Summary
Здесь мы представляем протокол для выполнения инвазивной гемодинамической оценки правого желудочка и легочной артерии у мышей с использованием подхода с открытой грудной клеткой.
Abstract
Легочная артериальная гипертензия (ПАГ) является хроническим и тяжелым сердечно-легочным расстройством. Мыши являются популярной моделью животных, используемых для имитации этого заболевания. Тем не менее, оценка правого желудочкового давления (РВП) и давления легочной артерии (PAP) остается технически сложной задачей у мышей. РВП и ППА труднее измерить, чем давление левого желудочка из-за анатомических различий между левой и правой сердечной системами. В этой работе мы описываем стабильный метод гемодинамического измерения правого сердца и его проверку с использованием здоровых и ПАУ мышей. Этот метод основан на операции на открытой грудной клетке и поддержке искусственной вентиляции легких. Это сложная процедура по сравнению с закрытыми процедурами грудной клетки. Хотя хорошо обученный хирург необходим для этой операции, преимущество этой процедуры является то, что он может генерировать как RVP и PAP параметров в то же время, так что это предпочтительная процедура для оценки моделей ПАУ.
Introduction
Легочная артериальная гипертензия (ПАУ) является хроническим и тяжелым сердечно-легочным расстройством с повышением давления легочной артерии (ППА) и давлением правого желудочка (РВП), которое вызвано клеточной пролиферацией и фиброзом малых легочных артерий 1. Катетеры легочной артерии, также называемые катетерами Лебедя-Ганца2,широко используются в клиническом мониторинге РВП и ППА. Кроме того, беспроводная система мониторинга PAP была использована клинически3,4,5. Для имитации заболевания для изучения у мышей, гипоксическая среда используется для имитации клинических проявлений человека ПАУ6. При оценке PAP у животных, крупных животных относительно легко контролировать с помощью легочной артерии катетеров с использованием той же техники, как для человека, но мелких животных, таких как крысы и мыши трудно оценить из-за их небольшой размер тела. Гемодинамическое измерение правой желудочковой системы у мышей возможно с ультрамалым размером 1 Fr катетер7. Метод измерения РВП и PAP у мышей был зарегистрирован в литературе8,9, но методология не имеет подробного описания. РВП и ППА являются более сложными для измерения, чем давление левого желудочка из-за анатомических различий между левой и правой сердечной систем.
Чтобы получить параметры PAP и RVP в одной и той же мыши, мы описываем подход на основе операции на открытой груди для измерения гемодинамических измерений правого сердца, его проверки здоровыми и ПАУ мышами, а также о том, как избежать генерации искусственных данных во время сложной открытой груди Хирургии. Хотя этот метод лучше всего выполняется хорошо обученным хирургом, он имеет то преимущество, что в состоянии оценить PAP и RVP в той же мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол о животных был рассмотрен и одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в больнице Фувай, Китайской академии медицинских наук, Пекинском медицинском колледже Союза (NO.0000287). Экспериментальные животные были размещены и кормили в соответствии с руководящими принципами благополучия животных в Китае.
ПРИМЕЧАНИЕ: 8- до 12-недельный самец C57BL мышей были размещены в среде с 12 ч темный / 12 ч светового цикла. PAH мышей были размещены в течение 4 недель под концентрацией кислорода 10%, поддерживается кислородом контролируемой гипоксии камеры, чтобы вызвать легочную гипертензию, и контроль мышей были размещены в комнате воздуха (21% кислорода) в одинаковых условиях. Измерения РВП и ППА были проведены в конце 4 недель гипоксии вызов.
1. Предоперационная подготовка
- Замочите катетер преобразователя давления (размер: 1 Fr) в 0,9% сольника при комнатной температуре, по крайней мере 30 минут до гемодинамического эксперимента.
- Фильтр 2,2,2-Трибромотанол раствор с 0,22 мкм фильтр и хранить в 4-градусный холодильник.
- Подготовьте очищенные инструменты хирургии и материалы, такие как перчатки для хирургии.
- Приготовьте 10 мл 1,0% раствора пищеварительного фермента для очистки катетера.
- Подключите катетер преобразователя давления к системе давления-объема.
- Калибрать преобразователь давления до получения измерений давления для каждой мыши.
- Поверните ручку калибровки до 0 мм рт. ст. и 25 мм рт. ст., чтобы отправить сигнал давления проверки в программное обеспечение для сбора данных и настроить настройку калибровки в программном обеспечении.
- Поверните ручку к Transducer и отрегулируйте ручку баланса к нулю базовой линии.
