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Neuroscience

प्रोटीन के प्रकाश-प्रेरित आण्विक अवशोषण माइक्रो-पैटर्निंग के लिए प्राइमो सिस्टम का उपयोग करने के लिए अध्ययन सेल जवाब करने के लिए extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन

Published: October 11, 2019 doi: 10.3791/60092
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3,4, 5, 1
1Faculty of Biology, Medicine and Health. Division of Cell Matrix, Biology and Regenerative Medicine, Wellcome Trust Centre for Cell-Matrix Research, The University of Manchester, 2School of Materials, The University of Manchester, 3Blond McIndoe Laboratories, School of Biological Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, Division of Cell Matrix Biology and Regenerative Medicine, The University of Manchester, Manchester Academic Health Science Centre, 4Department of Plastic Surgery & Burns, Wythenshawe Hospital, Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Centre, 5Department of Pathology, UMC Utrecht
* These authors contributed equally

Summary

हमारा समग्र उद्देश्य यह समझने के लिए है कि कोशिकाओं को कैसे अतिरिक्त कोशिकीय संकेतों को समझना है जो निर्देशित एक्सोनल विकास की ओर ले जाते हैं। यहाँ, हम प्रोटीन के प्रकाश-प्रेरित आण्विक अवशोषण की पद्धति का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग एक्सॉन आउटग्रोथ और पथखोज को नियंत्रित करने वाली विशिष्ट घटनाओं का अध्ययन करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स घटकों के परिभाषित सूक्ष्म-पैटर्नका उत्पादन करने के लिए किया जाता है।

Abstract

कोशिकाओं को extracellular संकेतों की एक किस्म भावना, संरचना और extracellular मैट्रिक्स की ज्यामिति सहित, जो संश्लेषित और कोशिकाओं द्वारा खुद को remodeled है. यहाँ, हम प्रोटीन के एक या संयोजन का उपयोग कर सूक्ष्म-पैटर्नवाले एक्स्ट्राकोल्यूलर मैट्रिक्स (ईसीएम) substrates का उत्पादन करने के लिए एक पैटर्न तकनीक के रूप में PRIMO प्रणाली का उपयोग प्रोटीन के प्रकाश-प्रेरित आण्विक अवशोषण (LIMAP) की विधि प्रस्तुत करते हैं। विधि उत्कृष्ट reproducibility के साथ माइक्रोन संकल्प में ईसीएम पैटर्न के मुद्रण सक्षम बनाता है। हम एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और यह न्यूरॉन pathfinding की प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है. LIMAP एक से अधिक घटक पैटर्न की आसानी और किसी भी ज्यामिति या ढाल के साथ एक पैटर्न उत्पन्न करने की क्षमता के मामले में मौजूदा सूक्ष्म मुद्रण विधियों पर महत्वपूर्ण लाभ है. प्रोटोकॉल आसानी से सेल भाग्य और सेल व्यवहार की दिशा में लगभग किसी भी रासायनिक घटक के योगदान का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. अंत में, हम आम मुद्दों पर चर्चा करते हैं जो उत्पन्न हो सकते हैं और इनसे कैसे बचा जा सकता है।

Introduction

हाल के वर्षों में, जैविक विज्ञान तेजी से सामग्री विज्ञान द्वारा प्रदान की अग्रिमों का उपयोग किया है. इसका एक प्रमुख उदाहरण सब्स्ट्राट्स का माइक्रो-पैटर्निंग है, जिसका उपयोग सेल प्रसार जैसी सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।1,2भेदभाव3,4,5,6, सेल प्रवास7,8,9और पथखोज10,11. वहाँ उपलब्ध तकनीकों की एक संख्या है कि इस तरह के multiphoton उत्साहित photochemistry के रूप में substrates के माइक्रो-पैटर्निंग सक्षम कर रहे हैं12, एएफएम डिप-पेन नैनोलिथोग्राफी13, पिन और इंकजेट प्रत्यक्ष मुद्रण14, इलेक्ट्रॉन किरणपुंज लिथोग्राफी15या माइक्रोफ्लूइडिक्स16. हालांकि, दो तकनीक है कि व्यापक रूप से जैविक क्षेत्र में उपयोग किया जाता है microcontact मुद्रण कर रहे हैं17,18,19या लेसर-सहायता पैटर्निंग3(चित्र 1). लेजर की मदद पैटर्न प्रोटीन और खूंटी स्थिरता और पैटर्न पर सेल कारावास के मामले में अधिक विश्वसनीय परिणाम देने के लिए माना जाता है, microcontact मुद्रण की तुलना में20. यहाँ वर्णित माइक्रो-पैटर्निंग के लिए एक अधिक उपन्यास दृष्टिकोण प्रोटीन के प्रकाश-प्रेरित आण्विक अवशोषण का उपयोग है21(LIMAP,चित्र 1 D) एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली का उपयोग कर (PRIMO,सामग्री की तालिका). तरीकों में से प्रत्येक लाभ और सीमाओं है कि संक्षेप में नीचे वर्णित हैं. माइक्रोसंपर्क प्रिंटिंग में लिथोग्राफी किए गए मास्टरों से उत्पन्न होने वाली वांछित सूक्ष्म-विशेषताओं के साथ पीडीएमएस मोल्ड (स्टाम्प) का उपयोग किया जाता है। टिकटों को एक चुने हुए प्रोटीन के साथ इनक्यूबेट किया जाता है जिसे सेल कल्चर सब्सट्रेट पर स्थानांतरित किया जाता है (स्टैम्प्ड)18(चित्र 1 एक). लेजर की मदद से पैटर्न एक विरोधी fouling फिल्म को छोड़ने के लिए यूवी प्रकाश का उपयोग करता है22,23,24,25, उन क्षेत्रों को उजागर करना जिन्हें बाद में ब्याज के प्रोटीन के साथ लेपित किया जा सकता है (चित्र 1 बी). जबकि फोटो-पैटर्निंग दृष्टिकोण के साथ प्राप्त संकल्प माइक्रोन रेंज में है25,26, इन तकनीकों में से अधिकांश एक फोटो मास्क की आवश्यकता होती है, या तो नमूने के साथ संपर्क में, या माइक्रोस्कोप उद्देश्य के वस्तु विमान में स्थित23,27,28. दोनों microcontact मुद्रण और फोटो-पैटर्निंग में मास्क के लिए आवश्यकताओं को एक सीमा हो सकती है; विशिष्ट मास्क हर ज्यामितीय पैटर्न और आकार है, जो महंगा हो सकता है और उत्पन्न करने के लिए समय लेने के लिए आवश्यक हैं। इन तकनीकों के विपरीत, LIMAP एक मुखौटा की आवश्यकता नहीं है (चित्र 1 D). LIMAP के लिए PRIMO प्रणाली का उपयोग शुरू में गहन लागत हो सकता है क्योंकि यह उपकरणों की खरीद की आवश्यकता है. हालांकि, खुला स्रोत सॉफ्टवेयर किसी भी वांछित ज्यामिति के पैटर्न डिजाइन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और अधिक स्वतंत्रता दे रही है और प्रोटीन एकाग्रता gradients के उपयोग सहित अधिक जटिल प्रयोगों की अनुमति. PRIMO लेजर नियंत्रित और एक डिजिटल नियंत्रित micromirror डिवाइस द्वारा निर्देशित है (DMD) उपयोगकर्ता परिभाषित geometries के किसी भी संख्या में पैटर्न बनाने के लिए. LIMAP की आवश्यकता है संस्कृति सतह अणुओं है कि सेल लगाव को रोकने के साथ लेपित किया जा करने के लिए. पॉलीथीन ग्लाइकोल (PEG) सबसे अधिक इस तरह के एक "antifouling" अभिकर्मक के रूप में प्रयोग किया जाता है; यह कांच या प्लास्टिक की सतह पर एक घने एंटी-चिपकने वाला फिल्म बनाता है29. बाद में, एक फोटो-इनेटर जोड़ा जाता है जो खूंटी फिल्म को फोटोसिस तंत्र के माध्यम से उच्च परिशुद्धता के साथ हटाया जा सकता है30DMD के नियंत्रण में यूवी प्रकाश के लिए स्थानीय जोखिम द्वारा. इन खूंटी मुक्त क्षेत्रों प्रोटीन है कि लेजर etched सतह के लिए adsorb के साथ लेपित किया जा सकता है, एक माइक्रो-पैटर्न पैदा. लेजर शक्ति अलग करके, खूंटी की विभिन्न मात्रा उपयोगकर्ता प्रोटीन gradients उत्पन्न करने के लिए अनुमति सतह से हटाया जा सकता है. खूंटी हटाने और कोटिंग प्रक्रिया एक ही माइक्रो अच्छी तरह से दो या दो से अधिक अलग प्रोटीन के साथ पैटर्न बनाने के लिए दोहराया जा सकता है21. उत्पन्न माइक्रो-पैटर्न कोशिकाओं के लिए चिपकने वाला सतहों प्रदान करते हैं, सेल व्यवहार के अध्ययन की अनुमति. हमारे अध्ययन में, हम एक न्यूरोनल सेल लाइन के न्यूराइट या एक्सॉन पाथफाइंडिंग का अध्ययन करने के लिए माइक्रो-पैटर्निंग का उपयोग करते हैं (सीएडी (कैथेकोलोमाइनर्जिक-एक विभेदित) कोशिकाओं31) या प्राथमिक चूहा पृष्ठीय जड़ गुच्छिका (DRG) न्यूरॉन्स, क्रमशः. यहाँ, हम LIMAP के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल रूपरेखा (चित्र 2) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध PRIMO प्रणाली और साथ लियोनार्डो सॉफ्टवेयर का उपयोग कर। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह कैसे परिभाषित geometries और कई प्रोटीन है, जो हम axonal pathfinding का अध्ययन करने के लिए उपयोग के साथ पैटर्न की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम आम मुद्दों पर चर्चा करते हैं जो उत्पन्न हो सकते हैं और इनसे कैसे बचा जा सकता है।

Protocol

1. पैटर्न टेम्पलेट्स के डिजाइन

नोट: पैटर्न के लिए टेम्पलेट्स डिजिटल ड्राइंग सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका) केसाथ उत्पन्न कर रहे हैं। विभिन्न ग्रे स्तर ों में ड्राइंग लेजर तीव्रता का निर्धारण करेगा। पैटर्न टेम्पलेट्स डिजाइन करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग किसी भी वांछित ज्यामिति और gradients के साथ पैटर्न की तेजी से पीढ़ी की अनुमति देता है (चित्र 3) .

  1. डिजिटल ड्राइंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वांछित पैटर्न टेम्पलेट आकर्षित। 1824 पिक्सेल लंबाई और 1140 पिक्सेल चौड़ाई (जो इस अध्ययन में 415 डिग्री मीटर लंबाई और 260 डिग्री चौड़ाई से मेल खाती है) की एक छवि आकार का चयन करें। प्रतिमान टेम्पलेट को 8-बिट Tiff फ़ाइल के रूप में सहेजें.
    नोट: टेम्पलेट्स उत्पन्न करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल माइक्रो-पैटर्निंग उपकरण(सामग्री की तालिका)commercializes जो ब्रांड के लिए अनुरोध पर उपलब्ध है।

2. प्लाज्मा सफाई

नोट: इष्टतम परिणाम पैटर्न से पहले सतहों के प्लाज्मा सफाई की आवश्यकता होती है, जो सभी कार्बनिक पदार्थ को हटाने और सतह को सक्रिय करेगा. वर्तमान मामले में, परिवेश हवा सतह सक्रियण के लिए पर्याप्त है. एक प्लाज्मा क्लीनर (सामग्री की तालिका) 1000-1300 mTorr की एक प्रक्रिया दबाव और 1-5 मिनट के लिए 29.6 डब्ल्यू की शक्ति के साथ इस्तेमाल किया गया था।

  1. एक 20 मिमी आंतरिक अच्छी तरह से आकार और 0.16-0.19 मिमी के गिलास मोटाई के साथ कांच के नीचे पकवान / कई शर्तों के परीक्षण के लिए, एक 6 अच्छी तरह से ग्लास नीचे पकवान का उपयोग करें. अन्यथा, एक भी अच्छी तरह से गिलास नीचे पकवान(सामग्री की मेज) का उपयोग करें.
    नोट: प्लाज्मा सफाई के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल ब्रांड जो प्लाज्मा सफाई उपकरण(सामग्री की तालिका)commercializes के अनुरोध पर उपलब्ध है.

3. पारगम्यता

नोट: यह कदम एक antifouling फिल्म है कि कांच की सतह के लिए प्रोटीन अधिशोषण रोकता उत्पन्न करता है. खूंटी एक antifouling एजेंट के रूप में प्रोटीन अधिशोषण29 के लिए उच्च प्रतिरोध प्रदान करता है. LIMAP यूवी photoscission के माध्यम से स्थानीय रूप से खूंटी को दूर करने के लिए एक फोटो-इनिटेटर का उपयोग करता है। प्रोटीन/ ब्याज की है तो इन खूंटी मुक्त सतहों21के लिए adsorb होगा, माइक्रो-पैटर्न पैदा.

