Summary
Her præsenterer vi en protokol til at udføre en invasiv hæodynamisk vurdering af højre ventrikel og pulmonal arterie i mus ved hjælp af en åben bryst kirurgi tilgang.
Abstract
Pulmonal arteriel hypertension (PAH) er en kronisk og svær kardiopulmonær lidelse. Mus er en populær dyremodel, der bruges til at efterligne denne sygdom. Men evalueringen af højre ventrikel tryk (RVP) og pulmonal arterietryk (PAP) er stadig teknisk udfordrende i mus. RVP og PAP er sværere at måle end venstre ventrikel Tryk på grund af de anatomiske forskelle mellem venstre og højre hjerte systemer. I dette papir beskriver vi en stabil højre hjerte hæmodynamiske målemetode og dens validering ved hjælp af raske og PAH mus. Denne metode er baseret på åben bryst kirurgi og mekanisk ventilation støtte. Det er en kompliceret procedure i forhold til lukkede bryst procedurer. Mens en veluddannet kirurg er nødvendig for denne operation, fordelen ved denne procedure er, at det kan generere både RVP og PAP parametre på samme tid, så det er en foretrukket procedure for evaluering af PAH-modeller.
Introduction
Pulmonal arteriel hypertension (PAH) er en kronisk og svær kardiopulmonær lidelse med elevation i pulmonal arterietryk (PAP) og højre ventrikel tryk (RVP), der er forårsaget af cellulære proliferation og fibrose af små pulmonale arterier 1. pulmonale arterie katetre, også kaldet Swan-Ganz katetre2, er almindeligt anvendt i den kliniske monitorering af RVP og pap. Desuden er et trådløst pap-overvågningssystem blevet anvendt klinisk3,4,5. For at efterligne sygdommen til undersøgelse i mus anvendes et hypoxisk miljø til at simulere humane kliniske manifestationer af PAH6. Ved vurderingen af PAP hos dyr er store dyr relativt nemme at overvåge gennem pulmonale arterie katetre ved hjælp af samme teknik som for mennesker, men små dyr som rotter og mus er svære at vurdere på grund af deres lille kropsstørrelse. Hemodynamic måling af højre ventrikel system i mus er muligt med en ultrasmall størrelse 1 fr kateter7. En metode til måling af RVP og pap i mus er blevet rapporteret i litteraturen8,9, men metoden mangler en detaljeret beskrivelse. RVP og PAP er mere udfordrende at måle end venstre ventrikel Tryk på grund af de anatomiske forskelle mellem venstre og højre hjerte systemer.
For at få både pap og RVP parametre i samme mus, vi beskriver en åben-brystet kirurgi-baseret tilgang til højre hjerte hæmodynamiske målinger, dens validering med raske og PAH mus, og hvordan man undgår at generere kunstige data under den komplicerede Open-brystet Kirurgi. Selv om denne teknik er bedst udføres af en veluddannet kirurg, det har den fordel, at være i stand til at vurdere PAP og RVP i samme mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyre protokollen blev gennemgået og godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-brug på Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College (NO. 0000287). Forsøgsdyr blev opstaldet og fodret i henhold til retningslinjerne for dyrevelfærd i Kina.
Bemærk: otte-til 12-ugers gamle mandlige C57BL mus blev anbragt i et miljø med en 12 h mørk/12 h lys cyklus. PAH-musene blev opstaldet i 4 uger under en iltkoncentration på 10%, vedligeholdt af et iltkontrolleret hypoxi kammer for at inducere pulmonal hypertension, og kontrolmus blev anbragt i rumluft (21% ilt) under identiske forhold. RVP og pap målinger blev udført i slutningen af 4 uger af hypoxi Challenge.
1. præoperativt præparat
- Sug tryk transduceren kateter (størrelse: 1 FR) i 0,9% saltvand ved stuetemperatur i mindst 30 minutter før det hæmodynamiske eksperiment.
