Summary
Aquí, demostramos cómo configurar un antímetro de voltios barato con frecuencia de salida programable que se puede utilizar con electrodos de palillo disponibles comercialmente para mediciones de resistencia eléctrica transepitelial/endotelial.
Abstract
La resistencia eléctrica transepitelial/endotelial (TEER) se ha utilizado desde la década de 1980 para determinar la confluencia y permeabilidad de los sistemas de modelos de barrera in vitro. En la mayoría de los casos, los electrodos de palillo se utilizan para determinar la impedancia eléctrica entre el compartimento superior e inferior de un sistema de inserción de filtro de cultivo celular que contiene monocapas celulares. La membrana del filtro permite que las células se adhieran, polaricen e interactúen mediante la construcción de uniones estrechas. Esta técnica se ha descrito con una variedad de diferentes líneas celulares (por ejemplo, células de la barrera hematoencefálica, barrera del líquido hematoencefálico, o tracto gastrointestinal y pulmonar). Los dispositivos de medición TEER se pueden obtener fácilmente de diferentes proveedores de equipos de laboratorio. Sin embargo, hay soluciones más rentables y personalizables imaginables si un voltímetro adecuado se autoensambla. El objetivo general de esta publicación es configurar un dispositivo fiable con frecuencia de salida programable que se pueda utilizar con electrodos de palillo disponibles comercialmente para la medición TEER.
Introduction
Las células epiteliales y endoteliales funcionan como límites celulares, separando los lados apical y basolateral del cuerpo. Si están conectados a través de uniones estrechas, la difusión pasiva de sustancias a través de los espacios paracelulares está restringida1,lo que resulta en la formación de una barrera selectivamente permeable. Se han desarrolladovarios sistemas de barrera artificial 2 utilizando células endoteliales microvasculares (HBMEC, barrera hematoencefálica3,4,5,6,7), plexo coroideo células epiteliales (HIBCPP/PCPEC, barrera de líquido cefalorraquídeo8,9,10,11,12,13,14), Células de adenocarcinoma colorrectal (Caco-2, modelos gastrointestinales15),o líneas de células de las vías respiratorias/alveolares (modelos pulmonares16,17). Estos sistemas suelen consistir en células cultivadas en monocapa sobre membranas permeables (es decir, sistemas de inserción de filtros) para permitir el acceso a los lados apical y basolateral. Es importante que la integridad del sistema modelo coincida con las condiciones in vivo. Por lo tanto, se han desarrollado varias técnicas para analizar la función de barrera midiendo la difusión paracelular de compuestos trazadores a través de la capa celular. Estas sustancias incluyen sacarosa radioetiquetada, albúmina con etiqueta de tinte, inulina etiquetada por FITC o dextrans2con etiqueta de tinte. Sin embargo, los dedos químicos pueden hacer que las células sean inutilizables para más experimentos. Para monitorizar los sistemas de barrera de forma no invasiva, se puede utilizar la medición de la resistencia eléctrica transepitelial/transendotelial (TEER) a través de una monocapa celular2,18,19. Debido a que los sistemas de electrodos bipolares están influenciados por la impedancia de polarización de electrodos en la interfaz electrodo-electrolito, las mediciones tetrapolares se utilizan generalmente para superar esta limitación20. La técnica de subsistencia es una sensación de cuatro terminales (4T) que fue descrita por primera vez en 1861 por William Thomson (Lord Kelvin)21. En resumen, la corriente es inyectada por un par de electrodos portadores de corriente, mientras que un segundo par de electrodos de detección de voltaje se utiliza para medir la caída de tensión20. Hoy en día, los llamados electrodos de palillo consisten en un par de electrodos dobles, cada uno de los cuales contiene un pellet de plata/cloruro de plata para medir la tensión y un electrodo de plata para pasar corriente2. La impedancia eléctrica se mide entre el compartimento apical y el compartimento basolateral con la capa celular en el medio (Figura 1). Una señal de onda cuadrada a una frecuencia de típicamente 12,5 Hz se aplica en los electrodos exteriores y se mide la corriente alterna resultante (AC). Además, la caída potencial a través de la capa celular se mide por el segundo par de electrodos (interno). La impedancia eléctrica se calcula de acuerdo con la ley de Ohm. Los valores de TEER se normalizan multiplicando la impedancia y el área de la superficie de la capa celular y se expresan típicamente como á cm2.