  1. PLL-PEG के साथ पासिवेशन
    1. बाँझ शर्तों के तहत, PDMS stencils में कटौती (चित्रा 4ए, बी और सामग्री की तालिकादेखें) यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे भीतरी कांच के नीचे अच्छी तरह से फिट हैं, और बाँझ forceps के साथ आंतरिक माइक्रो-वेल भरने को हटा दें। संदंश का उपयोग करके कांच पर स्टेंसिल को अच्छी तरह से चिपकाएं।
    2. सुनिश्चित करें कि स्टेंसिल कांच पर कसकर अच्छी तरह से चिपके रहते हैं, हवा के बुलबुले के गठन को रोकते हैं जो पासिवेशन प्रक्रिया के दौरान रिसाव का कारण बन सकते हैं।
      नोट: PDMS स्टेंसिल भी प्रकाशित प्रोटोकॉल18,32का उपयोग कर घर में निर्मित किया जा सकता है.
    3. फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में PLL-PEG घोल(सामग्री की सारणी,0ण्1 मिलीग्राम/एमएल) तैयार करें। PLL-PEG समाधान के 20 $L प्रत्येक माइक्रो-वेल में जोड़ें और कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें, 1 h के लिए।
    4. सूक्ष्म कुओं से PLL-PEG के 15 डिग्री एल निकालें और उन्हें पीबीएस के 20 डिग्री एल (सामग्री की तालिका) के साथ पांच बार धोने उन्हें सूखी दे के बिना.
      नोट: हमेशा washes के बीच में पीबीएस के लगभग 5 $L छोड़ दें। उनकी छोटी मात्रा को देखते हुए, सूक्ष्म कुओं विशेष रूप से सुखाने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। सुखाने गरीब गुणवत्ता के सूक्ष्म पैटर्न में परिणाम होगा.
    5. या तो पीबीएस में संस्कृति पकवान रखने के लिए (3 एमएल प्रति अच्छी तरह से) 4 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 3 दिनों के लिए या अगले कदम के साथ जारी रखें (चरण 3.1.5).
    6. एक एकल माइक्रो-वेल से पीबीएस के 18 डिग्री सेल्सियस निकालें (उदाहरण के लिए, शीर्ष बाएँ माइक्रो-वेल, चित्रा 4Dदेखें), फोटो-प्रारंभक (PLPP, सामग्री की तालिका)के 5 $L जोड़ें और शेष माइक्रो-वेल्स में पीबीएस के 20 डिग्री सेल्सियस को छोड़ दें। PLPP के साथ इस माइक्रो-वेल का उपयोग सिस्टम अंशांकन चरण (चरण 4) के दौरान एक संदर्भ प्रतिमान बनाने के लिए किया जाएगा (चित्र 4D,Eदेखें)। PLPP प्रकाश से सुरक्षित रखें.
  2. लंबे समय से स्थायी खूंटी-SVA के साथ passivation
    नोट: विरोधी चिपकने वाला सतह एक का उपयोग कर सकते हैं उत्पन्न करने के लिए: 1) पाली-L-Lysine से जुड़े एक खूंटी (PLL-PEG, चरण 3.1) या 2) एक खूंटी-succinate N-hydroxisuccinimide (PEG-SVA). एक या अन्य passivation विकल्प का चयन करने का निर्णय भंडारण विकल्प पर निर्भर करता है (चरण 10 देखें). खूंटी-SVA के साथ incubated संस्कृति व्यंजन passivation और photopatterning समय की डबल राशि की आवश्यकता है.
    1. चरण 3.1.1 में वर्णित के रूप में स्टेंसिल तैयार करें।
    2. PLL के साथ पूर्व कोट करने के लिए 30 मिनट के लिए प्रत्येक माइक्रो-वेल और इनक्यूबेट के लिए 0.01% पाली-एल-Lysine (PLL, सामग्री की तालिका)के 20 $L जोड़ें।
    3. सूक्ष्म कुओं से पीएलएल के 15 डिग्री एल को निकालें और कुओं को सूखने की अनुमति दिए बिना 1 एम हेप्स बफर (सामग्री की तालिका) के 20 डिग्री सेल्सियस के साथ तीन बार धो लें।
      नोट: हमेशा hepes या PBS के लगभग 5 $L washes के बीच में छोड़ दें. उनकी छोटी मात्रा को देखते हुए, सूक्ष्म कुओं विशेष रूप से सुखाने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। सुखाने गरीब गुणवत्ता के सूक्ष्म पैटर्न में परिणाम होगा.
    4. खूंटी-SVA समाधान तैयार करें. खूंटी-SVA समाधान (50 mg/mL HEPES बफर 1M में) उपयोग से तुरंत पहले हर बार ताजा तैयार किया जाना चाहिए। प्रति सूक्ष्म-वेल में 20 डिग्री सेल्सियस पीईजी-एसवीए तैयार की जा सकता है।
    5. HEPES बफ़र 8-8.5 के बीच एक pH होना चाहिए। पीएच पेपर के साथ खूंटी-SVA समाधान तैयार करने से पहले HEPES pH का परीक्षण करें। एक सटीक पैमाने का उपयोग कर एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में खूंटी-SVA वजन। HEPES बफर और भंवर 30 s भंग जब तक जोड़ें. जब समाधान पारदर्शी होता है तो खूंटी-SVA पूरी तरह से भंग हो जाता है।
      नोट: SVA पहले लेपित PLL करने के लिए खूंटी की बाध्यकारी अनुमति देता है कि एस्टर है. एक बार HEPES बफर खूंटी-SVA में जोड़ा जाता है, SVA 15 मिनट का एक आधा जीवन है और तुरंत इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    6. प्रत्येक सूक्ष्म-वेल में पेग-एसवीए समाधान का 20 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें, 1 h के लिए 1 h. सूक्ष्म कुओं से पीईजी-एसवीए के 15 डिग्री सेल्सियस निकालें और पीबीएस(सामग्री की तालिका)के 20 डिग्री एल के साथ पांच बार धो लें।
    7. या तो लंबी अवधि के भंडारण के लिए संस्कृति पकवान तैयार (अप करने के लिए 1 महीने, कदम 10.2) देखें या अगले कदम के लिए आगे बढ़ना (चरण 3.2.8).
    8. एक एकल सूक्ष्म-वेल से पीबीएस के 18 डिग्री सेल्सियस को निकालें (उदाहरण के लिए, शीर्ष बाएँ सूक्ष्म-अच्छी, चित्रा 4Dदेखें), PLPP ( सामग्रीकी तालिका)के 5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और शेष सूक्ष्म-कुओं में पीबीएस के 20 डिग्री सेल्सियस छोड़ दें। इस माइक्रो अच्छी तरह से एक संदर्भ पैटर्न बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (देखें Fi gure 4D, ई). सुनिश्चित करें कि PLPP माइक्रो अच्छी तरह से की पूरी सतह पर समरूप है. PLPP प्रकाश से सुरक्षित रखें.

4. सिस्टम अंशांकन

नोट: इन चरणों में, लेजर का ध्यान संस्कृति पकवान के विशेष प्रकार के लिए समायोजित किया जाएगा (चरण 4.1). एक संदर्भ पैटर्न केवल एक माइक्रो अच्छी तरह से उत्पन्न किया जाएगा (चरण 4.2) एक प्रोटीन समाधान के साथ ऊष्मायन के बाद (चरण 4.3) लेजर के इष्टतम ध्यान शर्तों को सुनिश्चित करने के लिए (चरण 4.4), तेज और परिभाषित पैटर्न प्राप्त करने के लिए आवश्यक.

  1. लेजर अंशांकन
    नोट: अंशांकन प्रक्रिया के दौरान, एक अंशांकन लेजर छवि एक फ्लोरोसेंट-हाइलाइटेड ग्लास सतह पर पेश किया जाएगा (केलिब्रेशन अच्छी तरह से, एक फ्लोरोसेंट हाइलाइटर के साथ चिह्नित, चित्रा 4सी),जो पर ध्यान केंद्रित करने में रखा जाना चाहिए माइक्रोस्कोप.
    1. एक फ्लोरोसेंट हाइलाइटर (सामग्री की तालिका) काउपयोग करने के लिए एक खाली भीतरी गिलास अच्छी तरह से चिह्नित.
      नोट: अंशांकन अच्छी तरह से एक ही गिलास मोटाई (0.16-0.19 मिमी) संस्कृति पकवान जिस पर माइक्रो-पैटर्न उत्पन्न किया जाएगा के रूप में होना चाहिए। यदि एक 6 अच्छी तरह से ग्लास नीचे पकवान इस्तेमाल किया जा रहा है, एक खाली अच्छी तरह से अंशांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और बाँझ शर्तों के तहत फ्लोरोसेंट हाइलाइटर के साथ चिह्नित किया जाना चाहिए.
    2. माइक्रोस्कोप, मंच और कंप्यूटर पर स्विच करें. PRIMO माइक्रो-पैटर्निंग उपकरण पर स्विच करें, माइक्रो-प्रबंधक और लियोनार्डो सॉफ्टवेयर खोलें। लियोनार्डो सॉफ्टवेयर Plugins के तहत माइक्रो प्रबंधक के माध्यम से संचालित है. सामग्री तालिका में उपकरणों और सॉफ्टवेयर के ब्रांडों/कैटलॉगसंख्या की जाँच करें।
    3. लियोनार्डो के प्रारंभिक मेनू में, कैलिब्रेटका चयन करें। जाँच करें कि समर्पित PRIMO फिल्टर घन फिल्टर बुर्ज में सही स्थिति (ऑप्टिकल पथ) में है; 20X उद्देश्य (0.75 डीआईसी एस योजना Fluor, कोई चरण की अंगूठी) दोनों माइक्रोस्कोप पर और लियोनार्डो सॉफ्टवेयर पर का चयन करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल लियोनार्डो संस्करण 4.4 के लिए समायोजित किया जाता है। प्रोटोकॉल अन्य संस्करणों के लिए समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।
    4. उद्देश्य के ऊपर पहले हाइलाइट किए गए अंशांकन को अच्छी तरह से स्थित करें (चित्र 4C) . कैमरा पथ का चयन करें. प्राइमो लोगो और टैग लाइन दोनों की लेजर प्रक्षेपण ध्यान में रखते हुए उद्देश्य ध्यान समायोजित करें।
    5. 25 एमएस पर डिफ़ॉल्ट कैमरा जोखिम समय छोड़ दो लेजर तीव्रता समायोजित ग्रे रंग में PRIMO लोगो प्रक्षेपण से पत्र मैं और सफेद में पत्र के बाकी देखने के लिए.
    6. फोकल विमान की $ स्थिति रिकॉर्ड, (नमूना करने के लिए उद्देश्य की ऊंचाई) बाद में अंशांकन की स्थिति के रूप में संदर्भित. यह संदर्भ पैटर्न पीढ़ी के बाद प्राप्त इष्टतम ध्यान करने के लिए एक सन्निकटन हो जाएगा (चरण 4-2-4.4) देखें.
  2. संदर्भ पैटर्न
    1. उद्देश्य के ऊपर फोटो-इनेटर (संदर्भ पैटर्न माइक्रो-वेल, चित्र 4 डी)युक्त माइक्रो-वेल के साथ संस्कृति पकवान स्थिति और लियोनार्डो सॉफ्टवेयर में अब पैटर्न का चयन करें।
    2. कैमरे के माध्यम से प्रेषित प्रकाश के साथ माइक्रो-वेल के किनारे को विज़ुअलाइज़ करें और दाएँ हाथ के मेनू से ROI प्रतीक चुनें। ROI वृत्त का व्यास 4000$m पर सेट करें और वर्तमान माइक्रो-वेल के किनारे के साथ डिजिटल ROI के किनारे को संरेखित करें.
    3. सुनिश्चित करें कि माइक्रो-वेल के किनारों के चारों ओर चरण को ले जाकर डिजिटल ROI और वर्तमान माइक्रो-वेल के बीच सटीक ओवरलैप है। ROI स्थिति मंच आंदोलनों के लिए युग्मित किया जाएगा.
    4. लियोनार्डो सॉफ्टवेयर में ताला वांछित स्थिति में ROI लॉक करने के लिए का चयन करें। प्रेषित प्रकाश बंद करें.
    5. वांछित पैटर्न टेम्पलेट अपलोड करने के लिए PRIMO का चयन करें, जिसे ROI पर डिज़ाइन इकाई के रूप में प्रक्षेपित किया जाएगा (चित्र 5देखें). प्रतिमान किसी ड्रॉपडाउन सूची में दिखाई देंगे, जिसे क्रियाओं के रूप में संदर्भित किया जाता है और सॉफ़्टवेयर पर क्रियाएँ मेनू में दिखाया जाता है.
      नोट: पैटर्न टेम्पलेट्स पहले डिजाइन की जरूरत है (चरण 1 देखें) और सॉफ्टवेयर में टेम्पलेट लोड करने से पहले एक 8-बिट Tiff फ़ाइल के रूप में सहेजा गया।
    6. संदर्भ पैटर्न के लिए केवल एक छोटा सा पैटर्न की आवश्यकता है; उदाहरण के लिए, 3 पंक्तियाँ, 1 स्तंभ (चित्र 4E और चित्र 5Bदेखें ). प्रतिकृति मेनू में, स्तंभों और पंक्तियों (रलियोनार्डो सॉफ्टवेयर मेंलाइन्स) की वांछित संख्या निर्धारित करें। प्रतिमान डिज़ाइन का डिजिटल पूर्वावलोकन देखने के लिए ताज़ा करें क्लिक करें.
    7. प्रतिकृति मेनू में लेज़र खुराक सेट करें। इस सेटिंग में इष्टतम लेजर खुराक और PLL-PEG का उपयोगकर 1390 mJ/
      नोट: लेजर शक्ति 5-7.5 mW/mm2के बीच भिन्न हो सकते हैं। इस मामले में, यह 7.5 mW/mm2है, जो प्रत्येक डिजाइन इकाई पैटर्न के लिए लगभग 30 s लेता है, 1390 mJ/mm2की एक लेजर खुराक का उपयोग कर. उच्च लेजर खुराक की आवश्यकता हो सकती है अगर संस्कृति पकवान सतह खूंटी-SVA के साथ passivated है (लगभग डबल लेजर खुराक PLL-PEG की तुलना में). इसका पहले से परीक्षण किए जाने की आवश्यकता है।
    8. सूक्ष्म-वेल के एक परिधीय क्षेत्र पर नेविगेट करें, (उदाहरण के लिए, शीर्ष भाग) सूक्ष्म-वेल की पैटर्न उत्पादन (मध्य क्षेत्र) के लिए रुचि के मुख्य क्षेत्र से दूर (चित्र 4Eदेखें ) और लॉकका चयन करें। प्रतिमान प्रदर्शित होने तक प्रतीक्षा करें.
    9. अंशांकन की $-स्थिति के लिए फोकस समायोजित करें (चरण 4.1.6 देखें)।
      नोट: यह एक अतिरिक्त प्रणाली अंशांकन कदम करने के लिए सिफारिश की है अगर एक अन्य उपयोगकर्ता photopatterning दौर के बीच एक ही माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहा है.
    10. पैटर्न शुरू करने के लिए प्ले प्रतीक का चयन करें। सुनिश्चित करें कि लेजर सॉफ्टवेयर में पर है. पैटर्निंग प्रक्रिया समाप्त होने तक प्रतीक्षा करें। पैटर्निंग अवधि अनुमानित समय पैनल में प्रदर्शित की जाएगी। लियोनार्डो सॉफ्टवेयर संस्करण पर 4.4 पैटर्न पूरा हो गया है जब सभी कार्यों दृश्य मेनूमें नीले दिखाई देते हैं।
  3. संदर्भ पैटर्न पर प्रोटीन ऊष्मायन
    1. बाँझ शर्तों के तहत, संदर्भ पैटर्न माइक्रो अच्छी तरह से पीबीएस के 20 डिग्री एल के साथ तीन बार धोने PLPP को दूर करने के लिए.
    2. पीबीएस में फ्लोरोसेंट-लेबल ईसीएम प्रोटीन (10 ग्राम/एमएल लेमिन, फाइब्रोनेक्टिन या फाइब्रिनोजेन, सामग्री की तालिका और चरण 6) को संदर्भ पैटर्न माइक्रो-वेल में 20 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। 10-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट (प्रोटीन पर निर्भर करता है) प्रकाश से सुरक्षित (एल्यूमिनम पन्नी में पकवान लपेट).
    3. ऊष्मायन के बाद, 18 डिग्री प्रोटीन समाधान को हटा दें और पीबीएस के 20 डिग्री एल के साथ तीन बार धो लें; उन सूक्ष्म-वेल्स को रखें जिनका उपयोग संदर्भ प्रतिमान बनाने के लिए नहीं किया जाता है (PBSके 20 ल् में चित्र 4D,Eदेखें).
  4. विज़ुअलाइज़ेशन और सेटिंग ऑप्टिमल लेज़र फ़ोकस
    1. एक एपिफ्लोरेसी माइक्रोस्कोप, 20X उद्देश्य और उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करसंदर्भ पैटर्न कल्पना (सामग्री की तालिकामें इस अध्ययन में इस्तेमाल सॉफ्टवेयर की जाँच करें) . संदर्भ प्रतिमान परिधीय क्षेत्र में दिखाई देना चाहिए (उदाहरण के लिए, शीर्ष कूप क्षेत्र), जिसमें संदर्भ प्रतिमान उत्पन्न किया गया था (चित्र 4Eदेखें)।
    2. कैमरा पथ के माध्यम से पैटर्न किनारों पर ध्यान समायोजित करें. संदर्भ पैटर्न पर सबसे अच्छा ध्यान देने के अनुसार $ स्थिति रिकॉर्ड. यह समायोजित जेड-स्थिति इष्टतम लेजर फोकस बाद पैटर्न के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