- Filter 2, 2, 2-Tribromoethanol opløsning med 0,22 μm filter og opbevares i 4-graders køleskab.
- Forbered renset kirurgi værktøjer og forsyninger såsom handsker til kirurgi.
- Forbered 10 mL 1,0% fordøjelsesenzym opløsning til kateter rensning.
- Tilslut tryktransducer kateteret til et tryk volumen system.
- Kalibrer tryk transduceren før opnåelse af trykmålinger for hver mus.
- Drej kalibreringsknappen til 0 mmHg og 25 mmHg for at sende et verifikations tryksignal til dataindsamlings softwaren, og Konfigurer kalibrerings indstillingen i softwaren.
- Drej knappen til transducer og Juster balance knappen til nul baseline.
- Opret et standardstereomicroskop og et temperaturkontrolleret lille dyr operationsbord til vedligeholdelse af kropstemperaturen under operationen.
- Indstil et lysbelysnings system til mikrokirurgi for at give nok lys over operationsområdet.
2. åben bryst kirurgi og hæodynamisk måling
- Anæstetize mus med 250 mg/kg af 2, 2, 2-Tribromoethanol via intraperitoneal (IP) injektion. Hvis det er nødvendigt, gentages supplerende doser ved 1/3 til 1/2 af den oprindelige dosis under proceduren.
- Fjern bryst og nakke pels ved hjælp af en barbermaskine og hårfjerning lotion (figur 1a, 2a).
- Fastgør hver mus i liggende position på et temperaturkontrolleret lille dyr operationsbord for at hjælpe med at opretholde kropstemperaturen (37 °C) under operationen.
- Rengør operationsstedet med 70% ethanal.
- Når anæstesi er i kraft, bekræfte tilstrækkelig anæstesi induktion ved hjælp af en tå knivspids.
- Lav en mellemlinje indsnit på halsen huden (figur 1a).
- Dissekere skeletmuskulaturen ved hjælp af buede pincet og udsætte luftrøret (figur 1B, 1c).
- Udfør intubation gennem munden ved hjælp af en modificeret 22 G intravenøs kappe kateter. Bekræft, at slangen er i luftrøret med pincet (figur 1D).
- Tilslut slangen til en lille dyr ventilator. Beregn og Indstil respirationshastighed og tidevands volumenbaseret på legemsvægt i henhold til ventilatoren brugermanual10. For eksempel indstille respiration sats til 133/min og tidevands volumen til 180 μL for en 30 g mus baseret på den beskrevne beregning.
- Fastgør slangen til ventilation ved hjælp af tape.
- Bekræft tilstrækkelig anæstesi induktion ved hjælp af en tå knivspids.
- Lav en midterlinje indsnit på brystet huden og forsigtigt dissekere brystet muskler ved hjælp af en kautery Tool (figur 2B, 2c).
- Klip brystbenet med en saks hen over midten, og Udsæt brysthulen (figur 2D).
- Undgå enhver blødning ved hjælp af Cautery værktøj under den åbne bryst kirurgi procedure.
- Udsæt højre ventrikel med retraktorer (figur 2E).
- Indsæt det saltvands-gennemblødte tryktransducer kateter gennem en lille tunnel, der er oprettet med en 25 G nål i højre ventrikel for at måle RVP (figur 2F og figur 3a, 3c).
- Hold kateter kablet og krydse lunge ventilen på en koaksial måde med lungearterien. Overhold trykbølge formen og få et stabilt PAP-signal (figur 3B, 3D).
- Optag hæmodynamiske data ved hjælp af dataindsamlingen system og software.
- Efter de endelige målinger, aflive mus humant gennem IP injektion af en overskydende dosis af 2, 2, 2-tribromoethanol opløsning.
- Fjern forsigtigt kateteret fra det højre hjerte system, og Placer det i en 1 mL sprøjte, der indeholder 1% fordøjelsesenzym opløsning.
