Summary
Vores overordnede mål er at forstå, hvordan celler fornemmer ekstracellulære signaler, der fører til instrueret axonal vækst. Her beskriver vi metoden for lys-induceret Molekylær adsorption af proteiner, der anvendes til at producere definerede mikro-mønstre af ekstracellulære matrixkomponenter for at studere specifikke hændelser, der styrer Axon udvækst og Path Finding.
Abstract
Celler fornemmer en række ekstracellulære signaler, herunder sammensætningen og geometrien af den ekstracellulære matrix, som er syntetiseret og ombygget af cellerne selv. Her præsenterer vi metoden for lys-induceret Molekylær adsorption af proteiner (LIMAP) ved hjælp af PRIMO-systemet som en mønster teknik til fremstilling af mikro-mønstrede ekstrellulære matrix (ECM) substrater ved hjælp af en enkelt eller en kombination af proteiner. Metoden gør det muligt at udskrive ECM-mønstre i micron-opløsning med fremragende reproducerbarhed. Vi leverer en trin-for-trin protokol og demonstrere, hvordan dette kan anvendes til at studere processerne i neuronal pathfinding. LIMAP har betydelige fordele i forhold til eksisterende mikro-print metoder med hensyn til lethed af mønstret mere end én komponent og evnen til at generere et mønster med enhver geometri eller gradient. Protokollen kan nemt tilpasses til at studere bidraget fra næsten enhver kemisk komponent mod celle skæbne og celle adfærd. Endelig drøfter vi fælles spørgsmål, der kan opstå, og hvordan disse kan undgås.
Introduction
I de senere år har de biologiske videnskaber i stigende grad gjort brug af de fremskridt, som materiale videnskaberne har ydet. Et fremtrædende eksempel er mikromønstret af substrater, som kan bruges til at studere cellulære reaktioner såsom celle spredning1,2Differentiering3,4,5,6, celle overførsel7,8,9og patfinding10,11. Der er en række teknikker til rådighed, der muliggør mikro-mønstring af substrater, såsom multiphoton spændt fotokemi12, AFM dip-pen nanolithography13, PIN og inkjet direkte udskrivning14, elektronstråle litografi15eller microfluidics16. Men, to teknikker, der er meget udbredt i det biologiske område er microcontact Printing17,18,19eller laser assisteret mønster3(Figur 1). Laser-assisteret mønster anses for at levere mere pålidelige resultater i form af protein og PEG stabilitet og celle indeslutning på mønstrene, sammenlignet med microcontact Printing20. En mere ny tilgang til mikro-mønstret, der er beskrevet her, er brugen af let-induceret Molekylær adsorption af proteiner21(LIMAP,Figur 1 D) ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt system (PRIMO,Tabel over materialer). Hver af metoderne har fordele og begrænsninger, der er kort beskrevet nedenfor. Microcontact Printing bruger PDMS forme (frimærker) med ønskede mikro-funktioner, der genereres af litograferede mestre. Frimærkerne inkuberet med et valgt protein, som derefter overføres (stemplet) ind på cellekultur substratet18(Figur 1 A). Laser assisteret mønstning bruger UV-lys til at kløve en anti-fouling-film22,23,24,25, som udsætter regioner, der efterfølgende kan være belagt med det pågældende proteinFigur 1 B). Mens den opløsning, der er opnået med foto mønternes tilgange, er i micron-området25,26, de fleste af disse teknikker kræver en foto maske, enten i kontakt med prøven, eller beliggende i objekt planet af mikroskopet mål23,27,28. Kravene til masker i både mikrokontakt udskrivning og foto-mønster kan være en begrænsning; specifikke masker er nødvendige for hver geometrisk mønster og størrelse, som kan være dyrt og tidskrævende at generere. I modsætning til disse teknikker kræver LIMAP ikke en maske (Figur 1 D). Brug af PRIMO-systemet til LIMAP kan være omkostningskrævende i begyndelsen, fordi det kræver indkøb af udstyr. Men open source-software bruges til at designe mønstre af enhver ønsket geometri, hvilket giver meget mere frihed og tillader mere komplekse eksperimenter, herunder brugen af protein koncentrations gradienter. PRIMO laseren styres og ledes af en digitalt styret betegnelsen Micromirror Device-enhed (DMD) for at skabe mønstre i et vilkårligt antal brugerdefinerede geometrier. LIMAP kræver, at kultur overfladen er belagt med molekyler, der forhindrer celle fastgørelse. Polyethylenglycol (PEG) er mest almindeligt anvendt som sådan en "antifouling" reagens; det danner en tæt anti-klæbende film på glas eller plastik overflade29. Efterfølgende tilføjes en foto initiator, der gør det muligt at fjerne PIND filmen med høj præcision gennem en fotoscission-mekanisme30ved lokal udsættelse for UV-lys under kontrol af DMD. Disse PEG-fri regioner kan være belagt med proteiner, der adsorberes til den laser-ætsede overflade, genererer et mikro-mønster. Ved at variere laser effekt, kan forskellige mængder af PIND fjernes fra overfladen, så brugeren til at generere protein gradienter. PEG fjernelse og belægningen procedure kan gentages for at skabe mønstre med to eller flere særskilte proteiner i samme mikro-brønd21. De genererede mikro-mønstre giver klæbende overflader til celler, hvilket gør det muligt at studere celle adfærd. I vores studier bruger vi mikro-mønstret til at studere neurit eller Axon pathfinding af en neuronal cellelinje (CAD (Cathecholaminerge-a differentierede) celler31) eller primære rotte dorsale-rodganglion (DRG) neuroner. Her skitserer vi en trin-for-trin protokol for LIMAP (Figur 2) ved hjælp af det kommercielt tilgængelige PRIMO-system og ledsagende Leonardo-software. Vi demonstrerer, hvordan det kan bruges til generering af mønstre med definerede geometrier og flere proteiner, som vi bruger til at studere axonal pathfinding. Vi diskuterer fælles spørgsmål, der kan opstå, og hvordan disse kan undgås.
Protocol
1. design af mønster skabeloner
Bemærk: skabeloner til mønning genereres med digital tegnings software (tabel over materialer). Tegning i forskellige grå niveauer vil bestemme laser intensiteter. Brug af software til at designe mønster skabeloner giver mulighed for hurtig generering af mønstre med enhver ønsket geometri og gradienter (figur 3).
- Tegn den ønskede mønster skabelon digitalt ved hjælp af tegnings software. Vælg en billedstørrelse på 1824 pixels længde og 1140 pixels bredde (som i dette studie svarer til 415 μm længde og 260 μm bredde). Gem mønster skabelonen som en 8-bit TIFF-fil.
Bemærk: en trin-for-trin-protokol til at generere skabeloner er tilgængelig på anmodning til det brand, der kommercialiserer mikro-mønstret udstyr (tabel over materialer).
2. plasma rensning
Bemærk: optimale resultater kræver plasma rensning af overfladerne før mønstret, hvilket vil fjerne alt organisk materiale og aktivere overfladen. I det foreliggende tilfælde er den omgivende luft tilstrækkelig til overflade aktivering. En plasma renser (tabel over materialer) blev brugt med et proces tryk på 1000-1300 mTorr og en effekt på 29,6 W for 1-5 min.
- Brug glasbund skål/es med en 20 mm indre brønd størrelse og glas tykkelse på 0,16-0.19 mm. For at teste flere betingelser, brug en 6-brønd glasbund parabol. Ellers skal du bruge en enkelt brønd glasbund parabol (tabel over materialer).
Bemærk: en trin-for-trin-protokol for plasma rensning er tilgængelig efter anmodning til det brand, der kommercialiserer plasma rengøringsudstyr (tabel over materialer).
3. passivering
Bemærk: dette trin genererer en antifouling film, der forhindrer protein adsorptions til glasoverfladen. PEG tilbyder høj modstandsdygtighed over for protein adsorptions29 som et antifouling-middel. LIMAP bruger en foto initiator til lokalt at fjerne PIND gennem UV-fotoscission. Proteinet/s af interesse vil derefter adsorbe til disse PEG-fri overflader21, genererer mikro-mønstre.
- Passivation med PLL-PEG
- Under sterile forhold skæres PDMS stencils (Se figur 4A, B og tabel over materialer) for at sikre, at de passer i den indvendige glasbund godt, og fjern de indvendige mikro-brønd fyldninger med sterile pincet. Stick stencils på glasset godt ved hjælp af pincet.
- Sørg for, at stencils sidder stramt på glasset, og forhindrer dannelsen af luftbobler, der kan forårsage lækager under passivering.
Bemærk: PDMS stencils kan også fabrikeres internt ved hjælp af udgivne protokoller18,32. - Forbered PLL-PEG-opløsning (tabel over materialer, 0,1 mg/ml) i fosfat-bufferet saltvand (PBS). Tilsæt 20 μL PLL-PEG-opløsning til hver mikro-brønd, og Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
- Fjern 15 μL PLL-PEG fra mikro-brøndene og vask dem fem gange med 20 μL PBS (tabel over materialer) uden at lade dem tørre.
Bemærk: Efterlad altid ca. 5 μL PBS i mellem skyller. I betragtning af deres lille volumen, er mikro-brønde særligt modtagelige for tørring. Tørring vil resultere i mikro-mønstre af dårlig kvalitet. - Du skal enten beholde kultur skålen i PBS (3 mL pr. brønd) ved 4 °C i op til 3 dage eller fortsætte med næste trin (trin 3.1.5).
