Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utföra en invasiv hemodynamisk bedömning av den högra ventrikeln och lungartären hos möss med en öppen Bröstkirurgi metod.
Abstract
Pulmonell arteriell hypertension (PAH) är en kronisk och svår kardiopulmonary sjukdom. Möss är en populär djurmodell som används för att efterlikna denna sjukdom. Emellertid, utvärderingen av höger kammartryck (RVP) och pulmonell artärtryck (PAP) är fortfarande tekniskt utmanande hos möss. RVP och PAP är svårare att mäta än vänster kammartryck på grund av de anatomiska skillnaderna mellan vänster och höger hjärt system. I det här dokumentet beskriver vi en stabil rätt hjärt hemodynamisk mätmetod och dess validering med friska och PAH-möss. Denna metod är baserad på öppen bröstkirurgi och mekanisk ventilation stöd. Det är ett komplicerat förfarande jämfört med slutna bröstet förfaranden. Medan en välutbildad kirurg krävs för denna operation, fördelen med detta förfarande är att det kan generera både RVP och PAP parametrar samtidigt, så det är ett bättre förfarande för utvärdering av PAH-modeller.
Introduction
Pulmonell arteriell hypertension (PAH) är en kronisk och svår kardiopulmonary sjukdom med förhöjning av pulmonell artärtryck (PAP) och höger kammartryck (RVP) som orsakas av cellulär proliferation och fibros i små lungartärerna 1. pulmonell artärkatetrar, även kallad Swan-Ganz katetrar2, används ofta i den kliniska övervakningen av RVP och PAP. Dessutom har ett trådlöst PAP-övervakningssystem använts kliniskt3,4,5. För att efterlikna sjukdomen för studier på möss används en hypoxisk miljö för att simulera humana kliniska manifestationer av PAH6. I utvärderingen av PAP hos djur, stora djur är relativt lätt att övervaka genom pulmonell artärkatetrar med samma teknik som för försökspersoner, men små djur som råttor och möss är svåra att bedöma på grund av deras lilla kroppsstorlek. Hemodynamisk mätning av den högra ventrikulära systemet i möss är möjligt med en ultrasmall storlek 1 fr kateter7. En metod för att mäta RVP och PAP hos möss har rapporterats i litteraturen8,9, men metoden saknar en detaljerad beskrivning. RVP och PAP är mer utmanande att mäta än vänster kammartryck på grund av de anatomiska skillnaderna mellan vänster och höger hjärt system.
För att få både PAP och RVP parametrar i samma mus, beskriver vi en öppen Bröstkirurgi-baserade tillvägagångssätt för höger hjärta hemodynamiska mätningar, dess validering med friska och PAH möss, och hur man undviker att generera artificiella data under den komplicerade öppna bröstet Kirurgi. Även om denna teknik är bäst utförs av en välutbildad kirurg, har den fördelen att kunna bedöma PAP och RVP i samma mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal Protocol granskades och godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén vid Fuwai Hospital, kinesiska akademin för medicinsk vetenskap, Peking union Medical College (nr 0000287). Försöksdjuren var inhysta och utfodrade enligt riktlinjerna för djurens välbefinnande i Kina.
Obs: åtta till 12-veckors gamla manliga C57BL möss var inrymt i en miljö med en 12 h mörk/12 h ljus cykel. PAH-möss var inhysta i 4 veckor under en syrehalt av 10%, upprätthålls av en syrekontrollerad hypoxi kammare för att inducera pulmonell hypertension, och kontroll möss var inrymt i rumsluften (21% syre) under identiska förhållanden. RVP och PAP mätningar utfördes i slutet av 4 veckors hypoxi Challenge.
1. preoperativ förberedelse
- Blötlägg tryck givar katetern (storlek: 1 fr) i 0,9% saltlösning i rumstemperatur i minst 30 min före det hemodynamiska experimentet.
- Filter 2, 2, 2-Tribromöthanol lösning med 0,22 μm filter och förvara i 4-graders kylskåp.
- Förbered rengöras kirurgiska verktyg och förnödenheter såsom handskar för kirurgi.
- Förbered 10 mL 1,0% matsmältningsenzym lösning för kateter rengöring.
- Anslut tryck givar katetern till ett tryck volym system.
- Kalibrera tryckgivaren innan du erhåller tryck mätningar för varje mus.
- Vrid kalibrerings ratten till 0 mmHg och 25 mmHg för att skicka en verifierings trycksignal till datainsamlingsprogrammet och konfigurera kalibrerings inställningen i programvaran.
- Vrid ratten till givaren och justera balansen ratten till noll baslinjen.
