Summary
우리의 전반적인 목표는 세포가 지시된 축색 성장으로 이끌어 내는 세포외 단서를 어떻게 감지하는지 이해하는 것입니다. 여기에서는 축세포 자성장 및 경로 찾기를 제어하는 특정 이벤트를 연구하기 위해 세포 외 매트릭스 구성 요소의 정의된 마이크로 패턴을 생성하는 데 사용되는 단백질의 빛 유발 분자 흡착의 방법론을 설명합니다.
Abstract
세포는 세포 자체에 의해 합성되고 리모델링되는 세포 외 매트릭스의 조성 및 기하학을 포함하여 다양한 세포 외 단서를 감지합니다. 여기서, 우리는 단백질의 단일 또는 조합을 사용하여 마이크로 패턴 세포 외 매트릭스 (ECM) 기판을 생산하는 패터닝 기술로 PRIMO 시스템을 사용하여 단백질 (LIMAP)의 빛 유도 분자 흡착의 방법을 제시한다. 이 방법을 사용하면 뛰어난 재현성으로 미크로넨 해상도로 ECM 패턴을 인쇄할 수 있습니다. 우리는 단계별 프로토콜을 제공하고 이것이 신경 경로 찾기의 과정을 연구하기 위해 어떻게 적용될 수 있는지 보여줍니다. LIMAP는 두 개 이상의 구성 요소를 패터닝하는 용이성과 형상 또는 그라데이션을 사용하여 패턴을 생성하는 기능 측면에서 기존 마이크로 프린팅 방법에 비해 상당한 이점이 있습니다. 프로토콜은 세포 운명 및 세포 행동으로 거의 모든 화학 성분의 기여를 연구하기 위해 쉽게 적응될 수 있다. 마지막으로, 발생할 수 있는 일반적인 문제와 이러한 문제를 피할 수 있는 방법에 대해 논의합니다.
Introduction
최근 몇 년 동안, 생물 과학은 점점 재료 과학에 의해 제공되는 발전을 사용했다. 한 가지 눈에 띄는 예는 세포 증식과 같은 세포 반응을 연구하는 데 사용할 수있는 기판의 마이크로 패터닝입니다.1,2차별화3,4,5,6, 셀 마이그레이션7,8,9및 경로 찾기10,11. 다광자 광화학과 같은 기판의 마이크로 패터닝을 가능하게 하는 여러 가지 기술이 있습니다.12, AFM 딥펜 나노리소그래피13, 핀 및 잉크젯 직접 인쇄14, 전자 빔 리소그래피15또는 미세 유체 학적16. 그러나, 생물학 분야에서 널리 사용되는 두 가지 기술은 마이크로 접촉 인쇄입니다.17,18,19또는 레이저 보조 패터닝3(그림 1). 레이저 보조 패터닝은 마이크로접촉 인쇄에 비해 패턴에 대한 단백질 및 PEG 안정성 및 세포 감금 측면에서 보다 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 것으로 간주됩니다.20. 여기에 설명된 마이크로 패터닝에 대한 보다 새로운 접근법은 단백질의 빛 유발 분자 흡착의 사용입니다.21(LIMAP,그림 1 D) 상용 시스템(PRIMO,재료 표). 각 방법에는 아래에 간략하게 설명되어 있는 장점과 제한 사항이 있습니다. 마이크로 접촉 인쇄는 석판 화 마스터에서 생성되는 원하는 마이크로 피처와 PDMS 금형 (스탬프)을 사용합니다. 우표는 선택한 단백질로 배양된 후 세포 배양 기판으로 옮겨(스탬프)18(그림 1 A.). 레이저 보조 패터닝은 UV 광을 사용하여 오염 방지 필름을 파쇄합니다.22,23,24,25관심 있는 단백질로 나중에 코팅될 수 있는 노출 영역(그림 1 B). 포토 패터닝 접근법으로 달성된 해상도는 미칸 범위에 있습니다.25,26, 이러한 기술의 대부분은 샘플과 접촉하거나 현미경 목표의 물체 평면에 위치하는 포토 마스크를 필요로합니다.23,27,28. 마이크로 접촉 인쇄 및 사진 패터닝 모두에서 마스크에 대한 요구 사항은 제한될 수 있습니다. 특정 마스크는 모든 기하학적 패턴과 크기에 필요하며, 생성하는 데 비용이 많이 들고 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 이러한 기술과 달리 LIMAP에는 마스크가 필요하지 않습니다(그림 1 D). LIMAP용 PRIMO 시스템을 사용하면 장비 구매가 필요하기 때문에 처음에는 비용이 많이 들 수 있습니다. 그러나 오픈 소스 소프트웨어는 원하는 형상의 패턴을 설계하는 데 사용되어 훨씬 더 많은 자유를 제공하고 단백질 농도 그라데이션사용을 포함하여 더 복잡한 실험을 허용합니다. PRIMO 레이저는 디지털 제어 마이크로미러 장치(DMD)에 의해 제어 및 지시되어 사용자 정의 형상의 수에 관계없이 패턴을 생성합니다. LIMAP는 배양 표면이 세포 부착을 방지하는 분자로 코팅되어야 합니다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 이러한 "반오홍" 시약으로서 가장 일반적으로 사용된다; 그것은 유리 또는 플라스틱 표면에 조밀 한 안티 접착제 필름을 형성29. 그 후, 광시전 메커니즘을 통해 PEG 필름을 고정밀로 제거할 수 있는 광이니시에이터가 추가되었습니다.30DMD의 제어 하에 자외선에 국소 노출됩니다. 이러한 PEG 프리 영역은 레이저 에칭 표면에 흡착되는 단백질로 코팅되어 마이크로 패턴을 생성할 수 있습니다. 레이저 파워를 변화시킴으로써 표면에서 다양한 양의 PEG를 제거하여 사용자가 단백질 그라데이션을 생성할 수 있습니다. PEG 제거 및 코팅 절차를 반복하여 동일한 마이크로 웰에서 두 개 이상의 뚜렷한 단백질로 패턴을 만들 수 있습니다.21. 생성된 마이크로 패턴은 세포에 대한 접착제 표면을 제공하여 세포 행동을 연구할 수 있도록 합니다. 우리의 연구에서, 우리는 신경 세포주 (CAD (Cathecholaminergic-분화) 세포의 neurite 또는 축색 경로 찾기를 연구하기 위해 마이크로 패터닝을 사용합니다.31) 또는 1차 쥐 등-근근 신경절(DRG) 뉴런을 각각. 여기서는 LIMAP(에 대한 단계별 프로토콜)에 대해 간략하게 설명합니다.그림 2) 상용 PRIMO 시스템 및 레오나르도 소프트웨어를 함께 사용합니다. 우리는 우리가 축색 경로 찾기를 연구하는 데 사용하는 정의 된 기하학 및 여러 단백질패턴의 생성을 위해 사용될 수있는 방법을 보여줍니다. 발생할 수 있는 일반적인 문제와 이러한 문제를 피할 수 있는 방법에 대해 설명합니다.
Protocol
1. 패턴 템플릿의 디자인
참고: 패터닝용 템플릿은 디지털 드로잉소프트웨어(재질 표)로생성됩니다. 다른 회색 수준에서 그리면 레이저 강도가 결정됩니다. 소프트웨어를 사용하여 패턴 템플릿을 설계하면 원하는 형상 및 그라데이션을 사용하여 패턴을 빠르게 생성할 수있습니다(그림 3).
- 그리기 소프트웨어를 사용하여 원하는 패턴 템플릿을 디지털 방식으로 그립니다. 1824픽셀 길이와 1140픽셀 너비의 이미지 크기를 선택합니다(이 연구에서는 길이 415μm 및 너비 260μm에 해당). 패턴 템플릿을 8비트 Tiff 파일로 저장합니다.
참고: 마이크로 패터닝 장비를 상용화하는 브랜드에 대한 요청에 따라 템플릿을 생성하는 단계별 프로토콜을 사용할 수있습니다(재료 표).
2. 플라즈마 청소
참고: 최적의 결과를 얻으려면 패터닝 전에 표면을 플라즈마 세척해야 하므로 모든 유기 물질을 제거하고 표면을 활성화합니다. 현재의 경우, 주변 공기는 표면 활성화에 충분하다. 플라즈마 클리너(재료표)는1000-1300 mTorr의 공정 압력과 29.6W의 전력을 1-5분 동안 사용하였다.
- 유리 바닥 접시 /es는 20mm 내부 잘 크기와 0.16-0.19 mm의 유리 두께를 사용합니다. 여러 조건을 테스트하기 위해 6 웰 유리 바닥 접시를 사용하십시오. 그렇지 않으면, 하나의 우물 유리 바닥 접시(재료의 표)를사용합니다.
참고: 플라즈마 세척을 위한 단계별 프로토콜은 플라즈마 세척 장비를 상용화하는 브랜드에 요청시 사용할 수있습니다(재료 표).
3. 패시베이션
참고: 이 단계는 유리 표면에 단백질 흡착을 방지하는 반파울 필름을 생성합니다. PEG는 반파울링제로서 단백질흡착(29)에 높은 내성을 제공한다. LIMAP는 광이니시에이터를 사용하여 UV 광합성을 통해 PEG를 로컬로 제거합니다. 관심 있는 단백질/s는 다음 이 PEG 자유로운 표면에 흡착할 것입니다21,마이크로 패턴을 생성하.
- PLL-PEG를 가진 패시베이션
- 멸균 조건에서 PDMS 스텐실(그림 4 A, B 및 재료 표참조)을 잘라 내부 유리 바닥에 잘 맞도록 하고 멸균 집게로 내부 마이크로 웰 충전재를 제거합니다. 집게를 사용하여 유리에 스텐실을 잘 붙입니다.
- 스텐실이 유리에 단단히 붙어 패시베이션 과정에서 누출을 일으킬 수 있는 기포형성을 방지합니다.
참고 : PDMS 스텐실은 게시 된 프로토콜18,32를사용하여 사내에서 제작 할 수 있습니다. - 인산완식염수(PBS)에 PLL-PEG 용액(재료표,0.1 mg/mL)을 준비합니다. 각 마이크로 웰에 20 μL의 PLL-PEG 용액을 넣고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 마이크로 웰에서 PLL-PEG 15 μL을 제거하고 20 μL의 PBS(재료 표)로5 번 씻어 건조시키지 않고.
참고: 항상 세안 사이에 약 5 μL의 PBS를 두십시오. 작은 부피를 감안할 때, 마이크로 웰은 건조에 특히 취약합니다. 건조는 품질이 좋지 않는 마이크로 패턴을 초래할 수 있습니다. - 배양 접시를 최대 3일 동안 4°C에서 PBS(우물당 3 mL)에 보관하거나 다음 단계(3.1.5단계)를 계속합니다.