- Fjern 18 μL PBS fra en enkelt mikro-brønd (f. eks. den øverste venstre mikro-brønd, se figur 4D), tilsæt 5 ΜL foto initiator (Plpp, tabel over materialer) og Efterlad 20 μl PBS i de resterende mikro brønde. Denne mikro-brønd med PLPP vil blive brugt til at oprette et reference mønster (Se figur 4D, E) under system kalibrerings trinnet (trin 4). Hold PLPP beskyttet mod lys.
- Passivering med langvarig PEG-SVA
Bemærk: for at generere den anti-klæbende overflade kan man bruge: 1) en PIND knyttet til poly-L-lysin (PLL-PEG, trin 3,1) eller 2) en PEG-succinat N-hydroxisuccinimide (PEG-SVA). Beslutningen om at vælge den ene eller den anden passivering option afhænger af lagringsmulighederne (Se trin 10). Kultur retter inkuberet med PEG-SVA kræver dobbelt mængde af passivering og photopatterning tid.- Forbered stencils som beskrevet i trin 3.1.1.
- Tilsæt 20 μL 0,01% poly-L-lysin (PLL, tabel over materialer) til hver mikro-brønd og Inkuber ved stuetemperatur i 30 min til præ-frakke med PLL.
- Fjern 15 μL PLL fra mikro-brøndene og vask dem tre gange med 20 μL 1 M HEPES buffer (tabel over materialer) uden at lade brøndene tørre ud.
Bemærk: Efterlad altid ca. 5 μL HEPES eller PBS i mellem skyller. I betragtning af deres lille volumen, er mikro-brønde særligt modtagelige for tørring. Tørring vil resultere i mikro-mønstre af dårlig kvalitet. - Forbered PEG-SVA-opløsning. PEG-SVA opløsning (50 mg/mL i HEPES buffer 1M) skal tilberedes frisk hver gang umiddelbart før brug. Forbered 20 μL PEG-SVA pr. mikro-brønd.
- HEPES buffer skal have en pH mellem 8-8.5. Test HEPES pH før klargøring af PEG-SVA-opløsningen med pH-papir. Afvejes PEG-SVA i et centrifugeglas ved hjælp af en præcisions skala. Tilsæt HEPES buffer og vortex 30 s indtil opløst. PEG-SVA er helt opløst, når opløsningen er gennemsigtig.
Bemærk: SVA er ester, der tillader binding af PIND til den tidligere coatede PLL. Når HEPES-bufferen tilsættes til PEG-SVA, har SVA en halveringstid på 15 min. og bør anvendes med det samme. - Tilsæt 20 μL PEG-SVA-opløsning på hver mikro-brønd og Inkuber ved stuetemperatur i 1 time. Fjern 15 μL PEG-SVA fra mikro-brøndene og vask fem gange med 20 μL PBS (tabel over materialer) uden at lade brøndene tørre ud.
- Forbered enten kultur skålen til langtidsopbevaring (op til 1 måned, se trin 10,2) eller Fortsæt til næste trin (trin 3.2.8).
- Fjern 18 μL PBS fra en enkelt mikro-brønd (f. eks. den øverste venstre mikro-brønd, se figur 4D), tilsæt 5 μl plpp (tabel over materialer) og Efterlad 20 μl PBS i de resterende mikro brønde. Denne mikro-brønd vil blive brugt til at oprette et reference mønster (se fi Gure 4D, E). Sørg for, at PLPP er homogen på hele overfladen af mikro-brønden. Hold PLPP beskyttet mod lys.
4. system kalibrering
Bemærk: i disse trin vil fokus for laseren blive justeret til den særlige type af kultur skål (trin 4,1). Et reference mønster vil blive genereret i kun en mikro-brønd (trin 4,2) efterfulgt af inkubation med en proteinopløsning (trin 4,3) for at sikre de optimale fokus betingelser for laseren (trin 4,4), nødvendigt for at opnå skarpe og definerede mønstre.
- Laser kalibrering
Bemærk: under kalibreringsprocessen projiceres et kalibrerings laserbillede på en fluorescently-fremhævet glasoverflade (kalibrerings brønd, der er markeret med en lysstofrør, figur 4C), som skal sættes i fokus på Mikroskop.- Brug en fluorescerende overstregningstusch (tabel over materialer) til at markere en tom inderglas brønd.
Bemærk: kalibrerings brønden skal have samme glas tykkelse (0,16-0,19 mm) som den dyrknings skål, som mikromønstrene vil blive genereret på. Hvis der anvendes en 6-brønd glasbund parabol, kan en tom brønd anvendes til kalibrering og skal mærkes med fluorescerende overstregningstusch under sterile forhold. - Tænd mikroskopet, scenen og computeren. Tænd for PRIMO Micro-patterning udstyr, Open Micro-Manager og Leonardo software. Leonardo software drives gennem Micro-Manager under plugins. Tjek mærker/katalognumre af udstyr og software i tabel over materialer.
- Vælg Kalibreri den første menu i Leonardo. Kontrollér, at den dedikerede PRIMO filter kube er i den korrekte position (optisk kurve) i filter tårnet. Vælg 20X mål (0,75 DIC S plan fluor, ingen fase ring) både på mikroskop og på Leonardo software.
Bemærk: denne protokol er justeret til Leonardo version 4,4. Protokollen skal muligvis justeres for andre versioner. - Placer den tidligere fremhævede kalibrerings brønd (figur 4C) over målet. Vælg kamera kurve. Juster det objektive fokus, indtil laser projektion af både Primo -logoet og tag-linjen tager sig af dine celler er i fokus.
- Efterlad standard kameraets eksponeringstid på 25 ms. Juster laser intensiteten for at se Bogs tavet i fra Primo -logo projektion i grå farve og resten af bogstaverne i hvidt.
- Registrer den Z-position af brændplanet, (højden af målet til prøven) senere benævnt Z-position af kalibrering. Dette vil være en tilnærmelse til det optimale fokus opnået efter reference mønster generering (Se trin 4.2-4.4).
- Brug en fluorescerende overstregningstusch (tabel over materialer) til at markere en tom inderglas brønd.
- Reference mønster
- Placer kultur skålen med mikro-brønden, der indeholder foto-initiator (reference mønster mikro-brønd, figur 4D) over målet og vælg mønster nu i Leonardo software.
- Visualiser kanten af mikro-brønden med overført lys gennem kameraet og vælg ROI-symbolet fra menuen til højre. Indstil diameteren af ROI Circle til 4000 μm og Juster kanten af den digitale ROI med kanten af den nuværende mikro-brønd.
- Sørg for, at der er en nøjagtig overlapning mellem den digitale ROI og den aktuelle mikro-brønd ved at flytte scenen omkring kanterne af mikro-brønden. ROI position vil blive koblet til scenen bevægelser.
- Vælg Lås i Leonardo software for at låse ROI i den ønskede position. Sluk for det transmitterede lys.
- Vælg Primo for at uploade den ønskede mønster skabelon, som vil blive projiceret på investeringsafkastet som en design enhed (Se figur 5). Mønstre vises på en rulleliste, der omtales som handlinger og vises i menuen Handlinger på softwaren.
Bemærk: mønster skabelonerne skal designes tidligere (Se trin 1) og gemmes som en 8-bit TIFF-fil, før du indlæser skabelonen i softwaren. - Kun et lille mønster er nødvendigt for reference mønsteret; for eksempel 3 linjer, 1 kolonne (Se figur 4E og figur 5B). Angiv det ønskede antal kolonner og rækker (linjer i Leonardo-software) i menuen replikering . Klik på Opdater for at observere et digitalt eksempel på mønster designet.
- Indstil laser dosen i Replikeringsmenuen . Den optimale laser dosis i denne indstilling og ved hjælp af PLL-PEG er 1390 mJ/mm2.
Bemærk: laser effekt kan variere mellem 5-7,5 mW/mm2. I dette tilfælde er det 7,5 mW/mm2, som tager ca. 30 s til mønster hver design enhed, ved hjælp af en laser dosis på 1390 MJ/mm2. Højere laser doser kan være påkrævet, hvis kulturen parabol overflade er passiveret med peg-sva (ca. dobbelt laser dosis sammenlignet med PLL-peg). Dette skal testes på forhånd. - Naviger til et perifert område af mikro-brønden, (for eksempel øverste del) væk fra den vigtigste region af interesse for mønster generation (Central region) af mikro-brønd (Se figur 4E) og vælg Lås. Vent, indtil mønsteret vises.
- Juster fokus til Z-positionen for kalibrering (Se trin 4.1.6).
Bemærk: det anbefales at udføre et ekstra system kalibreringstrin, hvis en anden bruger anvender det samme mikroskop mellem fotopatterning-runder. - Vælg afspilnings symbolet for at starte mønstret. Sørg for, at laseren er tændt i softwaren. Vent, indtil mønster processen er afsluttet. Mønternes varighed vises i det anslåede tids panel. På Leonardo softwareversion 4,4 er mønstret fuldført, når alle handlinger vises blåt i visualiserings menuen.
- Protein inkubation på reference mønsteret
- Under sterile forhold vaskes reference mønsteret mikro-brønd tre gange med 20 μL PBS for at fjerne PLPP.
- Tilsæt 20 μl fluorescently-mærket ECM-protein (10 μg/ml Laminin, fibronektin eller fibrinogen i PBS, se tabel over materialer og trin 6) til reference mønsteret mikro-brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 10-20 min (afhængigt af proteinet) beskyttet mod lys (wrap skålen i aluminiumsfolie).