- Настройка стандартного стереомикроскопа и контролируемого температурой хирургического стола для поддержания температуры тела во время операции.
- Настройка системы освещения света для микрохирургии, чтобы обеспечить достаточно света над хирургической области.
2. Операция с открытым грудным оком и гемодинамическое измерение
- Анестезия мышей с 250 мг/кг 2,2,2-Трибромотанол через интраперитонеальной (i.p.) инъекции. При необходимости повторите дополнительные дозы в 1/3 до 1/2 от первоначальной дозы во время процедуры.
- Удалить грудь и шею меха с помощью бритвы и удаления волос лосьон(Рисунок 1A, 2A).
- Безопасный каждой мыши в положении на спине на температуре контролируемых малых животных хирургический стол, чтобы помочь поддерживать температуру тела (37 градусов по Цельсию) во время операции.
- Очистите хирургическое место с 70% этанала.
- После анестезии в силу, подтвердить адекватную индукцию анестезии с использованием ног щепотку.
- Сделайте разрез средней линии на коже шеи(рисунок 1А).
- Вскрыть скелетную мышцу с помощью изогнутых щипцы и разоблачить трахеи(Рисунок 1B, 1C).
- Выполняйте интубацию через рот с помощью модифицированного 22 G внутривенного катетера оболочки. Подтвердите, что трубка находится в трахеее с помощью щипк(рисунок 1D).
- Подключите трубку к небольшому аппарату искусственной вентиляции легких животных. Рассчитайте и установите скорость дыхания и приливный объем на основе массы тела в соответствии с вентилятором пользователя руководства10. Например, установите частоту дыхания до 133/мин, а приливного объема до 180 л для мыши объемом 30 г на основе описанного расчета.
- Защищайте трубку для вентиляции с помощью ленты.
- Подтвердите адекватную индукцию анестезии с помощью щепотки.
- Сделайте разрез средней линии на коже грудной клетки и тщательно вскрыть мышцы грудной клетки с помощью каутери инструмент(Рисунок 2B, 2C).
- Вырезать грудину с помощью ножниц посередине и разоблачить грудной полости(рисунок 2D).
- Предотвратить кровотечение с помощью каутери инструмент во время операции на открытой груди хирургии.
- Выставить правый желудочек с помощью ретракторов(рисунок 2E).
- Вставьте солен-пропитанный катетер преобразователя давления через небольшой туннель, созданный с иглой 25 G в правый желудочек для измерения RVP(Рисунок 2F и Рисунок 3A, 3C).
- Держите катетерный кабель и пересеките легочный клапан в соосно с легочной артерией. Наблюдайте форму давления и получите стабильный сигнал PAP(Рисунок 3B, 3D).
- Запись гемодинамических данных с помощью системы и программного обеспечения для сбора данных.
- После окончательных измерений, эвтаназии мышей гуманно через i.p. инъекции избыточной дозы 2,2,2-Tribromoethanol раствора.
- Тщательно удалите катетер из правой сердечной системы и поместите в шприц 1 мл, содержащий 1% раствор пищеварительного фермента.
- Используйте дистиллированную воду, чтобы непрерывно промыть катетер тщательно и хранить его в оригинальной коробке.
3. Анализ данных гемодинамики
ПРИМЕЧАНИЕ: Гемодинамические данные были записаны и проанализированы с помощью аналитического программного обеспечения11 (Таблица материалов).
- Для каждой мыши выберите не менее 10 непрерывных и стабильных циклов сердцебиения без шума, чтобы получить средние данные RVP или PAP по каждому параметру.
- Используйте Студенческая t-testдля сравнения нормального управления воздухом и групп гипоксии. ПРИМЕЧАНИЕ: р Злт; 0,05 считалось статистически значимым. Данные представлены в виде среднего sD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Катетер преобразователя давления был вставлен в правый желудочек(рисунок 3А) через туннель, расширенный 25 G иглой, и была получена типичная волновая форма RVP(рисунок 3C). Катетер постоянно корректировался и медленно продвигался и держался в той же оси, что и легочная артерия, проходя через легочной клапан(рисунок 3В). Когда датчик давления был успешно вставлен в легочную артерию, появилась типичная волновая форма PAP с характерной некротической выемкой(рисунок 3D). Чтобы избежать генерации искусственных данных, мы наблюдали, был ли в волновой форме шум(рисунок 4)или же нулевой уровень катетера дрейфовал(рисунок 5). Если это произошло, были сделаны коррекции, и эти сегменты с шумом были исключены из анализа данных.
