fluxo da molécula com medição de impedância.

Neste caso, a corrente aplicada foi limitada usando um 120 kΩ pré-resistor. Supondo que os valores típicos de TEER variam de 100 Ω − 2000 Ω, a gota da tensão através da camada da pilha pode ser calculada para ser 4 − 83 milivolt. Um TEER de 1 kΩ foi simulado por um resistor de teste e a gota potencial resultante foi confirmada para ser 40 mV (Figura 2C).

Os dispositivos comercialmente disponíveis fornecem frequentemente um interruptor da escala da medida para comutar o Pre-resistor e para limitar assim a corrente de saída aos valores diferentes. Neste caso, é viável instalar diferentes pré-resistores ou até mesmo substituir o resistor por um potenciómetro.

A configuração mostrada representa uma alternativa rentável aos instrumentos comercialmente disponíveis para a medida de TEER. Os valores medidos com o voltamômetro automontado foram comparáveis ao dispositivo de referência em uma ampla faixa. O mesmo é verdadeiro para os desvios padrão. O ruído no sinal de onda quadrada não afetou as medições notavelmente. O protocolo pode apoiar os cientistas que são restritos por recursos financeiros limitados ou que desejam realizar experimentos preliminares a baixos custos.

Além disso, o microcontrolador pode ser facilmente programado para diferentes frequências de saída. Isso pode ser benéfico, pois a impedância aparente consiste em Rmédio, rteer, bem como a capacidade dacamada de célulasC26 (Figura 2D). Adicionalmente, oelétrodo de C aparece se os sistemas bipolares são usados, visto que a influência da impedância do polarização do elétrodo é reduzida em sistemas tetrapolar. Isto significa que a impedância medida será dominada por Rteer em baixas frequências e, em sistemas bipolares, pela capacidade dos eletrodos, enquanto que em altas frequências a impedância total converge para a resistência do meio26, a 27. No meio, a impedância é influenciada pelacamada de célulasC, que é, portanto, acessível através de espectroscopia de impedância elétrica28.

Nós fornecemos dois códigos de exemplo (não testados) para dar uma idéia de como o dispositivo pode ser otimizado ou reprogramado para diferentes aplicações. Primeiramente, uma espectroscopia de impedância muito básica poderia ser realizada alternando a freqüência de saída em intervalos de 20 segundos entre 12,5, 500 e 5000 Hz (arquivo de codificação suplementar 2). Neste caso, um eletrodo tetrapolar20,28 ou bipolar27 poderia ser usado. A frequência aplicada pode ser mostrada pelo multímetro de construção (ou qualquer display ou LED conectado ao microcontrolador). Em segundo lugar, o dispositivo pode ser usado para medir a condutividade de buffers e mídia. Isto é feito tipicamente usando os elétrodos tetrapolar com freqüências elevadas em uma escala de 1-110kHz. O código no arquivo de codificação suplementar 3 não contém tempo de atraso e (com o nosso dispositivo) gerou uma frequência de aproximadamente 70kHz.

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Disclosures

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Herman Liggesmeyer e Marvin Bende pelo seu aconselhamento especializado em Eletrotécnica e informática.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
120 kOhm resistor General (generic) equipment
Banana plug cables General (generic) equipment
Cables General (generic) equipment
Chopstick electrode Merck Millicell MERSSTX01
Chopstick electrode (alternative) WPI World Precision Instruments STX2
Crimping tool General tool
Digispark / ATtiny85 AZ-Delivery Vertriebs GmbH Digispark Rev.3 Kickstarter
DMEM:F12 Gibco (Thermo Fisher) 31330038
Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10270106
Filter inserts 3µm translucent Greiner Bioone 662631
HIBCPP Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten
Insulation stripper General tool
Luster terminal General (generic) equipment
Oscilloscope HAMEG Digital Storage Scope HM 208
Plotter PHILIPS PM 8143 X-Y recorder
Software Arduino https://www.arduino.cc Arduino 1.8.9
Soldering iron General tool
Soldering lugs General (generic) equipment
Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector General (generic) equipment
Test resistor Merck Millicell MERSSTX04
True-RMS multimeters VOLTCRAFT VC185
USB charger General (generic) equipment
USB extension cord General (generic) equipment
Voltohmmeter for TEER measurement WPI World Precision Instruments EVOM
Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) Merck Millicell ERS
Wire end ferrules General (generic) equipment

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References

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Theile, M., Wiora, L., Russ, D., Reuter, J., Ishikawa, H., Schwerk, C., Schroten, H., Mogk, S. A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency. J. Vis. Exp. (152), e60087, doi:10.3791/60087 (2019).More

Theile, M., Wiora, L., Russ, D., Reuter, J., Ishikawa, H., Schwerk, C., Schroten, H., Mogk, S. A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency. J. Vis. Exp. (152), e60087, doi:10.3791/60087 (2019).

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