Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para realizar uma avaliação hemodinâmica invasiva do ventrículo direito e artéria pulmonar em camundongos usando uma abordagem de cirurgia de caixa aberta.
Abstract
A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença cardiopulmonar crônica e grave. Os ratos são um modelo animal popular usado para imitar esta doença. No entanto, a avaliação da pressão ventricular direita (RVP) e da pressão pulmonar da artéria (PAP) permanece tecnicamente desafiadora em camundongos. RVP e PAP são mais difíceis de medir do que a pressão ventricular esquerda por causa das diferenças anatômicas entre os sistemas cardíaco esquerdo e direito. Neste artigo, descrevemos um método de medição hemodinâmica do coração direito estável e sua validação usando camundongos saudáveis e PAH. Este método é baseado na cirurgia open-chest e na sustentação mecânica da ventilação. É um procedimento complicado em comparação com procedimentos torácicos fechados. Enquanto um cirurgião bem treinado é necessário para esta cirurgia, a vantagem deste procedimento é que ele pode gerar parâmetros rvp e PAP ao mesmo tempo, por isso é um procedimento preferível para a avaliação dos modelos de HAP.
Introduction
A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença cardiopulmonar crônica e grave com elevação da pressão arterial pulmonar (PAP) e pressão ventricular direita (RVP) causada pela proliferação celular e fibrose de pequenas artérias pulmonares 1. Cateteres de artéria pulmonar, também chamados de cateteres Swan-Ganz2,são comumente usados no monitoramento clínico de RVP e PAP. Além disso, um sistema de monitoramento PAP sem fio tem sido usado clinicamente3,4,5. Para imitar a doença para estudo em camundongos, um ambiente hipóxico é usado para simular manifestações clínicas humanas da HAP6. Na avaliação do PAP em animais, os animais de grande porte são relativamente fáceis de monitorar através de cateteres de artéria pulmonar usando a mesma técnica que para os seres humanos, mas pequenos animais, como ratos e camundongos, são difíceis de avaliar por causa de seu pequeno tamanho corporal. A medida hemodinâmica do sistema ventricular direito em camundongos é possível com um cateter ultrapequeno tamanho 1 Fr7. Um método para medir RVP e PAP em camundongos tem sido relatado na literatura8,9, mas a metodologia carece de uma descrição detalhada. RVP e PAP são mais desafiadores para medir do que a pressão ventricular esquerda por causa das diferenças anatômicas entre os sistemas cardíaco esquerdo e direito.
Para obter parâmetros PAP e RVP no mesmo mouse, descrevemos uma abordagem baseada em cirurgia de caixa aberto para medições hemodinâmicas do coração direito, sua validação com camundongos saudáveis e PAH e como evitar a geração de dados artificiais durante o complicado peito aberto Cirurgia. Embora esta técnica seja melhor executada por um cirurgião bem treinado, tem a vantagem de poder avaliar pap e RVP no mesmo rato.
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Protocol
O protocolo animal foi revisado e aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee no Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College (NO.0000287). Os animais experimentais foram alojados e alimentados de acordo com as diretrizes do bem-estar animal na China.
NOTA: Oito a 12 semanas de idade machos C57BL ratos foram alojados em um ambiente com um 12 h escuro / 12 h ciclo de luz. Os camundongos PAH foram alojados por 4 semanas uma concentração de oxigênio de 10%, mantidos por uma câmara de hipóxia controlada por oxigênio para induzir hipertensão pulmonar, e camundongos controle foram alojados no ar do quarto (21% de oxigênio) em condições idênticas. As medidas de RVP e PAP foram realizadas ao final das 4 semanas de desafio da hipóxia.
1. Preparação pré-operatória
- Mergulhe o cateter transdutor de pressão (tamanho: 1 Fr) em 0,9% de soro lógico à temperatura ambiente por pelo menos 30 min antes do experimento hemodinâmico.
- Filtrar a solução de 2,2,2-Tribromoetanol com filtro de 0,22 μm e armazenar em refrigerador de 4 graus.
- Prepare ferramentas e suprimentos de cirurgia limpos, como luvas para cirurgia.