- 단일 마이크로 웰에서 18 μL의 PBS를 제거합니다(예: 왼쪽 상단 마이크로 웰, 그림 4D참조), 광 이니시에이터(PLPP, 물자 표)의5 μL을 추가하고 나머지 마이크로 웰에 20 μL의 PBS를 남겨 둡니다. 이러한 마이크로웰와 PLPP는 시스템 캘리브레이션 단계(단계 4)동안 참조 패턴(도 4D, E참조)을 생성하는데 사용될 것이다. PLPP를 빛으로부터 보호하십시오.
- 오래 지속되는 PEG-SVA를 가진 패시베이션
참고: 항점착면을 생성하기 위해 1) 폴리-L-리신(PLL-PEG, 단계 3.1) 또는 2) PEG-수산화수쿠치니마이드(PEG-SVA)에 연결된 PEG. 하나 또는 다른 패시베이션 옵션을 선택하는 결정은 저장소 옵션에 따라 다릅니다(10단계 참조). PEG-SVA로 배양된 배양 요리는 이중 패시베이션과 포토패킹 시간이 필요합니다.- 3.1.1단계에 설명된 대로 스텐실을 준비한다.
- 0.01% 폴리-L-리신(PLL, 재료 표)의20 μL을 각 마이크로 웰에 넣고 실온에서 30분 동안 배양하여 PLL로 사전 코팅합니다.
- 마이크로 웰에서 PLL 15 μL을 제거하고 우물을 건조시키지 않고 20 μL의 1 M HEPES 버퍼(재료 표)로세 번 씻으십시오.
참고: 항상 약 5 μL의 HEPES 또는 PBS를 세정 사이에 두십시오. 작은 부피를 감안할 때, 마이크로 웰은 건조에 특히 취약합니다. 건조는 품질이 좋지 않는 마이크로 패턴을 초래할 수 있습니다. - PEG-SVA 솔루션을 준비합니다. PEG-SVA 용액(HEPES 완충액 1M의 50 mg/mL)은 사용하기 직전에 매번 신선히 준비되어야 합니다. 마이크로웰당 PEG-SVA 20 μL을 준비합니다.
- HEPES 버퍼는 8-8.5 사이의 pH를 가져야 합니다. pH 종이로 PEG-SVA 용액을 준비하기 전에 HEPES pH를 테스트합니다. 정밀 스케일을 사용하여 원심 분리튜브에서 PEG-SVA를 계량합니다. HEPES 버퍼와 와류30s를 녹일 때까지 추가합니다. 용액이 투명하면 PEG-SVA가 완전히 용해됩니다.
참고: SVA는 이전에 코팅된 PLL에 PEG의 결합을 허용하는 에스테르입니다. HEPES 버퍼가 PEG-SVA에 추가되면 SVA는 반감기가 15분이며 즉시 사용해야 합니다. - 각 마이크로 웰에 20 μL의 PEG-SVA 용액을 추가하고 실온에서 배양하여 1 시간 동안 마이크로 웰에서 PEG-SVA 15 μL을 제거하고 20 μL의 PBS(재료 표)로5 번 씻어 우물을 건조시키지 않습니다.
- 장기 보관을 위해 배양 접시를 준비하거나(최대 1개월, 10.2단계 참조) 다음 단계(단계 3.2.8)로 진행한다.
- 단일 마이크로 웰에서 18 μL의 PBS를 제거합니다 (예를 들어, 왼쪽 상단 마이크로 웰, 그림 4D참조), PLPP 5 μL(재료 표)을추가하고 나머지 마이크로 웰에 20 μL의 PBS를 둡니다. 이 마이크로 웰은 참조 패턴을 만드는 데 사용됩니다(Fi gure 4D, E 참조). PLPP가 마이크로 웰의 전체 표면에 균일한지 확인하십시오. PLPP를 빛으로부터 보호하십시오.
4. 시스템 교정
참고 : 이러한 단계에서, 레이저의 초점은 배양 접시의 특정 유형에 조정됩니다 (단계 4.1). 기준 패턴은 레이저의 최적의 초점 조건을 보장하기 위해 단백질 용액(단계 4.3)을 사용하여 인큐베이션한 후 단 하나의 마이크로웰(step 4.2)에서만 생성되며, 날카롭고 정의된 패턴을 얻는 데 필요하다.
- 레이저 교정
참고: 교정 과정에서 교정 레이저 이미지가 형광 강조 유리 표면에 투사됩니다(형광 형광펜으로 표시된 교정 음량, 그림4C)에초점을 맞추어야 합니다. 현미경.- 형광 형광펜(재료 표)을사용하여 빈 내부 유리를 잘 표시하십시오.
참고: 교정 웰은 마이크로 패턴이 생성되는 배양 접시와 동일한 유리 두께(0.16-0.19mm)를 가져야 합니다. 6웰 유리 바닥 접시를 사용하는 경우, 빈 우물을 교정에 사용할 수 있으며 멸균 조건에서 형광 하이라이터로 표시해야합니다. - 현미경, 무대 및 컴퓨터를 켭타. PRIMO 마이크로 패터닝 장비, 오픈 마이크로 매니저 및 레오나르도 소프트웨어를 켭타. 레오나르도 소프트웨어는 플러그인에서 마이크로 관리자를 통해 작동합니다. 재료 표에서장비 및 소프트웨어의 브랜드/카탈로그 번호를 확인하십시오.
- 레오나르도의 초기 메뉴에서 보정을선택합니다. 전용 PRIMO 필터 큐브가 필터 포탑의 올바른 위치(광학 경로)에 있는지 확인합니다. 현미경과 레오나르도 소프트웨어모두에서 20X 목표(0.75 DIC S Plan 형광, 위상 링 없음)를 선택합니다.
참고: 이 프로토콜은 레오나르도 버전 4.4로 조정됩니다. 프로토콜은 다른 버전에 대해 조정해야 할 수 있습니다. - 이전에 강조 표시된 교정을 목표 보다 잘 배치합니다(그림4C). 카메라 경로를 선택합니다. PRIMO 로고와 태그 라인의 레이저 프로젝션이 셀에 초점을 맞출 때까지 목표 초점을 조정합니다.
- 기본 카메라 노출 시간을 25ms로 두면 레이저 강도를 조정하여 PRIMO 로고 프로젝션의 문자 I을 회색으로 표시하고 나머지 문자는 흰색으로 표시합니다.
- 나중에 교정의 Z 위치라고 하는 초점 평면의 Z 위치(샘플에 대한 목표 높이)를 기록합니다. 이는 참조 패턴 생성 후 얻어진 최적의 초점에 대한 근사치일 것이다(단계 4.2-4.4 참조).
- 형광 형광펜(재료 표)을사용하여 빈 내부 유리를 잘 표시하십시오.
- 참조 패턴
- 광이니시에이터(참조 패턴 마이크로웰, 도4D)를포함하는 마이크로웰로 배양 접시를 객관적인 위에 놓고 레오나르도 소프트웨어에서 지금 패턴을 선택한다.
- 카메라를 통해 전송된 빛으로 마이크로 웰의 가장자리를 시각화하고 오른쪽 메뉴에서 ROI 기호를 선택합니다. ROI 원의 지름을 4000 μm로 설정하고 디지털 ROI의 가장자리를 현재 마이크로 웰의 가장자리와 정렬합니다.
- 마이크로 웰의 가장자리 주위에 스테이지를 이동하여 디지털 ROI와 현재 마이크로 웰 사이에 정확한 중첩이 있는지 확인합니다. ROI 위치는 스테이지 이동에 결합됩니다.
- 레오나르도 소프트웨어의 잠금을 선택하여 ROI를 원하는 위치에 고정합니다. 전송된 조명을 끕지.
- ROI에 디자인 단위로 투영될 원하는 패턴 템플릿을 업로드하려면 PRIMO를 선택합니다(그림 5참조). 패턴은 작업이라고 하는 드롭다운 목록에 표시되며 소프트웨어의 작업 메뉴에 표시됩니다.
참고: 패턴 템플릿은 소프트웨어에서 템플릿을 로드하기 전에 이전에 설계하고(1단계 참조) 8비트 Tiff 파일로 저장해야 합니다. - 참조 패턴에는 작은 패턴만 필요합니다. 예를 들어 3줄, 1개의 열(그림 4E 및 그림 5B참조). 복제 메뉴에서 원하는 열 및 행 수를 설정합니다(레오나르도 소프트웨어의줄). 새로 고침을 클릭하여 패턴 디자인의 디지털 미리 보기를 관찰합니다.
- 복제 메뉴에서 레이저 용량을 설정합니다. 이 설정 및 PLL-PEG를 사용하여 최적의 레이저 용량은 1390 mJ / mm2입니다.
참고 : 레이저 전력은 5-7.5 mW / mm2사이에서 다를 수 있습니다. 이 경우 7.5 mW/mm2이며, 1390 mJ/mm2의레이저 용량을 사용하여 각 설계 단위를 패턴화하는 데 약 30초가 걸립니다. 배양 접시 표면이 PEG-SVA로 전달되는 경우 더 높은 레이저 용량이 필요할 수 있습니다 (PLL-PEG에 비해 약 이중 레이저 용량). 이 테스트는 사전에 해야 합니다. - 마이크로웰의 주변 영역(예를 들어, 상부)을 마이크로웰의 패턴 생성(중앙 영역)에 대한 관심의 주요 영역으로부터 멀리 이동(도 4E참조)하고 잠금을선택한다. 패턴이 표시될 때까지 기다립니다.
- 보정의 Z 위치로 초점을 조정합니다(4.1.6 단계 참조).
참고: 다른 사용자가 포토패킹 라운드 간에 동일한 현미경을 사용하는 경우 추가 시스템 교정 단계를 수행하는 것이 좋습니다. - 패터닝을 시작하려면 재생 기호를 선택합니다. 소프트웨어에 레이저가 있는지 확인합니다. 패터닝 프로세스가 완료될 때까지 기다립니다. 패터닝 기간은 예상 시간 패널에 표시됩니다. 레오나르도 소프트웨어 버전4.4 패터닝은 모든 작업이 시각화 메뉴에서파란색으로 표시되면 완료됩니다.
- 기준 패턴에 단백질 배양
- 멸균 조건하에서, 20 μL의 PBS로 기준 패턴을 마이크로웰로 3회 세척하여 PLPP를 제거한다.