5. सॉफ्टवेयर सेट अप और photopaterning

नोट: एक बार प्रणाली के अंशांकन हासिल किया गया है (चरण 4), उपयोगकर्ता वांछित पैटर्न टेम्पलेट्स अपलोड करेगा (टेम्पलेट विन्यास, चित्रा 5)photopatterning के लिए, प्रत्येक में एक या एकाधिक प्रोटीन के लिए पैटर्न उत्पन्न करने के विकल्प के साथ माइक्रो अच्छी तरह से. माइक्रो-पैटर्निंग प्रक्रिया में फोटोपैटर्न और प्रोटीन ऊष्मायन चरण शामिल हैं (चित्र 2देखें)।

  1. बाँझ शर्तों के तहत, सभी माइक्रो कुओं से पीबीएस के 18 डिग्री सेल्सियस को हटा दें और प्रत्येक माइक्रो-वेल में पीएलपीपी के 5 डिग्री एल जोड़ें। सुनिश्चित करें कि PLPP सूक्ष्म कुओं की पूरी सतह पर समरूप है.
  2. संदर्भ पैटर्न माइक्रो-वेल के साथ संस्कृति पकवान स्थिति (चित्र 4डी, ई) उद्देश्य से ऊपर और लियोनार्डो सॉफ्टवेयर में अब पैटर्न का चयन करें।
  3. कैमरा पथ के माध्यम से प्रेषित प्रकाश के साथ माइक्रो-वेल कल्पना और ROI प्रतीक का चयन करें। ROI का व्यास 4,000 $m पर सेट करें और डिजिटल ROI के किनारे को वर्तमान माइक्रो-वेल के किनारे पर ओवरलैप करें. लॉककरें का चयन करें.
    नोट: रॉय के आकार और व्यास का उपयोग किया जा रहा PDMS स्टेंसिल के डिजाइन और आकार पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, यदि 5,000 x 5,000 $m PDMS वर्गित स्टेंसिल का उपयोग करते हैं, तो 5,000 x 5,000 $m वर्गित ROI का उपयोग करें.
  4. पकवान के प्रत्येक माइक्रो-वेल के लिए ओवरलैपिंग चरण (चरण 5.3) दोहराएँ। पूरा होने पर, प्रेषित प्रकाश बंद कर देते हैं।
  5. संदर्भ पैटर्न माइक्रो-वेल के केंद्र पर नेविगेट करें, संदर्भ पैटर्न क्षेत्र से दूर, और वांछित पैटर्न टेम्पलेट अपलोड करने के लिए PRIMO का चयन करें, जिसे ROI पर एक डिज़ाइन इकाई के रूप में प्रक्षेपित किया जाएगा (चित्र 5देखें)। प्रतिमान किसी ड्रॉपडाउन सूची में दिखाई देंगे, जिसे क्रियाओं के रूप में संदर्भित किया जाता है और सॉफ़्टवेयर पर क्रियाएँ मेनू में दिखाया जाता है.
    नोट: पैटर्न टेम्पलेट्स प्रयोग के आगे डिजाइन और सॉफ्टवेयर में टेम्पलेट लोड करने से पहले एक 8 बिट Tiff फ़ाइल के रूप में सहेजा जाना चाहिए.
  6. पूरे माइक्रो-वेल में एक पैटर्न बनाने के लिए, डिजाइन इकाई को दोहराया जाना चाहिए। एक डिजाइन इकाई माइक्रो अच्छी तरह से क्षेत्र के 0.1 मिमी2 के आसपास शामिल हैं. प्रतिकृति मेनू में, स्तंभों और पंक्तियों की इच्छित संख्या (सॉफ़्टवेयर मेंपंक्तियाँ) सेट करें (चित्र 5देखें).
  7. एक सतत प्रतिमान जनरेट करने के लिए, स्तंभों और पंक्तियों के बीच रिक्ति समायोजित करें; इस अध्ययन में, कॉलम के बीच -20 से -35 डिग्री अंतर (नकारात्मक रिक्ति) का उपयोग करके निरंतर पट्टियों के पैटर्न प्राप्त किए जाते हैं। यह ऋणात्मक रिक्ति अभिकल्प इकाइयों के बीच ओवरलैप बनाती है (चित्र 5ब्,ब्)।
  8. प्रतिकृति मेनू में लेज़र खुराक सेट करें। इस सेटिंग में इष्टतम लेजर खुराक और PLL-PEG का उपयोगकर 1390 mJ/ पैटर्न अवधि अनुमानित समय पैनल में प्रदर्शित किया जाएगा.
    नोट: इस मामले में लेजर शक्ति 7.5 mW/mm2है , प्रत्येक डिजाइन इकाई पैटर्न के लिएलगभग 30 s ले, 1390 mJ/ उदाहरण के लिए, एक डिजाइन इकाई (0.1 मिमी2) 4 कॉलम और 4 लाइनों (लगभग 1.6 मिमी2)में प्रतिकृति, पैटर्न होने के लिए 8 मिनट ले जाएगा। उच्च लेजर खुराक की आवश्यकता हो सकती है अगर संस्कृति पकवान सतह खूंटी-SVA के साथ passivated है (लगभग डबल लेजर खुराक PLL-PEG की तुलना में).
  9. लॉक करें का चयन करें और प्रतिमान को वस्तुतः प्रदर्शित होने तक प्रतीक्षा करें.
  10. प्रतिमान के पैरामीटर अद्यतन करने के लिए, संबंधित क्रियापर क्लिक करें, फिर पैरामीटर को अनवरोधित और अद्यतन करें. प्रतिमान अद्यतन पूर्ण होने पर पुन: अवरोधित करें का चयन करें.
  11. एक ही माइक्रो-वेल में कई प्रोटीन के पैटर्न (अनुक्रमिक माइक्रो-पैटर्निंग राउंड) के लिए पैटर्न का सटीक संरेखण आवश्यक है। इस तरह के संरेखण को प्राप्त करने के लिए, वांछित पैटर्न टेम्पलेट्स के सभी सेट एक साथ अपलोड करें (पहली और दूसरी photopatterning दौर के पैटर्न).
  12. प्रतिकृति और खुराक पैरामीटर प्रतिमान टेम्पलेट्स की सेट करें। पैरामीटर सेट करने के बाद, प्रतिमान क्रियाएँ सूची में क्रियाएँ के रूप में दिखाई देंगे. इस टेम्पलेट कॉन्फ़िगरेशन को सॉफ़्टवेयर में किसी फ़ाइल के रूप में सहेजें (चित्र 5Dदेखें).
  13. क्रियाएँ सूची में, केवल पहले पैटर्निंग राउंड के दौरान प्रतिमान ित की जाने वाली विशिष्ट क्रियाओं का चयन करें और दूसरे पैटर्निंग राउंड के दौरान प्रतिमानित की जाने वाली क्रियाओं का चयन करें (चित्र 5Dदेखें).
  14. उस क्षेत्र पर नेविगेट करें जहाँ संदर्भ प्रतिमान चरण 4-2 में निर्मित किया गया था (उदाहरण के लिए, संदर्भ प्रतिमान का शीर्ष क्षेत्र सूक्ष्म-अच्छी, चित्र 4Eदेखें). इष्टतम $-स्थिति के लिए फोकस समायोजित करें (चरण 4.4 में प्राप्त)।
    नोट: यह दृढ़ता से इस्तेमाल किया जा रहा माइक्रोस्कोप पर सही ध्यान प्रणाली का चयन करने के लिए सिफारिश की है (यदि उपलब्ध हो), जो यह सुनिश्चित करता है कि पैटर्न के लिए इष्टतम स्थिति पूरे photopatterning प्रक्रिया में बनाए रखा जाएगा.
  15. पैटर्न शुरू करने के लिए प्ले प्रतीक का चयन करें। पैटर्निंग अवधि अनुमानित समय पैनल में प्रदर्शित की जाएगी। लियोनार्डो सॉफ्टवेयर संस्करण पर 4.4 पैटर्न पूरा हो गया है जब सभी क्रियाएँ दृश्य मेनू में नीले दिखाई देते हैं.