- Prepare 10 mL de 1,0% de solução de enzimas digestivas para limpeza de cateter.
- Conecte o cateter transdutor de pressão a um sistema de volume de pressão.
- Calibrar o transdutor de pressão antes de obter medidas de pressão para cada mouse.
- Vire o botão de calibração para 0 mmHg e 25 mmHg para enviar um sinal de pressão de verificação para o software de aquisição de dados e configurar a configuração de calibração no software.
- Vire o botão para Transducer e ajuste o botão de equilíbrio para a linha de base zero.
- Configure um estereoscópio padrão e uma tabela cirúrgica animal pequena temperatura-controlada para a manutenção da temperatura de corpo durante a cirurgia.
- Configure um sistema de iluminação leve para microcirurgia para fornecer luz suficiente sobre a área cirúrgica.
2. Cirurgia de peito aberto e medição hemodinâmica
- Camundongos anestesios com 250 mg/kg de 2,2,2-Tribromoetanol via injeção intraperitoneal (i.p.). Se necessário, repita doses suplementares em 1/3 a 1/2 da dose original durante o procedimento.
- Retire a pele do peito e pescoço usando uma loção de barbear e depilação (Figura 1A, 2A).
- Fixe cada rato na posição supina em uma tabela cirúrgica animal pequena temperatura-controlada para ajudar a manter a temperatura de corpo (37 °C) durante a cirurgia.
- Limpe o local cirúrgico com 70% de etano.
- Uma vez que a anestesia está em vigor, confirme a indução adequada da anestesia usando uma pitada do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo.
- Faça uma incisão midline na pele do pescoço(Figura 1A).
- Dissecar o músculo esquelético usando fórceps curvos e expor a traqueia (Figura 1B, 1C).
- Realize a intubação pela boca usando um cateter de bainha intravenosa modificado de 22 G. Confirme que a tubulação está na traqueia usando fórceps (Figura 1D).
- Ligue a tubulação a um pequeno ventilador de animais. Calcule e defina taxa de respiração e volume de marés com base no peso corporal de acordo com o manual do usuário do ventilador10. Por exemplo, defina a taxa de respiração para 133/min e volume de marés para 180 μL para um mouse de 30 g com base no cálculo descrito.
- Fixe a tubulação para ventilação usando a fita adesiva.
- Confirme a indução adequada da anestesia usando uma pitada do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo.
- Faça uma incisão midline na pele do peito e dissecar cuidadosamente os músculos do peito usando uma ferramenta cautery (Figura 2B, 2C).
- Corte o esterno usando uma tesoura no meio e exponha a cavidade torácica(Figura 2D).
- Evite qualquer sangramento usando a ferramenta cautery durante o procedimento de cirurgia de caixa aberta.
- Expor o ventrículo direito com os retratores(Figura 2E).
- Insira o cateter transdutor de pressão salina através de um pequeno túnel criado com uma agulha de 25 G no ventrículo direito para medir RVP (Figura 2F e Figura 3A, 3C).
- Segure o cabo de cateter e atravesse a válvula pulmonar de forma coaxial com a artéria pulmonar. Observe a forma de onda de pressão e obtenha um sinal PAP estável (Figura 3B, 3D).
- Registre dados hemodinâmicos usando o sistema e o software de aquisição de dados.
- Após as medições finais, eutanásia ratos humanamente através de injeção de i.p. de uma dose excessiva de 2,2,2-Solução de Tribromoetanol.
- Retire cuidadosamente o cateter do sistema cardíaco direito e coloque em uma seringa de 1 mL contendo 1% de solução de enzima digestiva.
- Use água destilada para lavar continuamente o cateter com cuidado e armazená-lo na caixa original.
3. Análise de dados para hemodinâmica
NOTA: Os dados hemodinâmicos foram registrados e analisados usando o software de análise11 (Tabela de Materiais).
- Para cada mouse, selecione pelo menos 10 ciclos cardíacos contínuos e estáveis sem ruído para obter os dados médios dos dados de RVP ou PAP para cada parâmetro.
- Use o teste tdo estudante para comparar os grupos normais do controle de ar e da hipóxia. NOTA: p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os dados são apresentados como a média ± SD.