- 형광 표지된 ECM 단백질(10 μg/mL 라미닌, 피브로넥틴 또는 피브리노겐을 PBS에 넣고, 재료 표 및 6단계 참조 패턴 마이크로웰)을 20 μL 첨가합니다. (단백질에 따라 다름) 10-20 분 동안 실온에서 배양하십시오 (알루미늄 호일에 접시를 감싸십시오).
- 배양 후, 단백질 용액 18 μL을 제거하고 20 μL의 PBS로 세 번 세척; 참조 패턴을 만드는 데 사용되지 않는 마이크로 웰을 PBS의 20 μL에서 유지합니다(그림 4D, E참조).
- 최적의 레이저 포커스 시각화 및 설정
- 에피오레센스 현미경, 20배 객관적이고 적합한 소프트웨어를 사용하여 기준 패턴을 시각화합니다(재료 표에서본 연구에 사용된 소프트웨어 확인). 참조 패턴은 참조 패턴이 생성된 주변 영역(예: 위쪽 웰 영역)에 표시되어야 합니다(그림 4E참조).
- 카메라 경로를 통해 패턴 가장자리에 초점을 조정합니다. 참조 패턴에 가장 적합한 포커스에 따라 Z 위치를 기록합니다. 이 조정된 Z-위치는 후속 패터닝에 사용되는 최적의 레이저 포커스가 될 것입니다.
5. 소프트웨어 설정 및 포토패킹
참고: 시스템의 교정이 완료되면(4단계), 사용자는 포토패킹을 위해 원하는 패턴 템플릿(템플릿 구성, 그림 5)을업로드하고 각 단백질에 대해 하나 또는 여러 개의 단백질에 대한 패턴을 생성하는 옵션을 제공합니다. 마이크로 웰. 마이크로 패터닝 과정에는 포토패킹 및 단백질 배양 단계가 포함됩니다(그림 2참조).
- 멸균 조건에서 모든 마이크로 웰에서 18 μL의 PBS를 제거하고 각 마이크로 웰에 5 μL의 PLPP를 추가하십시오. PLPP가 마이크로 웰의 전체 표면에 균일한지 확인하십시오.
- 참조 패턴 마이크로 웰(그림 4D, E)를객관적인 위에 배치하고 레오나르도 소프트웨어에서 지금 패턴을 선택합니다.
- 카메라 경로를 통해 전송된 빛으로 마이크로 웰을 시각화하고 ROI 기호를 선택합니다. ROI의 직경을 4,000 μm로 설정하고 디지털 ROI의 가장자리를 현재 마이크로 웰의 가장자리와 겹칩니다. 잠금 을선택합니다.
참고: ROI의 모양과 직경은 사용 중인 PDMS 스텐실의 설계 및 크기에 따라 달라집니다. 예를 들어 5,000 x 5,000 μm PDMS 제곱 스텐실을 사용하는 경우 5,000 x 5,000 μm 제곱 ROI를 사용합니다. - 접시의 각 마이크로 웰에 대해 겹치는 단계(단계 5.3)를 반복합니다. 완료되면 전송된 조명을 끕지.
- 참조 패턴 영역에서 멀리 떨어진 참조 패턴의 중심으로 이동한 후 원하는 패턴 템플릿을 업로드하기 위해 PRIMO를 선택하면 ROI에 디자인 단위로 투영됩니다(그림 5참조). 패턴은 작업이라고 하는 드롭다운 목록에 표시되며 소프트웨어의 작업 메뉴에 표시됩니다.
참고: 패턴 템플릿은 실험에 앞서 설계하고 소프트웨어에서 템플릿을 로드하기 전에 8비트 Tiff 파일로 저장해야 합니다. - 전체 마이크로 웰에 걸쳐 패턴을 만들려면 설계 단위를 복제해야 합니다. 디자인 유닛은 마이크로 웰 영역의 약 0.1 mm2를 커버합니다. 복제 메뉴에서 원하는 열 및 행 수(소프트웨어의줄)를 설정합니다(그림 5참조).
- 연속 패턴을 생성하려면 열과 선 사이의 간격을 조정합니다. 이 연구에서 연속 줄무늬 패턴은 열 간에 -20 ~ -35 μm 간격(음수 간격)을 사용하여 얻어진다. 이 음수 간격은 설계 단위 간에 중첩을만듭니다(그림 5B, C).
- 복제 메뉴에서 레이저 용량을 설정합니다. 이 설정 및 PLL-PEG를 사용하여 최적의 레이저 용량은 1390 mJ / mm2입니다. 패터닝 기간은 예상 시간 패널에 표시됩니다.
참고 :이 경우 레이저 전력은 7.5 mW / mm2이며,1390 mJ / mm2의용량을 사용하여 각 설계 단위를 패턴화하는 데 약 30 초가 사용됩니다. 예를 들어 4개의 열과 4개의 줄(약 1.6mm2)으로복제된 설계 장치(0.1mm2)는패턴화하는 데 8분이 소요됩니다. 배양 접시 표면이 PEG-SVA로 전달되는 경우 더 높은 레이저 용량이 필요할 수 있습니다 (PLL-PEG에 비해 약 이중 레이저 용량). - 잠금을 선택하고 패턴이 실제로 표시될 때까지 기다립니다.
- 패턴의 매개 변수를 업데이트하려면 관련 작업을클릭한 다음 매개 변수의 잠금을 해제하고 업데이트합니다. 패턴 업데이트가 완료되면 다시 잠금을 선택합니다.
- 동일한 마이크로 웰 (순차적 마이크로 패터닝 라운드)에서 여러 단백질의 패터닝은 패턴의 정확한 정렬을 필요로한다. 이러한 정렬을 얻으려면 원하는 패턴 템플릿의 모든 세트를 동시에 업로드합니다(첫 번째 및 두 번째 포토패킹 라운드 패턴).
- 패턴 템플릿의 복제 및 용량 매개 변수를 설정합니다. 매개 변수를 설정하면 패턴이 작업 목록에 작업으로 나타납니다. 이 템플릿 구성을 소프트웨어에 파일로 저장합니다(그림 5D참조).
- 작업 목록에서 첫 번째 패터닝 라운드 동안 패턴화할 특정 작업만 선택하고 두 번째 패터닝 라운드 동안 패턴화할 작업을 선택 해제합니다(그림 5D참조).
- 4.2단계에서 기준 패턴이 생성된 영역으로 이동한다(예를 들어, 참조 패턴의 상부 영역마이크로웰, 도 4E참조). 초점을 최적의 Z 위치로 조정합니다(4.4단계에서 획득).
참고: 사용 중인 현미경(사용 가능한 경우)에서 완벽한 초점 시스템을 선택하는 것이 좋습니다. - 패터닝을 시작하려면 재생 기호를 선택합니다. 패터닝 기간은 예상 시간 패널에 표시됩니다. 레오나르도 소프트웨어 버전4.4 패터닝은 시각화 메뉴에서 모든 작업이 파란색으로 표시되면 완료됩니다.
6. 단백질 배양
참고: 마이크로 웰은 ECM 단백질(형광 표지)으로 배양됩니다. 이들은 단지 5 단계에서 설명한 포토패킹 과정을 통해 PEG가 갈라진 영역에 결합합니다. 각 웰은 4개의 마이크로 웰을 가진 PDMS 스텐실을 포함하며, 이는 예를 들어, 각 마이크로웰에서 상이한 단백질의 배양과 같은 4가지 다른 조건을 동시에 테스트할 수 있게 한다(도 4D참조).
- 마이크로 패턴을 시각화하기 위해 형광 표지 단백질 (예를 들어, 라미닌, 피브로넥틴 또는 피브리노겐을 적색 또는 녹색 형광소에 공액)을 사용하십시오 (단계 6.7 및 9.4 참조). 대안적으로, 흡착되지 않은 단백질은 면역형광을 사용하여 나중 단계에서 시각화될 수 있다.
참고: ECM 단백질(예를 들어, fibronectin)은 기존 프로토콜33 및 시판되는 형광 라벨링 키트(즉, Alexa 488 라벨링 키트)를 사용하여 표지될 수 있거나, 구입한 용이하게 라벨링(예를 들어, 컨쥬게이트 피브리노겐-488 또는 라미닌 - 빨간색 형광 로다민, 재료의 표참조). - 멸균 조건하에서 원하는 농도의 ECM 단백질(PBS에서 10 μg/mL 라미닌, 피브로넥틴 또는 피브리노겐)을 준비하십시오.
참고: 형광 표지로 표지된 ECM 단백질은 빛에 민감하며 빛(알루미늄 호일에 담긴 랩 접시)으로부터 보호되어야 하며 항상 얼음에 보관해야 합니다. - 멸균 조건에서, 20 μL의 PBS로 마이크로 웰을 세 번 세척하여 PLPP를 제거합니다.
- 모든 마이크로 웰에서 18 μL의 PBS를 제거하고 각 마이크로 웰에 20 μL의 ECM 단백질 용액을 추가합니다. 실온에서 20-30 분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하십시오.
참고: 최적의 코팅 배양 시간은 단백질의 종류와 농도에 따라 달라질 수 있습니다. - 배양 후, ECM 단백질 용액 15 μL을 제거하고 20 μL의 PBS로 마이크로 웰을 세 번 세척합니다.
참고: 항상 세안 사이에 약 5 μL의 PBS를 두십시오. - 하나의 단백질로 패터닝하는 경우(1회 마이크로 패터닝), 배양 접시의 저장(단계 10) 또는 세포 도금으로 진행한다(단계 11, 도 2참조). 동일한 마이크로웰에서 상이한 단백질을 가진 제2 패터닝을 수행하는 경우, 배양접시(단계 10)의 저장을 진행하거나 비특이적 결합 부위를 차단하도록 진행한다(단계 7, 도 2참조).
- 선택적 품질 관리 단계: 도금 전 에피오레전 현미경을 사용하여 인쇄된 패턴을 시각화하고 이미지화합니다. 적절한 형광 채널을 선택하고 그에 따라 노출 시간을 조정합니다.
참고: 실험 간의 패턴의 형광 강도를 비교하려면 동일한 단백질에 대해 동일한 노출 시간을 사용하는 것이 필수적입니다.
7. 비특이적 결합 부위 차단 (다중 단백질 패턴에 만 해당)
참고: 동일한 마이크로웰에서 여러 단백질을 가진 마이크로 패터닝은 순차적 패터닝 단계를 수반합니다(그림 2참조). 차단제(PLL-PEG 또는 BSA)는 제2 배양 단백질(단계 9)이 제1 배양 단백질(단계 6)에 결합할 때 발생하는 교차 결합을 방지하기 위해 마이크로 웰에 첨가되어, 따라서 패턴 내의 단백질의 혼합물을 피한다.