Hay sistemas en los que las células y los electrodos están dispuestos de una manera más sofisticada, pero también se basan en el principio de medición 4T y se pueden utilizar con los mismos dispositivos de medición. Los sistemas EndOhm, por ejemplo, en los que se inserta el filtro, contienen una cámara y una tapa con un par de electrodos concéntricos con la misma estructura que el electrodo de palillo. La forma de los electrodos permite un flujo de densidad de corriente más uniforme a través de la membrana, reduciendo así la variación entre las lecturas. Aún más complejo (pero también más preciso) es una cámara Ussing, donde una capa celular separa dos cámaras llenas con la solución de Ringer22. La cámara en sí puede ser gaseado con oxígeno, CO2,o N2, y agitado o complementado con sustancias experimentales. A medida que se produce el transporte iónico a través de la capa celular, una diferencia potencial se puede medir mediante dos electrodos de detección de voltaje cerca del tejido. Esta tensión se cancela mediante dos electrodos portadores de corriente colocados junto a la capa de celda. La corriente medida dará entonces el transporte iónico neto y la resistencia transepitelial, que refleja la integridad de la barrera, se puede determinar22. La medición TEER también se puede aplicar en sistemas de cuerpo en un chip que representan los modelos de tejido barrera23,24. Estos sistemas imitan las condiciones in vivo de las células y a menudo consisten en varios tipos de células, apiladas una encima de la otra en capas.
El siguiente protocolo explica cómo configurar un voltímetro rentable y fiable con frecuencia de salida programable que no produce diferencias estadísticamente significativas en TEER en comparación con los sistemas de medición disponibles en el mercado.
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Protocol
1. Montaje de un antímetro de voltios básico para la medición TEER
- Prepare un cargador USB estándar como la fuente de alimentación D.C. de 5 V, un cable de extensión USB, un microcontrolador que se utilizará como un generador de onda cuadrada programable, dos multímetros estándar que son capaces de medir la corriente alterna y el voltaje como cuadrado medio de la raíz ( True-RMS), cuatro cables con enchufes de plátano, un cable de extensión de teléfono con un conector hembra RJ14 que incluye seis pines con el interior de cuatro cableados (6P4C), dos cables cortos, un terminal de brillo, un prerresistencia de 120 k, casquillos de extremo de alambre y asas de soldadura. Las herramientas necesarias son un stripper de aislamiento, una herramienta de engarce y un soldador.
- En primer lugar, conecte la extensión USB a la placa del microcontrolador.
- Desmonte el aislamiento final de dos cables cortos. Soldar un lado por cable directamente a los pines 0 y 2 del microcontrolador o a las asas de soldadura, que a su vez se sujetan en los pines respectivos. Engarzar los otros extremos hasta las férulas del extremo del alambre y conéctelos a un terminal de brillo como se muestra en la Figura 1.
- Conecte los enchufes del plátano a los multímetros. Tira y engarza el otro extremo de cada uno de los cuatro cables.
- Cortar el cable de extensión del teléfono en dos piezas y desmontar y engarzar los conductores del lado que contiene el conector hembra. Compruebe la continuidad de los conductores y pasadores.
- El primer multímetro se utilizará para medir la corriente en aA (tenga en cuenta que el modo AC tiene que ser configurado explícitamente). Conéctelo en una serie con un prerresistencia de 120 ko a los pines cinco y seis del conector RJ14, correspondiente al par de electrodos exteriores del electrodo de palillo.
- Finalmente, conecte el segundo multímetro, que se utilizará para medir la caída de tensión transepitelial en mV, a través del terminal de brillo a los pines tres y cuatro del conector RJ14, correspondiente al par de electrodos internos del electrodo de palillo.
- Si lo desea, monte la instalación en un chasis.
2. Programación del microcontrolador
- Modifique el código fuente proporcionado (archivo de codificación suplementario 1) según sea necesario. En la forma dada, los pines 0 y 2 alternarán entre el suelo y +5 V con 40 ms de medio tiempo de oscilación. Por lo tanto, se generará una señal de onda cuadrada con una amplitud de 5 V y una frecuencia de aproximadamente 12,5 Hz. Los valores reales pueden diferir debido a la inexactitud del emisor de tiempo del microcontrolador.
- Conecte el microcontrolador a un ordenador de sobremesa a través de un puerto USB y cargue el código fuente con el software correspondiente25.
3. Registro de osciloscopios de tensión (opcional)
- Los pines de derivación de cinco y seis del conector RJ14 con una resistencia de prueba de 1 k y se conectan a un osciloscopio.
- Compruebe la frecuencia, el voltaje máximo y la forma de onda. Digitalice y exporte los datos.
- Si lo desea, registre los oscilogramas desde un dispositivo de referencia (EVOM) y el voltímetro automontado para su comparación.