- Ställ in en standard stereomikroskop och en temperaturkontrollerad små djur kirurgiska bord för kroppstemperatur underhåll under operationen.
- Ställ in ett ljus belysningssystem för mikrokirurgi för att ge tillräckligt med ljus över det kirurgiska området.
2. öppen bröstkirurgi och hemodynamisk mätning
- Anesthetize möss med 250 mg/kg 2, 2, 2-Tribromoethanol via intraperitoneal (i.p.) injektion. Vid behov, upprepa kompletterande doser på 1/3 till 1/2 av den ursprungliga dosen under förfarandet.
- Ta bort bröst-och hals päls med hjälp av en rakapparat och hårborttagning lotion (figur 1a, 2a).
- Säkra varje mus i ryggläge på en temperaturkontrollerad små djur kirurgiska tabellen för att upprätthålla kroppstemperaturen (37 ° c) under operationen.
- Rengör operationsområdet med 70% Etanal.
- När anestesi är i kraft, bekräfta adekvat anestesi induktion med hjälp av en tå nypa.
- Gör en mittlinje snitt på halsen huden (figur 1a).
- Dissekera skelettmuskulaturen med böjda tång och exponera luftstrupen (figur 1B, 1c).
- Utför intubation genom munnen med en modifierad 22 G intravenös mantel kateter. Kontrollera att slangen är i luftstrupen med hjälp av tång (figur 1D).
- Anslut slangen till en liten djur ventilator. Beräkna och Ställ in andningsfrekvens och tidvatten volym baserat på kroppsvikt enligt respiratorns bruksanvisning10. Till exempel, ange andningsfrekvens till 133/min och tidvatten volym till 180 μL för en 30 g mus baserat på den beskrivna beräkningen.
- Säkra slangen för ventilation med tejp.
- Bekräfta adekvat anestesi induktion med hjälp av en tå nypa.
- Gör en mittlinjen snitt på bröstet huden och försiktigt dissekera bröstmusklerna med hjälp av en diatermi verktyg (figur 2B, 2C).
- Skär bröstbenet med sax över mitten och exponera brösthålan (figur 2D).
- Förhindra blödning med hjälp av diatermi verktyget under den öppna bröstet kirurgi förfarande.
- Exponera den högra ventrikeln med upprullningsdon (figur 2E).
- Sätt i saltlösning-indränkt tryckgivaren kateter genom en liten tunnel som skapats med en 25 G nål i höger kammare för att mäta RVP (figur 2F och figur 3a, 3c).
- Håll kateter kabeln och korsa lungventilen i en koaxial sätt med lungartären. Observera tryck vågformen och få en stabil PAP-signal (figur 3B, 3D).
- Registrera hemodynamiska data med hjälp av datainsamlingssystemet och programvaran.
- Efter de slutliga mätningarna, euthanize möss humant genom i.p. injektion av en överflödig dos av 2, 2, 2-Tribromöthanol lösning.
- Ta försiktigt bort katetern från det högra hjärt systemet och placera den i en 1 mL spruta som innehåller 1% matsmältningsenzym lösning.
- Använd destillerat vatten för att kontinuerligt Spola katetern noggrant och förvara den i originalkartong.
3. data analys för hemodynamik
Obs: hemodynamiska data registrerades och analyserades med hjälp av analysprogram11 (tabell över material).
- För varje mus väljer du minst 10 kontinuerliga och stabila pulsslags cykler utan brus för att erhålla genomsnittsdata för RVP-eller PAP-data för varje parameter.
- Använd elevens t-test för att jämföra de normala luftkontroll-och hypoxigrupperna. Anmärkning: p < 0,05 ansågs statistiskt signifikant. Data presenteras som medelvärdet ± SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tryck givar katetern sattes in i den högra ventrikeln (figur 3a) genom en tunnel expanderad med en 25 G nål, och en typisk RVP-vågform (figur 3C) erhölls. Katetern var kontinuerligt justeras och långsamt avancerade och förvaras i samma axel som lungartären medan passerar genom lungventilen (figur 3B). När tryckgivaren framgångsrikt sattes in i lung artären, dök en typisk PAP-vågform med en karakteristisk dicrotic notch (figur 3D). För att undvika uppkomsten av artificiella data, observerade vi om vågform hade brus (figur 4) eller om nollnivån på katetern hade glidit (figur 5). Om detta inträffade gjordes korrigeringar, och dessa segment med buller exkluderades från dataanalys.