- 멸균 조건에서, 교차 결합을 방지하기 위해 차단 단계로 PLL-PEG (PBS에서 0.1 mg / mL) 또는 BSA (PBS에서 1 % BSA)의 20 μL을 추가하십시오.
참고: 차단 효율은 사용되는 단백질의 특성과 그 중 선호도에 따라 달라질 수 있습니다. PLL-PEG와 BSA를 사전에 차단제로서 테스트하는 것이좋습니다(그림 10D-I). - 실온에서 1 시간 동안 차단제를 인큐베이팅하고 빛으로부터 보호하십시오. 차단제 15 μL을 제거하고 모든 마이크로 웰을 20 μL의 PBS로 세 번 세척하십시오. 항상 세안 사이에 약 5 μL의 PBS를 둡니다.
- 모든 마이크로 웰에서 18 μL의 PBS를 제거하고 각 마이크로 웰에 5 μL의 PLPP를 추가하여 PLPP가 마이크로 웰의 전체 표면에 균일하게 되도록 합니다.
8. 포토패킹 2차(다중 단백질 패턴에한 경우)
참고 : 포토 패턴 및 단백질 배양의 첫 번째 라운드 후, 마이크로 패턴이 생성됩니다. 포토패킹의 제2 라운드 동안, 제2 단백질에 대한 패턴은 동일한 마이크로웰에서 생성될 것이다(도 2C 및 도 5D참조). 소프트웨어에서 이 라운드 중에 패턴화될 올바른 패턴 템플릿(작업)을 선택합니다(그림 5D참조).
- 첫 번째 마이크로 웰로 이동합니다(그림4D). 디지털 ROI와 마이크로 웰 간에 적절한 중첩을 보장합니다.
- 이전에 저장된 템플릿 구성을 로드하고(5.12단계) 두 번째 포토패킹 라운드 동안 패턴화할 동작을 선택합니다(첫 번째 라운드에서 작업 선택 취소, 그림 5D참조).
- 패터닝을 시작하려면 재생 기호를 선택합니다. 소프트웨어에 레이저가 있는지 확인합니다.
9. 단백질 배양의 두 번째 라운드 (다중 단백질 패턴에 대해서만)
참고 : 프로토콜의이 부분에서, 형광 표지 단백질 / s는 포토 패턴의 두 번째 라운드 후 배양 접시에 배양됩니다.
- 멸균 조건에서, 20 μL의 PBS로 마이크로 웰을 3회 세척하여 PLPP를 제거한다. 18 μL의 PBS를 제거하고 각 마이크로 웰에 20 μL의 ECM 단백질 용액을 추가합니다. 실온에서 20-30 분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하십시오.
참고: 최적의 코팅 배양 시간은 단백질의 종류와 농도에 따라 달라질 수 있습니다. - 배양 후, ECM 단백질 용액 15 μL을 제거하고 20 μL의 PBS로 마이크로 웰을 세 번 세척합니다. 항상 세안 사이에 약 5 μL의 PBS를 둡니다.
- 배양 접시(단계 10)의 저장을 진행하거나 세포 도금(단계 11 및 도 2참조)으로 진행한다.
- 선택적 품질 관리 단계: 에피오레전스 현미경을 사용하여 도금 전 패턴을 시각화하고 이미지 인쇄합니다. 적절한 형광 채널을 선택하고 노출 시간을 조정합니다.
참고: 실험 간의 패턴의 형광 강도를 비교하려면 동일한 단백질에 대해 동일한 노출 시간을 사용하는 것이 필수적입니다.
10. 마이크로 패턴의 저장
참고: 흡착된 단백질을 가진 마이크로 패턴은 프로토콜의 상이한 단계 동안 저장될 수 있다(도 2참조). 다중 단백질을 가진 마이크로 패터닝의 경우, 마이크로 패턴은 마이크로 패터닝의 첫 번째 라운드 후 또는 마이크로 패터닝의 두 순차적 라운드가 완료된 후에 저장될 수 있다(도 2B참조).
- PLL-PEG로 패시브하면 마이크로 패턴을 최대 3일 동안 4°C에서 PBS(우물당 3mL)에 보관하십시오.
- 배양 접시를 PEG-SVA로 전달한 경우, 마이크로 패턴은 최대 1개월 동안 보관할 수 있다. 이를 위해 이중 증류수로 마이크로 패턴을 집중적으로 헹구고 아르곤 또는 질소의 멸균 에어건으로 건조시지만 일반 공기도 사용할 수 있습니다. 건조 후, 마이크로 패턴은 최대 1 개월 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다 (PRIMO 시스템 지원 팀, 개인 통신).
11. 도금 세포
참고 : 다음 단계에서, 세포는 준비 된 마이크로 패턴 배양 접시 / es에 도금됩니다. 이들 연구에서, 신경세포주(CAD 세포)가31로사용된다. 그러나 이 프로토콜은 관심있는 다른 세포 유형을 연구하기 위해 조정 될 수있다 (필요에 따라 셀 도금 프로토콜을 조정).
- 분화 배지를 사용하여 48시간 동안 CAD 세포를 분화합니다(DMEM은 1% 글루타민, 혈청 없이, 1% 펜/스트렙으로 보충됨, 재료 표참조).
- 플레이트 1 mL을 내부 유리에 세포를 잘 넣고, 모든 마이크로 웰을 덮고 배양 접시를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 놓는다.
Representative Results
위의 프로토콜에 따라 ECM 단백질/s로 코팅된 마이크로 패턴 표면이 발생합니다. 우리는 신경 경로 찾기를 추적하기 위해 이러한 패턴을 사용하고 있습니다.
생성된 패턴은 템플릿을 정확하게 표현해야 합니다. 한 예는 하나의 디자인 유닛을 나타내는디지털 패턴 템플릿(그림6A)이20~2μm 너비에 이르는 정의된 마이크로 패턴을 표시하고 레이블이 지정된 경우를 보여 줍니다. 피브리노겐(그림 6B). ImageJ를 사용하여, 형광 강도 측정은 스트라이프를 따라 및 각 스트라이프 위 15 μm의 해당 배경 영역으로부터수직(도 6C)및 수평(도6E)을모두 수득하였다. 각 스트라이프 너비에 대한 패턴 측정에서 배경 측정을 뺍니다.
시스템의 한 가지 제한은 인쇄 시 에지 효과를 관찰할 수 있다는것입니다(도 6B,상단 스트라이프) 인쇄 시 ≥20 μm, 패턴 가장자리에서 더 높은 강도의 신호가 중앙에 비해(그림 6D,첫 번째 피크 형광 강도 프로파일). 우리의 실험에서 분해능 한계는 약 2 μm; 이 폭에서 우리는 상당한 감소를 관찰 (약 50%) 피브리노겐 형광 강도는 넓은 줄무늬의 강도에 비해(그림 6F,G). PRIMO 시스템과 여기에 설명된 프로토콜을 사용한 패터닝은 재현 가능한 패턴을 생성했으며, 4개의 개별 복제 설계 단위에서 2 μm 너비에 대해 측정된 평균 형광 강도의 가장 높은 표준 편차(그림6) G).패턴 스트라이프 내의 변형도 낮은 것으로 나타났다; 변형 계수는 3에서 10%까지 다양하며, 20 μm 및 2 μm 스트라이프는 가장 큰 내부 변동을 가집니다. 이는 각각 시스템의 에지 효과와 해상도 제한의 결과일 수 있습니다. 이러한 측정의 경우 이러한 이미지를 획득하는 데 사용되는 대물에서 발생하는 고르지 않은 조명을 피하기 위해 스트라이프 중앙의 강도만 측정했습니다(비네팅, 그림 6E).
특정 실험은 정의된 단백질 농도를 필요로 하는 질문을 포함할 수 있으며, 이는 두 가지 방법으로 달성될 수 있다: 1) 단백질 농도의변화(도 7A,B). 라미닌의 다른 농도와 배양, 상당히 다른 형광 강도를 초래, 높은 단백질 농도로 증가(그림 7B). 2) 항 접착제 필름(PEG)을 갈라기 위해 사용되는 레이저 용량은 다양할 수 있다. 더 높은 레이저 용량은 반파울링 필름을 더 큰 범위로 제거하여 관심 있는 단백질에 대한 더 많은 결합 부위를 생성합니다(그림7C,D)는더 높은 레이저로 증가하여 현저히 다른 형광 강도를 초래합니다. (그림7D).
레이저 용량을 다양하게 변경하면 동일한 패턴 내에서 단백질 그라데이션의 생성이 가능합니다. 이는 그림 8A에표시되며 그라데이션 템플릿은 검은색(레이저 전원 없음)에서 흰색(최대 레이저 전력)에 이르기까지 다양한 그레이스케일 레벨을 사용하여 설계되었습니다.
레이저 강도는 템플릿의 그레이스케일 레벨(8비트 이미지에서 0에서 255까지 범위)에 비례하여 UV 조명의 그라데이션을 생성합니다. 그라데이션 스트라이프를 따라 형광 강도 프로파일의 측정은 패턴템플릿(도 8B)과생성된 그라데이션 패턴(도8C,D)에서선형이다. 이는 동일한 템플릿 및 그라데이션 패턴 내의 모든 그라데이션 스트라이프 사이에서 재현할 수있습니다(그림 8B,D). 이러한 그라데이션의 생성은 매우 유용하며 세포가 종종 생리 활성 단백질34,35,36,37의구배에 반응하는 생체 환경에서 모방하는 데 도움이됩니다.
세포는 세포 외 환경을 변화시키는 것을 감지하지만 세포가 그러한 변화를 만날 때 세포 행동의 연구를 가능하게하는 세포는 제한적입니다. LIMAP는 동일한 마이크로 웰에서 여러 단백질을 마이크로 패턴화하는 데 사용할 수 있습니다. 예는 피브로넥틴(수평) 및 라미닌(수직)의 줄무늬로 교차 패턴이 생성된 그림 9에 나와 있습니다. 다중 단백질을 가진 패턴을 만들 때, 단백질의 교차 결합을 방지하기 위하여 제 1 및 제 2 단백질 배양 사이 차단 단계를 사용하는 것이 중요합니다 (단계 7 참조). 차단 효율은 코팅에 사용되는 단백질의 생화학적 특성에 따라 달라질 수 있으며 PLL-PEG(0.1 mg/mL) 및 BSA(1%)를 포함한 여러 차단 버퍼를 테스트하는 것이 좋습니다. 이러한 교차 결합 효과를 평가하기 위해 ImageJ(그림9)를사용하여 형광 강도 측정을 수행했으며, 섬유넥틴과 라미닌에 대한 PLL-PEG 버퍼(0.1 mg/mL)를 사용하여 교차 결합을 극적으로 줄일 수 있음을 보여주었습니다. 크로스 패턴(그림 9D, H).