ПАУ характеризуется устойчивым повышением ППА и РВП, вызванным повышенной резистентностью в небольших легочных артериях. ПАУ определяется средним PAP в размере 25 мм рт. ст. в состоянии покоя, измеренного во время катетеризации правого сердца в клинике12. Мы измерили РВП и ППА у мышей с индуцированной хронической гипоксией (сохраняется при 10% кислорода в течение 4 недель) или контрольной группы (сохраняется в нормальном воздухе). Результаты показаны на рисунке 6. По сравнению с теми, в нормальной группе контроля воздуха, систолическое PAP(Рисунок 6A), диастолический PAP (Рисунок 6B), среднее PAP(Рисунок 6C),и право желудочковое систолическое давление(рисунок 6D) были значительно увеличены в группе хронической гипоксии. Исследователи также сообщили, что по сравнению с гипоксией в одиночку, сочетание ингибитора VEGFR с хронической гипоксией в течение 3 недель, чтобы вызвать тяжелые ПАУ у мышей может привести к значительному увеличению RVP13,18.
Рисунок 1: Интубация для поддержки механической вентиляции легких у мышей. (A) Шея мех удаляется с помощью лосьона удаления волос для получения чистой области для хирургии. Разрез средней линии делается на коже шеи. (B) Скелетная мышца, покрывающая трахею подвергается. (C) Скелетные мышцы грубо расчленены, чтобы разоблачить трахею. На желтую стрелку указывается трахея. (D) Трубка (измененная с использованием 22 G внутривенного катетера) вставляется в дыхательные пути, с размещением подтверждено с помощью щипц. На желтую стрелку указывается трубка внутри трахеи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Операция на открытой груди для гемодинамического измерения в правой желудочковой системе. (A) Мех груди удаляется с помощью лосьона для удаления волос для получения чистой области для хирургии. (B) Разрез средней линии производится, чтобы разоблачить мышцы скелета грудной клетки и грудины. (C) инструмент cautery использован для того чтобы свести к минимуму кровотечение во время отверстия комода (стрелка показывает кончик cautery). (D) грудина разрезается вдоль средней линии (желтая тире линии). (E) Два ретрактора используются для разоблачения сердца (верхняя стрелка указывает на правой стенки предсердий, и нижняя стрелка указывает на правой стенки желудочков). (F) Катетер превосхода давления (нижняя стрелка) вставляется в правую желудочковую камеру с помощью прокола инструмент (25 G размер иглы, верхняя стрелка) для получения небольшой туннель на правом желудочковой свободной стенки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Представитель RVP и PAP кривых. Катетер преобразователя давления вставляется в правую желудочковую камеру(A) для получения формы волны RVP(C). Давление преобразователя катетер проходит через легочной клапан, а затем остается в легочной артерии (B) для создания формы волны PAP. Стрелки указывают на характерную некротической выемку на волновой форме PAP(D),которая является признаком закрытия легочного клапана. РА - правое предсердие, Р.В. и правый желудочек, ПА и легочная артерия, ЛВ и левый желудочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Шум формы волны RVP, вызванный прикосновением поверхности датчика давления к стенке желудочков. Стрелка точка показывает резкое увеличение давления на кривой RVP (верхний канал), который одновременно производит искусственное изменение в dP/dt (нижний канал). dP/dt рассчитывается из RVP. Разбитые линии указывают на шум dP/dt. Если шум постоянно присутствует, регулировка положения датчика катетера в желудочке может предотвратить шум. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Нулевой дрейф преобразователя давления во время измерения RVP. В левом окне показан искусственно слегка приподнятый конечный диастолический RVP. Правое расширенное окно показывает увеличенный конечный диастолический RVP (стрелки указывают на конечный диастолический RVP). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Гипоксия индуцированной легочной артерии гипертензии в C57BL мышей. (A) Систолическая PAP (sPAP). (B) Диастолическая PAP (dPAP). (C)Средний PAP (mPAP). (D) Право желудочковое систолическое давление (RVSP). (E) и (( F), Представитель PAP волновые формы для контроля и ПАУ мышей, соответственно,р-л; 0,05; Студенческая t-тест; контрольная группа n No 10; гипоксия группа n No 3. Данные представлены в виде среднего значения - SD. PAP - давление легочной артерии, РВП и давление правого желудочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Интубация трахеи является первым важным шагом для операций на открытой груди. Классический метод интубации трахеи для мелких животных, таких как крысы или мыши, включает в себя создание Т-образного разреза на трахеееи и непосредственное вставки Трэхеальных труб типа Y в трахею. На практике мы обнаруживаем, что этот метод не является легким во время работы. Транзи(-тюбинг типа Y слишком велик для мелких животных и образует угол с трахеей. Таким образом, трудно исправить трубки на месте. Кроме того, как только интубация трубки случайно выходит из дыхательных путей во время операции на открытой груди, это обычно приводит к смерти животных из-за потери поддержки механической вентиляции легких. Таким образом, мы изменили метод эндотрахеальной интубации14, сделав разрез на коже, отделяя мышечный слой, чтобы разоблачить трахею(рисунок 1C),и непосредственно вставив трахеи труб в дыхательные пути через рот животного. Размещение труб в трахееи может быть удобно подтверждено путем зажима трахеи с помощью щипков(рисунок 1D). После удаления направляющей иглы и только с помощью катетера оболочки, 22 G внутривенный катетер используется в качестве интубации трубки. Трубки могут быть легко защищены после интубации. Это безопасный способ управления интубации во время операции и может значительно улучшить показатель успеха малых животных открытой хирургии грудной клетки. Однако этот метод требует обучения и практики.