PAH kännetecknas av en ihållande förhöjning av PAP och RVP, orsakad av ökat motstånd i små lungartärer. PAH definieras med ett genomsnittligt PAP på ≥ 25 mmHg i vila, mätt under höger hjärtkateterisering på kliniken12. Vi mätte RVP och PAP i möss med den inducerade kroniska hypoxi (hålls på 10% syre i 4 veckor) eller en kontrollgrupp (hålls i normal luft). Resultaten visas i figur 6. Jämfört med de som finns i den normala luftkontroll gruppen, systoliskt PAP (figur 6A), det diastoliska PAP (figur 6B), medelvärdet för PAP (figur 6C) och det systoliska trycket i höger kammare (figur 6D) ökade signifikant i den kroniska hypoxigruppen. Utredare har också rapporterat att jämfört med hypoxi ensam, en kombination av en VEGFR hämmare med kronisk hypoxi för 3 veckor att inducera svår PAH hos möss kan resultera i signifikant ökad RVP13,18.
Figur 1: intubation för mekaniskt ventilationsstöd hos möss. (a) halsen päls avlägsnas med hjälp av hårborttagning lotion för att få en ren yta för kirurgi. Ett mittlinjen snitt görs på huden på halsen. B) skelett muskeln som täcker luftstrupen exponeras. Cskelettmusklerna dissekeras för att exponera luftstrupen. Den gula pilen indikerar luftstrupen. D) slangen (modifierad med hjälp av en 22 G intravenös kateter) sätts in i luftvägarna, med en placering bekräftad med hjälp av tång. Den gula pilen indikerar slangen inuti luftstrupen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: öppen Bröstkirurgi för hemodynamisk mätning vid det högra ventrikulära systemet. (a) bröstet päls avlägsnas med hjälp av hårborttagning lotion för att få en ren yta för kirurgi. (B) ett mittlinjen snitt görs för att exponera bröst skelett muskler och bröstbenet. (C) ett diatermi verktyg används för att minimera blödning under bröst öppningen (pilen indikerar den diatermi spetsen). Dbröstbenet skärs längs mittlinjen (den gula streck linjen). (E) två upprullningsdon används för att exponera hjärtat (den övre pilen indikerar den högra förmaksväggen, och den nedre pilen indikerar den högra ventrikelfria väggen). (F) en tryck givar kateter (den nedre pilen) sätts in i den högra kammar kammaren med hjälp av ett punkteringsverktyg (25 G nål, den övre pilen) för att framställa en liten tunnel på höger kammar fri vägg. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa RVP-och PAP-kurvor. Tryck givar katetern sätts in i den högra kammar kammaren (a) för att erhålla RVP-vågformen (C). Tryckgivaren katetern går genom lungventilen och sedan stannar i lungartären (B) för att generera PAP-vågform. Pilarna indikerar den karakteristiska dicrotic skåran på PAP-vågform (D), vilket är ett tecken på en pulmonell ventil stängning. RA = höger förmak, RV = höger kammare, PA = lungartären, LV = vänster kammare. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: RVP-vågformsbrus orsakad av beröring av trycksensorns yta till den ventrikulära väggen. Pilen pekar visar en kraftig ökning av trycket på RVP kurvan (den övre kanalen), som samtidigt ger en konstgjord förändring i dP/DT (den nedre kanalen). dP/DT beräknas från RVP. De streckade linjerna indikerar dP/DT-brus. Om bullret är ständigt närvarande, kan justering av kateter sensorn position i ventrikeln förhindra buller. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: nolldrift av TRYCKGIVAREN under RVP-mätningen. Det vänstra fönstret visar artificiellt något förhöjd end-diastolisk RVP. Den högra expanderade fönstret visar ökad end-diastolisk RVP (pilar indikerar slutet diastoliskt RVP). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: hypoxiinducerad pulmonell arteriell hypertension hos C57BL möss. (a) systoliskt PAP (SPAP). B) DIASTOLISKT PAP (DPAP). C) medelvärde för PAP (mPAP). (D) det systoliska trycket i höger kammare (RVSP). (E) och (F), representativa PAP-VÅGFORMER för kontroll respektive PAH-möss *p < 0,05; Students t-test; kontrollgrupp n = 10; hypoxi grupp n = 3. Data presenteras som medelvärdet ± SD. PAP = pulmonell artärtryck, RVP = höger kammartryck. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tracheal intubation är det första viktiga steget för öppen Bröstkirurgi. Den klassiska metoden för trakeal intubation för små djur, såsom råttor eller möss, innebär att göra en T-formad snitt på luftstrupen och direkt infoga Y-typ trakealslang i luftstrupen. I praktiken finner vi att denna metod inte är lätt under drift. Den Y-typ luftrör slangen är för stor för små djur och bildar en vinkel med luftstrupen. Därför är det svårt att fixera slangen på plats. Dessutom, när intubation slangen oavsiktligt kommer ut från luftvägarna under öppen-Bröstkirurgi, det brukar resulterar i djur död på grund av förlust av mekanisk ventilation stöd. Därför ändrade vi metoden för endotrakeal intubation14 genom att göra ett snitt på huden, separera muskellagret för att exponera luftstrupen (figur 1C), och direkt sätta in trakealslangen i luftvägarna genom djurets mun. Placeringen av slangar i luftstrupen kan enkelt bekräftas genom fastspänning av luftstrupen med hjälp av tång (figur 1D). Efter avlägsnande av styr nålen och endast med hjälp av mantel katetern, en 22 G intravenös kateter används som intubation slangen. Slangen kan lätt säkras efter intubation. Detta är ett säkert sätt att hantera intubation under kirurgi och kan avsevärt förbättra andelen framgångsrika små djur öppen Bröstkirurgi. Denna metod kräver dock utbildning och praktik.