생성된 교차 패턴은 CAD세포(도 10A,B)또는 쥐 등쪽 근근 신경절(DRG) 뉴런(도10C)을이용한 세포 검정을 사용하였다. 그들의 신경염 (CAD)와 축사 (DRG)는 다른 라인을 따라 성장합니다. CAD 세포는 1 차적인 뉴런에 비해 유사한 인테그린 발현 프로필을 보여주기 때문에 뉴런 모델로 사용되며, 배양시 48시간 후에도 액틴이 풍부한 성장 콘을 여전히 표시하므로 경로 찾기에적합합니다. 연구.
1차 뉴런을 향한 생성된 마이크로 패턴의 가능한 세포 독성 효과를 조사하기 위해, DRG 뉴런은 이전에 발표된 프로토콜38에따라 마이크로 패턴상에서 분리및 배양되었다. 결과는 1차 뉴런이 마이크로 패턴 환경을 용인한다는 것을보여준다(도 10C). 우리는 현재 다양한 ECM 단백질이 축색 (신경외) 경로 찾기에 미치는 영향을 연구하고 있습니다. CAD 세포에서 발견 되는 개념의 예비 증거는 DRG 뉴런을 사용 하 여 추가 조사 될 것 이다. 생성된 마이크로 패턴의 품질을 검증하기 위해, 세포 도금진행 전에 패턴 가장자리가 잘 정의되도록 형광 현미경으로 패턴을 이미지화하는 것이 바람직하다. 이미징 과정에서 현미경과 카메라 간의 광학 조정을 보장하여 데이터의 후방 분석 및 해석에 영향을 미치는 주변 암흑 효과(vignetting)를 피하는 것이 중요합니다. 또한 패턴을 이미지화하고 패턴 이미지에서 이 이미지를 빼는 데 사용되는 동일한 노출 시간을 사용하여 패턴이 없는 영역의 이미지를 획득합니다.
요약하면, 양질의 마이크로 패턴 생성을 위해, 단백질 농도를 평가하는 것이 바람직하다(그림 7A, B),레이저 용량(그림 7C, D),단백질 배경 수준(그림 6E, F, H)및 여러 단백질을 사용할 때 효율적인 차단단계(그림 9). 결론적으로, LIMAP로 생성된 마이크로 패턴의 품질은 세포 분석에서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 데이터를 얻기 위해 필수적입니다.
그림 1: 마이크로 패터닝 기술 구성표: 마이크로 접촉 인쇄 및 레이저 보조 패터닝. (A)마이크로접촉 프린팅은 정의된 마이크로 특징을 가진 석판화 마스터를 사용하여 관심 있는 단백질로 배양되는 PDMS 스탬프를 생성한다. 이 단백질은 유리 표면에 옮겨 (스탬프) 단백질 마이크로 패턴을 생성합니다. (B)레이저 보조 패터닝 기술에는 포토패터닝 및 직접 레이저 패터닝이 포함됩니다. (C)대부분의 포토패킹 접근법은 특정 위치에서 PEG 방수 표면을 갈라내기 위해 원하는 형상과 함께 UV 광원과 포토마스크(기판 표면또는 목표의 초점면에 접촉)를 사용하며, 정의된 패턴을 만듭니다. 후속 단백질 배양 단계는 레이저 절단 된 부위에만 단백질 흡착을 초래합니다. (D)LIMAP는 기판과 접촉하는 포토마스크를 필요로 하지 않는 포토패킹 기술이다(즉, 마스크리스 및 비접촉식 접근법). LIMAP는 광 이니시에이터를 사용하여, 이는 PEG의 빛 노출 지역을 조각, 레이저의 낮은 복용량에 의해 활성화됩니다. 이것은 순차적인 단백질 흡착을 위한 부착 사이트를 만듭니다. (e)직접 레이저 패터닝은 고에너지 빛을 사용하여 PEG 필름을 직접 에칭하여 에칭된 부위에 단백질 결합을 허용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 마이크로 패터닝 프로토콜의 단계의 요약을 보여주는 체계. (A)하나의 단백질을 가진 마이크로 패터닝은 마이크로 패터닝 (포토 패터닝 및 단백질 배양)의 한 라운드를 포함하고 8 시간(B)여러 단백질을 가진 마이크로 패터닝은 두 개의 순차적 라운드가 필요합니다. 마이크로 패터닝을 준비하고 있는 마이크로 패턴의 수에 따라 1-2일 이내에 완료할 수 있습니다. 작업 1 일 만에 프로토콜의 B 버전을 통과 할 수 있습니다. 연속 화살표는 프로토콜의 단계의 직접 흐름을 나타냅니다. 불연속 화살표는 한 단계와 다른 단계 사이에 상당한 시간 간격이 있음을 나타냅니다(단계 6.6 및 9.3 참조). (C)마이크로 패터닝(빨간색 줄무늬) 또는 두 개의 순차적 마이크로 패터닝(빨간색 및 녹색 줄무늬) 후 얻은 예패턴의 개략적 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: LIMAP를 사용하면 패턴 템플릿 생성이 다양합니다. (A, B) ImageJ(석궁, B 문자)로 디자인된 패턴 템플릿의 예입니다. 흰색으로 그려진 모양은 최대 레이저 출력으로 투사되었고 검은색으로 그려진 모양은 투영되지 않았습니다. (C, D) 10 μg/mL 피브리노겐(녹색)으로 배양 후 템플릿으로부터 LIMAP로 얻은 마이크로 패턴. (C)석궁은 가로 75 μm, 수직 50 μm의 폭 50 μm 높이입니다. (D)문자는 80 μm 너비와 85 μm 높이입니다. C 및 D의 배율 막대는 50 μm을 나타냅니다.
그림 4: LIMAP 프로토콜에 필요한 자료입니다. (A)이 프로토콜에 사용되는 스텐실은 직경 20 mm, 얇은 원형 형 PDMS 조각 (250 μm 두께)을 함유하고 4 마이크로 웰 (직경 4mm 각각)입니다. 마이크로 웰에 사용되는 부피범위는 5~20μL로, 각 실험에 필요한 시약과 단백질의 양을 상당히 줄입니다. (B)6 웰 유리 바닥 접시 어디 스텐실 이미 각 우물에 배치 되어 있습니다. 마이크로 웰에는 20 μL의 PBS가 포함되어 있습니다. (C)내부 유리가 잘 레이저 초점을 보정하는 데 사용되는 녹색 형광펜으로 표시 된 교정 접시. (D)B의 6 웰 유리 바닥 접시에서 잘 왼쪽 상단의 회로도보기 (파선 빨간색 원으로 윤곽). 내부 유리 바닥은 흰색으로 표시되고 스텐실은 회색으로 표시됩니다. 스텐실에는 4개의 마이크로 웰(번호가 매겨진 1-4)이 포함되어 있으며, 4가지 실험 조건(예: 다른 단백질 농도, 패턴 기하학, 단백질 조합 등)의 테스트를 위해. 별표는 참조 패턴을 포함하는 마이크로웰을 나타낸다. (E)상단 부분(채워진 화살촉이 있는 화살표)에서 참조 패턴이 생성된 마이크로 웰의 회로도 보기입니다. 이러한 기준 패턴은 패터닝을 위한 최적의 레이저 포커스를 얻기 위해 요구된다(단계 4 참조). 빈 화살촉이 있는 화살표는 마이크로 웰의 중앙 영역을 나타내며, 이는 시스템 교정 후 후속 패터닝에 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 마이크로 패터닝을 위한 소프트웨어 설정. (A)ImageJ로 설계되고 8 비트 Tiff 파일로 저장된 병렬 줄무늬가있는 패턴 템플릿. (B-D) 마이크로 패턴이 생성되는 현재 마이크로 웰과 겹치는 디지털 ROI(관심 영역)에 대한 회로도 보기입니다. (B)사용할 패턴 템플릿(길이 1824 픽셀=415 μm, 너비 1140 픽셀=260 μm)은 레오나르도에서 선택되고 ROI에 디자인 단위(검은색 파선 사각형의 빨간색 줄무늬)로 투영되어 약 0.1 mm2를 커버합니다. 마이크로 웰 영역. 디자인 단위는 복제 메뉴(템플릿 구성)에서 4개의 열과 4줄로 복제되어 마이크로 웰 전체에 걸쳐 패턴을 만듭니다. 열 사이의 공백을 기록합니다. (C)연속 줄무늬를 패턴화하려면 열 사이의 간격을 조정해야 합니다. 이 경우, 설계 단위 간의 간격을 달성하기 위해 열 간의 간격은 복제 메뉴에서 네거티브 간격으로설정되며, -20 μm.(D)동일한 마이크로웰에서 여러 단백질을 패턴화하기 위해, 패턴의 정확한 정렬은 필수. 소프트웨어 설정 단계(5단계)동안 원하는 모든 패턴 템플릿을 동시에 업로드합니다. 작업 목록에서 각 패터닝 라운드 동안 패턴화할 특정 작업만 선택하고 나머지 작업(5.12, 5.13 및 8.2 단계)을 선택 취소합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: LIMAP를 사용한 패턴 가변성 분석. (A)ImageJ로 디자인 된 패턴 템플릿은 다양한 너비 (20, 10, 5, 2 μm, 위에서 아래로)의 4 줄무늬를 마이크로 패턴으로 사용했습니다. (B)형광 표지된 피브리노겐(녹색)의 10 μg/mL로 배양 후 얻은 마이크로 패턴. (C)마이크로 패턴의 줄무늬를 교차하는 수직 선을 따라 강도를 측정합니다. (D)(C)에서 측정으로부터 얻은 수직 형광 강도 프로파일. 더 큰 폭(20 μm)에서는 스트라이프 가장자리에 단백질이 축적되어 두 개의 뚜렷한 형광 강도 피크(가장자리 효과)가 발생하여 수직 프로파일의 변화가 있습니다. 이 효과는 묘사 된 수평 선 (형광 및 배경)을 따라 스트라이프 너비 ≥20 μm.(E)강도 측정에서만 볼 수 있습니다. (F)(E)의 측정에서 얻은 수평 형광 강도 프로파일. (G)각 스트라이프 너비에 대한 평균 강도를 나타내는 그래프로, 4개의 개별 복제 설계 단위(패턴 간 변동)에서 측정하였다. 