Summary
在这里，我们提出一个协议，使用开胸手术方法对小鼠的右心室和肺动脉进行侵入性血液动力学评估。
Abstract
肺动脉高血压（PAH）是一种慢性和严重的心肺疾病。老鼠是一种流行的动物模型，用来模仿这种疾病。然而，在小鼠中，右心室压力 （RVP） 和肺动脉压力 （PAP） 的评估在技术上仍然具有挑战性。RVP 和 PAP 比左心室压力更难测量，因为左心和右心系统之间的解剖差异。本文介绍了一种稳定的右心血液动力学测量方法，以及使用健康和PAH小鼠进行的验证。该方法基于开胸手术和机械通气支持。与封闭的胸腔手术相比，这是一个复杂的程序。虽然这种手术需要训练有素的外科医生，但这个程序的优点是它可以同时生成RVP和PAP参数，所以这是评估PAH模型的一个可取的程序。
Introduction
肺动脉高血压（PAH）是一种慢性、严重的心肺疾病，由小肺动脉细胞增殖和纤维化引起肺动脉压力（PAP）和右心室压力（RVP）升高。1.肺动脉导管，也称为天鹅-甘兹导管2，通常用于RVP和PAP的临床监测。此外，无线PAP监测系统已临床上使用3，4，5。为了模拟小鼠研究的疾病，使用低氧环境来模拟PAH6的人类临床表现。在动物PAP的评估中，大型动物使用与人类受试者相同的技术，通过肺动脉导管进行监测相对容易，但大鼠和小鼠等小动物由于体型小而难以评估。使用超小尺寸1Fr导管7，可以测量小鼠右心室系统的造声法。文献8、9报道了一种测量小鼠RVP和PAP的方法，但该方法缺乏详细的描述。RVP 和 PAP 比左心室压力更具测量性，因为左心和右心系统之间存在解剖学差异。
为了在同一只小鼠中同时获得PAP和RVP参数，我们描述了一种基于开胸手术的右心血液动力学测量方法，其验证与健康和PAH小鼠，以及如何避免在复杂的开胸期间生成人工数据手术。虽然这种技术最好由训练有素的外科医生执行，但它的优点是能够在同一位小鼠中评估 PAP 和 RVP。
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Protocol
动物规程经中国医学科学院福威医院动物护理使用委员会审查通过，北京协和医学院（NO.0000287）。实验动物按照中国动物福利的指导方针进行饲养和喂养。
注：8至12周大的雄性C57BL小鼠被安置在12小时暗/12小时光周期的环境中。PAH小鼠在氧气浓度为10%的情况下被安置4周，由氧气控制的缺氧室维持，以诱发肺高血压，对照小鼠在相同条件下被安置在室内空气（21%氧气）。肥胖。RVP 和 PAP 测量在 4 周的缺氧挑战结束时进行。
1. 术前准备
- 在血液动力学实验前，在室温下将压力传感器导管（大小：1 Fr）浸泡在0.9%盐水中至少30分钟。
- 过滤2，2，2-三溴二醇溶液，带0.22 μm过滤器，储存在4度冰箱中。
- 准备清洁的手术工具和用品，如手术手套。
- 准备10 mL的1.0%消化酶溶液，用于导管清洁。
- 将压力传感器导管连接到压力体积系统。
- 在获得每只鼠标的压力测量值之前，校准压力传感器。
- 将校准旋钮转动至 0 mmHg 和 25 mmHg，向数据采集软件发送验证压力信号，并在软件中配置校准设置。
- 将旋钮转向传感器，并将平衡旋钮调整为零基线。
- 在手术期间设置标准立体显微镜和温度控制小动物手术台，用于体温维护。
- 为显微外科建立一个照明系统，为手术区域提供足够的光线。
2. 开胸手术和血液动力学测量
- 通过腹内注射（即p.p.）对小鼠进行250mg/kg2，2，2-三溴二苯醚乙醇的麻醉。如果需要，在手术过程中以原始剂量的1/3至1/2重复补充剂量。
- 使用除洗和脱毛化妆水去除胸部和颈部毛皮（图1A，2A）。
- 将每只小鼠固定在温度控制的小型动物手术台上，以帮助在手术过程中保持体温（37 °C）。
- 用70%的伊森来清洁手术部位。
- 一旦麻醉生效，使用脚趾捏确认足够的麻醉诱导。
- 在颈部皮肤上做一个中线切口 （图 1A）。
- 使用弯曲的钳子解剖骨骼肌肉，并暴露气管（图1B，1C）。
- 使用经过修饰的 22 G 静脉注射护套导管通过口腔进行插管。使用钳子确认管子在气管中（图1D）。