Den slutna bröstet tillvägagångssätt för höger hjärta hemodynamiska mätning har beskrivits i detalj15,16. En begränsning av den slutna-Chest metoden är att den kan användas för att endast utvärdera RVP, eftersom katetern inte kan komma åt lungartären hos möss. Vi använder en mittlinje bröst snitt där den högra ventrikelfria väggen är placerad, strax under bröstbenet (figur 2D). Efter rätt ventrikulär kateterisering för att få RVP, är det lätt att sätta in katetern i en koaxial sätt med lungartären att få PAP (figur 2E). När bröstbenet skärs under den öppna bröstet kirurgi, ett elektrokoaguleringsverktyg används för att undvika sternala skära avsnitt blödning för att förhindra artificiell blodtryckssänkning orsakad av blodförlust (figur 2C). Det är frivilligt för denna öppen Bröstkirurgi att använda en P-V loop kateter för att få både RVP och volyminformation17. Det är dock bäst att inte använda den för att få PAP på grund av dess större storlek. Även om denna metod är bäst utförs av en välutbildad kirurg, är det bättre att den slutna bröstet tillvägagångssätt eftersom det möjliggör underhåll av trakeal intubation och förebyggande av blödning under öppen Bröstkirurgi för att undvika djurens död.
Dessutom är den högra ventrikelfria väggen punkteras med en 25 G eller mindre nål för att minska motståndet under införandet av katetern i ventrikeln. Under kateterisering får inte trycksensorns yta avvika från kanylens avfasning för att förhindra oavsiktlig skada på kateter sensorn av den vassa metallytan. Det är bättre att inte använda en stor nål för att punktera den ventrikulära fria väggen, eftersom det vanligtvis orsakar ytterligare blödning, och otillräcklig blodvolym i omlopp orsakar också konstgjorda tryckdata.
På grund av den lilla volymen av ventrikeln och den oregelbundna storleken på den högra ventrikulära kammaren i möss, trycksensorn av katetern vidrör lätt höger kammar fri vägg under den höga hjärtrytmen takt. Detta genererar brus på ventrikulär tryck kurva (figur 4), direkt påverkar ventrikulär tryck analys. I detta fall bör vinkeln och djupet av katetern justeras tills bullret försvinner för att få en slät ventrikulär tryckvågform igen.
Den lilla storleken på 1 fr tryck givar katetern7 gör den till en mycket exakt, exakt tryckgivare. Noll drift är i allmänhet inte upplevt under ett standard kateter test i saltlösning in vitro-om inte katetern är defekt eller skadad. I närvaro av kropps blod kan dock blodkomponenter som ansluter sig till trycksensorns yta orsaka att katetern genomgår noll drift under ett in vivo-experiment (figur 5). För att lösa detta problem gör vi följande: ta tillfälligt bort katetern ur kammar kammaren och placera sensorns spets på katetern i varm 1,0% matsmältningsenzym lösning; Inkubera det för att smälta de blodkomponenter som är fästa vid sensorns yta; och efter att försiktigt torka katetern med saltlösning-indränkt gasväv, sätt in katetern tillbaka till kammar kammaren för att få en stabil, icke-noll drift ventrikulär tryckvågform.
Beredningen av en tryck givar kateter är också viktigt för att få stabila data. Den tryckgivare spetsen av katetern måste blötläggas i minst 30 min i 0,9% saltlösning i rumstemperatur före in vivo-förfarande för att bibehålla stabiliteten i katetern. På detta sätt kan de elektriska egenskaperna hos tryck givar katetern stabiliseras optimalt.