NOTA: En este caso, los datos se registraron con un alcance de almacenamiento digital HM 208. Al ser un osciloscopio digital muy básico, la imagen podía digitalizarse internamente (congelada) pero tenía que ser trazada usando una grabadora analógica PM 8143 X-Y. La imagen fue escaneada posteriormente.
4. Cultivo celular y medición teRE
- Células de Pajoma del Plexo Humano de semillas (HIBCPP) en insertos de filtro de cultivo celular con un tamaño de poro de 3 m en DMEM/F12 (ver Tabla de Materiales)que contiene 10% de suero de becerro fetal9. Cultivar las células a 37 oC en una atmósfera saturada de agua que contenga 5% co2 como se describe en la cena y otros9.
- Cuando los filtros alcancen una impedancia de 70 cm2,cambie a DMEM/F12 sin suero y defina el punto de tiempo como Día 0.
- Conecte el electrodo al puerto RJ14 del voltímetro automontado y conecte la fuente de alimentación USB. Ajuste los multímetros al modo de voltaje de CA (mV) y al modo de corriente de CA (A), respectivamente.
- Alternativamente, conecte el electrodo a un dispositivo de referencia disponible comercialmente y enciéndalo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Esterilice el electrodo en 80% de etanol durante 10 min y equilibre en el medio apropiado durante otros 10 minutos.
- Coloque el electrodo en ambos compartimentos de un sistema de inserción de filtro de cultivo celular (la parte más larga del electrodo en el compartimiento inferior y la parte más corta en el compartimento superior) que contenga una capa de celda HIBCPP hasta que los valores de medición permanezcan constantes.
- Para un dispositivo de referencia, anote la impedancia directamente o calcule la impedancia de acuerdo con la ley de Ohm (R - U / I) para el voltímetro automontado. Tenga en cuenta que el ángulo del electrodo afecta a las mediciones.
- Repita la medición TEER (pasos 3 a 6) desde el día 0 hasta el día 4.
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Representative Results
Para comparar el funcionamiento de un voltímetro autoensamblado con su contraparte disponible comercialmente, se registró un oscilograma de voltaje de ambos dispositivos.
Como se muestra en la Figura 2A, el instrumento de referencia generó una señal de onda cuadrada con una amplitud de 80 mV y un tiempo de oscilación de 80 ms, que corresponde a una frecuencia de 12,5 Hz, cuando se opera en carga con una resistencia de prueba de 1 k.
Por el contrario, el microcontrolador del dispositivo automontado cambió la tensión de alimentación a una señal de onda cuadrada con una amplitud de 5 V(Figura 2B)si no se estableció ninguna resistencia previa. Se hizo evidente que la corriente resultante destruye cualquier función de barrera y no es aplicable para experimentos de cultivo celular (datos no mostrados). Otro problema es que, en esta configuración, una resistencia de prueba de 1 k causó una sobrecarga con una disminución resultante de la tensión(Figura 2B). Además, el tiempo de oscilación efectivo del microcontrolador fue de 60 ms (frecuencia a 16,7 Hz) y, por lo tanto, difería del tiempo de retardo programado debido a la inexactitud del emisor de tiempo. Si se instaló un prerresistor de 120 ko, la amplitud disminuyó a un valor de 40 mV, que era adecuado para el cultivo celular(Figura 2C). Como se observa en el oscilograma, la relación señal-ruido se vio considerablemente afectada(Figura 2C),pero no afectó notablemente a las mediciones.
Ambos dispositivos se utilizaron para determinar la impedancia de una barrera de líquido cefalorraquídeo artificial (diagrama de circuito simplificado que se muestra en la Figura 2D). Las células HIBCPP se cultivaron en plaquitas de filtro de cultivo celular y el TEER se midió durante 6 días: a partir de un día antes de que las células se moviera naderas de suero (Día -1) y hasta 4 días después de cambiar el medio (Día 4). Todas las mediciones se realizaron en cuadrúlicados utilizando cuatro filtros HIBCPP preparados de la misma manera. Se obtuvieron valores similares para el instrumento de referencia y el voltímetro autoensamblado(Figura 3). Las mediciones eran reproducibles y las desviaciones estándar estaban dentro del mismo rango. Los valores del TEER oscilaron entre 20 y 550 o cm2cm. Usando 0,33 cm2 filtros, esto equivale a una impedancia absoluta de 83 x 1.660 o.