- Efter inkubation fjernes 18 μL proteinopløsning og vaskes tre gange med 20 μL PBS. Opbevar de mikrobrønde, der ikke anvendes til at oprette et reference mønster (Se figur 4D, E), i 20 μl PBS.
- Visualisering og indstilling af optimalt laser fokus
- Visualiser reference mønsteret ved hjælp af et epifluorescens mikroskop, 20X objektiv og egnet software (Se software, der anvendes i dette studie i tabel over materialer). Reference mønsteret skal være synligt i det perifere område (f. eks. top Well region), hvor reference mønsteret blev genereret (Se figur 4E).
- Juster fokus på mønster kanterne gennem kameraets sti. Optag Z-positionen i henhold til det bedste fokus på reference mønsteret. Denne justerede Z-position vil være den optimale laser fokus, der anvendes til efterfølgende mønster.
5. software opsætning og photopatterning
Bemærk: Når kalibreringen af systemet er opnået (trin 4), vil brugeren uploade de ønskede mønster skabeloner (skabelon konfiguration, figur 5) for photopatterning, med mulighed for at generere mønstre for en eller flere proteiner i hver mikro-brønd. Mikromøntionsprocessen involverer fotopatterning og protein inkubations trin (Se figur 2).
- Under sterile forhold skal du fjerne 18 μL PBS fra alle mikro-brønde og tilføje 5 μL PLPP til hver mikro-brønd. Sørg for, at PLPP er homogen på hele overfladen af mikro-brønde.
- Placer kultur skålen med reference mønsteret mikro-brønd (figur 4D, E) over målet og vælg mønster nu i Leonardo-softwaren.
- Visualiser mikro-brønden med overført lys gennem kameraets sti og vælg ROI-symbolet. Indstil diameteren af ROI til 4.000 μm og overlap kanten af den digitale ROI til kanten af den nuværende mikro-brønd. Vælg Lås.
Bemærk: form og diameter af ROI afhænger af udformningen og størrelsen af den PDMS stencil, der anvendes. Hvis du for eksempel bruger 5.000 x 5.000 μm PDMS squared stencils, skal du bruge et 5.000 x 5.000 μm kvadreret ROI. - Gentag det overlappende trin (trin 5,3) for hver mikro-brønd af skålen. Sluk det transmitterede lys, når det er færdigt.
- Naviger til midten af reference mønsteret mikro-brønd, væk fra reference mønsteret regionen, og vælg Primo for at uploade den ønskede mønster skabelon, som vil blive projiceret på ROI som en design enhed (Se figur 5). Mønstre vises på en rulleliste, der omtales som handlinger og vises i menuen Handlinger på softwaren.
Bemærk: mønster skabelonerne skal designes forud for eksperimentet og gemmes som en 8-bit TIFF-fil, før skabelonen indlæses i softwaren. - For at skabe et mønster på tværs af hele mikro-brønd, design enheden skal replikeres. En design enhed dækker ca. 0,1 mm2 af mikro-brønd området. I menuen replikering indstiller du det ønskede antal kolonner og rækker (linjer i softwaren) (Se figur 5).
- Hvis du vil generere et kontinuerligt mønster, skal du justere afstanden mellem kolonner og streger. i denne undersøgelse opnås mønstre af kontinuerlige striber ved hjælp af-20 til-35 μm afstand (negativ afstand) mellem kolonnerne. Denne negative afstand skaber en overlapning mellem design enheder (figur 5B, C).
- Indstil laser dosen i Replikeringsmenuen . Den optimale laser dosis i denne indstilling og ved hjælp af PLL-PEG er 1390 mJ/mm2. Mønternes varighed vises i det anslåede tids panel.
Bemærk: i dette tilfælde laser effekt er 7,5 mW/mm2, tager ca. 30 s til mønster hver design enhed, ved hjælp af en dosis på 1390 MJ/mm2. For eksempel, en design enhed (0,1 mm2) replikeret i 4 søjler og 4 linier (omkring 1,6 mm2), ville tage 8 min at være mønstrede. Højere laser doser kan være påkrævet, hvis kulturen parabol overflade er passiveret med peg-sva (ca. dobbelt laser dosis sammenlignet med PLL-peg). - Vælg Lås , og vent, indtil mønsteret vises stort set.
- Hvis du vil opdatere parametrene for et mønster, skal du klikke på den relaterede handlingog derefter låse og opdatere parametrene. Vælg Lås igen, når mønster opdateringen er fuldført.
- Mønstret for flere proteiner i samme mikro-brønd (sekventielle mikro-mønstringrunder) kræver en nøjagtig tilpasning af mønstrene. For at opnå en sådan justering, uploade alle sæt af ønskede mønster skabeloner samtidigt (mønstre af første og anden photopatterning runder).
- Angiv Replikerings-og dosis parametrene for mønster skabelonerne. Når parametrene er angivet, vises mønstre som handlinger på listen handlinger . Gem denne skabelon konfiguration som en fil i software (Se figur 5D).
- På listen handlinger skal du kun vælge de specifikke handlinger, der skal mønstrede under den første mønster runde, og fravælge de handlinger, som vil blive mønstret under den anden mønstrede runde (Se figur 5D).
- Naviger til det område, hvor reference mønsteret blev produceret i trin 4,2 (f. eks. den øverste region af reference mønsteret mikro-brønd, se figur 4E). Justér fokus til den optimale Z-position (opnået i trin 4,4).
Bemærk: det anbefales kraftigt at vælge perfekt fokus system på det mikroskop, der anvendes (hvis det er tilgængeligt), hvilket sikrer, at den optimale Z-position for mønstret vil blive opretholdt i hele fotopatterprocessen. - Vælg afspilnings symbolet for at starte mønstret. Mønternes varighed vises i det anslåede tids panel. På Leonardo softwareversion 4,4 er mønstret fuldført, når alle handlinger vises blåt i visualiserings menuen.
6. protein inkubation
Bemærk: mikro-brønde inkuberet med ECM-proteiner (fortrinsvis fluorescently-mærket). Disse vil kun binde sig til de områder, hvor PEG blev kløvet gennem den photopatterning proces, der er beskrevet i trin 5. Hver brønd indeholder en PDMS stencil med 4 mikro-brønde, som vil gøre det muligt at teste 4 forskellige betingelser samtidig, for eksempel, inkubation af et andet protein i hver mikro-brønd (Se figur 4D).
- Brug fluorescently-mærkede proteiner (for eksempel Laminin, fibronektin eller fibrinogen konjugeret til røde eller grønne fluorophorer) for at visualisere mikro-mønstre (Se trin 6,7 og 9,4). Alternativt kan adsorbede ikke-mærkede proteiner visualiseres på senere stadier ved hjælp af immunofluorescens.
Bemærk: ECM-proteiner (f. eks. fibronectin) kan mærkes ved hjælp af eksisterende protokoller33 og kommercielt tilgængelige fluorescens mærknings kits (dvs. Alexa 488 mærknings pakke) eller købt let mærket (for eksempel konjugeret fibrinogen-488 eller Laminin-rød fluorescerende rhodamin, se tabel over materialer). - Under sterile forhold forberedes den ønskede koncentration af ECM-proteiner (10 μg/ml Laminin, fibronektin eller fibrinogen i PBS, se tabel over materialer og trin 4,3).
Bemærk: Fluorescently-mærkede ECM-proteiner er lysfølsomme og bør beskyttes mod lys (wrap skål i aluminiumsfolie) og bør holdes på is på alle tidspunkter. - Under sterile forhold vaskes mikrobrøndene tre gange med 20 μL PBS for at fjerne PLPP.
- Fjern 18 μL PBS fra alle mikro-brønde og tilsæt 20 μL ECM-proteinopløsning til hver mikro-brønd. Inkuber ved stuetemperatur, for 20-30 min og Beskyt mod lys.
Bemærk: optimale belægnings tider for belægningen kan variere afhængigt af protein type og-koncentration. - Efter inkubation fjernes 15 μL ECM-proteinopløsning, og mikrobrøndene vaskes tre gange med 20 μL PBS.
Bemærk: Efterlad altid ca. 5 μL PBS i mellem skyller. - Hvis mønstret med kun ét protein (en runde af mikro-mønster), enten fortsætte til opbevaring af kulturen skålen (trin 10) eller til celle plating (trin 11, og se figur 2). Hvis du udfører en anden runde af mikro-mønstret med et andet protein i samme mikro-brønd, skal du enten fortsætte til opbevaring af kultur skålen (trin 10) eller til at blokere uspecifikke bindingssteder (trin 7 og se figur 2).
- Valgfri kvalitetskontrol trin: Visualiser og billede trykte mønstre ved hjælp af en epifluorescens mikroskop før plating celler. Vælg passende fluorescerende kanaler, og Juster eksponerings tiderne i overensstemmelse hermed.
Bemærk: for at sammenligne fluorescens intensiteten af mønstre mellem eksperimenter, er det vigtigt at bruge de samme eksponeringstider for de samme proteiner.
7. blokering af uspecifikke bindingssteder (kun for flere protein mønstre)
Bemærk: mikromønster med flere proteiner i samme mikro-brønd involverer sekventielle mønster trin (Se figur 2). Der tilsættes et blokerende middel (PLL-PEG eller BSA) til mikro-brøndene for at forhindre krydsbinding, hvilket opstår, når det andet inkuberet protein (trin 9) binder sig til det første inkuberet protein (trin 6) og dermed undgår en blanding af proteiner i mønstrene.
- Under sterile forhold tilsættes 20 μL PLL-PEG (0,1 mg/mL i PBS) eller BSA (1% BSA i PBS) som et blokerende trin for at forhindre krydsbinding.