2 μm 스트라이프 폭의 패턴에 감소 된 단백질 흡착참고. (H)패턴 스트라이프(편속계수) 내의 편차가 3~10%에 이르는 모든 스트라이프 너비에 대해 낮았다. G 및 H의 데이터는 평균 ± SD로 나타낸 G 및 H에서의 통계 적 분석을 다중 비교를 이용한 단방향 ANOVA(Kruskal-Wallis) 비파라메트릭 검정을 사용하여 수행하였다. P 값은 **에 대한 <0.001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 단백질 흡착 효율을 위한 레이저 전력 및 단백질 농도의 변동의 효과. (A)PLL-PEG 표면을 일정한 레이저 용량(1390 mJ/mm2)으로 레이저-크리브시키고 형광표지라미닌(magenta)의 지시된 농도로 배양하였다. (B)(A)에서 라미닌 줄무늬의 형광 강도를 정량화. (C)다른 지시된 레이저 투여량은 형광표지된 피피넥틴(녹색)의 동일한 농도(10 μg/mL)로 배양한 후 적용되었다. (D)(C)에서 섬유넥틴 줄무늬의 형광 강도의 정량화는 더 높은 레이저 용량이 흡착 단백질의 상부와 상관관계가 있음을 보여준다. 모든 측정값은 배경이 빼게 됩니다. 샘플 번호는 열 의 맨 아래에 표시됩니다. 데이터는 평균 ±SEM. 통계 분석을 두 꼬리 계산으로 비파라메트릭 Mann-Whitney 검정을 사용하여 수행하였다. P 값은 ****에 대한 <0.0001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: 마이크로 패턴 내의 단백질 농도 구배의 생성. (A)그레이스케일의 그라데이션 패턴 템플릿입니다. (B)(A)에서 측정된 형광 강도 프로파일. (C)패턴 템플릿으로부터 LIMAP를 얻은 패턴은 (A) 형광표지된 피브로넥틴(녹색)의 10 μg/mL로 배양 후. (D)n=3 줄무늬 및 배경의 형광 강도 프로파일은 평균 ±SEM으로 나타내며, 단백질 구배의 강도의 선형 증가를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 9: 여러 단백질을 순차적으로 패터닝할 때 의 교차 결합 효과. (A-C, E-G) 형광표지된 피브로넥틴(시안, 수평) 및 형광표지 라미닌(마젠타, 수직)의 10μm 줄무늬가 있는 교차 패턴. (A-C) BSA 차단 버퍼로 처리된 샘플. (E-F) 비특이적 결합 부위를 차단하기 위해 PLL-PEG로 처리된 샘플(단계 7). (A, E) 섬유넥틴 및 라미닌을 모두 나타내는 병합된 형광 채널. (B, F) 피브로넥틴만을 보여주는 이미지. (C, G)) 라미닌만 보여주는 이미지. C의 경우, BSA와 빈 결합 사이트의 비효율적인 차단으로 인해 수평 fibronectin 긍정적 인 줄무늬에 또한 라미닌의 존재를 주의. G의 경우 PLL-PEG로 차단하면 섬유넥틴 줄무늬에 라미닌이 효율적으로 결합되는 것을 방지합니다. (D, H) A와 E에서 각각 표시된 측정(대각선 노란색 선)에서 얻은 형광 강도 프로파일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 노이라이트/축색 경로 찾기를 조사하기 위한 교차 패턴. (A-C) 형광표지된 피브로넥틴(시안, 수평) 및 형광표지 라미닌(마젠타, 수직)의 10μm 줄무늬가 있는 교차 패턴. (A, B) 마이크로 패턴을 따라 성장하는 신경과 CAD 세포의 형광 이미지. 신경염을 가시화하기 위해, 세포는 48시간 동안 배양되었고, 4% PFA로 고정되었고, 튜불린(A) 또는 튜불린 및 액틴(B)을 위해 염색하였다. (C)쥐 등도 뿌리 신경절 (DRG) 마이크로 패턴을 따라 성장 축과 뉴런. 축세포를 시각화하기 위해 DRG 뉴런은 72시간 동안 배양되었고, 4% PFA로 고정되고, 튜불린에 염색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 11: LIMAP를 가진 마이크로 패턴을 생성할 때 얻어진 일반적인 음성 결과의 예. (A-C) 다른 상황에서 얻은 10 μg/mL 형광 표지 피브리노겐(녹색)의 최적 패턴 스트라이프. (A)패턴 생성 시 미세 잘 건조. 배경 (화살표)의 형광의 높은 수준과 PBS 결정 (별표)의 존재를 주목하십시오. (B)소프트웨어 설정 중에 스트라이프 사이의 스티치가 제대로 조정되지 않아 설계 단위 사이에 간격(화살표)이 있는 불연속 줄무늬가 발생했습니다(3.4.7 단계 참조). (C)레이저 포커스는 패턴 템플릿의 실제 줄무늬 폭을 나타내지 않는 확산 된 줄무늬 (화살표)를 유발하지 않는 최적이 아닌 것이었으며, 이는(B)에서와같이 위에서 아래로 20, 10, 5, 2 μm여야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
LIMAP(PRIMO) 마이크로 패터닝 의 장점과 마이크로 접촉 인쇄와의 비교
마이크로접촉 인쇄는 아마도 생물학적분야에서가장 일반적으로 사용되는 마이크로 패터닝 기술이지만, LIMAP 기술40,41,42를 사용하는 연구자의 수가 증가하고 있는 것으로 보입니다. ,43,44. 여기서는 LIMAP용 상용 시스템인 PRIMO를 사용하는 프로토콜을 제시했습니다. 아래에서는 마이크로접촉 인쇄 및 LIMAP 사진 패터닝의 잠재적인 장점과 한계에 대해 간략하게 설명합니다.
마이크로 접촉 인쇄는 유리 또는 실리콘 웨이퍼에 포토 마스크 (일반적으로 SU-8)를 스핀 코팅하여 생산 된 석판 화 마스터를 필요로하며, 원하는 마이크로 특징으로 레이저 에칭됩니다. 이러한 마스터는 PDMS 스탬프45를만드는 템플릿으로 사용됩니다. 스탬프는 그것에 부속하는 선택된 단백질로 배양되고, 그 때 세포 배양 접시에 (스탬프) 옮겨질 것입니다. PDMS 스탬프에 단백질의 흡착 과정은 단백질 농도, 완충제 및 배양 시간에 의존한다. 이러한 매개 변수는 최적의 결과를 위해 사전에 테스트해야합니다 46.
마스터는 제대로 보존하는 경우, 개월 또는 년 동안 지속, 실험의 상당수에 사용할 수 있습니다. 그러나 이 기술의 제한 요소는 원하는 모든 수정에 대해 새로운 석판 화 마스터를 다시 디자인할 필요성입니다. 실험 설계의 변경으로 인해 새로운 마스터(최대 몇 주)의 생산시간이 소요되므로 실험이 지연될 수 있습니다. 이에 비해 LIMAP 포토패킹에는 물리적 마스터가 필요하지 않습니다. 원하는 마이크로 패턴 의 형상을 변화하는 연구 질문에 유연하게 적응하는 데 사용할 수있는 소프트웨어 생성 패턴 템플릿을 사용합니다. LIMAP는 또한 마이크로접촉프린팅(47)을사용하여 재현성 방식으로 얻기 어려운 동일한 마이크로패턴(도 8)내에서 단백질 구배를 생성하는데 사용될 수 있다.
또한, LIMAP로 달성된 마이크로 패턴 분해능은 2 μm(도6B)이다.
이 해상도에 접근하면 인트라-및 인터-패턴 가변성이 증가했습니다. 10 μm 너비 주위 또는 그 이상의 패턴을 생성하는 것은 매우 재현성이있었습니다(그림 6G,H). 반대로 마이크로 접촉 인쇄를 사용하면 10 μm 미만의 해상도를 일관되게 얻기가 어려우며 작은 피처(데이터가 표시되지 않음)를 스탬핑할 때 유물을 찾는 것이 일반적입니다.
우리는 LIMAP가 동일한 마이크로 웰 내에서 여러단백질을마이크로 패턴화하는 데 사용될 수 있음을 보여주었으며, 더 많은 수준의 복잡성을 실험에 추가할 수 있습니다. 마이크로 접촉 인쇄를 통해 이를 달성할 수 있지만, 다른 단백질을 높은 정밀도로 정렬하는 것은 기술적으로 오히려 까다로울 수 있습니다. LIMAP를 사용하여 여러 단백질을 패터닝하는 것은 곧바로 앞으로 보이지만, 순차적 코팅 절차를 통해 단백질의 교차 결합은 시약을 차단하지만 완전히 제거되지는 않음을 통해 감소될 수 있다는 점을 언급하는 것이중요합니다(그림 9).
하나 또는 다른 기술의 비용에 관하여, 여기에 기술된 바와 같이 LIMAP는 상이한 형광 현미경에 설치될 수 있고 전동 단계를 필요로 하는 마이크로 패터닝 장비(PRIMO)의 구입을 요구한다. 이 투자는 처음에는 비용 집약적이지만 LIMAP와 관련된 장기적으로 소모품 (스텐실, PEG 및 PLPP) 이외의 추가 구매는 없습니다. 대안적으로, PDMS 스텐실은 또한 출판된 프로토콜18,32에따른 자체 실험자에 의해 실험실에서 생산될 수 있다. 마이크로 접촉 인쇄에 대한 가장 큰 비용은 새로운 마스터의 생산과 관련될 수 있으며, 실험에 새로운 패턴이 필요한 경우 상당한 규모가 될 수 있습니다.
LIMAP의 한 가지 단점은 이 기술의 처리량이 상대적으로 낮다는 것입니다. 마이크로 접촉 인쇄는 LIMAP를 사용하는 필요한 순차 레이저 마이크로 패터닝에 비해 동시 스탬핑 단계에서 많은 수의 마이크로 패턴을 빠르고 효율적으로 생성할 수 있습니다. 예를 들어, PDMS 스탬프(스탬프 준비 제외)를 이용한 마이크로접촉 인쇄를 통해 약 2시간 동안 6개의 스탬핑 유리 커버슬립을 생성할 수 있습니다. LIMAP와 유사한 영역(6-well 접시)을 패터닝하는 것은 표면 패시베이션의 절차를 제외하고 약 4시간이 걸릴 것이다(5.12단계에 설명된 패턴 템플릿 구성을 고려하고 도 5B참조).