6. प्रोटीन ऊष्मायन

नोट: माइक्रो-वेल्स ईसीएम प्रोटीन के साथ इनक्यूबेट किए जाते हैं (अधिमानतः फ्लोरोसेंट-लेबल)। ये केवल उन क्षेत्रों में बाध्य होंगे जहां खूंटी को चरण 5 में वर्णित फोटोपैटर्न प्रक्रिया के माध्यम से बंद कर दिया गया था। प्रत्येक कुएं में 4 माइक्रो-वेल्स के साथ एक पीडीएमएस स्टेंसिल होता है, जो एक साथ 4 अलग-अलग स्थितियों का परीक्षण करने की अनुमति देगा, उदाहरण के लिए, प्रत्येक माइक्रो-वेल में एक अलग प्रोटीन की ऊष्मायन (चित्र 4Dदेखें)।

  1. माइक्रो-पैटर्न्स (चरण 6.7 और 9.4 देखें) की कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंट-लेबल प्रोटीन (उदाहरण के लिए, लेमिनिन, फाइब्रोनेक्टिन या फाइब्रिनोजेन को लाल या हरे फ्लोरोफोर्स के लिए संयुग्मी) का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, adsorbed unlabeled प्रोटीन इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर बाद के चरणों में कल्पना की जा सकती है।
    नोट: ECM प्रोटीन (उदाहरण के लिए, fibronectin) मौजूदा प्रोटोकॉल33 और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट लेबलिंग किट (यानी, Alexa 488 लेबलिंग किट) का उपयोग कर लेबल किया जा सकता है, या आसानी से लेबल खरीदा (उदाहरण के लिए, संयुग्मी फाइब्रिनोजेन-488 या पटल-लाल फ्लोरोसेंट रोडामाइन, सामग्री की तालिकादेखें |
  2. बाँझ शर्तों के तहत, ईसीएम प्रोटीन की वांछित एकाग्रता तैयार (10 g/एमएल लेमिन, फाइब्रोनेक्टिन या पीबीएस में फाइब्रिनोजेन, सामग्री की तालिका और चरण 4.3) देखें।
    नोट: Fluorescently लेबल ECM प्रोटीन प्रकाश संवेदनशील हैं और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए (एल्युमीनियम पन्नी में पकवान लपेट) और हर समय बर्फ पर रखा जाना चाहिए.
  3. बाँझ शर्तों के तहत, पीबीएस के 20 डिग्री एल के साथ तीन बार माइक्रो-वेल्स को धोने के लिए PLPP को हटा दें।
  4. सभी सूक्ष्म कुओं से पीबीएस के 18 डिग्री सेल्सियस निकालें और प्रत्येक माइक्रो-वेल में 20 डिग्री सेल्सियस ईसीएम प्रोटीन समाधान जोड़ें। कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट, 20-30 मिनट के लिए और प्रकाश से बचाने के लिए।
    नोट: इष्टतम कोटिंग ऊष्मायन समय प्रकार और प्रोटीन की एकाग्रता के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
  5. ऊष्मायन के बाद, ईसीएम प्रोटीन समाधान के 15 डिग्री सेल्सियस को हटा दें और पीबीएस के 20 डिग्री एल के साथ तीन बार माइक्रो-वेल्स को धो लें।
    नोट: हमेशा washes के बीच में पीबीएस के लगभग 5 $L छोड़ दें।
  6. यदि केवल एक प्रोटीन (माइक्रो-पैटर्निंग का एक दौर) के साथ पैटर्निंग, तो या तो संस्कृति पकवान के भंडारण के लिए आगे बढ़ना (चरण 10) या सेल चढ़ाना के लिए (चरण 11, और चित्र 2देखें). यदि एक ही माइक्रो-वेल में एक अलग प्रोटीन के साथ माइक्रो-पैटर्निंग का दूसरा दौर प्रदर्शन करते हैं, तो या तो संस्कृति डिश (चरण 10) के भंडारण के लिए या विशिष्ट बाइंडिंग साइटों को अवरुद्ध करने के लिए (चरण 7, और चित्र 2देखें)।
  7. वैकल्पिक गुणवत्ता नियंत्रण कदम: कल्पना और छवि मुद्रित पैटर्न कोशिकाओं चढ़ाना से पहले एक epifluorscence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर। उपयुक्त फ्लोरोसेंट चैनलों का चयन करें और तदनुसार जोखिम समय समायोजित करें।
    नोट: प्रयोगों के बीच पैटर्न की फ्लोरोसेंट तीव्रता की तुलना करने के लिए, यह एक ही प्रोटीन के लिए एक ही जोखिम समय का उपयोग करने के लिए आवश्यक है।

7. अवरुद्ध unspecific बाध्यकारी साइटों (केवल कई प्रोटीन पैटर्न के लिए)

नोट: एक ही माइक्रो-वेल में एकाधिक प्रोटीन ों के साथ माइक्रो-पैटर्निंग में अनुक्रमिक पैटर्निंग चरण शामिल होते हैं (चित्र 2देखें)। एक अवरुद्ध एजेंट (PLL-PEG या बीएसए) को पार बाध्यकारी को रोकने के लिए माइक्रो-वेल्स में जोड़ा जाता है, जो तब होता है जब दूसरा इनक्यूबेटकिया प्रोटीन (चरण 9) पहले इनक्यूबेटकिएटेड प्रोटीन (चरण 6) को बांधता है, इस प्रकार पैटर्न के भीतर प्रोटीन के मिश्रण से बचने।

  1. बाँझ शर्तों के तहत, पार बाध्यकारी को रोकने के लिए एक अवरुद्ध कदम के रूप में PLL-PEG (0.1 mg/mL में पीबीएस) या बीएसए (1% बीएसए पीबीएस में) के 20 $L जोड़ें।
    नोट: अवरुद्ध दक्षता प्रोटीन की प्रकृति के आधार पर भिन्न हो सकते हैं इस्तेमाल किया जा रहा है और उन के बीच आत्मीयता. पहले से ही ब्लॉकिंग एजेंट के रूप में PLL-PEG और बीएसए दोनों का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है (चित्र 10D-I)।
  2. 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर अवरुद्ध एजेंट इनक्यूबेट और प्रकाश से बचाने के लिए। एजेंट को अवरुद्ध करने के 15 डिग्री सेल्सियस निकालें और पीबीएस के 20 डिग्री एल के साथ तीन बार सभी माइक्रो-वेल्स को धोएं। हमेशा washes के बीच में पीबीएस के लगभग 5 डिग्री सेल्सियस छोड़ दें.
  3. सभी सूक्ष्म कुओं से पीबीएस के 18 डिग्री सेल्सियस निकालें और प्रत्येक माइक्रो-वेल में पीएलपीपी के 5 डिग्री एल जोड़ें, यह सुनिश्चित करना कि पीएलपीपी सूक्ष्म कुओं की पूरी सतह पर समरूप है।

8. photopatterning के दूसरे दौर (केवल कई प्रोटीन पैटर्न के लिए)

नोट: photopatterning और प्रोटीन ऊष्मायन के पहले दौर के बाद, एक माइक्रो-पैटर्न उत्पन्न होता है। फ़ोटोपैटर्न के दूसरे दौर के दौरान, दूसरे प्रोटीन के लिए पैटर्न एक ही सूक्ष्म-वेल में उत्पन्न किया जाएगा (चित्र 2ब् और चित्र 5Dदेखें)। सॉफ़्टवेयर में, सही प्रतिमान टेम्पलेट (क्रियाएँ) का चयन करें, जो इस दौर के दौरान प्रतिरूपित किए जाएँगे (चित्र 5Dदेखें).

  1. पहले माइक्रो-वेल पर नेविगेट करें (चित्र 4D) . सुनिश्चित करें कि डिजिटल ROI और माइक्रो-वेल के बीच उपयुक्त ओवरलैप करें.
  2. पहले सहेजे गए टेम्पलेट कॉन्फ़िगरेशन को लोड करें (चरण 5.12) और दूसरे फ़ोटोपैटर्निंग राउंड के दौरान पैटर्न किए जाने वाली क्रियाओं का चयन करें (पहले दौर से क्रियाओं को अचयनित करें, चित्र 5Dदेखें).
  3. पैटर्न शुरू करने के लिए प्ले प्रतीक का चयन करें। सुनिश्चित करें कि लेजर सॉफ्टवेयर में पर है.

9. प्रोटीन ऊष्मायन का दूसरा दौर (केवल कई प्रोटीन पैटर्न के लिए)

नोट: प्रोटोकॉल के इस भाग में, फ्लोरोसेंट-लेबल प्रोटीन/एस को फोटोपैटर्न के दूसरे दौर के बाद संस्कृति डिश पर इनक्यूबेट किया जाएगा।

  1. बाँझ शर्तों के तहत, पीबीएस के 20 डिग्री सेल्सियस के साथ माइक्रो-वेल तीन बार धोने के लिए PLPP को दूर. पीबीएस के 18 डिग्री सेल्सियस निकालें और प्रत्येक माइक्रो-वेल में 20 डिग्री सेल्सियस ईसीएम प्रोटीन समाधान जोड़ें। 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट और प्रकाश से बचाने के लिए।
    नोट: इष्टतम कोटिंग ऊष्मायन समय प्रकार और प्रोटीन की एकाग्रता के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
  2. ऊष्मायन के बाद, ईसीएम प्रोटीन समाधान के 15 डिग्री सेल्सियस को हटा दें और पीबीएस के 20 डिग्री एल के साथ तीन बार माइक्रो-वेल्स को धो लें। हमेशा washes के बीच में पीबीएस के लगभग 5 डिग्री सेल्सियस छोड़ दें.
  3. या तो संस्कृति पकवान के भंडारण के लिए आगे बढ़ना (कदम 10) या सेल चढ़ाना के लिए (चरण 11, और चित्र 2देखें).
  4. वैकल्पिक गुणवत्ता नियंत्रण कदम: एक epifluorscence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, कल्पना और कोशिकाओं चढ़ाना से पहले छवि मुद्रित पैटर्न। उपयुक्त फ्लोरोसेंट चैनलों का चयन करें और जोखिम समय समायोजित करें।
    नोट: प्रयोगों के बीच पैटर्न की फ्लोरोसेंट तीव्रता की तुलना करने के लिए, यह एक ही प्रोटीन के लिए एक ही जोखिम समय का उपयोग करने के लिए आवश्यक है।

10. माइक्रो-पैटर्न्स का भंडारण

नोट: अधिशोषित प्रोटीन के साथ माइक्रो-पैटर्न प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों के दौरान संग्रहीत किए जा सकते हैं (चित्र 2देखें)। यदि एकाधिक प्रोटीन के साथ माइक्रो-पैटर्निंग, माइक्रो-पैटर्निंग के पहले दौर के बाद या माइक्रो-पैटर्निंग के दो अनुक्रमिक दौरों के पूरा होने के बाद संग्रहीत किया जा सकता है (चित्र 2ठदेखें)।

  1. जब PLL-PEG के साथ passivated, अप करने के लिए 3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस (3 एमएल प्रति अच्छी तरह से) में माइक्रो-पैटर्न स्टोर।
  2. यदि संस्कृति पकवान खूंटी-SVA के साथ passivated किया गया था, माइक्रो-पैटर्न अप करने के लिए 1 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है. ऐसा करने के लिए, डबल आसुत deionized पानी के साथ सूक्ष्म-पैटर्न गहन कुल्ला और argon या नाइट्रोजन के एक बाँझ हवा बंदूक के साथ सूखी, हालांकि सामान्य हवा भी इस्तेमाल किया जा सकता है. सुखाने के बाद, माइक्रो-पैटर्न 1 महीने तक (PRIMO सिस्टम समर्थन टीम, व्यक्तिगत संचार) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

11. चढ़ाना कोशिकाओं

नोट: अगले चरणों के दौरान, कोशिकाओं को तैयार माइक्रो-पैटर्न्ड संस्कृति डिश/es पर चढ़ाया जाएगा। इन अध्ययनों में, एक न्यूरोनल सेल लाइन (सीएडी कोशिकाओं) का उपयोग किया जाता है31. हालांकि इस प्रोटोकॉल ब्याज के अन्य सेल प्रकार के अध्ययन के लिए समायोजित किया जा सकता है (आवश्यक के रूप में सेल चढ़ाना प्रोटोकॉल समायोजित).

  1. भेदभाव माध्यम का उपयोग कर 48 एच के लिए सीएडी कोशिकाओं को अलग (DMEM 1% Glutamine के साथ पूरक, सीरम के बिना, और 1% पेन /
  2. आंतरिक कांच में कोशिकाओं के साथ मध्यम की प्लेट 1 एमएल अच्छी तरह से, सभी माइक्रो-वेल्स को कवर और एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में संस्कृति पकवान जगह है।

Representative Results

उपरोक्त प्रोटोकॉल के बाद सूक्ष्म-पैटर्नवाली सतहों में परिणाम, ईसीएम प्रोटीन के साथ लेपित / हम इन पैटर्न का उपयोग कर रहे हैं न्यूरॉन pathfinding ट्रैक.