- 将管子连接到小型动物呼吸机。根据呼吸机用户手册10计算和设置呼吸速率和潮汐体积，根据体重。例如，根据所述计算，将 30 克鼠标的呼吸速率设置为 133/min，将潮汐体积设置为 180 μL。
- 用胶带固定管道进行通风。
- 使用脚趾捏确认足够的麻醉诱导。
- 在胸部皮肤上进行中线切口，并使用烧焦工具仔细解剖胸部肌肉（图2B，2C）。
- 用剪刀在中间切开胸骨，露出胸腔（图2D）。
- 在开胸手术过程中，使用烧灼工具防止任何出血。
- 用伸缩器露出右心室 （图 2E）。
- 将盐水浸透的压力传感器导管插入用25G针头制作的小隧道，以测量RVP（图2F和图3A，3C）。
- 握住导管电缆，以肺动脉同轴方式穿过肺瓣。观察压力波形并获得稳定的PAP信号（图3B，3D）。
- 使用数据采集系统和软件记录血液动力学数据。
- 经过最后的测量，通过i.p.注射过量剂量为2，2，2-三溴二苯基乙醇溶液，人道地对小鼠实施安乐死。
- 小心地从右心脏系统取出导管，放入含有1%消化酶溶液的1mL注射器中。
- 使用蒸馏水持续冲洗导管仔细，并将其存储在原始框中。
3. 流体动力学数据分析
注：使用分析软件11（材料表）记录和分析血液动力学数据。
- 对于每只鼠标，选择至少 10 个连续且稳定的检测周期，无噪声，以获得每个参数的 RVP 或 PAP 数据的平均数据。
- 使用学生t-测试比较正常的空气控制和缺氧组。注： p < 0.05 被认为具有统计显著性。数据以均值 = SD 的形式显示。
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Representative Results
压力传感器导管通过25G指针膨胀的隧道插入右心室（图3A），获得典型的RVP波形（图3C）。导管不断调整，缓慢推进，与肺动脉保持同一轴，同时通过肺瓣膜（图3B）。当压力传感器成功插入肺动脉时，出现了典型的具有双分波槽的PAP波形（图3D）。为了避免产生人工数据，我们观察波形是否有噪声（图4），或者导管的零电平是否漂移（图5）。如果发生这种情况，则进行更正，并且从数据分析中排除具有噪声的段。
PAH 的特点是 PAP 和 RVP 持续升高，由小肺动脉的阻力增加引起。PAH的定义是平均PAP +25 mmHg在休息，测量在右心导管在诊所12。我们测量了诱导性慢性缺氧小鼠（在10%氧气中保持4周）或对照组（保存在正常空气中）的RVP和PAP。结果如图6所示。与正常空气控制组相比，收缩性PAP（图6A）、舒张PA（图6B）、均PA（图6C）和右心室收缩压（图6D）慢性缺氧组均明显增加。研究者还报告说，与仅缺氧相比，将VEGFR抑制剂与慢性缺氧结合3周，在小鼠中诱导严重的PAH可导致RVP13、18显著增加。
图1：小鼠机械通气支撑的插管.（A）使用脱毛化妆水去除颈部毛毛，以获得手术的清洁区域。颈部皮肤上有一个中线切口。（B） 覆盖气管的骨骼肌暴露。（C） 骨骼肌肉被直接解剖以暴露气管.黄色箭头表示气管。（D） 管子（使用22G静脉导管修改）插入气道，使用钳子确认放置。黄色箭头表示气管内的管。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：开胸手术，用于右心室系统的造气系统测量。 （A） 胸部毛皮通过脱毛化妆水去除，以获得手术的清洁区域。（B） 中线切口用于暴露胸部骨骼肌和胸骨。（C） 烧焦工具用于在开胸期间尽量减少出血（箭头表示烧焦尖端）。（D） 胸骨沿中线（黄色破折号线）切割。（E） 使用两个缩回器来暴露心脏（上箭头表示右心房壁，下箭头表示右心室自由壁）。（F） 压力传感器导管（下箭头）使用穿刺工具（25 G 尺寸针，上箭头）插入右心室室，在右心室自由壁上产生一个小隧道。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：代表 RVP 和 PAP 曲线。压力传感器导管插入右心室 （A） 以获得 RVP 波形 （C）。压力传感器导管穿过肺瓣，然后停留在肺动脉 （B） 中生成 PAP 波形。箭头表示PAP波形（D）上的特征二角槽，这是肺瓣闭合的标志。