- Brug destilleret vand til kontinuerligt at skylle kateteret forsigtigt og opbevare det i den originale æske.
3. data analyse for hæodynamik
Bemærk: de hæmodynamiske data blev indspillet og analyseret ved hjælp af Analysis software11 (tabel over materialer).
- For hver mus skal du vælge mindst 10 kontinuerlige og stabile puls cyklusser uden støj for at få de gennemsnitlige data for RVP-eller PAP-data for hver parameter.
- Brug elevens t-test til at sammenligne den normale luftkontrol og hypoxi grupper. Bemærk: p < 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant. Data præsenteres som middelværdien ± SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trykket transducer kateter blev indsat i højre ventrikel (figur 3a) gennem en tunnel udvidet med en 25 G nål, og en typisk RVP bølgeform (figur 3C) blev opnået. Kateteret blev kontinuerligt justeret og langsomt fremskreden og holdt i samme akse som lungearterien, mens den passerer gennem lunge ventilen (figur 3B). Da trykføleren med held blev indsat i lungearterien, dukkede en typisk PAP-bølgeform med et karakteristisk dicrotisk hak op (figur 3D). For at undgå generering af kunstige data observerede vi, om bølgeformen havde støj (figur 4), eller om nulniveauet af kateteret var blevet drevet (figur 5). Hvis dette skete, blev der foretaget korrektioner, og disse segmenter med støj blev udelukket fra dataanalyse.
PAH er karakteriseret ved en vedvarende stigning i PAP og RVP, forårsaget af øget resistens i små pulmonale arterier. PAH defineres ved et gennemsnitligt PAP på ≥ 25 mmHg i hvile, målt under højre hjerte kateterisering i klinikken12. Vi målte RVP og PAP i musene med induceret kronisk hypoksi (opbevares ved 10% ilt i 4 uger) eller en kontrolgruppe (holdes i normal luft). Resultaterne er vist i figur 6. Sammenlignet med dem i den normale luftkontrol gruppe, systolisk pap (figur 6A), diastolisk pap (figur 6B), gennemsnitlig pap (figur 6C), og højre ventrikulært systolisk tryk (figur 6D) blev alle signifikant forøget i den kroniske hypoxi gruppe. Efterforskere har også rapporteret, at sammenlignet med hypoksi alene, en kombination af en vegfr-hæmmer med kronisk hypoksi i 3 uger til at fremkalde svær PAH i mus kan resultere i signifikant forøget RVP13,18.
Figur 1: intubation for mekanisk ventilations støtte i mus. (a) nakke pels fjernes ved hjælp af hårfjerning lotion for at opnå et rent område til kirurgi. En midterlinje indsnit er lavet på huden af halsen. B) den skeletmuskulatur, der dækker luftrøret, eksponeres. C) skeletmuskulaturen dissekteres for at afsløre luftrøret. Den gule pil indikerer luftrøret. D) slangen (modificeret ved hjælp af et intravenøs kateter på 22 G) indsættes i luftvejene, og placeringen bekræftes ved hjælp af pincet. Den gule pil indikerer slangen inde i luftrøret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: åben bryst kirurgi for hæodynamisk måling i højre ventrikel system. (a) brystet pels fjernes ved hjælp hårfjerning lotion for at opnå et rent område til kirurgi. (B) en mellemlinie indsnit er lavet til at udsætte bryst skeletmuskulatur og brystnum. (C) et kautery værktøj bruges til at minimere blødning under bryst åbningen (pilen indikerer Cautery spidsen). D) brystbenet skæres langs midterlinjen (den gule streg linje). (E) to retraktorer anvendes til at udsætte hjertet (den øverste pil indikerer den højre