Slutligen, hypoxi perioden är lönsamt från 3 till 4 veckor för hypoxi-inducerad hypertoni modell i möss6,14,17,18. Våra data visade att 4 veckors hypoxi kan inducera en stabil Pulmonell hypertoni modell i C57BL möss, och PAP och RVP nivåer är jämförbara med litteraturen. Ytterligare studier behövs för att ta itu med hur länge PAH-modellen kan bibehållas om mössen sätts tillbaka i normoxiska förhållanden för olika hypoxiska protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av forskarutbildning och undervisning reform projekt i Peking union Medical College (10023-2016-002-03), den Fuwai Hospital Youth Fund (2018-F09), och direktören fonden i Peking viktigaste laboratoriet för preklinisk forskning och Utvärdering för kardiovaskulära implantatmaterial (2018-PT2-ZR05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-5G | For anesthesia |
| Animal temperature controller | Physitemp Instruments, Inc. | TCAT-2LV | For temperature control |
| Dissection forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11274-20 | For surgery |
| Gemini Cautery System | Gemini | GEM 5917 | For surgery |
| Intravenous catheter (22G) | BD angiocath | 381123 | For intubation |
| LabChart 7.3 | ADInstruments | For data analysis | |
| Light illumination system | Olympus | For surgery | |
| Mikro-Tip catheter | Millar Instruments, Houston, TX | SPR-1000 | For pressure measurement |
| Millar Pressure-Volume Systems | Millar Instruments, Houston, TX | MVPS-300 | For pressure measurement |
| O2 Controller and Hypoxia chamber | Biospherix | ProOx 110 | For chronic hypoxia |
| PowerLab Data Acquisition System | ADInstruments | PowerLab 16/30 | For data recording |
| Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | For surgery |
| Small animal ventilator | Harvard Apparatus | Mini-Vent 845 | For surgery |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | For surgery |
| Surgery tape | 3M | For surgery | |
| Terg-a-zyme enzyme | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | For catheter cleaning |
References
- Humbert, M., et al. Advances in therapeutic interventions for patients with pulmonary arterial hypertension. Circulation. 130 (24), 2189-2208 (2014).
- Chatterjee, K. The Swan-Ganz catheters: past, present, and future: a viewpoint. Circulation. 119 (1), 147-152 (2009).
- Adamson, P. B., et al. CHAMPION trial rationale and design: the long-term safety and clinical efficacy of a wireless pulmonary artery pressure monitoring system. Journal of Cardiac Failure. 17 (1), 3-10 (2011).
- Abraham, W. T., et al. Wireless pulmonary artery haemodynamic monitoring in chronic heart failure: a randomised controlled trial. The Lancet. 377 (9766), 658-666 (2011).
- Adamson, P. B., et al. Wireless pulmonary artery pressure monitoring guides management to reduce decompensation in heart failure with preserved ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 7 (6), 935-944 (2014).
- Shatat, M. A., et al. Endothelial Kruppel-like Factor 4 modulates pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (3), 647-653 (2014).
- SPR-1000 Mouse Pressure Catheter. , Available from: https://millar.com/products/research/pressure/single-pressure-no-lumen/spr-1000 (2019).
- Tabima, D. M., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Measuring right ventricular function in the normal and hypertensive mouse hearts using admittance-derived pressure-volume loops. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (6), 2069-2075 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial deletion of hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) alters vascular function and tumor angiogenesis. Blood. 114 (2), 469-477 (2009).
- Harvard Inspira Advanced Safety Ventilator User's Manual. , Available from: http://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Inspira_557058_9.pdf. (2019).
- LabChart. , Available from: https://www.adinstruments.com/products/labchart?creative=290739105773_keyword=labchart_matchtype=e_network=g_device=_gclid=CjwKCAjwxrzoBRBBEiwAbtX1n42I2S06KmccVncUHkmExU8KKOXXREyzx8bvTrxYMSze-ooE0atcbRoCliwQAvD_BwE (2019).
- Marius, M. H., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 62 (25), 42-50 (2013).
- Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Chen, W. C., et al. Right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice. Journal of Visualized Experiments. (71), 50023 (2013).
- Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic characterization of rodent models of pulmonary arterial hypertension. Journal of Visualized Experiments. (110), 53335 (2016).
- Chen, M. Berberine attenuates hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension via bone morphogenetic protein and transforming growth factor-β signaling. Journal of Cellular Physiology. , (2019).
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. Methods in Molecular Biology. vol 1816. Ishikawa, K. , Humana Press. New York, NY. (2018).