जनरेट किए गए प्रतिमान टेम्पलेट का सटीक प्रतिनिधित्व होना चाहिए. एक उदाहरण चित्र 6 में दिखाया गया है, जहाँ एक डिजाइन इकाई ( चित्र5ठ) का प्रतिनिधित्व करने वाला एक डिजिटल पैटर्न टेम्पलेट (चित्र 5B) के परिणामस्वरूप परिभाषित माइक्रो-पैटर्न होते हैं, जो 20 से 2 डिग्री मीटर चौड़ाई तक होते हैं, जिन्हें लेबल के साथ लेपित किया जाता है फाइब्रिनोजेन (चित्र 6बी)। ImageJ का उपयोग करते हुए, फ्लोरोसेंट तीव्रता माप दोनों खड़ी प्राप्त किए गए (चित्र 6ब्) और क्षैतिज रूप से (चित्र 6म्) धारी के साथ और एक संगत पृष्ठभूमि क्षेत्र से 15 उ प्रत्येक धारी के ऊपर। पृष्ठभूमि माप प्रत्येक धारी चौड़ाई के लिए पैटर्न माप से घटाया गया.

प्रणाली की एक सीमा यह है कि एक बढ़त प्रभाव देखा जा सकता है (चित्र 6बी, शीर्ष पट्टी) मुद्रण सुविधाओं $20 डिग्री मीटर, केंद्र की तुलना में पैटर्न किनारों पर एक उच्च तीव्रता संकेत के साथ (चित्र 6डी, के पहले शिखर फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रोफ़ाइल). हमारे प्रयोगों में संकल्प सीमा लगभग 2 डिग्री थी; इस चौड़ाई में हम एक महत्वपूर्ण कमी मनाया (लगभग 50% से) व्यापक धारियों की तीव्रता की तुलना में फाइब्रिनोजेन फ्लोरोसेंट तीव्रता में (चित्र 6च, जी)। PRIMO प्रणाली और प्रोटोकॉल का उपयोग कर पैटर्न यहाँ reproducible पैटर्न का उत्पादन किया, मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता के उच्चतम मानक विचलन के साथ चार व्यक्ति प्रतिकृति डिजाइन इकाइयों से 2 डिग्री मीटर चौड़ाई के लिए मापा(चित्र 6 जी) पैटर्न वाली पट्टियों के भीतर भिन्नता भी कम पाई गई; भिन्नता के गुणांक 3 से 10% तक, 20 डिग्री उ और 2 डिग्री मीटर धारियों के साथ सबसे बड़ी आंतरिक भिन्नता वाले होते हैं। यह क्रमशः किनारे प्रभाव और प्रणाली के संकल्प सीमा का एक परिणाम होने की संभावना है। ध्यान दें कि इन मापों के लिए हम केवल धारियों के केंद्र में तीव्रता को मापते हैं, इन छवियों को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए गए उद्देश्य से उत्पन्न असमान रोशनी से बचने के लिए (विगनेटिंग, चित्र 6ई)।

कुछ प्रयोगों में ऐसे प्रश्न शामिल हो सकते हैं जिनके लिए परिभाषित प्रोटीन सांद्रता की आवश्यकता होती है, जिन्हें दो तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है: 1) प्रोटीन सांद्रता को अलग करते हुए (चित्र 7ए,बी)। लेमिन की विभिन्न सांद्रताओं के साथ इन्क्यूबेशन, जिसके परिणामस्वरूप काफी भिन्न फ्लोरोसेंट तीव्रता होती है, जिससे उच्च प्रोटीन सांद्रता में वृद्धि होती है (चित्र 7ठ)। 2) लेजर खुराक है कि विरोधी चिपकने वाला फिल्म (PEG) को छोड़ने के लिए प्रयोग किया जाता है विविध किया जा सकता है. उच्च लेजर खुराक एक बड़ी हद तक antifouling फिल्म को दूर करेगा, ब्याज के प्रोटीन के लिए और अधिक बाध्यकारी साइटों पैदा (चित्र 7सी, डी) काफी अलग फ्लोरोसेंट तीव्रता में जिसके परिणामस्वरूप, उच्च लेजर के साथ बढ़ रही है खुराक (चित्र 7डी)

लेजर खुराक भिन्न एक ही पैटर्न के भीतर प्रोटीन gradients की पीढ़ी की अनुमति देता है. यह चित्र 8Aमें प्रदर्शित किया जाता है, जहाँ एक ग्रेडिएंट टेम्पलेट को विभिन्न ग्रेस्केल स्तरों का उपयोग करके, काले (कोई लेज़र पावर) से सफेद (अधिकतम लेज़र पावर) में डिज़ाइन किया गया था.

लेजर तीव्रता टेम्पलेट के ग्रेस्केल स्तर के लिए आनुपातिक है (एक 8-बिट छवि में 0 से 255 तक), यूवी रोशनी की ग्रेडिएंट पैदा कर रहा है। प्रवणता धारी के साथ फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रोफाइल का माप पैटर्न टेम्पलेट में रेखीय है (चित्र 8ठ) और उत्पन्न प्रवणता पैटर्न में (चित्र 8ब्, D) । यह एक ही टेम्पलेट और ढाल पैटर्न के भीतर सभी ग्रेडिएंट धारियों के बीच पुन: उत्पादनीय है (चित्र 8ठ, द)। ऐसी प्रवणताका ओंकार अत्यंत उपयोगी होती है और विवो वातावरण में नकल करने में सहायता करती है जहां कोशिकाएं प्राय : जैव सक्रिय प्रोटीनों की प्रवणताओं का अनुक्रिया करती हैं34,35, 36,37.

कोशिकाओं को अतिरिक्त कोशिकीय वातावरण बदलने की भावना है, लेकिन परख है कि सेल व्यवहार के अध्ययन को सक्षम जब कोशिकाओं मुठभेड़ ऐसे परिवर्तन सीमित हैं. LIMAP एक ही माइक्रो अच्छी तरह से कई प्रोटीन के साथ माइक्रो-पैटर्न के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण चित्र 9 में दिखाए गए हैं, जहाँ क्रॉस-पैटर्न फाइब्रोनेक्टिन (क्षैतिज) और लेमिन (विपरीत) की पट्टियों से उत्पन्न किए गए थे। कई प्रोटीन के साथ पैटर्न बनाते समय, प्रोटीन के क्रॉस-बाइंडिंग को रोकने के लिए, पहले और दूसरे प्रोटीन ऊष्मायन के बीच एक अवरुद्ध कदम का उपयोग करना महत्वपूर्ण है (चरण 7 देखें)। अवरुद्ध दक्षता कोटिंग के लिए उपयोग किया जाता है कि प्रोटीन की जैव रासायनिक विशेषताओं के आधार पर भिन्न हो सकते हैं और हम PLL-PEG (0.1 mg/mL) और बीएसए (1%) सहित कई अवरुद्ध बफ़र्स परीक्षण सलाह देते हैं। इस पार बाध्यकारी प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हम ImageJ का उपयोग कर फ्लोरोसेंट तीव्रता माप प्रदर्शन किया (चित्र 9) और हमने दिखाया कि पार बाध्यकारी नाटकीय रूप से कम किया जा सकता है, PLL-PEG बफर का उपयोग कर (0.1 mg/mL) फाइब्रोनेक्टिन और laminin के लिए क्रॉस-पैटर्न्स (चित्र 9D,H)।

उत्पन्न क्रॉस-पैटर्न का उपयोग सीएडी कोशिकाओं के साथ सेलुलर परख के लिए किया गया था (चित्र 10ए, बी) या चूहे पृष्ठीय-मूल गुच्छिका (डीआरजी) न्यूरॉन्स ( चित्र10ब्)। उनके न्यूराइट (सीएडी) और एक्सॉन्स (डीआरजी) अलग-अलग लाइनों के साथ बढ़ते हैं। CAD कोशिकाओं को एक न्यूरॉन मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है क्योंकि वे प्राथमिक न्यूरॉन्स की तुलना में एक समान integrin अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल दिखाने के लिए और वे अभी भी actin-रिच विकास शंकु प्रदर्शित करने के बाद 48 एच संस्कृति में (चित्र 10बी),उन्हें pathfinding के लिए उपयुक्त बनाने अध्ययन.

प्राथमिक न्यूरॉन्स की ओर उत्पन्न माइक्रो-पैटर्न के संभावित साइटोटॉक्सिक प्रभावों की जांच करने के लिए, DRG न्यूरॉन्स को पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल38के बाद माइक्रो-पैटर्न्स पर अलग-थलग और सुसंस्कृत किया गया था। परिणाम ों से पता चलता है कि प्राथमिक न्यूरॉन्स सूक्ष्म-पैटर्न पर्यावरण को सहन करते हैं (चित्र 10ब्)। वर्तमान में हम अध्ययन कर रहे हैं कि कैसे ECM प्रोटीन की एक किस्म axonal (न्युराइट) pathfinding प्रभावित करते हैं. सीएडी कोशिकाओं में पाया अवधारणाओं के प्रारंभिक सबूत आगे DRG न्यूरॉन्स का उपयोग कर जांच की जाएगी. उत्पन्न माइक्रो-पैटर्न की गुणवत्ता को मान्य करने के लिए, यह सेल चढ़ाना करने के लिए आगे बढ़ने से पहले पैटर्न किनारों को अच्छी तरह से परिभाषित कर रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि पैटर्न के लिए वांछनीय है। इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, परिधीय अंधेरे प्रभाव (विगनेटिंग) से बचने के लिए सूक्ष्मदर्शी और कैमरे के बीच ऑप्टिकल समायोजन सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है जो डेटा के पश्च विश्लेषण और व्याख्या को प्रभावित करता है। इसके अतिरिक्त, एक ही जोखिम समय है कि पैटर्न छवि और पैटर्न छवि से इस छवि को घटाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा का उपयोग कर एक पैटर्न मुक्त क्षेत्र की एक छवि प्राप्त.

संक्षेप में, अच्छी गुणवत्ता वाले माइक्रो-पैटर्न पीढ़ी के लिए, प्रोटीन एकाग्रता का आकलन करने की सलाह दी जाती है (चित्र 7ए, बी), लेजर खुराक ( चित्र7सी, डी), प्रोटीन पृष्ठभूमि स्तर ( चित्र6ई, एफ, एच) और एक एकाधिक प्रोटीनका उपयोग करते समय कुशल अवरोधक चरण (चित्र 9) आंशिक रूप से, LIMAP के साथ उत्पन्न माइक्रो-पैटर्न की गुणवत्ता सेलुलर परख से विश्वसनीय और पुन: उत्पादनीय डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।