atrieflimvæg, og den nederste pil indikerer den højre ventrikel frie væg). (F) en tryktransducer kateter (den nedre pil) er indsat i højre ventrikel kammer ved hjælp af en punktering værktøj (25 G størrelse nål, den øverste pil) til at producere en lille tunnel på højre ventrikel fri væg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative RVP-og pap-kurver. Tryktransducer kateteret indsættes i det højre ventrikel kammer (A) for at opnå RVP-bølgeform (C). Trykket transducer kateter går gennem lunge ventilen og derefter forbliver i lungearterien (B) at generere pap bølgeform. Pilene angiver det karakteristiske dicrotiske hak på PAP-bølgeformen (D), som er et tegn på en pulmonal ventil lukning. RA = højre atrium, RV = højre ventrikel, PA = pulmonal arteriel, LV = venstre ventrikel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: RVP bølgeform støj forårsaget af berøring af tryksensor overflade til ventrikel væggen. Pile punktet viser en skarp stigning i trykket på RVP kurven (den øvre kanal), som samtidig producerer en kunstig ændring i dP/dt (den nedre kanal). dP/dt beregnes ud fra RVP. De stiplede linjer indikerer dP/dt-støj. Hvis støjen konstant er til stede, kan justering af kateter sensorens position i ventriklen forhindre støj. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: nuldrift af TRYKTRANSDUCER under RVP-måling. Det venstre vindue viser kunstigt lidt forhøjet end-diastolisk RVP. Det højre udvidede vindue viser øget end-diastolisk RVP (pilene indikerer end-diastolic RVP). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: hypoxia-induceret pulmonal arterie hypertension i C57BL mus. (A) systolisk pap (SPAP). B) diastolisk pap (DPAP). C) gennemsnitlig pap (mpap). D) det systoliske tryk i højre ventrikel (RVSP). E) ogf), repræsentative pap-bølgeformer for henholdsvis kontrol og PAH-mus *p < 0,05; Elevens t-test; kontrolgruppe n = 10; hypoxi gruppe n = 3. Data præsenteres som middelværdien ± SD. PAP = pulmonal arterietryk, RVP = højre ventrikel tryk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tracheal intubation er det første vigtige skridt for Open-brystet kirurgi. Den klassiske metode til trakeal intubation for små dyr, såsom rotter eller mus, indebærer at lave et T-formet snit på luftrør og direkte indsætte Y-type trakeal slanger i luftrøret. I praksis finder vi, at denne metode ikke er let under drift. Den Y-type trakeal slange er for stor til små dyr og danner en vinkel med luftrøret. Således er det vanskeligt at fastsætte slangen på plads. Derudover, når intubation slangen utilsigtet kommer ud fra luftvejene under åben bryst kirurgi, det normalt resulterer i animalsk død på grund af tab af mekanisk ventilation støtte. Derfor ændrede vi metoden til endotracheal tubus intubation14 ved at lave et snit på huden, adskille muskellag for at udsætte luftrør (figur 1C), og direkte indsættelse af trakeal slangen i luftvejene gennem dyrs mund. Placeringen af slanger i luftrøret kan bekvemt bekræftes ved at fastspænde luftrøret med pincet (figur 1D). Efter fjernelse af styre nålen og kun ved hjælp af kappe kateter, anvendes et 22 G intravenøst kateter som intubationsslange. Slangen kan let fastgøres efter intubation. Dette er en sikker måde at styre intubation under kirurgi og kan betydeligt forbedre succesraten for små dyr åben bryst kirurgi. Men denne metode kræver uddannelse og praksis.