Bemærk: blokerende effektivitet kan variere afhængigt af arten af de proteiner, der anvendes, og affiniteten blandt dem. Det anbefales at teste både PLL-PEG og BSA som blokerende stoffer på forhånd (figur 10D-I). - Incubate blokerende middel ved stuetemperatur i 1 time og Beskyt mod lys. Fjern 15 μL blokerende middel og vask alle mikro-brønde tre gange med 20 μL PBS. Efterlad altid ca. 5 μL PBS i mellem skyller.
- Fjern 18 μL PBS fra alle mikrobrønde, og tilsæt 5 μL PLPP til hver mikro-brønd, hvilket sikrer, at PLPP er homogen på hele overfladen af mikro-brøndene.
8. anden runde af photopatterning (kun for flere protein mønstre)
Bemærk: efter den første runde af photopatterning og protein inkubation genereres et mikro-mønster. Under den anden runde af photopatterning vil mønsteret for det andet protein blive genereret i samme mikro-brønd (Se figur 2C og figur 5D). I softwaren skal du vælge de korrekte mønster skabeloner (handlinger), som vil blive mønstret i denne runde (Se figur 5D).
- Naviger til den første mikro-brønd (figur 4D). Sikre passende overlapning mellem det digitale ROI og mikro-brønden.
- Indlæs den skabelon konfiguration, der tidligere er gemt (trin 5,12), og vælg de handlinger, der skal mønstrede under den anden photopatterning-runde (Fravælg handlinger fra første runde, se figur 5D).
- Vælg afspilnings symbolet for at starte mønstret. Sørg for, at laseren er tændt i softwaren.
9. anden runde af protein inkubation (kun for flere protein mønstre)
Bemærk: i denne del af protokollen vil fluorescently-mærket protein/s blive inkuberet på kultur skålen efter den anden runde af photopatterning.
- Under sterile forhold vaskes mikro-brønden tre gange med 20 μL PBS for at fjerne PLPP. Fjern 18 μL PBS, og tilsæt 20 μL ECM-proteinopløsning til hver mikro-brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 20-30 min. og Beskyt mod lys.
Bemærk: optimale belægnings tider for belægningen kan variere afhængigt af protein type og-koncentration. - Efter inkubation fjernes 15 μL ECM-proteinopløsning, og mikrobrøndene vaskes tre gange med 20 μL PBS. Efterlad altid ca. 5 μL PBS i mellem skyller.
- Enten fortsætte til opbevaring af kulturen parabol (trin 10) eller til celle plating (trin 11, og se figur 2).
- Valgfri kvalitetskontrol trin: ved hjælp af en epifluorescens mikroskop, visualisere og billede trykte mønstre før plating celler. Vælg passende fluorescerende kanaler og Juster eksponeringstid.
Bemærk: for at sammenligne fluorescens intensiteten af mønstre mellem eksperimenter, er det vigtigt at bruge de samme eksponeringstider for de samme proteiner.
10. opbevaring af mikro-mønstre
Bemærk: Mikromønstre med adsorberede proteiner kan lagres under forskellige trin i protokollen (Se figur 2). Hvis mikro-mønstret med flere proteiner, mikro-mønstre kan lagres efter den første runde af mikro-mønstring eller efter de to sekventielle runder af mikro-mønster er afsluttet (Se figur 2B).
- Når du har passiveret med PLL-PEG, skal du opbevare mikro-mønstrene i PBS (3 mL pr. brønd) ved 4 °C i op til 3 dage.
- Hvis kulturen skålen blev passiveret med peg-sva, mikro-mønstre kan opbevares i op til 1 måned. For at gøre dette, skylles mikro-mønstre intensivt med dobbeltdestilleret deioniseret vand og tørre med en steril luft pistol af argon eller nitrogen, selv om normal luft også kan anvendes. Efter tørring kan mikro-mønstre opbevares ved 4 °C i op til 1 måned (PRIMO system support team, personlig kommunikation).
11. plating celler
Bemærk: under de næste trin vil cellerne blive belagt på den forberedte mikro-mønstrede kultur skål/es. I disse undersøgelser, en neuronal cellelinje (CAD-celler) anvendes31. Men denne protokol kan justeres til at studere andre celletyper af interesse (justere celle plating protokol som krævet).
- Differentiere CAD-celler for 48 h ved hjælp af differentierings medium (DMEM suppleret med 1% glutamin, uden serum, og med 1% pen/STREP, se tabel over materialer).
- Plade 1 mL medium med celler i det inderste glas brønd, der dækker alle mikro-brønde og placere kulturen skålen i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
Representative Results
Efter ovenstående protokol resulterer i mikro-mønstrede overflader, belagt med ECM protein/s af interesse. Vi bruger disse mønstre til at spore neuronal pathfinding.
Genererede mønstre skal være en præcis gengivelse af skabelonen. Et eksempel er vist i figur 6 , hvor en digital mønster skabelon (figur 6a), der repræsenterer én design enhed (figur 5B), resulterede i definerede mikro-mønstre, der spænder fra 20 til 2 μm bredde, belagt med mærket Fibrinogen (figur 6B). Ved hjælp af ImageJ blev målingerne af fluorescens intensitet opnået både lodret (figur 6C) og vandret (figur 6E) langs med striben og fra et tilsvarende baggrundsområde 15 μm over hver stribe. Baggrunds målingerne blev trukket fra mønster målingerne for hver stribe bredde.
En begrænsning af systemet er, at en kant effekt kan observeres (figur 6B, top stribe), når udskrivning funktioner ≥ 20 μm, med en højere intensitet signal på mønster kanterne sammenlignet med midten (figur 6D, første peak af fluorescerende intensitets profil). I vores eksperimenter var afviklings grænsen ca. 2 μm; i denne bredde observerede vi et signifikant fald (med ca. 50%) i fibrinogen fluorescens intensitet sammenlignet med intensiteten af de bredere striber (figur 6F, G). Mønstret ved hjælp af PRIMO-systemet og den her skitserede protokol producerede reproducerbare mønstre med den højeste standardafvigelse for den gennemsnitlige fluorescerende intensitet målt for 2 μm-bredden fra fire individuelle replikerede design enheder (figur 6 G). variation inden for de mønstrede striber blev også konstateret at være lav; variationskoefficienten varierede fra 3 til 10% med 20 μm og 2 μm striber med den største interne variation. Dette er sandsynligvis et resultat af henholdsvis Edge-effekten og afviklings grænsen for systemet. Bemærk, at for disse målinger målte vi kun intensiteten i midten af striberne for at undgå den ujævne belysning som følge af det mål, der anvendes til at erhverve disse billeder (vignettering, figur 6E).
Visse eksperimenter kan omfatte spørgsmål, der kræver definerede proteinkoncentrationer, som kan opnås på to måder: 1) varierende proteinkoncentrationen (figur 7A, B). Inkubation med forskellige koncentrationer af Laminin, resulterer i signifikant forskellige fluorescens intensiteter, stigende med højere proteinkoncentrationer (figur 7B). 2) den laser dosis, der bruges til at kløve den anti-klæbende film (PEG) kan varieres. Højere laser doser vil fjerne antifouling film i større udstrækning, genererer mere bindende steder for de proteiner af interesse (figur 7C, D) resulterer i signifikant forskellige fluorescens intensiteter, stigende med højere laser doser (figur 7D).
Varierende laser dosis tillader generering af protein gradienter inden for samme mønster. Dette vises i figur 8a, hvor en gradient skabelon blev designet ved hjælp af forskellige gråskala niveauer, fra sort (ingen laser effekt) til hvid (maksimal laser effekt).
Laser intensitet er proportional med den gråskala niveau af skabelonen (fra 0 til 255 i en 8-bit billede), genererer gradienter af UV-belysning. Målingen af fluorescens intensitets profilen langs gradient striben er lineær i mønster skabelonen (figur 8B) og i det genererede graduerings mønster (figur 8C, D). Dette er reproducerbar blandt alle gradient striber inden for samme skabelon og gradient mønster (figur 8B, D). Generering af sådanne gradienter er yderst nyttig og hjælper med at efterligne in vivo miljøer, hvor cellerne ofte reagerer på gradienter af bioaktive proteiner34,35,36,37.
Celler Sense skiftende ekstracellulære miljøer, men analyser, der gør det muligt at studere celle adfærd, når celler støder på sådanne ændringer er begrænset. LIMAP kan bruges til mikro-mønster med flere proteiner i samme mikro-brønd. Eksempler er vist i figur 9 , hvor Cross-mønstre blev genereret med striber af fibronektin (vandret) og Laminin (lodret). Når du opretter mønstre med flere proteiner, er det afgørende at bruge et blokerende trin mellem første og anden protein inkubation for at forhindre krydsbinding af proteiner (Se trin 7). Blokerings effektiviteten kan variere afhængigt af de biokemiske egenskaber ved de proteiner, der anvendes til belægning, og vi anbefaler, at der testes flere blokerende buffere, herunder PLL-PEG (0,1 mg/mL) og BSA (1%). For at evaluere denne tværbindende effekt udførte vi målinger af fluorescens intensitet ved hjælp af ImageJ (figur 9), og vi viste, at krydsbinding kan reduceres dramatisk ved hjælp af PLL-peg buffer (0,1 mg/ml) til fibronektin og Laminin kryds mønstre (figur 9D, H).