Figure 1
चित्र 1: माइक्रो-पैटर्निंग तकनीकों की योजना: माइक्रो-संपर्क प्रिंटिंग और लेजर की सहायता से पैटर्न। (क)माइक्रो-संपर्क मुद्रण एक पीडीएमएस स्टाम्प उत्पन्न करने के लिए परिभाषित सूक्ष्म-सुविधाओं के साथ एक लिथोग्राफी मास्टर का उपयोग करता है जो ब्याज के प्रोटीन के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। यह प्रोटीन तो एक गिलास सतह पर स्थानांतरित (स्टैम्प्ड) है, प्रोटीन माइक्रो-पैटर्न पैदा. (बी)लेजर की मदद से पैटर्न तकनीक photopatterning और प्रत्यक्ष लेजर पैटर्न शामिल हैं. (ग)अधिकांश फोटोपैटर्न दृष्टिकोण एक यूवी प्रकाश स्रोत और एक photomask का उपयोग करें (या तो सब्सट्रेट सतह के साथ संपर्क में या उद्देश्य के फोकल तल में) वांछित geometries के साथ विशिष्ट स्थितियों में खूंटी antifouling सतह को छोड़ने के लिए, एक परिभाषित पैटर्न बनाने. बाद में प्रोटीन ऊष्मायन कदम के परिणामस्वरूप प्रोटीन अधिशोषण केवल लेजर-क्लीव्ड क्षेत्रों में होता है। (छ) लिमैप एक फोटोपैटर्न तकनीक है जिसके लिए सब्सट्रेट (अर्थात मास्क रहित और संपर्करहित दृष्टिकोण) के संपर्क में फोटोमास्क की आवश्यकता नहीं होती है। LIMAP एक फोटो-इनेटर का उपयोग करता है, जो एक लेजर की कम खुराक से सक्रिय होता है, खूंटी के प्रकाश-उजागर क्षेत्रों को cleaving. यह अनुक्रमिक प्रोटीन अधिशोषण के लिए अनुलग्नक साइटें बनाता है. (ई) प्रत्यक्ष लेजर पैटर्न उच्च ऊर्जा प्रकाश का उपयोग करता है सीधे पीईजी फिल्म etch, उन etched क्षेत्रों में प्रोटीन बाइंडिंग की अनुमति. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: माइक्रो-पैटर्निंग प्रोटोकॉल में दिए गए चरणों का सारांश दर्शाने वाली योजना। (ए) एक प्रोटीन के साथ माइक्रो-पैटर्निंग में माइक्रो-पैटर्निंग (फोटोपैटर्न और प्रोटीन इनक्यूबेशन) का केवल एक दौर होता है और इसे 8 ज (बी) एकाधिक प्रोटीन के साथ माइक्रो-पैटर्निंग के दो अनुक्रमिक राउंड की आवश्यकता होती है माइक्रो-पैटर्निंग और तैयार किए जा रहे माइक्रो-पैटर्न की संख्या के आधार पर 1-2 दिनों में पूरा किया जा सकता है। यह काम के 1 दिन में प्रोटोकॉल के बी संस्करण के माध्यम से जाने के लिए संभव है. सतत तीर प्रोटोकॉल में चरणों के प्रत्यक्ष प्रवाह को दर्शाते हैं। अविच्छिन्न तीर इंगित करते हैं कि एक चरण और दूसरे के बीच एक महत्वपूर्ण समय अंतराल है (चरण 6.6 और 9.3 देखें)। (ग) सूक्ष्म पैटर्निंग (लाल धारियों) के एक दौर या सूक्ष्म पैटर्निंग (लाल और हरे रंग की पट्टियों) के दो अनुक्रमिक दौरों के बाद प्राप्त उदाहरण पैटर्नों का योजनाबद्ध दृश्य । कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पैटर्न टेम्पलेट पीढ़ी LIMAP के साथ बहुमुखी है. (ए, बी) ImageJ (एक crossbows, बी पत्र) के साथ डिजाइन पैटर्न टेम्पलेट्स के उदाहरण. सफेद रंग की आकृतियाँ अधिकतम लेजर शक्ति पर प्रक्षेपित की गई थीं और काले रंग में तैयार की गई आकृतियों का अनुमान नहीं लगाया गया था। (सी, डी) 10 ग्राम/एमएल फाइब्रिनोजेन (हरा) के साथ ऊष्मायन के बाद टेम्पलेट्स से LIMAP के साथ प्राप्त माइक्रो-पैटर्न। (ग) क्रॉसबोव 50 डिग्री मीटर चौड़ाई और 50 डिग्री मीटर ऊंचाई 75 डिग्री मीटर क्षैतिज और 50 डिग्री मीटर खड़ी है। (छ) अक्षर 80 डिग्री मीटर चौड़ाई और 85 डिग्री मीटर की ऊंचाई है। C और D में स्केल बार50 m का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: LIMAP प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक सामग्री. (ए) इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त स्टेंसिल 20 मिमी व्यास, पतले वृत्ताकार आकार के पीडीएमएस टुकड़े (250 डिग्री मीटर मोटाई) हैं जिनमें 4 माइक्रो-वेल्स (4 मिमी व्यास प्रत्येक) होते हैं। सूक्ष्म-वेल्स में उपयोग किए जाने वाले आयतन ों की मात्रा 5 से 20 डिग्री सेल्सियस तक होती है, जो प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक अभिकर्मकों और प्रोटीनों की मात्रा को काफी कम करती है। (बी) 6 अच्छी तरह से ग्लास नीचे पकवान जहां स्टेंसिल पहले से ही प्रत्येक अच्छी तरह से रखा गया है. सूक्ष्म कूपों में पीबीएस के 20 डिग्री सेल्सियस होते हैं ताकि उन्हें दृश्यमान बना सकें। (सी) अंशांकन पकवान जिसमें आंतरिक कांच अच्छी तरह से एक हरे रंग की हाइलाइटर के साथ चिह्नित किया गया है, जो लेजर फोकस जांचना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। (डी) बी में 6-वेल ग्लास बॉटम डिश से ऊपर के स्केमेटिक दृश्य (डैश्ड लाल वृत्त के साथ रेखांकित) भीतरी कांच नीचे अच्छी तरह से सफेद में प्रतिनिधित्व किया है और स्टेंसिल ग्रे में दिखाया गया है. स्टेंसिल में 4 माइक्रो-वेल्स (संख्या 1-4) 4 विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों (उदाहरण के लिए, विभिन्न प्रोटीन सांद्रता, पैटर्न geometries, प्रोटीन के संयोजन, आदि) के परीक्षण के लिए होते हैं। तारांकन सूक्ष्म-वेल में संदर्भ पैटर्न को दर्शाता है. (ई) माइक्रो-वेल का योजनाबद्ध दृश्य जहां शीर्ष भाग में एक संदर्भ पैटर्न उत्पन्न किया गया है (भर तीर के साथ तीर)। इस संदर्भ पैटर्न पैटर्न के लिए इष्टतम लेजर फोकस प्राप्त करने के लिए आवश्यक है (चरण 4 देखें). खाली ऐरोहेड वाला तीर माइक्रो-वेल का केंद्रीय क्षेत्र इंगित करता है, जिसका उपयोग सिस्टम अंशांकन के बाद बाद के पैटर्न के लिए किया जाएगा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: माइक्रो-पैटर्निंग के लिए सॉफ़्टवेयर सेट-अप. (ए) ImageJ के साथ डिजाइन समानांतर धारियों के साथ पैटर्न टेम्पलेट और एक 8 बिट Tiff फ़ाइल के रूप में बचाया. (बी-डी) डिजिटल ROIs (ब्याज के क्षेत्रों) है कि वर्तमान माइक्रो कुओं जहां माइक्रो-पैटर्न उत्पन्न किया जाएगा के साथ ओवरलैप होगा की Schematic दृश्य. (बी) पैटर्न टेम्पलेट का उपयोग किया जा करने के लिए (लंबाई 1824 पिक्सेल $ 415 मीटर, चौड़ाई 1140 पिक्सेल $ 260 $m) लियोनार्डो पर चुना गया है और एक डिजाइन इकाई के रूप में ROI पर पेश किया गया है (काले डैश्ड आयत में लाल धारियों), जो लगभग कवर किया जाएगा 0.1 मिमी2 के सूक्ष्म-कूप क्षेत्र। डिजाइन इकाई 4 कॉलम और प्रतिकृति मेनू (टेम्पलेट कॉन्फ़िगरेशन) में 4 लाइनों में प्रतिकृति है, माइक्रो-वेल भर में एक पैटर्न बनाने। स्तंभों के बीच रिक्ति नोट करें। (ग) सतत पट्टियों को पैटर्न करने के लिए स्तंभों के बीच की रिक्ति को समायोजित करना होगा। इस स्थिति में, डिज़ाइन इकाइयों के बीच ओवरलैप प्राप्त करने के लिए स्तंभों के बीच रिक्ति प्रतिकृति मेनू में नकारात्मक रिक्तिके रूप में सेट की जाती है, -20 $m. (D) एक ही माइक्रो-वेल में एकाधिक प्रोटीनों को पैटर्न करने के लिए, पैटर्न का एक सटीक संरेखण है आवश्यक. सॉफ्टवेयर सेट-अप चरण (चरण 5) के दौरान, सभी वांछित पैटर्न टेम्पलेट्स एक साथ अपलोड करें। क्रियाएँ सूची पर, प्रत्येक प्रतिमान दौर के दौरान पैटर्न किया जा करने के लिए केवल विशिष्ट क्रियाओं का चयन करें और शेष क्रियाओं (चरण 5.12, 5.13 और 8.2) अचयनित करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: LIMAP का उपयोग करके प्रतिमान परिवर्तनशीलता का विश्लेषण. (ए) ImageJ के साथ डिजाइन पैटर्न टेम्पलेट अलग चौड़ाई के माइक्रो-पैटर्न चार धारियों के लिए इस्तेमाल किया (20, 10, 5, 2 मीटर, ऊपर से नीचे तक). (बी)10 ग्राम/एमएल फ्लोरोसेंट-लेबल फाइब्रिनोजेन (हरा) के साथ ऊष्मायन के बाद प्राप्त माइक्रो-पैटर्न। (ग) सूक्ष्म-पैटर्न की पट्टियों को पार करते हुए ऊर्ध्वाधर रेखा के साथ तीव्रता मापन। (घ) ऊर्ध्वाधर फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रोफाइल में माप से प्राप्त (सी)। ध्यान दें कि बड़ी चौड़ाई (20 डिग्री मी) पर धारी के किनारों पर प्रोटीन के संचय के कारण ऊर्ध्वाधर प्रोफ़ाइल में एक भिन्नता है, जिसके परिणामस्वरूप दो अलग-अलग फ्लोरोसेंट तीव्रता चोटियों (एज प्रभाव) होती है। यह प्रभाव केवल धारी चौड़ाई में देखा जाता है [20 ]m. (ई) चित्रित क्षैतिज लाइनों के साथ तीव्रता माप (प्रवाह और पृष्ठभूमि). (च)क्षैतिज फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रोफाइल में माप से प्राप्त (ई)। (छ) प्रत्येक धारी चौड़ाई के लिए माध्य तीव्रता दर्शाने वाला ग्राफ, जिसे चार अलग-अलग प्रतिकृति डिजाइन इकाइयों (इंटर-पैटर्न भिन्नता) से मापा जाता है। 2 डिग्री मीटर धारी चौड़ाई के पैटर्न के लिए कम प्रोटीन अधिशोषण नोट करें। (ज) पैटर्नधारी पट्टियों (परिवर्तन के गुणांक) में भिन्नता सभी धारी चौड़ाई के लिए कम थी, जो 3 से 10% तक थी। जी और एच में डेटा मतलब के रूप में दिखाया गया है - एसडी सांख्यिकीय विश्लेषण जी और एच में एक तरह से ANOVA (Kruskal-Wallis) कई तुलना के साथ गैर-पैरामीट्रिक परीक्षण का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था। * * महत्व के लिए P मान है ;lt;0.001. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: लेजर शक्ति और प्रोटीन अधिशोषण दक्षता के लिए प्रोटीन एकाग्रता में बदलाव का प्रभाव. (ए) पीएलएल-पीईजी सतह को लेजर-क्लीव्ड किया गया था जिसमें एक निरंतर लेजर खुराक (1390 एमजे/मिमी2) और फ्लोरोसेंट-लेबल लेमिनिन (मैजेंटा) के संकेत सांद्रता के साथ इनक्यूबेट किया गया था। (ख) (ए)में लेमिन धारियों की फ्लोरोसेंट तीव्रता का परिमाणीकरण। (ग) विभिन्न संकेत लेजर खुराक फ्लोरोसेंट-लेबल फाइब्रोनेक्टिन (हरा) की एक ही एकाग्रता (10 ग्राम/एमएल) के साथ ऊष्मायन द्वारा पीछा किया गया। (घ) (ग)में फाइब्रोनेक्टिन धारियों की फ्लोरोसेंट तीव्रता का परिमाणीकरण दर्शाता है कि उच्च लेजर खुराक अधिशोषित प्रोटीन के उच्च स्तर से संबंधित होती है। सभी माप पृष्ठभूमि घटाया जाता है. नमूना संख्याओं को स्तंभों के निचले भाग में दर्शाया जाता है; डेटा को माध्य के रूप में दर्शाया गया है - SEM. सांख्यिकीय विश्लेषण दो पूंछ वाली गणना के साथ गैर-पैरामीट्रिक मान-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग करके किया गया था। P-value is[lt;0.0001 for *** महत्व. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: एक माइक्रो-पैटर्न के भीतर एक प्रोटीन एकाग्रता ढाल का उत्पादन। (क)ग्रेस्केल में ग्रैडिएंट पैटर्न टेम्पलेट। (ठ) फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रोफाइल से मापा गया (ए)। (ग) 10 ग्राम/एमएल फ्लोरोसेंट-लेबल फाइब्रोनेक्टिन (हरा) के साथ ऊष्मायन के बाद पैटर्न टेम्पलेट से एलआईमैप के साथ प्राप्त पैटर्न। (घ)द र् 3 धारियों तथा पृष्ठभूमि की फ्रलुओरेन्सी तीव्रता प्रोफाइल माध्य सेम के रूप में निरूपित होती है, जो प्रोटीन प्रवणता की तीव्रता में रैखिक वृद्धि दर्शाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9: पार बाध्यकारी प्रभाव जब कई प्रोटीन क्रमिक पैटर्न. (ए-सी, ई-जी) फ्लोरोसेंट-लेबल फाइब्रोनेक्टिन (सियान, क्षैतिज) और फ्लोरोसेंट-लेबल लेमिन (मैजेंटा, ऊर्ध्वाधर) के 10 डिग्री मीटर धारियों के साथ क्रॉस-पैटर्न। (ए-सी) बफर अवरुद्ध बीएसए के साथ इलाज के नमूने. (ई-एफ) विशिष्ट बाइंडिंग साइट्स (चरण 7) को अवरोधित करने के लिए PLL-PEG के साथ उपचारित नमूने. (ए, ई) मर्ज्ड फ्लोरोसेंट चैनल दोनों फाइब्रोनेक्टिन और लेमिन दिखा रहा है। (बी, एफ) केवल फाइब्रोनेक्टिन दिखा रही छवि. (सी, जी) केवल लेमिन न दर्शाने वाली छवि। सी के लिए, क्षैतिज फाइब्रोनेक्टिन सकारात्मक धारियों पर भी लेमिनकी की उपस्थिति को ध्यान दें जो बीएसए के साथ खाली बाध्यकारी साइटों के अप्रभावी अवरुद्ध के कारण है। जी के लिए, ध्यान दें कि PLL-PEG के साथ अवरुद्ध फाइब्रोनेक्टिन धारियों के लिए laminin के कुशलतासे बाध्यकारी रोकता है. (डी, एच) ए और ई में संकेत माप (डायगोनल पीली रेखा) से प्राप्त फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रोफाइल, क्रमशः। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्र 10: क्रॉस-पैटर्न्स न्यूराइट/ (ए-सी) फ्लोरोसेंट-लेबल फाइब्रोनेक्टिन (सियान, क्षैतिज) और फ्लोरोसेंट-लेबल लेमिन (मैजेंटा, ऊर्ध्वाधर) के 10 डिग्री मीटर धारियों के साथ क्रॉस-पैटर्न। (ए, बी) सूक्ष्म-पैटर्न के साथ बढ़ रही neurites के साथ सीएडी कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट छवियों. न्यूराइट को विज़ुअलाइज़ करने के लिए, कोशिकाओं को 48 ज के लिए सुसंस्कृत किया गया था, 4% पीएफए के साथ तय किया गया था और ट्यूबुलिन (ए) या ट्यूबुलिन और एक्टिन (बी) के लिए दाग लगाया गया था। (ग)चूहा पृष्ठीय जड़ गुच्छिका (डीआरजी) माइक्रो-पैटर्न के साथ बढ़ तेवरों वाले न्यूरॉन्स। axons कल्पना करने के लिए, DRG न्यूरॉन्स 72 ज के लिए सुसंस्कृत थे, 4% पीएफए के साथ तय की और tubulin के लिए दाग. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्र 11: LIMAP के साथ माइक्रो-पैटर्न ्सीवकर उत्पन्न करते समय प्राप्त सामान्य नकारात्मक परिणामों के उदाहरण। (ए-सी) विभिन्न परिस्थितियों में प्राप्त 10 ग्राम/एमएल फ्लोरोसेंटी लेबल वाले फाइब्रिनोजेन (हरा) की उप-अनुकूल पैटर्नधार धारियों। (ए)पैटर्न उत्पादन के दौरान माइक्रो-वेल सूख जाता है। पृष्ठभूमि (तीर) में फ्लोरोसेंट के उच्च स्तर और पीबीएस क्रिस्टल (एस्टर्स) की उपस्थिति को नोट करें। (ख) पट्टियों के बीच सिलाई सॉफ्टवेयर सेट-अप के दौरान ठीक से समायोजित नहीं की गई जिसके परिणामस्वरूप डिजाइन इकाइयों के बीच अंतराल (तीर) के साथ असतत धारियों का उपयोग किया गया (चरण 3.4.7 देखें)। (ग) लेजर फोकस उप-अनुकूल था जिसके कारण विसरित धारियों (एरो) जो पैटर्न टेम्पलेट की वास्तविक धारी चौड़ाई का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, जो ऊपर से नीचे तक 20, 10, 5, 2 डिग्री मीटर होना चाहिए, जैसा कि (बी) में है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