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Representative Results
O cateter transdutor de pressão foi inserido no ventrículo direito(Figura 3A)através de um túnel expandido por uma agulha de 25 G, e uma forma de onda RVP típica (Figura 3C)foi obtida. O cateter foi continuamente ajustado e avançado lentamente e mantido no mesmo eixo que a artéria pulmonar ao passar pela válvula pulmonar(Figura 3B). Quando o sensor de pressão foi inserido com sucesso na artéria pulmonar, uma forma de onda pap típica com um entalhe dicrotic característico apareceu (Figura 3D). Para evitar a geração de dados artificiais, observamos se a forma de onda tinha ruído(Figura 4)ou se o nível zero do cateter havia se desviado (Figura 5). Se isso ocorreu, as correções foram feitas, e esses segmentos com ruído foram excluídos da análise de dados.
A HAP é caracterizada por uma elevação sustentada em PAP e RVP, causada pelo aumento da resistência em pequenas artérias pulmonares. A HAP é definida por um PAP médio de ≥25 mmHg em repouso, medido durante o cateterismo do coração direito na clínica12. Medimos o RVP e o PAP nos camundongos com a hipóxia crônica induzida (mantida em 10% de oxigênio por 4 semanas) ou um grupo controle (mantido no ar normal). Os resultados são mostrados na Figura 6. Comparado com aqueles no grupo de controle aéreo normal, PAP sistólica (Figura 6A), PAP diastólica ( Figura6B), PAP médio ( Figura6C), e pressão sistólica ventricular direita ( Figura6D) foram todos aumentados significativamente no grupo crônico da hipóxia. Os investigadores também relataram que, em comparação com a hipóxia sozinho, uma combinação de um inibidor VEGFR com hipóxia crônica por 3 semanas para induzir HAP grave em camundongos pode resultar em aumento significativo RVP13,18.
Figura 1:Intubação para suporte de ventilação mecânica em camundongos. (A)A pele do pescoço é removida usando loção de depilação para obter uma área limpa para a cirurgia. Uma incisão midline é feita na pele do pescoço. (B) O músculo esquelético que cobre a traqueia é exposto. Osmúsculos esqueléticos são dissecados sem rodeios para expor a traqueia. A seta amarela indica a traqueia. (D)A tubulação (modificada usando um cateter intravenoso de 22 G) é inserida nas vias aéreas, com colocação confirmada usando fórceps. A seta amarela indica a tubulação dentro da traqueia. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2:Cirurgia de tórax aberto para medição hemodinâmica no sistema ventricular direito. (A)A pele torácica é removida usando loção de depilação para obter uma área limpa para cirurgia. (B) Uma incisão midline é feita para expor os músculos esqueléticos do peito e o esterno. (C)Uma ferramenta cautery é usada para minimizar o sangramento durante a abertura do peito (a seta indica a ponta cautery). (D)O esterno é cortado ao longo da linha média (a linha de traço amarelo). (E)Dois retratores são usados para expor o coração (a seta superior indica a parede atrial direita, e a seta inferior indica a parede livre ventricular direita). (F) Um cateter transdutor de pressão (a seta inferior) é inserido na câmara ventricular direita usando uma ferramenta de perfuração (agulha de tamanho 25 G, a seta superior) para produzir um pequeno túnel na parede livre ventricular direita. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3:Representante svp e pap curvas. O cateter transdutor de pressão é inserido na câmara ventricular direita(A)para obter a forma de onda RVP (C). O cateter transdutor de pressão passa pela válvula pulmonar e, em seguida, permanece na artéria pulmonar(B)para gerar a forma de onda PAP. As setas indicam o entalhe dicrotic característico no waveform de PAP (D),que é um sinal de um fechamento pulmonar da válvula. RA = átrio direito, RV = ventrículo direito, PA = artéria pulmonar, LV = ventrículo esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4:RVP ruído de forma de onda causado pelo toque da superfície do sensor de pressão para a parede ventricular. O ponto de seta mostra um aumento acentuado na pressão sobre a curva RVP (o canal superior), que simultaneamente produz uma mudança artificial no dP/dt (o canal inferior). dP/dt é calculado a partir de RVP. As linhas tracejadas indicam ruído dP/dt. Se o ruído estiver constantemente presente, o ajuste da posição do sensor de cateter no ventrículo pode evitar o ruído. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5:Zero deriva de transdutor de pressão durante a medição de RVP. A janela esquerda mostra rvp final-diastólica artificialmente ligeiramente elevado. A janela expandida direita mostra o rVP end-diastólico aumentado (as setas indicam rvp fim-diastólicos). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 6:Hipertensão arterial pulmonar induzida por hipóxia em camundongos C57BL. (A)Pap sistólica (sPAP). (B) Pap diastólica (dPAP). (C)Média PAP (mPAP). (D)Pressão sistólica ventricular direita (RVSP). (E) e (F),formulários de onda pap representativos para controle e camundongos PAH respectivamente *p < 0,05; T-teste do aluno; grupo de controle n = 10; grupo hipóxia n = 3. Os dados são apresentados como a média ± SD. PAP = pressão pulmonar da artéria, RVP = pressão ventricular direita. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
A intubação do traqueal é a primeira etapa importante para cirurgias da aberto-caixa. O método clássico de intubação traqueal para pequenos animais, como ratos ou camundongos, envolve fazer uma incisão em forma de T na traqueia e inserir diretamente tubos traqueais do tipo Y na traqueia. Na prática, descobrimos que este método não é fácil durante a operação. A tubulação do traqueal do Tipo Y é muito grande para pequenos animais e forma um ângulo com a traqueia. Assim, é difícil reparar a tubulação no lugar. Além disso, uma vez que a tubulação de intubação acidentalmente sai das vias aéreas durante a cirurgia de peito aberto, geralmente resulta em morte animal por causa da perda de suporte de ventilação mecânica. Portanto, modificamos o método de intubação endotraqueana14 fazendo uma incisão na pele, separando a camada muscular para expor a traqueia(Figura 1C),e inserindo diretamente a tubulação traqueal nas vias aéreas através da a boca do animal. A colocação de tubos na traqueia pode ser convenientemente confirmada apertando a traqueia usando fórceps (Figura 1D). Depois de remover a agulha guia e usar apenas o cateter bainha, um cateter intravenoso de 22 G é usado como tubos de intubação. A tubulação pode ser facilmente fixada após a intubação. Esta é uma maneira segura de controlar a intubação durante a cirurgia e pode significativamente melhorar a taxa de sucesso da cirurgia da aberto-caixa animal pequeno. No entanto, este método requer treinamento e prática.
A aproximação da fechado-caixa para a medida hemodinâmica do coração direito foi descrita no detalhe15,16. Uma limitação do método da caixa fechado é que pode ser usado para avaliar somente RVP, porque o cateter não pode alcançar a artéria pulmonar nos ratos. Usamos uma incisão no peito de linha média onde a parede livre ventricular direita está localizada, logo abaixo do esterno (Figura 2D). Após o cateterismo ventricular direito para obter RVP, é fácil inserir o cateter de forma coaxial com a artéria pulmonar para obter PAP (Figura 2E). Quando o esterno é cortado durante a cirurgia de peito aberto, uma ferramenta de eletrocoagulação é usada para evitar o sangramento da seção de corte severo para evitar a diminuição da pressão arterial artificial causada pela perda de sangue (Figura 2C). É opcional para esta cirurgia de peito aberto para usar um cateter loop P-V para obter informações de RVP e volume17. No entanto, é melhor não usá-lo para obter PAP por causa de seu tamanho maior. Embora este método seja melhor executado por um cirurgião bem treinado, é preferível à aproximação da fechado-caixa porque permite a manutenção da intubação e da prevenção do traqueal do sangramento durante a cirurgia da aberto-caixa para evitar a morte animal.
Além disso, a parede livre ventricular direita é perfurada com uma agulha de 25 G ou menor para reduzir a resistência durante a inserção do cateter no ventrículo. Durante o cateterismo, a superfície do sensor de pressão não deve desviar-se do bisumem da agulha para evitar danos acidentais ao sensor de cateter pela superfície de metal afiada. É preferível não usar uma agulha grande para perfurar a parede livre ventricular, pois geralmente causa mais sangramento, e o volume sanguíneo insuficiente em circulação também causa dados de pressão artificial.