De genererede Cross-mønstre blev brugt til cellulære assays med CAD-celler (figur 10A, B) eller rotte dorsale-root ganglion (DRG) neuroner (figur 10C). Deres neurites (CAD) og axoner (DRG) vokser langs forskellige linjer. CAD-celler bruges som en neuronal model, da de viser en lignende anti Expression profil sammenlignet med primære neuroner og de stadig vise actin-rige vækst kegler efter 48 h i kultur (figur 10B), hvilket gør dem egnede til patfinding Undersøgelser.
For at undersøge de mulige cytotoksiske virkninger af de genererede mikromønstre i retning af primære neuroner blev DRG-neuroner isoleret og dyrket på mikro-mønstre efter en tidligere offentliggjort protokol38. Resultaterne viser, at primære neuroner tolererer mikro-mønstre miljøet (figur 10C). Vi er i øjeblikket ved at studere, hvordan en række ECM proteiner påvirker axonal (neurite) pathfinding. Foreløbigt bevis for begreber fundet i CAD-celler vil blive yderligere undersøgt ved hjælp af DRG neuroner. For at validere kvaliteten af genererede mikro-mønstre, er det ønskeligt at billed mønstre ved Fluorescens mikroskopi for at sikre mønster kanterne er veldefinerede, før du fortsætter til celle plating. Under billeddannelses processen er det vigtigt at sikre den optiske justering mellem mikroskopet og kameraet for at undgå den perifere mørkere effekt (vignettering), som påvirker den posterior analyse og fortolkning af data. Desuden erhverve et billede af en mønster-fri region ved hjælp af de samme eksponeringstider, der vil blive brugt til at afbilde mønstre og trække dette billede fra mønster billedet.
Sammenfattende er det tilrådeligt at vurdere proteinkoncentrationen (figur7A, B), laser doser (figur 7C, D), protein baggrundsniveauer (figur6E, f, H) og en effektivt blokerende trin (figur 9) ved brug af flere proteiner. Endegyldigt er kvaliteten af mikro-mønstre genereret med LIMAP afgørende for at opnå pålidelige og reproducerbare data fra cellulære assays.
Figur 1: ordning for mikromøntionsteknikker: mikrokontakttrykning og laser assisteret mønster. (A) ved mikrokontakt udskrivning anvendes en litograferet Master med definerede mikro-funktioner til at generere et PDMS stempel, der inkuberet med det protein af interesse. Dette protein er derefter overført (stemplet) på en glasoverflade, genererer protein mikro-mønstre. (B) laser-assisteret møntionsteknikker omfatter photopatterning og direkte laser mønster. C) de fleste fotopattermetoder anvender en UV-lyskilde og en Mask (enten i berøring med substrat overfladen eller i målplanet) med ønskede geometrier for at kløve den stivantifoulingflade i bestemte positioner oprettelse af et defineret mønster. Et efterfølgende protein inkubations trin resulterer kun i protein adsorptions til de laser kløvede områder. D) limap er en photopattering-teknik, der ikke kræver en Mask i kontakt med substratet (dvs. en maskøs og kontaktfri tilgang). Limap bruger en foto-initiator, som er aktiveret ved lave doser af en laser, kløvende lys-udsatte områder af peg. Dette skaber fastgørelses steder for sekventiel protein adsorption. (E) direkte laser mønster bruger høj energi lys til direkte etch den pind film, så proteinbinding i disse ætsede regioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skema, der viser en oversigt over trinnene i mikromønternes protokol. A) mikromønstret med ét protein omfatter kun én runde af mikro-mønstret (photopatterning og protein inkubation) og kan udføres i under 8 h.B) mikromønster med flere proteiner kræver to fortløbende runder af mikro-mønstret og kan udfyldes i 1-2 dage, afhængigt af antallet af mikro-mønstre, der forberedes. Det er muligt at gå gennem B-versionen af protokollen i 1 dags arbejde. Fortløbende pile indikerer direkte strøm af trin i protokollen. Diskontinuerlige pile indikerer, at der er en betydelig tidsforskel mellem et trin og det andet (Se trin 6,6 og 9,3). (C) Skematisk visning af eksempelmønstre opnået efter en runde af mikro-mønstring (røde striber) eller to fortløbende runder af mikro mønster (røde og grønne striber). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: generering af mønster skabeloner er alsidig med LIMAP. (A, B) Eksempler på mønster skabeloner designet med ImageJ (en armbrøster, B-bogstaver). Figurer tegnet i hvidt blev projiceret ved maksimal laser effekt og figurer trukket i sort blev ikke projiceret. (C, D) Mikro-mønstre opnået med LIMAP fra skabeloner efter inkubation med 10 μg/mL fibrinogen (grøn). (C) armbrøker 50 μm bredde og 50 μm højde fordelt med 75 μm vandret og 50 μm lodret. (D) bogstaverne er 80 μm bredde og 85 μm højde. Skala stænger i C og D repræsenterer 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: essentielle materialer til LIMAP-protokollen. (A) stencils, der anvendes i denne protokol er 20 mm diameter, tynde cirkulære-form PDMS stykker (250 μm tykkelse), der indeholder 4 mikro-brønde (4 mm diameter hver). De mængder, der anvendes i mikro-brønde spænder fra 5 til 20 μL, betydeligt reducere mængden af reagenser og proteiner, der er nødvendige for hvert eksperiment. (B) 6 brønd glasbund fad, hvor stencils allerede er placeret i hver brønd. Mikrobrønde indeholder 20 μL PBS for at gøre dem synlige. C) kalibrerings skål, hvor det indvendige glas brønd er mærket med en grøn overstregningstusch, som vil blive brugt til at kalibrere laser fokuseringen. (D) Skematisk visning af øverste venstre godt fra 6-brønd glasbund skålen i B (skitseret med stiplede rød cirkel). Den indvendige glasbund godt er repræsenteret i hvidt og stencilen er vist i gråt. Stencilen indeholder 4 mikro-brønde (nummereret 1-4), til afprøvning af 4 forskellige eksperimentelle betingelser (f. eks. forskellige proteinkoncentrationer, mønster geometrier, kombinationer af proteiner osv.). Stjernen repræsenterer mikro-brønden, der indeholder reference mønsteret. E) Skematisk visning af mikro-brønd, hvor der er genereret et reference mønster i den øverste del (pil med udfyldt pilespids). Dette reference mønster er nødvendigt for at opnå det optimale laser fokus for mønsterning (Se trin 4). Pil med Tom pilespids angiver det centrale område af mikro-brønden, som vil blive brugt til efterfølgende mønster efter systemkalibrering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: software set-up for mikro-møning. (A) mønster skabelon med parallelle striber designet med ImageJ og gemt som en 8-bit TIFF-fil. (B-D) Skematisk visning af digitale ROIs (regioner af interesse), der vil overlappe med de nuværende mikro-brønde, hvor mikro-mønstre vil blive genereret. (B) den mønster skabelon, der skal anvendes (længde 1824 pixel = 415 μm, bredde 1140 pixel = 260 μm) er valgt på Leonardo og PROJICERES på ROI som en design enhed (røde striber i det sorte stiplede rektangel), som vil dække ca. 0,1 mm2 af mikro-brønd område. Design enheden replikeres i 4 kolonner og 4 linjer i Replikeringsmenuen (skabelon konfiguration), hvilket skaber et mønster på tværs af mikro-brønden. Bemærk afstanden mellem kolonnerne. (C) for at mønster kontinuerlige striber, skal afstanden mellem kolonnerne justeres. I dette tilfælde, for at opnå en overlapning mellem design enheder er afstanden mellem kolonnerne angivet i replikeringsmenuen som negativ afstand,-20 μm. (D) for at mønstre flere proteiner i samme mikro-brønd, er en nøjagtig tilpasning af mønstrene Kræves. Under software set-up Step (trin 5), uploade alle ønskede mønster skabeloner samtidigt. På listen handlinger skal du kun vælge de specifikke handlinger, der skal mønstrede under hver mønster runde, og fravælge resten af handlingerne (trin 5,12, 5,13 og 8,2). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: analyse af mønster variabilitet ved hjælp af LIMAP. (A) mønster skabelon designet med ImageJ anvendes til mikro-mønster fire striber af varierende bredde (20, 10, 5, 2 μm, fra top til bund). B) mikromønster opnået efter inkubation med 10 μg/ml fluorescently-mærket fibrinogen (grøn). C) intensitets målinger langs en lodret linje, der krydser striberne i mikro-mønsteret. D) vertikal profil for fluorescens intensitet opnået ved måling i litra C). Bemærk, at ved større bredder (20 μm) er der en variation i den lodrette profil forårsaget af akkumulering af protein i kanterne af striben, hvilket resulterer i to særskilte fluorescens intensitets toppe (kant effekt). Denne effekt ses kun i stribe bredder ≥ 20 μm.E) intensitets målinger langs de afbildede vandrette linjer (Fluorescens og baggrund). F) horisontale fluorescens intensitets profiler opnået ved målinger i (E). G) graf, der viser den gennemsnitlige intensitet for hver stribe bredde, målt fra fire individuelle replikerede design enheder (inter-mønster variation). Bemærk den reducerede protein adsorptions til mønstre af 2 μm stribe bredde. H) variationen inden for de mønstrede striber (variationskoefficienten) var lav for alle stribe bredder, nemlig fra 3 til 10%. Data i G og H vist som middelværdi ± SD. statistisk analyse i G og H blev udført ved hjælp af en-vejs ANOVA (Kruved-Wallis) ikke-parametrisk test med flere sammenligninger. P-værdien er < 0,001 for * * signifikans. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: effekten af variationer i laser effekt og proteinkoncentration for protein adsorptions effektivitet. A) PLL-peg-overfladen var laser kløvet med en konstant laser dosis (1390 MJ/mm2) og inkuberet med de indikerede koncentrationer af fluorescently-mærket Laminin (magenta). B) kvantificering af laminat striberne i (a) Fluorescens intensitet. C) de forskellige indikerede laser doser blev anvendt efterfulgt af inkubation med samme koncentration (10 μg/ml) fluorescently-mærket fibronektin (grøn). D) kvantificering af fluorescens intensitet af fibronektin-striberne i (C), der viser, at højere laser doser korrelerer til højere niveauer af adsorbet protein. Alle målinger er baggrunds trukket. Prøve numrene er angivet i bunden af kolonnerne. data vises som middel ± SEM. statistisk analyse blev udført ved hjælp af ikke-parametrisk Mann-Whitney test med to-sidet beregning. P-værdien er < 0.0001 for * * * * signifikans. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: generering af en protein koncentrations gradient i et mikro-mønster. (A) gradient mønster skabelon i gråskala. B) Fluorescens intensitets profil målt fra (A). C) mønster opnået med limap fra mønster skabelon i (A) efter inkubation med 10 μg/ml fluorescently-mærket fibronektin (grøn). D) Fluorescens intensitets profil for n = 3 striber og baggrund repræsenteret som middelværdien ± SEM, der viser den lineære stigning i protein gradienten intensitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: den tværbindende effekt ved mønster flere proteiner sekventielt. (A-C, E-G) Cross-mønstre med 10 μm striber af fluorescently-mærket fibronektin (cyan, vandret) og fluorescently-mærket Laminin (magenta, lodret). (A-C) Prøver behandlet med BSA blokerende buffer. (E-F) Prøver behandlet med PLL-PEG til blokering af uspecifikke bindingssteder (trin 7). (A, E) Flettede fluorescens kanaler, der viser både fibronektin og Laminin. (B, F) Billede, der kun viser fibronektin. (C, G) Billede, der kun viser Laminin. For C, Bemærk tilstedeværelsen af Laminin også på horisontale fibronektin positive striber, som skyldes den ineffektive blokering af ubesatte bindingssteder med BSA. For G, Bemærk, at blokering med PLL-peg forhindrer effektiv binding af Laminin til fibronektin striber. (D, H) Fluorescens intensitets profiler opnået fra indikerede målinger (diagonal gul linje) i henholdsvis A og E. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Krydsmønster for at undersøge neurite/Axon-pathfinding. (A-C) Cross-mønstre med 10 μm striber af fluorescently-mærket fibronektin (cyan, vandret) og fluorescently-mærket Laminin (magenta, lodret). (A, B) Fluorescerende billeder af CAD-celler med neuritter vokser langs mikro-mønstre. For at visualisere neuritter blev cellerne dyrket i 48 h, fastgjort med 4% PFA og plettet for Tubulin (A) eller Tubulin og actin (B). (C) rotte dorsale-root ganglion (DRG) neuroner med axoner vokser langs mikro-mønstre. For at visualisere axons blev DRG neuroner dyrket i 72 h, fikseret med 4% PFA og plettet til Tubulin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: eksempler på fælles negative resultater opnået ved generering af mikro-mønstre med LIMAP. (A-C) Suboptimale mønstrede striber på 10 μg/mL fluorescently-mærket fibrinogen (grøn) fremstillet under forskellige omstændigheder. A) mikro-brønden tørres ud under mønster generering. Bemærk de høje niveauer af fluorescens i baggrunden (pil) og tilstedeværelsen af PBS krystaller (Asterisks). (B) sømmen mellem striberne blev ikke justeret korrekt under software opsætning, hvilket resulterede i diskontinuerlig striber med mellemrum (pil) blandt design enheder (Se trin 3.4.7). (C) laser fokuseringen var suboptimal og forårsagede spredte striber (pile), som ikke repræsenterer mønster skabelonens faktiske stribe bredder, som skal være 20, 10, 5, 2 μm fra top til bund, som i (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
LIMAP (PRIMO) mikro-mønster fordele og sammenligning med microcontact Printing
Mens mikrokontakt udskrivning er muligvis den mest almindeligt anvendte mikro-mønster teknik i det biologiske felt39, der synes at være et stigende antal forskere ved hjælp af limap teknologi40,41,42 ,43,44. Her præsenterede vi en protokol ved hjælp af PRIMO, et kommercielt tilgængeligt system til LIMAP. Nedenfor diskuterer vi kort mulige fordele og begrænsninger ved mikrokontaktudskrivning og LIMAP-foto mønster.
Mikrokontakt udskrivning kræver litograferede mestre produceret af spin-coating en foto maske (generelt SU-8) på et glas eller silicium wafer, som derefter laser-ætset med de ønskede mikro-funktioner. Disse mastere bruges som skabeloner til at oprette et PDMS-stempel45. Stemplet er inkuberet med et valgt protein, der Adsorber til det, og derefter overføres (stemplet) på cellen kultur parabol. Adsorptionsprocessen af proteinet til PDMS-stemplet er afhængig af proteinkoncentration, buffer og inkubationstiden. Disse parametre skal testes på forhånd for optimale resultater46.
Masters kan bruges i et stort antal eksperimenter, der varer i måneder eller endda år, hvis korrekt bevaret. Men, en begrænsende faktor for denne teknologi er nødvendigheden af at re-designe nye litograferede mestre for hver ønsket modifikation. Ændringer i eksperimentelle design kan resultere i tidskrævende produktion af nye mestre (op til flere uger) og dermed forsinke eksperimenter. Til sammenligning kræver LIMAP photopatterning ikke en fysisk Master; Det bruger software-genererede mønster skabeloner, der kan bruges til fleksibelt tilpasse ønskede geometrier af mikro-mønstre til at ændre forskningsspørgsmål. LIMAP kan også bruges til at generere protein gradienter inden for samme mikro-mønster (figur 8), som er sværere at opnå på en reproducerbar måde ved hjælp af microcontact Printing47.
Desuden er den mikro-mønster opløsning opnået med LIMAP, i vores tilfælde, er 2 μm (figur 6B).
Nærmer sig denne resolution øget intra-og Inter-mønster variabilitet. Generering af mønstre omkring eller over 10 μm bredde var meget reproducerbar (figur 6G, H). Tværtimod, med mikrokontakt udskrivning er det svært at konsekvent opnå opløsninger under 10 μm, og det er almindeligt at finde artefakter, når stempling små funktioner (data ikke vist).
Vi har vist, at LIMAP kan anvendes til mikro-mønster flere proteiner (figur 9) inden for samme mikro-brønd, så yderligere niveauer af kompleksitet, der skal føjes til eksperimenter. Selv om dette kunne opnås med mikrokontakt udskrivning, tilpasse forskellige proteiner med høj præcision kan være teknisk temmelig krævende. Mens mønstret flere proteiner ved hjælp af LIMAP synes ligetil, er det vigtigt at nævne, at krydsbinding af proteiner gennem sekventiel belægning procedurer kan reduceres gennem blokerende reagenser, men ikke helt elimineret (figur 9).
Med hensyn til omkostningerne ved den ene eller den anden teknik, LIMAP som beskrevet her kræver køb af mikro-mønstring udstyr (PRIMO), der kan installeres på forskellige fluorescens mikroskoper og kræver en motoriseret fase. Selv om denne investering i første omgang er omkostningsintensiv, er der ingen andre Køb end forbrugsvarer (stencils, PEG og PLPP) på det lange løb forbundet med LIMAP. Alternativt kan PDMS stencils også produceres i laboratoriet af egen eksperimententer efter offentliggjorte protokoller18,32. De største omkostninger til mikrokontakttrykning kan være forbundet med produktion af nye mestre, som kan blive betydelige, hvis eksperimenter kræver nye mønstre.
En ulempe ved LIMAP er den relativt lave gennemløb tilgang af denne teknik. Mikrokontakt udskrivning kan producere et stort antal mikro-mønstre hurtigt og effektivt i en samtidig stempling trin, sammenlignet med den krævede sekventielle laser mikro-mønstring med LIMAP. For eksempel er det muligt at producere 6 stemplet glas dæksedler i ca 2 h med mikrokontakt udskrivning ved hjælp af PDMS frimærker (undtagen stempel præparat); mønstret et lignende område (6-brønd skål) med LIMAP ville tage omkring 4 h, undtagen proceduren for overflade passivering (i betragtning af mønster skabelon konfigurationen beskrevet i trin 5,12 og se figur 5B).
En anden sats begrænsende faktor for LIMAP-teknologien er den lange belysnings tid, der kræves til at mønstret store områder (30 s pr. design enhed med en 7,5 mW/mm2 -laser). I disse tilfælde kan udskrivning af mikrokontakter være en foretrukken mulighed. En nyligt tilgængelig foto-initiator (PLPP gel, tabel over materialer) bør betydeligt reducere den tid, der tages for mønstret, så generation af hundredvis af mikro-mønstre i store områder (op til 8 mm2) på blot et par minutter.
En anden vigtig faktor at tage hensyn til, når mikro-mønstrende overflader for cellekultur er reproducerbarhed af mikro-mønstre blandt forskellige eksperimentelle gentagelser, i forhold til variabiliteten opnået med mikrokontakt trykning. For eksempel er de grafer, der er vist i figur 7B, D repræsentative data for tre uafhængige eksperimentelle gentagelser med meget ens resultater (data ikke vist). Baseret på vores erfaring og tidligere publikationer, er dette niveau af reproducerbarhed vanskeligt at opnå med microcontact Printing48,49,50,51,52.