LIMAP 기술의 또 다른 속도 제한 계수는 넓은 영역을 패터닝하는 데 필요한 긴 조명 시간입니다(설계 단위당 7.5mW/mm2 레이저가 있는 설계 단위당 30s). 이러한 경우 마이크로 접촉 인쇄가 선호되는 옵션일 수 있습니다. 새로 출시된 광 이니시에이터(PLPP 젤, 재료 표)는패터닝에 걸리는 시간을 상당히 단축하여 단 몇 분 만에 넓은 영역(최대 8mm2)에서수백 개의 마이크로 패턴을 생성할 수 있습니다.
세포 배양을 위한 마이크로 패터닝 표면이 마이크로 접촉 인쇄로 얻어진 가변성과 비교하여 상이한 실험 반복 들 사이에서 마이크로 패턴의 재현성일 때 고려해야 할 또 다른 중요한 요소는. 예를 들어, 도 7B,D에 도시된 그래프는 매우 유사한 결과를 가진 3개의 독립적인 실험 반복의 대표적인 데이터이다(데이터는 도시되지 않음). 우리의 경험과 이전 간행물에 기초하여, 재현성의이 수준은 마이크로 접촉 인쇄48,49,50,51,52로달성하기 어렵다.
감광성 물질을 설계하기 위해 전용 화학을 필요로하는 다른 사진 패터닝 기술과는 달리 일반적으로 생체 적합성3,LIMAP (PLPP)의 감광 성 성분은 매우 생체 적합성이 아닌 광 감작제의 사용 )은 생체 적합성이며 세포(21)에의해 잘 용납된다; 우리의 손에 우리는 CAD, DRG 뉴런(그림 10),섬유 아세포, 상피 세포 및 흑색종 세포 (데이터가 표시되지 않음)를 포함하여 다양한 세포에 걸쳐 세포 독성을 경험하지 않았습니다. 다른 사진 패터닝 기법에 비해 PRIMO를 사용하는 LIMAP의 또 다른 장점은 포토마스크가 필요하지 않다는 것입니다. 마이크로 접촉 인쇄와 마찬가지로 새로운 포토마스크는 원하는 모든 패턴에 대해 설계및 생성되어야 합니다.
마이크로 접촉 인쇄에 대해 위에서 언급 한 모든 제한 사항은 기술의 수동 접근 방식을 참조하십시오. 그러나, 스탬프 하중 및 압력제어(53)를이용한 자동화된 장치를 사용하여 마이크로접촉 인쇄의 처리량 및 재현성을 향상시킬 수 있다.
PRIMO를 사용하여 LIMAP에 대한 프로토콜 및 문제 해결의 주요 단계
이 프로토콜 에서 발견되는 가장 일반적인 문제 중 하나는 마이크로 패턴 내에서 높은 수준의 배경 형광을 갖는 것입니다. 이것은 종종 작은 부피로 인해 발생하는 마이크로 웰의 건조때문일 수 있습니다. 이러한 현상이 발생하면, PBS 결정은 종종 ECM 패턴을 둘러싸고나타난다(그림 11A).
단백질 배양 후 불충분하거나 비효율적인 세척 단계는 또한 배경 형광의 상부귀착될 수 있습니다. 이는 특히 10 μg/mL 이상의 단백질 농도를 사용할 때 관찰될 수있다(그림 11B)이상. 배경에 있는 단백질의 과잉은 PBS를 가진 추가 세척 단계를 포함하여 감소될 수 있습니다.
단백질 배경의 존재를 측정하고 각 실험에서 특성화할 필요가 있으며, 배경 형광 강도를 계산하고(도6E)마이크로 패턴 강도에서 빼기(그림6F-H) 및 그림 7B,D). 높은 단백질 배경은 CAD 세포의 부착 및 발아에 영향을 미칠 수 있으며, 결과의 해석을 손상시다.
디자인 단위 간의 간격이 있는 것은 사용자가 패턴 간의 중복이 부족하여 발생하는경험(그림 11B)이제한되어 있는 일반적인 문제입니다. 레오나르도 소프트웨어의 두 파라미터는 이를 극복하기 위해 조정될 수 있다: 1) 패턴의 설계에 따라 컬럼 들 사이의 음의 간격이 필요할 수 있다(단계 5.7및 도 5B,C참조). 또는 2) 전문가 메뉴에서 그라데이션 옵션을 사용하여 열을 스티치합니다. 최적의 간격 파라미터를 결정하기 위한 신속한 시험은 UV 접착제(재료표)를사용하여 수행될 수 있다. 이 접착제의 작은 방울은 유리 슬라이드에 적용된 다음 유리 커버 슬립으로 덮여 필름을 만듭니다. 내장 된 UV 접착제는 낮은 레이저 용량 (30 mJ / mm2)을사용하여 관심있는 패턴 템플릿으로 포토 패턴화됩니다. 임베디드 접착제의 UV 노출 영역은 경화되어 밝은 필드 현미경 검사법으로 볼 수 있습니다. 테스트 결과는 패턴 내에서 얻은 간격을 평가하기 위해 시각화됩니다. 우리의 신경 실험에서, 줄무늬 사이의 간격은 세포 행동에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다., 성장 역학에 변화를 생산 (감소 속도 또는 경로의 포기).
레오나르도 소프트웨어의 최신 업데이트 (출판 시, 레오나르도 4.11), 마이크로 웰 표면의 훨씬 더 큰 영역 (최대 8mm2 2를 사용 하 여) 커버 하는 이전에 설계 된 더 큰 패턴 템플릿을 업로드할 수 있습니다. 설계 단위당 현재 0.1mm2와 비교하여 더 작은 설계 유닛을 함께 스티치할 필요가 없습니다. 정의되지 않은 모서리는 패턴 생성 중에 레이저 초점 조정이 부족하여 발생할 수있습니다(그림 11C). 따라서 패터닝 전에 레이저를 교정하고 기준 패턴 단계(4단계 참조)를 수행하는 것이 중요합니다. 줄무늬가 잘못 정의되면 줄무늬 너비가 달라지므로 축축한 성장 역학과 줄무늬 너비 간의 상관 관계가 어려워지습니다. 축삭은 또한 가장자리가 분산된 줄무늬를 포기하는 경향이 있습니다. 또한 10-20 μm 너비 이상의 줄무늬를 인쇄할 때 가장자리의 가변성을 발견할 수 있으며, 그 결과 패턴의 중앙 영역에 비해 가장자리에서 단백질 함량이 높아질 수있습니다(그림 6B,D). 이 에지 효과는 포토 패터닝 프로세스 중에 광 개시자의 비균질 확산에 의해 생성됩니다. 광선화 반응은 산소에 의존하며 가장자리에서 더 많이 확산됩니다. 이러한 에지 효과는 포토패터닝 공정 중에 마이크로웰에 파이펫을 장착하여 광이니시에이터를 균질화하는 것을 최소화할 수 있다. 더욱이, 새로운 상용화 된 광 이니시에이터 (PLPP 젤), 또한 에지 효과 (PRIMO 시스템 지원 팀, 개인 통신)를 줄일 수 있습니다.
하나 이상의 단백질의 마이크로 프린팅은 교차 결합을 초래할 수있다(도 9A-D). 이는 두 개의 상이한 단백질에 대한 배양 단계 들 사이의 비특이적 결합 부위를 차지하는 데 사용되는 차단 효율을 증가시킴으로써 최소화될 수 있다. 단백질의 교차 결합은 실험 결과의 재현성을 교란시킬 수 있고, 축삭 성장 역학 및 그밖 세포 행동에 각 단백질의 기여를 결정하는 것이 어렵기 때문에, 데이터의 오해로 이끌어 낼 수 있습니다.
결론
우리는 LIMAP를 사용하여 제공된 프로토콜이 PRIMO 시스템의 사용을 통해 단백질 마이크로 패턴의 생성을 용이하게 하기를 희망한다. 우리의 프로토콜은 2D 유리 표면에서 마이크로 패턴을 안정적으로 생성하는 방법에 초점을 맞추고 있지만, 다른 프로토콜은 3D 배양체(42)의부드러운 기판(54)및 미세 구조화 표면의 마이크로 패터닝에 LIMAP를 사용할 수 있음을 보여 주었다. 이러한 마이크로 패턴은 마이크로 환경의 변화에 대한 세포 반응을 연구하는 다목적 도구가 될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 BBSRC, EPSRC, MRC 및 웰컴 트러스트에 의해 지원됩니다. C.B. 실험실은 웰컴 트러스트 (보조금 번호 088785 / Z / 09 / Z)의 핵심 자금으로 지원되는 맨체스터 대학의 셀 매트릭스 연구를위한 웰컴 트러스트 센터의 일부입니다. 저자는 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회 (BBSRC)가 C.M., K.J.(BB/M020630/1) 및 P.A.(BB/P000681/1)와 공학 및 물리 과학 연구 위원회(EPSRC) 및 의료에 의해 제공된 자금을 인정하고자 합니다. 연구위원회 (MRC) A.K.에 재생 의학 박사 교육을위한 센터 (EP / L014904/1). 저자는 그들의 서신과 판매 후 지원 팀에 대한 Alvéole에게 감사드립니다. 저자는 현미경 검사법에 그들의 도움을 맨체스터 대학, 생물 이미징 시설에서 피터 월과 로저 메도우스 감사합니다. 이 연구결과에 사용된 생물이미징 시설 현미경은 BBSRC, 웰컴 트러스트 및 맨체스터 전략 기금 대학의 보조금으로 구입되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 protein labeling kit | Invitrogen | A10235 | Working concentration: N.A. |
| Alexa 647 protein labeling kit | Invitrogen | A20173 | Working concentration: N.A. |
| CAD cells | ECACC | 8100805 | Working concentration: N.A. |
| Conjugated fibrinogen-488 | Molecular Probes | F13191 | Working concentration: 10 μg/ml |
| DMEM culture medium | Gibco | 11320033 | Working concentration: N.A. |
| Epifluorescence Microscope** | Nikon | Eclipse Ti inverted | Working concentration: N.A. |
| Fibronectin | Sigma | F4759 | Working concentration: 10 μg/ml (after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) (diluted in PBS) |
| Fiji-Image J | www.imagej.nih.gov | Version 2.0.0-rc-54/1.51f | Working concentration: N.A. |
| Fluorescent highlighter | Stabilo | Stabilo Boss Original | Working concentration: N.A. |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Working concentration: 1M |
| Inkscape software | Inkscape | Check last update | Working concentration: N.A. |
| Laminin-red fluorescent rhodamine | Cytoskeleton, Inc. | LMN01 | Working concentration: 10 μg/ml (diluted in PBS) |
| Leonardo software | Alvéole | version 4.11 | Working concentration: N.A. |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Working concentration: 1% |
| Micro-manager software | Open imaging | Check last update | Working concentration: N.A. |
| Motorized x/y stage | PRIOR Scientific | Proscan II | Working concentration: N.A. |
| NIS Elements Software | Nikon | NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs) | Working concentration: N.A. |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Sigma | D8537 | Working concentration: 1X |
| PDMS Stencils | Alvéole | visit www.alveolelab.com | Working concentration: N.A. |
| PEG-SVA | Laysan bio, Inc. | MPEG-SVA-5000-1g | Working concentration: 50 mg/ml |
| Phalloidin 405 | Abcam | ab176752 | Working concentration: 1:1000 |
| Photo-initiator (PLPP) | Alvéole | Classic PLPP | Working concentration: 14.5 mg/ml |
| Photo-initiator (PLPP gel) | Alvéole | PLPP gel | Working concentration: 4.76% diluted in ethanol |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V) | Working concentration: N.A. |
| PLL-PEG | SuSoS (also distributed by Alvéole) | www.alveolelab.com | Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS) |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | Working concentration: 0.01% |
| Primo equipment | Alvéole | www.alveolelab.com | Working concentration: N.A. |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Working concentration: 1% |
| Tubulin anti-alpha antibody | Abcam | DM1A | Working concentration: 1:1000 CAD cells |
| Tubulin anti-beta 3 antibody | Sigma | T8660 | Working concentration: 1:500 DRG neurons |
| UV adhesive | Norland Products | NOA81 | Working concentration: N.A. |
| 1 well glass bottom dish | Cellvis | D35-20-1.5-N | Working concentration: N.A. |
| 6 well glass bottom dish | Cellvis | P06-20-1.5-N | Working concentration: N.A. |
| 20x objective** | Nikon | no phase ring (check updated catalogue) | Working concentration: N.A. **Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alvéole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera. |
References
- Alamdari, O. G., Seyedjafari, E., Soleimani, M., Ghaemi, N. Micropatterning of ECM Proteins on Glass Substrates to Regulate Cell Attachment and Proliferation. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (4), 234-240 (2013).
