Summary
Vårt övergripande mål är att förstå hur celler känner av extracellulära ledtrådar som leder till riktad axonal tillväxt. Här beskriver vi metoden för ljus-inducerad molekylär adsorption av proteiner, används för att producera definierade mikro-mönster av extracellulära matrix komponenter för att studera specifika händelser som styr Axon utväxt och pathfinding.
Abstract
Celler känner en mängd extracellulära ledtrådar, inklusive sammansättningen och geometrin hos den extracellulära matrisen, som syntetiseras och remodeled av cellerna själva. Här presenterar vi metoden för ljus-inducerad molekylär adsorption av proteiner (LIMAP) med hjälp av PRIMO-systemet som en mönster teknik för att producera mikromönstrade extracellulära matrix (ECM) substrat med hjälp av en enda eller kombination av proteiner. Metoden möjliggör tryckning av ECM-mönster i micron upplösning med utmärkt reproducerbarhet. Vi tillhandahåller ett steg-för-steg-protokoll och visar hur detta kan tillämpas för att studera processerna för neuronala pathfinding. LIMAP har betydande fördelar jämfört med befintliga mikro-Printing metoder i termer av enkel mönstra mer än en komponent och förmågan att generera ett mönster med någon geometri eller lutning. Protokollet kan enkelt anpassas för att studera bidraget från nästan alla kemiska komponenter mot cellernas öde och cell beteende. Slutligen diskuterar vi gemensamma frågor som kan uppstå och hur dessa kan undvikas.
Introduction
De senaste åren har de biologiska vetenskaperna i allt högre grad fått använda sig av de framsteg som materialvetenskaper erbjuder. Ett framträdande exempel är mikro-mönkning av substrat, som kan användas för att studera cellulära reaktioner såsom cellproliferation1,2Differentiering3,4,5,6, cell migration7,8,9och pathfinding10,11. Det finns ett antal tillgängliga tekniker som möjliggör mikromönkning av substrat, såsom multiphoton upphetsad fotokemi12, AFM DIP-penna nanolithografi13, PIN-och Inkjet Direct-utskrift14, elektronstråle litografi15eller mikrofluidik16. Men två tekniker som ofta används i det biologiska fältet är microcontact utskrift17,18,19eller laserassisterad mönkning3(Figur 1). Laserassisterad mönstrar anses ge mer pålitliga resultat när det gäller protein och PEG stabilitet och cell inneslutning på mönstren, jämfört med microcontact utskrift20. En mer ny metod för mikro-Patterning beskrivs här är användningen av Ljusinducerad molekylär adsorption av proteiner21(LIMAP,Figur 1 D) med ett kommersiellt tillgängligt system (PRIMO,Tabell över material). Var och en av metoderna har fördelar och begränsningar som kortfattat beskrivs nedan. Microcontact utskrift använder PDMS formar (frimärken) med önskade mikro-funktioner som genereras från litograferad plåt Masters. Stämplarna inkuberas med ett utvalt protein som sedan överförs (stämplas) på cell odlingssubstrat18(Figur 1 A). Laserassisterad mönkning använder UV-ljus för att klyva en antifoulingfilm22,23,24,25, utsätta regioner som senare kan beläggas med proteinet av intresse (Figur 1 B). Medan den upplösning som uppnås med foto-mönkning närmar sig är i micron Range25,26, de flesta av dessa tekniker kräver en foto-mask, antingen i kontakt med provet, eller ligger i objekt planet av mikroskopet mål23,27,28. Kraven för masker i både microcontact utskrift och foto-mönster kan vara en begränsning; specifika masker krävs för varje geometriskt mönster och storlek, vilket kan vara dyrt och tidskrävande att generera. I motsats till dessa tekniker, LIMAP kräver inte en mask (Figur 1 D). Att använda PRIMO-systemet för LIMAP kan vara kostnadskrävande i början eftersom det kräver inköp av utrustning. Dock används programvara med öppen källkod för att designa mönster av önskad geometri, vilket ger mycket mer frihet och möjliggör mer komplexa experiment, inklusive användning av proteinkoncentrationsgradienter. PRIMO laser styrs och leds av en digitalt kontrollerad Micromirror Device-enhet (DMD) för att skapa mönster i valfritt antal användardefinierade geometrier. LIMAP kräver att odlingsytan är belagd med molekyler som