Por causa do pequeno volume do ventrículo e do tamanho irregular da câmara ventricular direita em camundongos, o sensor de pressão do cateter toca facilmente a parede livre ventricular direita durante a alta taxa de batimento cardíaco. Isso gera ruído na curva de pressão ventricular (Figura 4),afetando diretamente a análise de pressão ventricular. Neste caso, o ângulo e a profundidade do cateter devem ser ajustados até que o ruído desapareça para obter um formulário de onda de pressão ventricular liso outra vez.
O pequeno tamanho do cateter transdutor de pressão 1 Fr7 torna-o um transdutor de pressão muito preciso e preciso. A tração zero geralmente não é experimentada durante um teste padrão do cateter na solução soro fisiona, a menos que o cateter esteja com defeito ou danificado. No entanto, na presença de sangue corporal, componentes sanguíneos que aderem à superfície do sensor de pressão podem fazer com que o cateter se submeta a zero de deriva durante um experimento in vivo(Figura 5). Para resolver esta questão, fazemos o seguinte: remover temporariamente o cateter para fora da câmara ventricular e colocar a ponta do sensor do cateter em solução de enzima digestiva quente de 1,0%; incuba-lo para digerir os componentes sanguíneos ligados à superfície do sensor; e depois de limpar suavemente o cateter com gaze sorino-embebido, insira o cateter de volta para a câmara ventricular para obter um estável, não-zero deriva ventricular forma de onda de pressão.
A preparação de um cateter transdutor de pressão também é essencial para obter dados estáveis. A ponta do sensor de pressão do cateter deve ser embebida por pelo menos 30 minutos em 0,9% de soro latente à temperatura ambiente antes do procedimento in vivo para manter a estabilidade do cateter. Desta forma, as características elétricas do cateter transdutor de pressão podem ser estabilizadas de forma otimizada.
Finalmente, o período de hipóxia é viável de 3 a 4 semanas para o modelo de hipertensão induzida pela hipóxia em camundongos6,14,17,18. Nossos dados mostraram que 4 semanas de hipóxia podem induzir um modelo estável de hipertensão pulmonar em camundongos C57BL, e os níveis DE PAP e RVP são comparáveis com a literatura. Um estudo mais adicional é necessário endereçar quanto tempo o modelo do PAH pode ser mantido se os ratos são postos para trás em circunstâncias normoxic para protocolos diferentes da hipóxia.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa é apoiada pelo Projeto de Pós-Graduação em Educação e Reforma Do Ensino da Faculdade de Medicina da União de Pequim (10023-2016-002-03), pelo Fuwai Hospital Youth Fund (2018-F09) e pelo Fundo diretor do Laboratório-Chave de Pesquisa Pré-clínica de Pequim e Avaliação de Materiais de ImplanteS Cardiovasculares (2018-PT2-ZR05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-5G | For anesthesia |
| Animal temperature controller | Physitemp Instruments, Inc. | TCAT-2LV | For temperature control |
| Dissection forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11274-20 | For surgery |
| Gemini Cautery System | Gemini | GEM 5917 | For surgery |
| Intravenous catheter (22G) | BD angiocath | 381123 | For intubation |
| LabChart 7.3 | ADInstruments | For data analysis | |
| Light illumination system | Olympus | For surgery | |
| Mikro-Tip catheter | Millar Instruments, Houston, TX | SPR-1000 | For pressure measurement |
| Millar Pressure-Volume Systems | Millar Instruments, Houston, TX | MVPS-300 | For pressure measurement |
| O2 Controller and Hypoxia chamber | Biospherix | ProOx 110 | For chronic hypoxia |
| PowerLab Data Acquisition System | ADInstruments | PowerLab 16/30 | For data recording |
| Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | For surgery |
| Small animal ventilator | Harvard Apparatus | Mini-Vent 845 | For surgery |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | For surgery |
| Surgery tape | 3M | For surgery | |
| Terg-a-zyme enzyme | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | For catheter cleaning |
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