I modsætning til andre foto mønster teknikker, der kræver enten dedikeret kemi til ingeniør fotosensitive materialer eller brug af fotosensibiliserende stoffer, som generelt ikke er meget biokompatible3, er den lysfølsomme bestanddel af limap (plpp ) er biokompatibelt og veltolereret af cellerne21; i vores hænder har vi ikke oplevet nogen cytotoksicitet på tværs af en række celler, herunder CAD, DRG neuroner (figur 10), fibroblaster, epiteliale celler og melanom celler (data ikke vist). En anden fordel ved limap ved hjælp af primo sammenlignet med andre foto-mønster teknikker er, at ingen Mask er påkrævet. Svarende til microcontact Printing, nye photomspørger skal designes og genereres for hver ønsket mønster.
Alle de begrænsninger, som er nævnt ovenfor for microcontact Printing, henvises til den manuelle fremgangsmåde af teknikken. Det er dog muligt at forbedre dataoverførselshastigheden og reproducerbarhed af mikrokontaktudskrivning ved hjælp af en automatiseret enhed med stempel belastning og tryk kontrol53.
Vigtige trin i protokollen og problemer med at løse for LIMAP ved hjælp af PRIMO
Et af de mest almindeligt forekommende problemer i denne protokol er at have høje niveauer af baggrunds fluorescens i mikro-mønstre. Dette kan skyldes udtørring af mikro-brønde, som ofte opstår på grund af deres lille volumen. Når dette sker, vises PBS-krystaller ofte omkring ECM-mønstrene (Figur 11A).
Utilstrækkelig eller ineffektiv vask trin efter protein inkubation kan også resultere i høje niveauer af baggrunds fluorescens. Dette kan især iagttages ved anvendelse af proteinkoncentrationer på 10 μg/mL (Figur 11B) eller derover. Det overskydende protein i baggrunden kan reduceres ved at medtage yderligere vaske trin med PBS.
Tilstedeværelsen af protein baggrund skal måles og karakteriseres i hvert eksperiment, beregning af baggrunden fluorescens intensitet (figur 6E) og trække det fra mikro-mønstre intensitet (figur 6F-H og figur 7B, D). Høj protein baggrund kan have en indvirkning på fastgørelse og spiring af CAD-celler, kompromittere fortolkningen af resultater.
Det er et almindeligt problem at have huller mellem design enheder, når brugerne har begrænset erfaring (Figur 11B), hvilket skyldes utilstrækkelig overlapning mellem mønstrene. To parametre i Leonardo software kan justeres for at overvinde dette: 1) en negativ afstand mellem kolonnerne kan være påkrævet, afhængigt af udformningen af mønsteret (trin 5,7 og se figur 5B, C). Alternativt, 2) Brug gradient option i ekspert menuen til at sy kolonnerne. En hurtig test til at bestemme de optimale afstands parametre kan udføres ved hjælp af UV-klæbemiddel (tabel over materialer). En lille dråbe af denne lim påføres en glas rutsjebane, som derefter dækkes med en glas dækseddel, der laver en film. Den indlejrede UV klæbemiddel er photopatterned med mønsteret skabelon af interesse ved hjælp af en lav laser dosis (30 mJ/mm2). De UV-udsatte områder af den indlejrede klæbemiddel vil blive helbredt, bliver synlige under lyse-felt mikroskopi. Testresultaterne visualiseres for at evaluere den opnåede afstand inden for mønsteret. I vores neuronal eksperimenter, en kløft mellem striber kan påvirke celle adfærd, der producerer variationer i vækstdynamik (enten reduceret hastighed eller nedlæggelse af stien).
I den seneste opdatering af Leonardo software (på tidspunktet for offentliggørelsen, Leonardo 4,11), er det muligt at uploade tidligere designede større mønster skabeloner, der dækker et meget større område (op til 8 mm2 ved hjælp af 20x mål) af mikro-brønd overflade sammenlignet med den nuværende 0,1 mm2 pr. design enhed, hvilket eliminerer behovet for at sy de mindre design enheder sammen. Udefineret kanter kan skyldes manglende justering af laser fokus under mønster generering (Figur 11C). Det er derfor afgørende at kalibrere laseren og udføre reference mønster trin (Se trin 4) før mønstret. Dårligt definerede striber resulterer i variationer i stribe bredde, hvilket gør korrelationen mellem Axon vækstdynamik og stribe bredde vanskelig. Axons har også tendens til at opgive striber, der har diffbrugte kanter. Desuden kan variabilitet i kanter også findes, når der udskrives striber på 10-20 μm bredde eller højere, hvilket resulterer i et højere proteinindhold i kanterne sammenlignet med de centrale områder af mønsteret (figur 6B, D). Denne Edge effekt er produceret af en ikke-homogen diffusion af foto-initiator under photopatterning proces. Photoscission reaktionen er iltafhængig, som spreder mere i kanterne. Denne kant effekt kan minimeres ved at homogenisere foto initiatoren med en pipette i mikro-brønden under fotopatterprocessen. Desuden, en ny kommercialiseret foto-initiator (PLPP gel), kan også reducere Edge effekt (PRIMO system support team, personlig kommunikation).
Mikroprintning af mere end ét protein kan resultere i krydsbinding (figur 9A-D). Dette kan minimeres ved at øge den blokerende effektivitet, der bruges til at besætte uspecifikke bindingssteder mellem inkubations trinene for de to forskellige proteiner. Krydsbinding af proteiner kan forstyrrer reproducerbarhed af eksperimentelle resultater og kan føre til fejlfortolkning af data, da det er vanskeligt at bestemme bidraget fra hvert protein til Axon vækstdynamik og til andre celle adfærd.
Konklusion
Vi håber, at den medfølgende protokol ved hjælp af LIMAP letter genereringen af protein mikro-mønstre gennem brug af PRIMO-systemet. Mens vores protokol fokuserer på, hvordan man pålideligt producerer mikro-mønstre i 2D glasoverflader, andre har vist, at det er muligt at bruge LIMAP til mikro-mønstring af bløde substrater54, og mikrostrukturerede overflader til 3D-kulturer42. Disse mikro-mønstre kan være et alsidigt værktøj til at studere cellulære reaktioner på ændringer i deres mikro-miljø.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes af BBSRC, EPSRC, MRC og Wellcome Trust. C.B. laboratoriet er en del af Wellcome Trust Center for Cell-matrix Research, University of Manchester, som understøttes af kernefinansiering fra Wellcome Trust (tilskudsnummer 088785/Z/09/Z). Forfatterne ønsker at anerkende de midler, der er ydet af Forskningsrådet for bioteknologi og biologisk videnskab (BBSRC) til C.M., K.J. (BB/M020630/1) og P.A. (BB/P000681/1) og af Forskningsrådet for Ingeniørvidenskab og fysik (EPSRC) og medicinsk Forskningsråd (MRC) Center for ph. d.-uddannelse i regenerativ medicin til A.K. (EP/L014904/1). Forfatterne takker Alvéole for deres korrespondance og deres eftersalgssupport team. Forfatterne takker Peter march og Roger Meadows fra bioimaging Facility, University of Manchester for deres hjælp med mikroskopi. Bioimaging Facility mikroskoper, der anvendes i denne undersøgelse blev købt med tilskud fra BBSRC, Wellcome Trust og University of Manchester Strategic fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 protein labeling kit | Invitrogen | A10235 | Working concentration: N.A. |
| Alexa 647 protein labeling kit | Invitrogen | A20173 | Working concentration: N.A. |
| CAD cells | ECACC | 8100805 | Working concentration: N.A. |
| Conjugated fibrinogen-488 | Molecular Probes | F13191 | Working concentration: 10 μg/ml |
| DMEM culture medium | Gibco | 11320033 | Working concentration: N.A. |
| Epifluorescence Microscope** | Nikon | Eclipse Ti inverted | Working concentration: N.A. |
| Fibronectin | Sigma | F4759 | Working concentration: 10 μg/ml (after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) (diluted in PBS) |
| Fiji-Image J | www.imagej.nih.gov | Version 2.0.0-rc-54/1.51f | Working concentration: N.A. |
| Fluorescent highlighter | Stabilo | Stabilo Boss Original | Working concentration: N.A. |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Working concentration: 1M |
| Inkscape software | Inkscape | Check last update | Working concentration: N.A. |
| Laminin-red fluorescent rhodamine | Cytoskeleton, Inc. | LMN01 | Working concentration: 10 μg/ml (diluted in PBS) |
| Leonardo software | Alvéole | version 4.11 | Working concentration: N.A. |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Working concentration: 1% |
| Micro-manager software | Open imaging | Check last update | Working concentration: N.A. |
| Motorized x/y stage | PRIOR Scientific | Proscan II | Working concentration: N.A. |
| NIS Elements Software | Nikon | NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs) | Working concentration: N.A. |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Sigma | D8537 | Working concentration: 1X |
| PDMS Stencils | Alvéole | visit www.alveolelab.com | Working concentration: N.A. |
| PEG-SVA | Laysan bio, Inc. | MPEG-SVA-5000-1g | Working concentration: 50 mg/ml |
| Phalloidin 405 | Abcam | ab176752 | Working concentration: 1:1000 |
| Photo-initiator (PLPP) | Alvéole | Classic PLPP | Working concentration: 14.5 mg/ml |
| Photo-initiator (PLPP gel) | Alvéole | PLPP gel | Working concentration: 4.76% diluted in ethanol |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V) | Working concentration: N.A. |
| PLL-PEG | SuSoS (also distributed by Alvéole) | www.alveolelab.com | Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS) |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | Working concentration: 0.01% |
| Primo equipment | Alvéole | www.alveolelab.com | Working concentration: N.A. |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Working concentration: 1% |
| Tubulin anti-alpha antibody | Abcam | DM1A | Working concentration: 1:1000 CAD cells |
| Tubulin anti-beta 3 antibody | Sigma | T8660 | Working concentration: 1:500 DRG neurons |
| UV adhesive | Norland Products | NOA81 | Working concentration: N.A. |
| 1 well glass bottom dish | Cellvis | D35-20-1.5-N | Working concentration: N.A. |
| 6 well glass bottom dish | Cellvis | P06-20-1.5-N | Working concentration: N.A. |
| 20x objective** | Nikon | no phase ring (check updated catalogue) | Working concentration: N.A. **Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alvéole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera. |
References
- Alamdari, O. G., Seyedjafari, E., Soleimani, M., Ghaemi, N. Micropatterning of ECM Proteins on Glass Substrates to Regulate Cell Attachment and Proliferation. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (4), 234-240 (2013).