RA = 右心房，RV = 右心室，PA = 肺动脉，LV = 左心室。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：将压力传感器表面接触心室壁引起的RVP波形噪声。箭头点显示 RVP 曲线（上通道）上的压力急剧增加，同时产生 dP/dt（下通道）的人工变化。dP/dt 是根据 RVP 计算的。虚线表示 dP/dt 噪声。如果噪音持续存在，调节心室中的导管传感器位置可以防止噪音。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：在RVP测量期间压力传感器零漂移。左侧窗口显示人为稍微升高的端分 RVP。右展开的窗口显示增加的端舒张 RVP（箭头表示端舒张 RVP）。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：C57BL小鼠缺氧引起的肺动脉高血压.（A）收缩性PAP（sPAP）。（B） 舒张 PAP （dPAP）。（C） 均值 PAP （ mPAP）。（D） 右心室收缩压力 （RVSP）。（E） 和 （F）， 代表 PAP 波形，分别用于控制和 PAH 小鼠 =p < 0.05;学生的不测试;控制组 n = 10;缺氧组 n = 3。数据以均值 = SD. PAP = 肺动脉压力、RVP = 右心室压力的形式呈现。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
气管插管是开胸手术的第一步。对于小动物（如大鼠或小鼠）来说，气管插管的经典方法包括在气管上做一个T形切口，并将Y型气管直接插入气管。在实践中，我们发现这种方法在操作过程中并不容易。Y 型气管管对于小动物来说太大，与气管形成一个角度。因此，很难将管固定到位。此外，一旦插管在开胸手术过程中意外地从气道流出，它通常会导致动物死亡，因为失去机械通气支持。因此，我们修改了内切管插管的方法14，在皮肤上做切口，分离肌肉层以暴露气管（图1C），并直接将气管插入气管通过动物的嘴。使用钳子夹紧气管可以方便地确认管材在气管中的放置（图1D）。取出导针后，仅使用护套导管，使用 22 G 静脉导管作为插管。插管后可轻松固定。这是一种在手术期间管理插管的安全方法，可以显著提高小动物开胸手术的成功率。但是，这种方法需要培训和练习。
右心血液动力学测量的闭胸方法已详细描述15，16。闭胸方法的一个限制是，它只能用于评估RVP，因为导管不能进入小鼠的肺动脉。我们使用一个中线胸切口，其中右心室自由壁位于，就在胸骨的正下方 （图2D）。右心室导管化后获得RVP，很容易以同轴方式插入导管与肺动脉获得PAP（图2E）。在开胸手术中切胸骨时，使用电凝工具避免胸腔切段出血，防止因失血引起的人工血压降低（图2C）。这是可选的这种开胸手术使用P-V循环导管，以获得RVP和体积信息17。但是，最好不要使用它来获得 PAP，因为它的大小更大。虽然这种方法最好由训练有素的外科医生执行，但它比闭胸方法更好，因为它允许在开胸手术期间维持气管插管和防止出血，以避免动物死亡。
此外，右心室自由壁用25 G或更小的针刺穿，以减少导管插入心室过程中的阻力。在导管插入过程中，压力传感器表面不得偏离针的斜面，以防止锋利的金属表面意外损坏导管传感器。最好不要使用大针刺穿心室自由壁，因为它通常会导致进一步出血，并且血液流通量不足也会导致人工压力数据。
由于小鼠心室体积小，右心室尺寸不规则，导管压力传感器在高心跳率期间很容易触及右心室自由壁。这在心室压力曲线上产生噪声（图4），直接影响心室压力分析。在这种情况下，应调整导管的角度和深度，直到噪音消失，以便再次获得平滑的心室压力波形。
1 Fr 压力传感器导管7的体积小，使其成为非常精确、精确的压力传感器。在体外盐水溶液中的标准导管测试期间，通常不会经历零漂移，除非导管有故障或损坏。然而，在身体血液存在的情况下，附着在压力传感器表面的血液成分可能导致导管在体内实验期间发生零漂移（图5）。为了解决这个问题，我们做以下工作：暂时从心室取出导管，并将导管的传感器尖端放入温暖的消化酶溶液中;孵育它以消化附着在传感器表面的血液成分;用盐水浸泡的纱布轻轻擦拭导管后，将导管插入心室，以获得稳定、非零漂移心室压力波形。