- Sunami, H., Yokota, I., Igarashi, Y. Influence of the pattern size of micropatterned scaffolds on cell morphology, proliferation, migration and F-actin expression. Biomaterials Science. 2 (3), 399-409 (2014).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
- Marino, A., et al. Two-photon polymerization of sub-micrometric patterned surfaces: investigation of cell-substrate interactions and improved differentiation of neuron-like cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (24), 13012-13021 (2013).
- Joo, S., et al. Effects of ECM protein micropatterns on the migration and differentiation of adult neural stem cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. K. Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning. Elife. 7, (2018).
- Javaherian, S., O'Donnell, K. A., McGuigan, A. P. A Fast and Accessible Methodology for Micro-Patterning Cells on Standard Culture Substrates Using Parafilm (TM) Inserts. Plos One. 6 (6), (2011).
- Smirnov, M. S., Cabral, K. A., Geller, H. M., Urbach, J. S. The effects of confinement on neuronal growth cone morphology and velocity. Biomaterials. 35 (25), 6750-6757 (2014).
- Albert, P. J., Schwarz, U. S. Dynamics of Cell Ensembles on Adhesive Micropatterns: Bridging the Gap between Single Cell Spreading and Collective Cell Migration. PLOS Computational Biology. 12 (4), (2016).
- Evans, A. R., et al. Laminin and fibronectin modulate inner ear spiral ganglion neurite outgrowth in an in vitro alternate choice assay. Developmental Neurobiology. 67 (13), 1721-1730 (2007).
- Nichol, R. H., Hagen, K. M., Lumbard, D. C., Dent, E. W., Gomez, T. M. Guidance of Axons by Local Coupling of Retrograde Flow to Point Contact Adhesions. Journal of Neuroscience. 36 (7), 2267-2282 (2016).
- Burdick, J. A., Khademhosseini, A., Langer, R. Fabrication of gradient hydrogels using a microfluidics/photopolymerization process. Langmuir. 20 (13), 5153-5156 (2004).
- Schwartz, P. V. Molecular transport from an atomic force microscope tip: A comparative study of dip-pen nanolithography. Langmuir. 18 (10), 4041-4046 (2002).
- Barbulovic-Nad, I., et al. Bio-microarray fabrication techniques--a review. Critical Reviews in Biotechnology. 26 (4), 237-259 (2006).
- Shafagh, R. Z., Vastesson, A., Guo, W. J., van der Wijngaart, W., Haraldsson, T. E-Beam Nanostructuring and Direct Click Biofunctionalization of Thiol-Ene Resist. Acs Nano. 12 (10), 9940-9946 (2018).
- Kobayashi, J., Yamato, M., Itoga, K., Kikuchi, A., Okano, T. Preparation of microfluidic devices using micropatterning of a photosensitive material by a maskless, liquid-crystal-display projection method. Advanced Materials. 16 (22), (2004).
- Bernard, A., et al. Printing patterns of proteins. Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).
- Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Fink, J., et al. Comparative study and improvement of current cell micro-patterning techniques. Lab Chip. 7 (6), 672-680 (2007).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light-Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
- Belisle, J. M., Correia, J. P., Wiseman, P. W., Kennedy, T. E., Costantino, S. Patterning protein concentration using laser-assisted adsorption by photobleaching, LAPAP. Lab Chip. 8 (12), 2164-2167 (2008).
- Belisle, J. M., Kunik, D., Costantino, S. Rapid multicomponent optical protein patterning. Lab Chip. 9 (24), 3580-3585 (2009).
- Heinz, W. F., Hoh, M., Hoh, J. H. Laser inactivation protein patterning of cell culture microenvironments. Lab Chip. 11 (19), 3336-3346 (2011).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Thery, M., Piel, M. Protein Micropatterns: A Direct Printing Protocol Using Deep UVs. Microtubules: In Vivo. 97, 133-146 (2010).
- Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. Polyacrylamide hydrogel micropatterning. Methods in Cell Biology. 120, 93-116 (2014).
- Waldbaur, A., Waterkotte, B., Schmitz, K., Rapp, B. E. Maskless projection lithography for the fast and flexible generation of grayscale protein patterns. Small. 8 (10), 1570-1578 (2012).
- Kang, J., Choi, J. C., Kim, M., Jung, H. R., Doh, J. Photopatterning with a printed transparency mask and a protein-friendly photoresist. Methods in Cell Biology. 119, 55-72 (2014).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Morlat, S., Gardette, J. L. Phototransformation of water-soluble polymers. Part II: photooxidation of poly(ethylene oxide) in aqueous solution. Polymer. 44 (26), 7891-7897 (2003).
- Qi, Y., Wang, J. K., McMillian, M., Chikaraishi, D. M. Characterization of a CNS cell line, CAD, in which morphological differentiation is initiated by serum deprivation. Journal of Neuroscience. 17 (4), 1217-1225 (1997).
- Shrirao, A. B., et al. A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Pankov, R., Momchilova, A. Fluorescent labeling techniques for investigation of fibronectin fibrillogenesis (labeling fibronectin fibrillogenesis). Methods in Molecular Biology. 522, 261-274 (2009).
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12542-12547 (2002).
- Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), (2014).
- Tang, Y., Qiu, Q. F., Zhang, F. L., Xie, M., Huang, W. H. Quantifying orientational regeneration of injured neurons by natural product concentration gradients in a 3D microfluidic device. Lab Chip. 18 (6), 971-978 (2018).
- Srinivasan, P., Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R. Synergistic effects of 3D ECM and chemogradients on neurite outgrowth and guidance: a simple modeling and microfluidic framework. PLoS One. 9 (6), (2014).
- de Luca, A. C., Faroni, A., Reid, A. J. Dorsal root ganglia neurons and differentiated adipose-derived stem cells: an in vitro co-culture model to study peripheral nerve regeneration. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Khadpekar, A. J., Khan, M., Sose, A., Majumder, A. Low Cost and Lithography-free Stamp fabrication for Microcontact Printing. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Delepine, C., et al. Altered microtubule dynamics and vesicular transport in mouse and human MeCP2-deficient astrocytes. Human Molecular Genetics. 25 (1), 146-157 (2016).
- Decock, J., Schlenk, M., Salmon, J. B. In situ photo-patterning of pressure-resistant hydrogel membranes with controlled permeabilities in PEGDA microfluidic channels. Lab Chip. 18 (7), 1075-1083 (2018).
- Stoecklin, C., et al. A New Approach to Design Artificial 3D Microniches with Combined Chemical, Topographical, and Rheological Cues. Advanced Biosystems. 2 (7), (2018).
- Toraille, L., et al. Optical Magnetometry of Single Biocompatible Micromagnets for Quantitative Magnetogenetic and Magnetomechanical Assays. Nano Letters. , (2018).
- Theodoly, O., et al. Live nanoscopic to mesoscopic topography reconstruction with an optical microscope for chemical and biological samples. PLoS One. 13 (12), (2018).
- Ermis, M., Antmen, E., Hasirci, V. Micro and Nanofabrication methods to control cell-substrate interactions and cell behavior: A review from the tissue engineering perspective. Bioactive Materials. 3 (3), 355-369 (2018).
- von Philipsborn, A. C., et al. Microcontact printing of axon guidance molecules for generation of graded patterns. Nature Protocols. 1 (3), 1322-1328 (2006).
- Ricoult, S. G., Kennedy, T. E., Juncker, D. Substrate-bound protein gradients to study haptotaxis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, (2015).
- Bietsch, A., Michel, B. Conformal contact and pattern stability of stamps used for soft lithography. Journal of Applied Physics. 88 (7), 4310-4318 (2000).
- Hui, C. Y., Jagota, A., Lin, Y. Y., Kramer, E. J. Constraints on microcontact printing imposed by stamp deformation. Langmuir. 18 (4), 1394-1407 (2002).
- Sharp, K. G., Blackman, G. S., Glassmaker, N. J., Jagota, A., Hui, C. Y. Effect of stamp deformation on the quality of microcontact printing: theory and experiment. Langmuir. 20 (15), 6430-6438 (2004).
- Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Biebuyck, H. Stability of molded polydimethylsiloxane microstructures. Advanced Materials. 9 (9), 741-746 (1997).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21 (22), 2257-2268 (2009).
- Chakra, E. B., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, C. D., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
- Pasturel, A., Strale, P., Studer, V. Tailoring 3D cell culture templates with common hydrogels. bioRxiv. , (2019).