LIMAP (PRIMO) माइक्रो-पैटर्निंग लाभ और माइक्रो-संपर्क प्रिंटिंग के साथ तुलना
जबकि माइक्रोसंपर्क प्रिंटिंग संभवतः जैविक क्षेत्र में सबसे अधिक इस्तेमाल किया माइक्रो-पैटर्निंग तकनीकहै 39, वहाँ LIMAP प्रौद्योगिकी का उपयोग कर शोधकर्ताओं की बढ़ती संख्या हो रहा है40,41,42 ,43,44. यहाँ, हम PRIMO, LIMAP के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया. नीचे हम संक्षेप में संभावित लाभ और microcontact मुद्रण और LIMAP फोटो-पैटर्निंग की सीमाओं पर चर्चा.

माइक्रोसंपर्क प्रिंटिंग के लिए स्पिन-कोटिंग द्वारा उत्पादित लिथोग्राफी किए गए मास्टरों की आवश्यकता होती है, जो एक ग्लास या सिलिकॉन वेफर पर एक फोटो-मास्क (आमतौर पर एसयू-8) का उत्पादन करता है, जो तब वांछित सूक्ष्म-सुविधाओं के साथ लेजर-एबिटड किया जाता है। इन मास्टरों का उपयोग पीडीएमएस स्टाम्प45बनाने के लिए टेम्पलेट के रूप में किया जाता है . टिकट एक चुना प्रोटीन है कि यह करने के लिए adsorbs के साथ incubated है, और फिर सेल संस्कृति पकवान पर स्थानांतरित (स्टैम्प्ड) है. पीडीएमएस स्टाम्प को प्रोटीन के अधिशोषण की प्रक्रिया प्रोटीन एकाग्रता, बफर और ऊष्मायन समय पर निर्भर करती है। इष्टतमपरिणामोंके लिए इन पैरामीटरों का पहले से परीक्षण किए जाने की आवश्यकता है .

परास्नातक प्रयोगों की एक पर्याप्त संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है, महीनों या यहां तक कि साल के लिए स्थायी, अगर सही ढंग से संरक्षित. हालांकि, इस तकनीक का एक सीमित कारक हर वांछित संशोधन के लिए नए लिथोग्राफी स्वामी को फिर से डिजाइन करने की आवश्यकता है। प्रयोगात्मक डिजाइनों में परिवर्तन के परिणामस्वरूप नए स्वामी (कई सप्ताह तक) के समय लेने वाली उत्पादन में इस प्रकार के प्रयोगों में देरी हो सकती है। इसकी तुलना में, LIMAP photopaterning एक भौतिक मास्टर की आवश्यकता नहीं है; यह सॉफ्टवेयर जनित पैटर्न टेम्पलेट्स का उपयोग करता है जो अनुसंधान प्रश्नों को बदलने के लिए माइक्रो-पैटर्न ्सके वांछित geometries को अनुकूलित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। LIMAP का उपयोग उसी माइक्रो-पैटर्न में प्रोटीन ग्रेडिएंट उत्पन्न करने के लिए भी किया जा सकता है (चित्र 8) जो माइक्रो-संपर्क मुद्रण47का उपयोग करके पुन: उत्पादन योग्य तरीके से प्राप्त करना कठिन है.

इसके अलावा, हमारे मामले में, LIMAP के साथ प्राप्त माइक्रो-पैटर्न संकल्प 2 डिग्री उ है(चित्र 6ठ)।

इस संकल्प को आ रहा अंतर और अंतर पैटर्न परिवर्तनशीलता में वृद्धि हुई. 10 डिग्री मीटर चौड़ाई के आस-पास या उससे ऊपर के पैटर्न उत्पन्न करना अत्यधिक पुनरुत्पाद्य था (चित्र 6जी, एच)। इसके विपरीत, माइक्रो-संपर्क मुद्रण के साथ यह लगातार 10 डिग्री से नीचे संकल्प प्राप्त करने के लिए मुश्किल है और यह कलाकृतियों को खोजने के लिए जब छोटी सुविधाओं (डेटा नहीं दिखाया) मुद्रांकन करने के लिए आम है।

हमने दिखाया है कि LIMAP का उपयोग माइक्रो-पैटर्न एकाधिक प्रोटीनों (चित्र 9) के लिए एक ही सूक्ष्म कूप के भीतर किया जा सकता है, जिससे प्रयोगों में जटिलता के और स्तर को जोड़ा जा सकता है। हालांकि इस microcontact मुद्रण के साथ प्राप्त किया जा सकता है, परिशुद्धता के उच्च स्तर के साथ विभिन्न प्रोटीन aligning तकनीकी रूप से बल्कि मांग की जा सकती है. LIMAP का उपयोग कर कई प्रोटीन पैटर्न Whilst सीधे आगे लगता है, यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि अनुक्रमिक कोटिंग प्रक्रियाओं के माध्यम से प्रोटीन के पार बाध्यकारी अभिकर्मकों अवरुद्ध के माध्यम से कम किया जा सकता है लेकिन पूरी तरह से समाप्त नहीं (चित्र 9).

एक या अन्य तकनीक की लागत के बारे में, LIMAP यहाँ वर्णित के रूप में माइक्रो-पैटर्निंग उपकरण (PRIMO) है कि विभिन्न फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर स्थापित किया जा सकता है और एक motorized चरण की आवश्यकता है की खरीद की आवश्यकता है. हालांकि यह निवेश शुरू में गहन लागत है, वहाँ कोई अतिरिक्त खरीद कर रहे हैं के अलावा अन्य कोई उपभोग्य वस्तुओं (stencils, खूंटी और PLPP) लंबे समय LIMAP के साथ जुड़े पर. वैकल्पिक रूप से, प्रकाशित प्रोटोकॉल18,32के बाद स्वयं प्रयोगकर्ता द्वारा पीडीएमएस स्टेंसिल का भी प्रयोगशाला में उत्पादन किया जा सकता है। microcontact मुद्रण के लिए सबसे बड़ी लागत नए स्वामी के उत्पादन के साथ जुड़ा हो सकता है, जो पर्याप्त हो सकता है अगर प्रयोगों नए पैटर्न की आवश्यकता हो सकती है.

LIMAP का एक दोष इस तकनीक के अपेक्षाकृत कम थ्रूपुट दृष्टिकोण है. माइक्रोसंपर्क प्रिंटिंग एक साथ स्टैंपिंग चरण में बड़ी संख्या में माइक्रो-पैटर्न्स का उत्पादन कर सकता है, जबकि LIMAP के साथ आवश्यक अनुक्रमिक लेजर माइक्रो-पैटर्निंग की तुलना में। उदाहरण के लिए, पीडीएमएस टिकटों (टिकट तैयार करने को छोड़कर) का उपयोग करके माइक्रो-संपर्क प्रिंटिंग के साथ लगभग 2 एच में 6 स्टाम्प ग्लास कवरलिप्स का उत्पादन करना संभव है; LIMAP के साथ एक समान क्षेत्र (6-वेल डिश) पैटर्न सतह passivation की प्रक्रिया को छोड़कर, चारों ओर ले जाएगा (चरण 5.12 में वर्णित पैटर्न टेम्पलेट विन्यास पर विचार और चित्र 5Bदेखें).

LIMAP प्रौद्योगिकी का एक और दर सीमित कारक लंबे समय से बड़े क्षेत्रों पैटर्न के लिए आवश्यक समय है (30 एक 7.5 mW/mm2 लेजर के साथ डिजाइन इकाई प्रति एस). इन मामलों में, microcontact मुद्रण एक पसंदीदा विकल्प हो सकता है. एक नए उपलब्ध फोटो-इनेटर (PLPP जेल, सामग्री की तालिका)काफी पैटर्न के लिए लिया समय कम करना चाहिए, बड़े क्षेत्रों में माइक्रो-पैटर्न के सैकड़ों की पीढ़ी की अनुमति (अप करने के लिए 8 मिमी2) बस कुछ ही मिनटों में.

एक अन्य महत्वपूर्ण कारक को ध्यान में रखना जब सेल संस्कृति के लिए माइक्रो-पैटर्निंग सतहों माइक्रो संपर्क मुद्रण के साथ प्राप्त परिवर्तनशीलता की तुलना में विभिन्न प्रयोगात्मक दोहराता के बीच माइक्रो-पैटर्न की प्रजनन क्षमता है। उदाहरण के लिए, चित्र 7B,D में दिखाए गए ग्राफ़ तीन स्वतंत्र प्रयोगात्मक दोहरावों के प्रतिनिधि डेटा होते हैं, जिनमें बहुत समान परिणाम होते हैं (डेटा नहीं दिखाया गया). हमारे अनुभव और पिछले प्रकाशनों के आधार पर , माइक्रो-संपर्क मुद्रण48,49, 50,51,52के साथ पुनरुत्पादनीयता का यह स्तर प्राप्त करना कठिन है .

अन्य फोटो-पैटर्निंग तकनीकों के विपरीत, जिनके लिए या तो फोटो-संवेदी सामग्री इंजीनियर के लिए समर्पित रसायन विज्ञान की आवश्यकता होती है या फोटो-संवेदनशील का उपयोग किया जाता है, जो आम तौर पर बहुत बायोसंगत3नहीं होते हैं, LIMAP (PLPP) के फोटोसंवेदी घटक ) जैव संगत और कोशिकाओं द्वारा अच्छी तरह से सहन किया जाता है21; हमारे हाथों में हम सीएडी, DRG न्यूरॉन्स (चित्र 10),फाइब्रोब्लास्ट, उपकला कोशिकाओं, और मेलेनोमा कोशिकाओं (डेटा नहीं दिखाया) सहित कोशिकाओं की एक किस्म भर में किसी भी cytotoxicity का अनुभव नहीं किया है। अन्य फोटो-पैटर्निंग तकनीकों की तुलना में PRIMO का उपयोग करLIMAP का एक अन्य लाभ यह है कि कोई photomask की आवश्यकता है. माइक्रोसंपर्क प्रिंटिंग की तरह ही, नए photomasks डिजाइन और हर वांछित पैटर्न के लिए उत्पन्न करने की आवश्यकता होगी.