Подход закрытой грудной клетки для измерения гемодинамического правого сердца был подробно описан15,16. Одним из ограничений метода закрытой грудной клетки является то, что он может быть использован только для оценки RVP, потому что катетер не может получить доступ к легочной артерии у мышей. Мы используем разрез грудной клетки средней линии, где правая стенка желудочков, расположенная чуть ниже грудины(рисунок 2D). После правой рецерулярной катетеризации для получения РВП, легко вставить катетер в соосный образ с легочной артерии, чтобы получить PAP(Рисунок 2E). Когда грудина разрезается во время операции на открытой груди, электрокоагуляционный инструмент используется, чтобы избежать кровотечения стернальной резки раздела, чтобы предотвратить искусственное снижение артериального давления, вызванное кровопотерей(Рисунок 2C). Это необязательно для этой операции с открытой грудной клетки использовать P-V петли катетер, чтобы получить как RVP и объем информации17. Тем не менее, лучше не использовать его для получения PAP из-за его большего размера. Хотя этот метод лучше всего выполняется хорошо обученным хирургом, предпочтительнее подхода с закрытой грудью, поскольку он позволяет проводить интубацию трахеи и профилактику кровотечений во время операции на открытой груди, чтобы избежать смерти животных.
Кроме того, правая стенка желудочков проколов прокалывается 25 G или меньше йглой, чтобы уменьшить сопротивление во время вставки катетера в желудочек. Во время катетеризации поверхность датчика давления не должна отклоняться от скобели иглы, чтобы предотвратить случайное повреждение датчика катетера острой металлической поверхностью. Предпочтительно не использовать большую иглу для прокола стенки желудочка, так как это обычно вызывает дальнейшее кровотечение, а недостаточный объем крови в обращении также вызывает данные искусственного давления.
Из-за небольшого объема желудочка и нерегулярных размеров правой желудочковой камеры у мышей, датчик давления катетера легко касается правой стенки желудочка свободной во время высокой частоты сердцебиения. Это генерирует шум на кривой давления желудочка(Рисунок 4),непосредственно влияющих желудочкового анализа давления. В этом случае, угол и глубина катетера должны быть скорректированы до тех пор, пока шум исчезает, чтобы получить гладкую форму давления желудочков снова.
Небольшой размер 1 Fr давление преобразователя катетератеран та и меньше, чем преобразователь давления. Нулевой дрейф, как правило, не испытывали во время стандартного теста катетера в солевых растворах in vitro, если катетер не исправен или поврежден. Однако, в присутствии крови тела, компоненты крови, прилипающие к поверхности датчика давления, могут привести к тому, что катетер подвергнется нулевому дрейфу во время эксперимента in vivo(рисунок 5). Для решения этой проблемы мы делаем следующее: временно удалить катетер из желудочковой камеры и поместить кончик датчика катетера в теплый 1,0% пищеварительного фермента раствор; инкубировать его, чтобы переварить компоненты крови, прикрепленные к поверхности датчика; и после мягко вытирая катетер с солевым пропитанной марлей, вставьте катетер обратно в желудочковую камеру, чтобы получить стабильную, ненулевой дрейф желудочковой формы давления.
Подготовка катетера преобразователя давления также необходима для получения стабильных данных. Кончик датчика давления катетера должен быть пропитан в течение по крайней мере 30 мин в 0,9% солевых при комнатной температуре до процедуры in vivo для поддержания стабильности катетера. Таким образом, электрические характеристики катетера преобразователя давления могут быть оптимально стабилизированы.