- Sunami, H., Yokota, I., Igarashi, Y. Influence of the pattern size of micropatterned scaffolds on cell morphology, proliferation, migration and F-actin expression. Biomaterials Science. 2 (3), 399-409 (2014).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
- Marino, A., et al. Two-photon polymerization of sub-micrometric patterned surfaces: investigation of cell-substrate interactions and improved differentiation of neuron-like cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (24), 13012-13021 (2013).
- Joo, S., et al. Effects of ECM protein micropatterns on the migration and differentiation of adult neural stem cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. K. Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning. Elife. 7, (2018).
- Javaherian, S., O'Donnell, K. A., McGuigan, A. P. A Fast and Accessible Methodology for Micro-Patterning Cells on Standard Culture Substrates Using Parafilm (TM) Inserts. Plos One. 6 (6), (2011).
- Smirnov, M. S., Cabral, K. A., Geller, H. M., Urbach, J. S. The effects of confinement on neuronal growth cone morphology and velocity. Biomaterials. 35 (25), 6750-6757 (2014).
- Albert, P. J., Schwarz, U. S. Dynamics of Cell Ensembles on Adhesive Micropatterns: Bridging the Gap between Single Cell Spreading and Collective Cell Migration. PLOS Computational Biology. 12 (4), (2016).
- Evans, A. R., et al. Laminin and fibronectin modulate inner ear spiral ganglion neurite outgrowth in an in vitro alternate choice assay. Developmental Neurobiology. 67 (13), 1721-1730 (2007).
- Nichol, R. H., Hagen, K. M., Lumbard, D. C., Dent, E. W., Gomez, T. M. Guidance of Axons by Local Coupling of Retrograde Flow to Point Contact Adhesions. Journal of Neuroscience. 36 (7), 2267-2282 (2016).
- Burdick, J. A., Khademhosseini, A., Langer, R. Fabrication of gradient hydrogels using a microfluidics/photopolymerization process. Langmuir. 20 (13), 5153-5156 (2004).
- Schwartz, P. V. Molecular transport from an atomic force microscope tip: A comparative study of dip-pen nanolithography. Langmuir. 18 (10), 4041-4046 (2002).
- Barbulovic-Nad, I., et al. Bio-microarray fabrication techniques--a review. Critical Reviews in Biotechnology. 26 (4), 237-259 (2006).
- Shafagh, R. Z., Vastesson, A., Guo, W. J., van der Wijngaart, W., Haraldsson, T. E-Beam Nanostructuring and Direct Click Biofunctionalization of Thiol-Ene Resist. Acs Nano. 12 (10), 9940-9946 (2018).
- Kobayashi, J., Yamato, M., Itoga, K., Kikuchi, A., Okano, T. Preparation of microfluidic devices using micropatterning of a photosensitive material by a maskless, liquid-crystal-display projection method. Advanced Materials. 16 (22), (2004).
- Bernard, A., et al. Printing patterns of proteins. Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).
- Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Fink, J., et al. Comparative study and improvement of current cell micro-patterning techniques. Lab Chip. 7 (6), 672-680 (2007).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light-Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
- Belisle, J. M., Correia, J. P., Wiseman, P. W., Kennedy, T. E., Costantino, S. Patterning protein concentration using laser-assisted adsorption by photobleaching, LAPAP. Lab Chip. 8 (12), 2164-2167 (2008).
- Belisle, J. M., Kunik, D., Costantino, S. Rapid multicomponent optical protein patterning. Lab Chip. 9 (24), 3580-3585 (2009).
- Heinz, W. F., Hoh, M., Hoh, J. H. Laser inactivation protein patterning of cell culture microenvironments. Lab Chip. 11 (19), 3336-3346 (2011).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Thery, M., Piel, M. Protein Micropatterns: A Direct Printing Protocol Using Deep UVs. Microtubules: In Vivo. 97, 133-146 (2010).
- Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. Polyacrylamide hydrogel micropatterning. Methods in Cell Biology. 120, 93-116 (2014).
- Waldbaur, A., Waterkotte, B., Schmitz, K., Rapp, B. E. Maskless projection lithography for the fast and flexible generation of grayscale protein patterns. Small. 8 (10), 1570-1578 (2012).
- Kang, J., Choi, J. C., Kim, M., Jung, H. R., Doh, J. Photopatterning with a printed transparency mask and a protein-friendly photoresist. Methods in Cell Biology. 119, 55-72 (2014).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Morlat, S., Gardette, J. L. Phototransformation of water-soluble polymers. Part II: photooxidation of poly(ethylene oxide) in aqueous solution. Polymer. 44 (26), 7891-7897 (2003).
- Qi, Y., Wang, J. K., McMillian, M., Chikaraishi, D. M. Characterization of a CNS cell line, CAD, in which morphological differentiation is initiated by serum deprivation. Journal of Neuroscience. 17 (4), 1217-1225 (1997).
- Shrirao, A. B., et al. A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Pankov, R., Momchilova, A. Fluorescent labeling techniques for investigation of fibronectin fibrillogenesis (labeling fibronectin fibrillogenesis). Methods in Molecular Biology. 522, 261-274 (2009).
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12542-12547 (2002).
- Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), (2014).
- Tang, Y., Qiu, Q. F., Zhang, F. L., Xie, M., Huang, W. H. Quantifying orientational regeneration of injured neurons by natural product concentration gradients in a 3D microfluidic device. Lab Chip. 18 (6), 971-978 (2018).
- Srinivasan, P., Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R. Synergistic effects of 3D ECM and chemogradients on neurite outgrowth and guidance: a simple modeling and microfluidic framework. PLoS One. 9 (6), (2014).
- de Luca, A. C., Faroni, A., Reid, A. J. Dorsal root ganglia neurons and differentiated adipose-derived stem cells: an in vitro co-culture model to study peripheral nerve regeneration. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Khadpekar, A. J., Khan, M., Sose, A., Majumder, A. Low Cost and Lithography-free Stamp fabrication for Microcontact Printing. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Delepine, C., et al. Altered microtubule dynamics and vesicular transport in mouse and human MeCP2-deficient astrocytes. Human Molecular Genetics. 25 (1), 146-157 (2016).
- Decock, J., Schlenk, M., Salmon, J. B. In situ photo-patterning of pressure-resistant hydrogel membranes with controlled permeabilities in PEGDA microfluidic channels. Lab Chip. 18 (7), 1075-1083 (2018).
- Stoecklin, C., et al. A New Approach to Design Artificial 3D Microniches with Combined Chemical, Topographical, and Rheological Cues. Advanced Biosystems. 2 (7), (2018).
- Toraille, L., et al. Optical Magnetometry of Single Biocompatible Micromagnets for Quantitative Magnetogenetic and Magnetomechanical Assays. Nano Letters. , (2018).
- Theodoly, O., et al. Live nanoscopic to mesoscopic topography reconstruction with an optical microscope for chemical and biological samples. PLoS One. 13 (12), (2018).
- Ermis, M., Antmen, E., Hasirci, V. Micro and Nanofabrication methods to control cell-substrate interactions and cell behavior: A review from the tissue engineering perspective. Bioactive Materials. 3 (3), 355-369 (2018).
- von Philipsborn, A. C., et al. Microcontact printing of axon guidance molecules for generation of graded patterns. Nature Protocols. 1 (3), 1322-1328 (2006).
- Ricoult, S. G., Kennedy, T. E., Juncker, D. Substrate-bound protein gradients to study haptotaxis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, (2015).
- Bietsch, A., Michel, B. Conformal contact and pattern stability of stamps used for soft lithography. Journal of Applied Physics. 88 (7), 4310-4318 (2000).
- Hui, C. Y., Jagota, A., Lin, Y. Y., Kramer, E. J. Constraints on microcontact printing imposed by stamp deformation. Langmuir. 18 (4), 1394-1407 (2002).
- Sharp, K. G., Blackman, G. S., Glassmaker, N. J., Jagota, A., Hui, C. Y. Effect of stamp deformation on the quality of microcontact printing: theory and experiment. Langmuir. 20 (15), 6430-6438 (2004).
- Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Biebuyck, H. Stability of molded polydimethylsiloxane microstructures. Advanced Materials. 9 (9), 741-746 (1997).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21 (22), 2257-2268 (2009).
- Chakra, E. B., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, C. D., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
- Pasturel, A., Strale, P., Studer, V. Tailoring 3D cell culture templates with common hydrogels. bioRxiv. , (2019).