माइक्रो-संपर्क मुद्रण के लिए ऊपर उल्लिखित सभी सीमाएं, तकनीक के मैनुअल दृष्टिकोण को देखें। हालांकि, स्टांप लोड और दबाव नियंत्रण53के साथ एक स्वचालित डिवाइस का उपयोग कर के माध्यम और माइक्रोसंपर्क मुद्रण की प्रजनन क्षमता को बढ़ाने के लिए संभव है।

प्रोटोकॉल के मुख्य कदम और LIMAP के लिए समस्याओं को सुलझाने PRIMO का उपयोग कर
इस प्रोटोकॉल के दौरान पाया सबसे आम समस्याओं में से एक माइक्रो-पैटर्न के भीतर पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट के उच्च स्तर रहा है। यह सूक्ष्म कुओं के सूखने के कारण हो सकता है जो अक्सर उनकी छोटी मात्रा के कारण होता है। जब ऐसा होता है, PBS क्रिस्टल अक्सर ECM पैटर्न के आसपास दिखाई देते हैं (चित्र 11ए).

प्रोटीन ऊष्मायन के बाद अपर्याप्त या अक्षम धोने के कदम भी पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट के उच्च स्तर में परिणाम कर सकते हैं। यह विशेष रूप से 10 g/mL (चित्र 11ठ) या अधिक प्रोटीन सांद्रता का उपयोग करने पर देखा जा सकता है। पृष्ठभूमि में प्रोटीन की अधिकता पीबीएस के साथ अतिरिक्त धोने के कदम सहित द्वारा कम किया जा सकता है.

प्रोटीन पृष्ठभूमि की उपस्थिति को मापा और प्रत्येक प्रयोग में विशेषता की आवश्यकता है, पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट तीव्रता की गणना (चित्र 6ई) और यह माइक्रो-पैटर्न्स तीव्रता से घटाना(चित्र 6F-H और चित्रा 7बी, डी) . उच्च प्रोटीन पृष्ठभूमि लगाव और सीएडी कोशिकाओं के अंकुरित में एक प्रभाव हो सकता है, परिणामों की व्याख्या समझौता.

डिजाइन इकाइयों के बीच अंतराल होना एक आम समस्या है जब उपयोगकर्ताओं के पास सीमित अनुभव होता है (चित्र 11B),जो पैटर्न के बीच अपर्याप्त ओवरलैप के परिणामस्वरूप होता है. लियोनार्डो सॉफ्टवेयर में दो मापदंडों को इस पर काबू पाने के लिए समायोजित किया जा सकता है: 1) स्तंभों के बीच एक नकारात्मक रिक्ति की आवश्यकता हो सकती है, पैटर्न के डिजाइन के आधार पर (चरण 5.7 और चित्र 5B,Cदेखें)। वैकल्पिक रूप से, 2) स्तंभ सिलाई करने के लिए विशेषज्ञ मेनू में ग्रेडिएंट विकल्प का उपयोग करें। इष्टतम रिक्ति मापदंडों को निर्धारित करने के लिए एक त्वरित परीक्षण यूवी चिपकने वाला(सामग्री की तालिका)का उपयोग कर के लिए किया जा सकता है। इस चिपकने वाला की एक छोटी सी बूंद एक गिलास स्लाइड है, जो तो एक गिलास coverslip के साथ कवर किया जाता है, एक फिल्म बनाने के लिए लागू किया जाता है. एम्बेडेड यूवी चिपकने वाला एक कम लेजर खुराक का उपयोग कर ब्याज कीपैटर्न टेम्पलेट के साथ photopatterned है (30 mJ/ एम्बेडेड चिपकने वाले के यूवी उजागर क्षेत्रों ठीक हो जाएगा, उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के तहत दिखाई बनने. परीक्षण परिणाम पैटर्न के भीतर प्राप्त रिक्ति का मूल्यांकन करने के लिए विज़ुअलाइज़ किए जाते हैं। हमारे न्यूरॉन प्रयोगों में, धारियों के बीच एक अंतर प्रतिकूल सेल व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं, विकास गतिशीलता में बदलाव का उत्पादन (या तो कम गति या पथ का परित्याग).

लियोनार्डो सॉफ्टवेयर के नवीनतम अद्यतन में (प्रकाशन के समय, लियोनार्डो 4.11), यह पहले से डिजाइन बड़ा पैटर्न टेम्पलेट्स कि एक बहुत बड़ा क्षेत्र को कवर अपलोड करने के लिए संभव है (अप करने के लिए 8 मिमी2 20X उद्देश्य का उपयोग कर) माइक्रो अच्छी तरह से सतह की डिजाइन इकाई प्रति वर्तमान 0.1 मिमी2 की तुलना में, छोटे डिजाइन इकाइयों के साथ सिलाई करने की आवश्यकता को नष्ट करने. अपरिभाषित किनारे पैटर्न पीढ़ी के दौरान लेजर फोकस समायोजन की कमी से परिणाम कर सकते हैं (चित्र 11ग)। इसलिए यह लेजर जांचना और संदर्भ पैटर्न कदम प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है (चरण 4 देखें) पैटर्न से पहले. खराब परिभाषित धारियों धारी चौड़ाई में बदलाव में परिणाम, एक्सॉन विकास गतिशीलता और धारी चौड़ाई मुश्किल के बीच संबंध बना रही है। Axons भी धारियों कि फैलाना किनारों है छोड़ देते हैं. इसके अतिरिक्त, किनारों में परिवर्तनशीलता भी पाया जा सकता है जब मुद्रण धारियों 10-20 डिग्री चौड़ाई या अधिक, पैटर्न के केंद्रीय क्षेत्रों की तुलना में किनारों पर एक उच्च प्रोटीन सामग्री में जिसके परिणामस्वरूप (चित्र 6B,D). इस बढ़त प्रभाव photopatterning प्रक्रिया के दौरान फोटो-इनिटेटर के एक गैर-समजातीय प्रसार द्वारा उत्पादित है। Photoscission प्रतिक्रिया ऑक्सीजन निर्भर है, जो किनारों पर अधिक diffuses है. इस बढ़त प्रभाव photopaterning प्रक्रिया के दौरान माइक्रो-वेल में एक पिपेट के साथ फोटो-इनेटर homogenizing कम से कम किया जा सकता है। इसके अलावा, एक नया commercialized फोटो-प्रारंभक (PLPP जेल), भी बढ़त प्रभाव को कम कर सकते हैं (PRIMO प्रणाली का समर्थन टीम, व्यक्तिगत संचार).

एक से अधिक प्रोटीन के सूक्ष्म मुद्रण के परिणामस्वरूप क्रॉस-बाध्यकारी होसकताहै ( चित्र 9ए-डी)। यह दो अलग प्रोटीन के लिए ऊष्मायन चरणों के बीच विशिष्ट बाध्यकारी साइटों पर कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि अवरुद्ध दक्षता बढ़ाने के द्वारा कम से कम किया जा सकता है. प्रोटीन के क्रॉस-बाइंडिंग प्रयोगात्मक परिणामों की पुनरावृत्ति कर सकते हैं और डेटा की गलत व्याख्या करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, क्योंकि यह एक्सॉन विकास गतिशीलता के लिए और अन्य सेल व्यवहार करने के लिए प्रत्येक प्रोटीन के योगदान का निर्धारण करने के लिए मुश्किल है.

निष्कर्ष
हमें उम्मीद है कि LIMAP का उपयोग कर प्रदान प्रोटोकॉल PRIMO प्रणाली के उपयोग के माध्यम से प्रोटीन माइक्रो-पैटर्न की पीढ़ी की सुविधा. Whilst हमारे प्रोटोकॉल कैसे मज़बूती से 2 डी कांच सतहों में माइक्रो-पैटर्न का उत्पादन करने पर केंद्रित है, दूसरों से पता चला है कि यह नरम substrates54के माइक्रो-पैटर्निंग के लिए LIMAP का उपयोग करने के लिए संभव है, और 3 डी संस्कृतियों के लिए microstructed सतहों42. इन माइक्रो-पैटर्न्स अपने सूक्ष्म पर्यावरण में परिवर्तन करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण हो सकता है।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम BBSRC, EPSRC, एमआरसी और वेलकम ट्रस्ट द्वारा समर्थित है। सी.बी. प्रयोगशाला सेल-मैट्रिक्स अनुसंधान के लिए वेलकम ट्रस्ट सेंटर का हिस्सा है, मैनचेस्टर विश्वविद्यालय, जो वेलकम ट्रस्ट से कोर फंडिंग द्वारा समर्थित है (अनुदान संख्या 088785/ लेखक जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबीएसआरसी) द्वारा सीएम, के.जे. (BB/M020630/1) और पी.ए. (BB/P000681/1) और इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (EPSRC) और चिकित्सा के लिए प्रदान की गई धन को स्वीकार करना चाहते हैं अनुसंधान परिषद (एमआरसी) अपक्षयी चिकित्सा में डॉक्टरेट प्रशिक्षण के लिए केंद्र ए.के. (ईपी/ लेखकों उनके पत्राचार और उनके बाद बिक्री समर्थन टीम के लिए Alvole धन्यवाद. लेखकों Bioimaging सुविधा, मैनचेस्टर विश्वविद्यालय से पीटर मार्च और रोजर Meadows माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी मदद के लिए धन्यवाद. इस अध्ययन में इस्तेमाल बायोइमेजिंग सुविधा माइक्रोस्कोप BBSRC, वेलकम ट्रस्ट और मैनचेस्टर सामरिक कोष के विश्वविद्यालय से अनुदान के साथ खरीदा गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa 488 protein labeling kit Invitrogen A10235 Working concentration: N.A.
Alexa 647 protein labeling kit Invitrogen A20173 Working concentration: N.A.
CAD cells ECACC 8100805 Working concentration: N.A.
Conjugated fibrinogen-488 Molecular Probes F13191 Working concentration: 10 μg/ml
DMEM culture medium Gibco 11320033 Working concentration: N.A.
Epifluorescence Microscope** Nikon Eclipse Ti inverted Working concentration: N.A.
Fibronectin Sigma F4759 Working concentration: 10 μg/ml
(after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above)
(diluted in PBS)
Fiji-Image J www.imagej.nih.gov Version 2.0.0-rc-54/1.51f Working concentration: N.A.
Fluorescent highlighter Stabilo Stabilo Boss Original Working concentration: N.A.
HEPES Gibco 15630080 Working concentration: 1M
Inkscape software Inkscape Check last update Working concentration: N.A.
Laminin-red fluorescent rhodamine Cytoskeleton, Inc. LMN01 Working concentration: 10 μg/ml
(diluted in PBS)
Leonardo software Alvéole version 4.11 Working concentration: N.A.
L-Glutamine Sigma G7513 Working concentration: 1%
Micro-manager software Open imaging Check last update Working concentration: N.A.
Motorized x/y stage PRIOR Scientific Proscan II Working concentration: N.A.
NIS Elements Software Nikon NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs) Working concentration: N.A.
PBS (without Ca2+, Mg2+) Sigma D8537 Working concentration: 1X
PDMS Stencils Alvéole visit www.alveolelab.com Working concentration: N.A.
PEG-SVA Laysan bio, Inc. MPEG-SVA-5000-1g Working concentration: 50 mg/ml
Phalloidin 405 Abcam ab176752 Working concentration: 1:1000
Photo-initiator (PLPP) Alvéole Classic PLPP Working concentration: 14.5 mg/ml
Photo-initiator (PLPP gel) Alvéole PLPP gel Working concentration: 4.76% diluted in ethanol
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V) Working concentration: N.A.
PLL-PEG SuSoS (also distributed by Alvéole) www.alveolelab.com Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS)
Poly-L-Lysine Sigma P4707 Working concentration: 0.01%
Primo equipment Alvéole www.alveolelab.com Working concentration: N.A.
Pen/Strep Thermo Fisher 15140122 Working concentration: 1%
Tubulin anti-alpha antibody Abcam DM1A Working concentration: 1:1000
CAD cells
Tubulin anti-beta 3 antibody Sigma T8660 Working concentration: 1:500
DRG neurons
UV adhesive Norland Products NOA81 Working concentration: N.A.
1 well glass bottom dish Cellvis D35-20-1.5-N Working concentration: N.A.
6 well glass bottom dish Cellvis P06-20-1.5-N Working concentration: N.A.
20x objective** Nikon no phase ring (check updated catalogue) Working concentration: N.A.
**Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alvéole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera.

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 152 माइक्रो-पैटर्न पैटर्निंग माइक्रो-पैटर्निंग LIMAP extracellular मैट्रिक्स (ECM) न्यूरॉन सेल व्यवहार प्रवास axonal विकास pathfinding निर्णय लेने
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Melero, C., Kolmogorova, A., Atherton, P., Derby, B., Reid, A., Jansen, K., Ballestrem, C. Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins. J. Vis. Exp. (152), e60092, doi:10.3791/60092 (2019).

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