förhindrar cell infästning. Polyetylenglykol (PEG) används oftast som en sådan "antifouling" reagens; den bildar en tät anti-lim film på glas eller plast yta29. Därefter en Photo-initiativtagare läggs som gör att PEG filmen tas bort med hög precision genom en fotoscission mekanism30genom lokal exponering för UV-ljus under kontroll av DMD. Dessa PEG-fria regioner kan beläggas med proteiner som adsorberas till den laseretsade ytan, vilket genererar ett mikro-mönster. Genom att variera lasereffekten kan olika kvantiteter av PEG avlägsnas från ytan så att användaren får möjlighet att generera proteingradienter. PEG-borttagning och beläggnings proceduren kan upprepas för att skapa mönster med två eller flera distinkta proteiner i samma mikro-och21. De genererade mikro-mönster ger lim ytor för celler, vilket gör att studera cell beteende. I våra studier använder vi mikro-Patterning för att studera neurit eller Axon pathfinding av en neuronala cellinjer (CAD (Cathecholaminergic-a differentierade) celler31) eller primära råttor dorsala-root ganglion (DRG) neuroner, respektive. Här skisserar vi ett steg-för-steg-protokoll för LIMAP (Figur 2) med hjälp av det kommersiellt tillgängliga PRIMO-systemet och medföljande Leonardo-programvara. Vi visar hur det kan användas för generering av mönster med definierade geometrier och multipla proteiner, som vi använder för att studera axonal pathfinding. Vi diskuterar vanliga frågor som kan uppstå och hur dessa kan undvikas.
Protocol
1. utformning av mönstermallar
Obs: mallar för mönster genereras med digital ritprogram (tabell över material). Ritning i olika grå nivåer kommer att avgöra laser intensiteter. Använda programvara för att designa mönster mallar möjliggör snabb generering av mönster med önskad geometri och gradienter (figur 3).
- Rita den önskade mönster mal len digitalt med ritprogrammet. Välj en bildstorlek på 1824 pixlar längd och 1140 pixlar bredd (som i denna studie motsvarar 415 μm längd och 260 μm bredd). Spara mönster mal len som en 8-bitars TIFF-fil.
Anmärkning: ett steg-för-steg-protokoll för att generera mallar är tillgänglig på begäran till varumärket som kommersialiserar mikro-Patterning utrustning (tabell över material).
2. plasma rengöring
Obs: optimala resultat kräver plasma rengöring av ytorna före mönkning, vilket tar bort allt organiskt material och aktiverar ytan. I föreliggande fall räcker omgivningsluften för att aktivera ytan. En plasma renare (tabell över material) användes med ett processtryck på 1000-1300 mtorr och en effekt på 29,6 W för 1-5 min.
- Använd glasbotten skålen/es med en 20 mm inre brunn storlek och glastjocklek av 0.16-0.19 mm. För att testa flera villkor, Använd en 6-brunn glasbotten skålen. Annars, Använd en enda brunn glasbotten skålen (tabell över material).
Anmärkning: ett steg-för-steg-protokoll för plasma rengöring finns tillgängligt på begäran till varumärket som kommersialiserar plasma rengöringsutrustning (tabell över material).
3. passivering
Anmärkning: detta steg genererar en botten film som förhindrar proteinadsorption till glasytan. PEG erbjuder hög motståndskraft mot proteinadsorption29 som ett antifoulingmedel. LIMAP använder en fotoinitierare för att lokalt ta bort PEG genom UV-fotoscission. Proteinet/s av intresse kommer sedan att adsorberas till dessa PEG-fria ytor21, genererar mikro-mönster.
- Passivering med PLL-PEG
- Under sterila förhållanden, klippa PDMS stenciler (se figur 4A, B och tabell över material) för att säkerställa att de passar i den inre glasbotten väl, och ta bort den inre mikro-och fyllningar med sterila pinpett. Stick stenciler på glaset väl med hjälp av pinps.
- Se till att stencilerna sticka tätt på glaset väl, förhindra bildandet av luftbubblor som kan orsaka läckage under passivering processen.
Obs: PDMS schabloner kan också tillverkas i egen hand med hjälp av publicerade protokoll18,32. - Förbered PLL-PEG lösning (tabell över material, 0,1 mg/ml) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt 20 μL PLL-PEG-lösning till varje mikro-brunn och inkubera vid rumstemperatur, för 1 h.