Figura 1: Diagrama de diseño de un voltímetro básico para la medición TEER. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Oscilogramas y configuración de medición. (A) EVOM disponible comercialmente. (B) Voltímetro automontado sin resistencia previa. (C) Voltímetro automontado con prerresistencia de 120 ko. (D) Diagrama de circuito de configuración de medición. Tenga en cuenta que elelectrodo C solo aparece en los circuitos eléctricos cuando se utilizan sistemas bipolares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mediciones TEER de capas celulares HIBCPP en plaquitas de filtro de cultivo celular antes de cambiar a medio de cultivo libre de suero (Día -1), el día de la conmutación (Día 0), y hasta 4 días después (Días 1-4). Las barras de error indican la desviación estándar de los cuatro filtros HIBCPP que se prepararon de la misma manera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo de codificación suplementario 1. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 2. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 3. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Antes de que un voltímetro hecho a sí mismo se pueda utilizar en una rutina diaria, es esencial comprobar el dispositivo para el correcto funcionamiento. En nuestro caso, se programó un medio tiempo de oscilación de 40 ms (12,5 Hz), pero el tiempo de oscilación efectivo resultó ser 60 ms (16,7 Hz). Esta imprecisión del emisor de tiempo del microcontrolador no tuvo ningún impacto detectable en las mediciones TEER. Podría ser mejor determinar la frecuencia real usando el ajuste de frecuencia de uno de los multímetros. Si se encuentra alguna desviación, el código fuente se puede ajustar en consecuencia. Además, se recomienda encarecidamente comprobar si una resistencia de prueba u otras configuraciones definidas dan resultados correctos y reproducibles. Si se trabaja con sistemas de barrera celular artificial, podría ser mejor correlacionar siempre el flujo de moléculas con la medición de impedancia.
En este caso, la corriente aplicada se limitó utilizando una prerresistencia de 120 k. Suponiendo que los valores típicos de TEER van desde 100 x 2.000 o 2.000 o2, la caída de tensión a través de la capa de celda se puede calcular de 4 a 83 mV. Un TEER de 1 k fue simulado por una resistencia de prueba y se confirmó que la caída potencial resultante era de 40 mV(Figura 2C).
Los dispositivos disponibles comercialmente a menudo proporcionan un interruptor de rango de medición para alternar la resistencia previa y, por lo tanto, limitar la corriente de salida a diferentes valores. En este caso, es factible instalar diferentes prerresistencias o incluso reemplazar la resistencia con un potenciómetro.
La configuración mostrada representa una alternativa rentable a los instrumentos disponibles comercialmente para la medición TEER. Los valores que se han medido con el voltímetro autoensamblado eran comparables al dispositivo de referencia en un amplio rango. Lo mismo es cierto para las desviaciones estándar. El ruido en la señal de onda cuadrada no afectó a las mediciones notablemente. El protocolo puede apoyar a los científicos que están restringidos por recursos financieros limitados o que desean realizar experimentos preliminares a bajo costo.
Además, el microcontrolador se puede programar fácilmente a diferentes frecuencias de salida. Esto puede ser beneficioso, ya que la impedancia aparente consiste en Rmedio,RTEER, así como la capacidad C capa decelda26 (Figura 2D). Además, elelectrodo C aparece si se utilizan sistemas bipolares, mientras que la influencia de la impedancia de polarización del electrodo se reduce en los sistemas tetrapolares. Esto significa que la impedancia medida estará dominada por RTEER a bajas frecuencias y, en sistemas bipolares, por la capacidad de los electrodos, mientras que a altas frecuencias la impedancia total converge a la resistencia del medio26, 27. En el medio, la impedancia está influenciada por lacapa de célulasC, que por lo tanto es accesible mediante espectroscopia de impedancia eléctrica28.
Proporcionamos dos códigos de ejemplo (no probados) para dar una idea de cómo el dispositivo podría ser optimizado o reprogramado para diferentes aplicaciones. En primer lugar, se podría realizar una espectroscopia de impedancia muy básica alternando la frecuencia de salida en intervalos de 20 segundos entre 12,5, 500 y 5000 Hz (archivo de codificación suplementario 2). En este caso, se podría utilizar un electrodo tetrapolar20,28 o bipolar27. La frecuencia aplicada podría ser mostrada por el multímetro incorporado (o cualquier pantalla o LED conectado al microcontrolador). En segundo lugar, el dispositivo podría utilizarse para medir la conductividad de los búferes y los medios. Esto se hace típicamente usando electrodos tetrapolares con altas frecuencias en un rango de 1-110 kHz. El código del archivo de codificación suplementario 3 no contiene tiempo de retardo y (con nuestro dispositivo) generó una frecuencia de aproximadamente 70 kHz.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia u otros conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer a Herman Liggesmeyer y Marvin Bende por su asesoramiento experto en electrotecnia e informática.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
References
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