Наконец, период гипоксии является жизнеспособным от 3 до 4 недель для гипоксии индуцированной модели гипертонии у мышей6,14,17,18. Наши данные показали, что 4 недели гипоксии может вызвать стабильную модель легочной гипертензии у мышей C57BL, а уровни ППА и РВП сопоставимы с литературой. Необходимы дальнейшие исследования для решения вопроса о том, как долго модель ПАУ может быть сохранена, если мышей помещают обратно в нормокиси для различных протоколов гипоксии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование поддерживается последипломным образованием и реформой преподавания проекта Пекинского союза медицинского колледжа (10023-2016-002-03), Фувай больницы молодежный фонд (2018-F09), и директор фонда Пекинключевые лаборатории доклинических исследований и Оценка материалов для сердечно-сосудистых имплантатов (2018-PT2-NoR05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-5G | For anesthesia |
| Animal temperature controller | Physitemp Instruments, Inc. | TCAT-2LV | For temperature control |
| Dissection forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11274-20 | For surgery |
| Gemini Cautery System | Gemini | GEM 5917 | For surgery |
| Intravenous catheter (22G) | BD angiocath | 381123 | For intubation |
| LabChart 7.3 | ADInstruments | For data analysis | |
| Light illumination system | Olympus | For surgery | |
| Mikro-Tip catheter | Millar Instruments, Houston, TX | SPR-1000 | For pressure measurement |
| Millar Pressure-Volume Systems | Millar Instruments, Houston, TX | MVPS-300 | For pressure measurement |
| O2 Controller and Hypoxia chamber | Biospherix | ProOx 110 | For chronic hypoxia |
| PowerLab Data Acquisition System | ADInstruments | PowerLab 16/30 | For data recording |
| Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | For surgery |
| Small animal ventilator | Harvard Apparatus | Mini-Vent 845 | For surgery |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | For surgery |
| Surgery tape | 3M | For surgery | |
| Terg-a-zyme enzyme | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | For catheter cleaning |
References
- Humbert, M., et al. Advances in therapeutic interventions for patients with pulmonary arterial hypertension. Circulation. 130 (24), 2189-2208 (2014).
- Chatterjee, K. The Swan-Ganz catheters: past, present, and future: a viewpoint. Circulation. 119 (1), 147-152 (2009).
- Adamson, P. B., et al. CHAMPION trial rationale and design: the long-term safety and clinical efficacy of a wireless pulmonary artery pressure monitoring system. Journal of Cardiac Failure. 17 (1), 3-10 (2011).
- Abraham, W. T., et al. Wireless pulmonary artery haemodynamic monitoring in chronic heart failure: a randomised controlled trial. The Lancet. 377 (9766), 658-666 (2011).
- Adamson, P. B., et al. Wireless pulmonary artery pressure monitoring guides management to reduce decompensation in heart failure with preserved ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 7 (6), 935-944 (2014).
- Shatat, M. A., et al. Endothelial Kruppel-like Factor 4 modulates pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (3), 647-653 (2014).
- SPR-1000 Mouse Pressure Catheter. , Available from: https://millar.com/products/research/pressure/single-pressure-no-lumen/spr-1000 (2019).
- Tabima, D. M., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Measuring right ventricular function in the normal and hypertensive mouse hearts using admittance-derived pressure-volume loops. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (6), 2069-2075 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial deletion of hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) alters vascular function and tumor angiogenesis. Blood. 114 (2), 469-477 (2009).
- Harvard Inspira Advanced Safety Ventilator User's Manual. , Available from: http://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Inspira_557058_9.pdf. (2019).
- LabChart. , Available from: https://www.adinstruments.com/products/labchart?creative=290739105773_keyword=labchart_matchtype=e_network=g_device=_gclid=CjwKCAjwxrzoBRBBEiwAbtX1n42I2S06KmccVncUHkmExU8KKOXXREyzx8bvTrxYMSze-ooE0atcbRoCliwQAvD_BwE (2019).
- Marius, M. H., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 62 (25), 42-50 (2013).
- Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Chen, W. C., et al. Right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice. Journal of Visualized Experiments. (71), 50023 (2013).
- Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic characterization of rodent models of pulmonary arterial hypertension. Journal of Visualized Experiments. (110), 53335 (2016).
- Chen, M. Berberine attenuates hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension via bone morphogenetic protein and transforming growth factor-β signaling. Journal of Cellular Physiology. , (2019).
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. Methods in Molecular Biology. vol 1816. Ishikawa, K. , Humana Press. New York, NY. (2018).