压力传感器导管的制备对于获得稳定数据也至关重要。在体内手术之前，导管的压力传感器尖端必须在室温下以0.9%的盐水浸泡至少30分钟，以保持导管的稳定性。这样，压力传感器导管的电气特性就可以得到最佳稳定。
最后，在小鼠6、14、17、18的缺氧诱发高血压模型中，缺氧期为3至4周。我们的研究表明，4周缺氧可诱导C57BL小鼠肺高血压模型稳定，PAP和RVP水平与文献相当。需要进一步的研究，以解决PAH模型可以维持多久，如果小鼠放回不同的缺氧方案的规范条件。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究由北京协和医学院研究生教育教学改革项目（10023-2016-002-03）、福威医院青年基金（2018-F09）和北京临床前研究重点实验室主任基金资助。心血管植入材料评估 （2018-PT2-ZR05）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-5G | For anesthesia |
| Animal temperature controller | Physitemp Instruments, Inc. | TCAT-2LV | For temperature control |
| Dissection forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11274-20 | For surgery |
| Gemini Cautery System | Gemini | GEM 5917 | For surgery |
| Intravenous catheter (22G) | BD angiocath | 381123 | For intubation |
| LabChart 7.3 | ADInstruments | For data analysis | |
| Light illumination system | Olympus | For surgery | |
| Mikro-Tip catheter | Millar Instruments, Houston, TX | SPR-1000 | For pressure measurement |
| Millar Pressure-Volume Systems | Millar Instruments, Houston, TX | MVPS-300 | For pressure measurement |
| O2 Controller and Hypoxia chamber | Biospherix | ProOx 110 | For chronic hypoxia |
| PowerLab Data Acquisition System | ADInstruments | PowerLab 16/30 | For data recording |
| Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | For surgery |
| Small animal ventilator | Harvard Apparatus | Mini-Vent 845 | For surgery |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | For surgery |
| Surgery tape | 3M | For surgery | |
| Terg-a-zyme enzyme | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | For catheter cleaning |
References
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