Den lukkede brystet tilgang til højre hjerte hæmodynamiske måling er blevet beskrevet i detaljer15,16. En begrænsning af den lukkede brystet metode er, at det kan bruges til kun evaluere RVP, fordi kateteret ikke kan få adgang til lungearterien i mus. Vi bruger en mellemlinie bryst indsnit, hvor den højre ventrikel fri væg er placeret, lige under brystbenet (figur 2D). Efter højre ventrikel kateterisation for at opnå RVP, er det let at indsætte kateteret i en koaksial måde med lungearterien for at få PAP (figur 2E). Når brystbenet skæres under den åbne bryst kirurgi, et elektro koagulations værktøj anvendes til at undgå brystbenet skæring sektion blødning for at forhindre kunstigt blodtryksfald forårsaget af blodtab (figur 2C). Det er valgfrit for denne Open-brystet kirurgi til at bruge en P-V loop kateter for at få både RVP og Volume Information17. Men, det er bedst at ikke bruge det til at opnå PAP på grund af sin større størrelse. Selv om denne metode er bedst udføres af en veluddannet kirurg, er det at foretrække frem for den lukkede brystet tilgang, fordi det giver mulighed for vedligeholdelse af trakeal intubation og forebyggelse af blødning under åben bryst kirurgi for at undgå dyrs død.
Derudover er den højre ventrikel frie væg punkteret med en 25 G eller mindre nål for at reducere modstanden under indsættelse af kateteret i ventrikel. Under kateteriseringen må tryk sensorens overflade ikke afvige fra nålens facet for at forhindre utilsigtet beskadigelse af kateter sensoren ved den skarpe metaloverflade. Det er at foretrække ikke at bruge en stor nål til at punktere ventrikel fri væg, da det normalt forårsager yderligere blødning, og den utilstrækkelige blodvolumen i omløb også forårsager kunstige trykdata.
På grund af den lille volumen af ventrikel og den uregelmæssige størrelse af højre ventrikel kammer i mus, tryksensor af kateteret let rører den højre ventrikel fri væg under den høje puls. Dette genererer støj på ventrikel tryk kurven (figur 4), direkte påvirker ventrikel tryk analyse. I dette tilfælde skal katetrets vinkel og dybde justeres, indtil støjen forsvinder for at opnå en jævn ventrikel trykbølge form igen.
Den lille størrelse af 1 fr tryktransducer kateter7 gør det til en meget præcis, præcis tryktransducer. Nuldrift opleves generelt ikke under en standard kateter test i saltvandsopløsning in vitro, medmindre kateteret er defekt eller beskadiget. Ved tilstedeværelse af krops blod kan blodkomponenter, som overholder tryksensor overfladen, dog bevirke, at katetret underkastes nuldrift under et in vivo-eksperiment (figur 5). For at løse dette problem, gør vi følgende: midlertidigt fjerne kateteret ud fra det ventrikulære kammer og placere sensoren spidsen af kateteret i varm 1,0% fordøjelsesenzym opløsning; inkubere det til at fordøje de blodkomponenter, der er fastgjort til sensor overfladen; og efter forsigtigt at tørre kateteret med saltvand-gennemblødt gaze, Indsæt kateteret tilbage til det ventrikulære kammer for at opnå en stabil, ikke-nul drift ventrikel trykbølge form.
Fremstilling af et tryktransducer kateter er også afgørende for at opnå stabile data. Katetrets tryksensor spids skal være gennemblødt i mindst 30 minutter i 0,9% saltvand ved stuetemperatur før in vivo-proceduren for at opretholde katetrets stabilitet. På denne måde kan de elektriske egenskaber ved tryktransducer kateteret stabiliseres optimalt.