- Ta bort 15 μL PLL-PEG från mikrobrunnarna och tvätta dem fem gånger med 20 μL PBS (tabell över material) utan att låta dem torka.
Obs: lämna alltid cirka 5 μL PBS mellan tvättedelar. Med tanke på deras ringa volym är mikrobrunnarna särskilt mottagliga för torkning. Torkning kommer att resultera i mikro-mönster av dålig kvalitet. - Antingen hålla kultur skålen i PBS (3 mL per brunn) vid 4 ° c i upp till 3 dagar eller fortsätta med nästa steg (steg 3.1.5).
- Ta bort 18 μL PBS från en enda mikro-brunn (t. ex. den övre vänstra mikro-brunnen, se figur 4D), tillsätt 5 μl FOTOINITIERARE (plpp, tabell över material) och lämna 20 μl PBS i de återstående mikrobrunnarna. Denna Micro-well med PLPP kommer att användas för att skapa ett referensmönster (se figur 4D, E) under system kalibrerings steget (steg 4). Håll PLPP skyddat från ljus.
- Passivering med långvarig PEG-SVA
Anmärkning: för att generera den anti-lim yta man kan använda: 1) en PEG kopplad till Poly-L-lysin (PLL-PEG, steg 3,1) eller 2) en PEG-succinate N-hydroxisuccinimide (PEG-SVA). Beslutet att välja ett eller ett annat alternativ för passivering beror på lagringsalternativen (se steg 10). Kultur rätter som inkuberas med PEG-SVA kräver dubbelt så mycket passivering och photopatterning tid.- Förbered stenciler enligt beskrivningen i steg 3.1.1.
- Tillsätt 20 μL av 0,01% Poly-L-lysin (PLL, tabell av material) till varje mikro-brunn och inkubera i rumstemperatur under 30 min till pre-Coat med PLL.
- Ta bort 15 μL PLL från mikrobrunnarna och tvätta dem tre gånger med 20 μL 1 M HEPES-buffert (tabell över material) utan att låta brunnarna torka ut.
Obs: lämna alltid cirka 5 μL av HEPES eller PBS mellan tvättar. Med tanke på deras ringa volym är mikrobrunnarna särskilt mottagliga för torkning. Torkning kommer att resultera i mikro-mönster av dålig kvalitet. - Förbered PEG-SVA-lösning. PEG-SVA lösning (50 mg/mL i HEPES buffert 1M) bör förberedas färskt varje gång omedelbart före användning. Bered 20 μL PEG-SVA per mikro-brunn.
- HEPES buffert måste ha ett pH mellan 8-8.5. Testa HEPES pH innan du förbereder PEG-SVA-lösningen med pH-papper. Väga PEG-SVA i ett centrifugerör med en precisions skala. Tillsätt HEPES buffert och Vortex 30 s tills upplöst. PEG-SVA är helt upplöst när lösningen är transparent.
Anmärkning: SVA är Ester som tillåter bindning av PEG till den tidigare belagda PLL. När HEPES buffert läggs till PEG-SVA, SVA har en halveringstid på 15 min och bör användas omedelbart. - Tillsätt 20 μL PEG-SVA-lösning till varje mikro-brunn och inkubera vid rumstemperatur, under 1 h. ta bort 15 μL PEG-SVA från mikrobrunnarna och tvätta fem gånger med 20 μL PBS (tabell över material) utan att låta brunnarna torka ut.
- Antingen förbereda kultur skålen för långtidslagring (upp till 1 månad, se steg 10,2) eller gå vidare till nästa steg (steg 3.2.8).
- Ta bort 18 μL PBS från en mikro-brunn (t. ex. den övre vänstra mikro-brunnen, se figur 4D), tillsätt 5 μl plpp (tabell över material) och lämna 20 μl PBS i de återstående mikrobrunnarna. Denna Micro-well kommer att användas för att skapa ett referensmönster (se fi Gure 4D, E). Se till att PLPP är homogen på hela ytan av mikro-brunn. Håll PLPP skyddat från ljus.