Endelig, hypoksi periode er levedygtig fra 3 til 4 uger for hypoxi-induceret hypertension model i mus6,14,17,18. Vores data viste, at 4 ugers hypoksi kan inducere en stabil pulmonal hypertension model i C57BL mus, og PAP og RVP niveauer er sammenlignelige med litteraturen. Yderligere undersøgelse er nødvendig for at tage stilling til, hvor længe PAH-modellen kan opretholdes, hvis musene sættes tilbage i normoxiske forhold for forskellige hypoxi protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning støttes af postgraduate-uddannelses-og undervisnings reform projektet på Peking Union Medical College (10023-2016-002-03), Fuwai Hospital Youth Fund (2018-F09), og direktøren for Beijing Key Laboratory for præklinisk forskning og Vurdering af kardiovaskulære implantat materialer (2018-PT2-ZR05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-5G | For anesthesia |
| Animal temperature controller | Physitemp Instruments, Inc. | TCAT-2LV | For temperature control |
| Dissection forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11274-20 | For surgery |
| Gemini Cautery System | Gemini | GEM 5917 | For surgery |
| Intravenous catheter (22G) | BD angiocath | 381123 | For intubation |
| LabChart 7.3 | ADInstruments | For data analysis | |
| Light illumination system | Olympus | For surgery | |
| Mikro-Tip catheter | Millar Instruments, Houston, TX | SPR-1000 | For pressure measurement |
| Millar Pressure-Volume Systems | Millar Instruments, Houston, TX | MVPS-300 | For pressure measurement |
| O2 Controller and Hypoxia chamber | Biospherix | ProOx 110 | For chronic hypoxia |
| PowerLab Data Acquisition System | ADInstruments | PowerLab 16/30 | For data recording |
| Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | For surgery |
| Small animal ventilator | Harvard Apparatus | Mini-Vent 845 | For surgery |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | For surgery |
| Surgery tape | 3M | For surgery | |
| Terg-a-zyme enzyme | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | For catheter cleaning |
References
- Humbert, M., et al. Advances in therapeutic interventions for patients with pulmonary arterial hypertension. Circulation. 130 (24), 2189-2208 (2014).
- Chatterjee, K. The Swan-Ganz catheters: past, present, and future: a viewpoint. Circulation. 119 (1), 147-152 (2009).
- Adamson, P. B., et al. CHAMPION trial rationale and design: the long-term safety and clinical efficacy of a wireless pulmonary artery pressure monitoring system. Journal of Cardiac Failure. 17 (1), 3-10 (2011).
- Abraham, W. T., et al. Wireless pulmonary artery haemodynamic monitoring in chronic heart failure: a randomised controlled trial. The Lancet. 377 (9766), 658-666 (2011).
- Adamson, P. B., et al. Wireless pulmonary artery pressure monitoring guides management to reduce decompensation in heart failure with preserved ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 7 (6), 935-944 (2014).
- Shatat, M. A., et al. Endothelial Kruppel-like Factor 4 modulates pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (3), 647-653 (2014).
- SPR-1000 Mouse Pressure Catheter. , Available from: https://millar.com/products/research/pressure/single-pressure-no-lumen/spr-1000 (2019).
- Tabima, D. M., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Measuring right ventricular function in the normal and hypertensive mouse hearts using admittance-derived pressure-volume loops. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (6), 2069-2075 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial deletion of hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) alters vascular function and tumor angiogenesis. Blood. 114 (2), 469-477 (2009).
- Harvard Inspira Advanced Safety Ventilator User's Manual. , Available from: http://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Inspira_557058_9.pdf. (2019).
- LabChart. , Available from: https://www.adinstruments.com/products/labchart?creative=290739105773_keyword=labchart_matchtype=e_network=g_device=_gclid=CjwKCAjwxrzoBRBBEiwAbtX1n42I2S06KmccVncUHkmExU8KKOXXREyzx8bvTrxYMSze-ooE0atcbRoCliwQAvD_BwE (2019).
- Marius, M. H., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 62 (25), 42-50 (2013).
- Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Chen, W. C., et al. Right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice. Journal of Visualized Experiments. (71), 50023 (2013).
- Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic characterization of rodent models of pulmonary arterial hypertension. Journal of Visualized Experiments. (110), 53335 (2016).
- Chen, M. Berberine attenuates hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension via bone morphogenetic protein and transforming growth factor-β signaling. Journal of Cellular Physiology. , (2019).
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. Methods in Molecular Biology. vol 1816. Ishikawa, K. , Humana Press. New York, NY. (2018).