4. system kalibrering
Obs: i dessa steg kommer laser fokus att anpassas till den särskilda typen av kultur rätt (steg 4,1). Ett referensmönster kommer att genereras i endast en mikro-brunn (steg 4,2) följt av inkubation med en proteinlösning (steg 4,3) för att säkerställa optimala fokus förhållanden av lasern (steg 4,4), krävs för att få skarpa och definierade mönster.
- Laser kalibrering
Obs: under kalibreringsprocessen kommer en kalibrerings laser bild att projiceras på en fluorescerande-markerad glasyta (kalibrerings brunn, märkt med en fluorescerande highlighter, figur 4C), som måste placeras i fokus på Mikroskop.- Använd en fluorescerande highlighter (tabell över material) för att markera ett tomt innerglas väl.
Anmärkning: kalibrerings brunnen måste ha samma glas tjocklek (0,16-0,19 mm) som den kultur maträtt på vilken mikro-mönster kommer att genereras. Om en 6-brunn glasbotten skålen används, en tom brunn kan användas för kalibrering och bör märkas med fluorescerande highlighter under sterila förhållanden. - Slå på mikroskopet, scenen och datorn. Slå på PRIMO Micro-Patterning Equipment, Open Micro-Manager och Leonardo Software. Leonardo programvara drivs via Micro-Manager under plugins. Kontrollera märken/katalognummer av utrustning och programvara i tabell över material.
- Välj kalibrerai den ursprungliga menyn i Leonardo. Kontrollera att den särskilda PRIMO-filterkuben är i rätt läge (optisk bana) i filterrevolvern. Välj 20X mål (0,75 DIC S plan fluor, ingen fas ring) både på Mikroskop och på Leonardo programvara.
Anmärkning: detta protokoll är justerat till Leonardo version 4,4. Protokollet kan behöva justeras för andra versioner. - Placera den tidigare markerade kalibrerings brunnen (figur 4C) ovanför målet. Välj kamera Sök väg. Justera mål skärpan tills laserprojektionen av både Primo -logotypen och Tagglinjen tar hand om dina celler är i fokus.
- Lämna standard kamerans exponeringstid på 25 MS. Justera laserintensiteten för att se bokstaven jag från Primo logo projektion i grå färg och resten av bokstäverna i vitt.
- Anteckna fokalplanets Z-position (höjden på målet till provet) som senare kallas Z-position för kalibrering. Detta kommer att vara en approximation av det optimala fokus som erhålls efter referensmönstret generation (se steg 4.2-4.4).
- Använd en fluorescerande highlighter (tabell över material) för att markera ett tomt innerglas väl.
- Referensmönster
- Placera kultur skålen med mikro-väl som innehåller Photo-initiativtagaren (referensmönster mikro-brunn, figur 4D) ovanför målet och välj mönster nu i Leonardo programvaran.
- Visualisera kanten av mikro-väl med genomlysning genom kameran och välj ROI-symbolen från den högra menyn. Ställ in diametern på ROI-cirkeln till 4000 μm och rikta in kanten på den digitala avkastningen med kanten av den nuvarande mikro-brunnen.
- Se till att det finns en korrekt överlappning mellan den digitala avkastningen och den nuvarande mikro-väl genom att flytta scenen runt kanterna på mikro-väl. ROI-positionen kommer att kopplas till scen rörelserna.
- Välj Lås i Leonardo programvara för att låsa ROI i önskad position. Stäng av det överförda ljuset.
- Välj Primo för att ladda upp den önskade mönster mal len, som kommer att PROJICERAS på ROI som en konstruktionsenhet (se figur 5). Mönster visas i en nedrullningsbar lista som kallas åtgärder och visas i menyn åtgärder på programvaran.
Anmärkning: mönstermallar måste utformas tidigare (se steg 1) och sparas som en 8-bitars TIFF-fil innan du läser in mallen i programvaran. - Endast ett litet mönster behövs för referensmönstret; till exempel 3 rader, 1 kolumn (se figur 4E och figur 5B). I menyn replikering anger du önskat antal kolumner och rader (rader i Leonardo-program). Klicka på Uppdatera för att se en digital förhandsgranskning av mönsterdesignen.
- Ställ in laser dosen i menyn replikering . Den optimala laser dosen i denna inställning och med PLL-PEG är 1390 mJ/mm2.
Obs: laser effekten kan variera mellan 5-7.5 mW/mm2. I detta fall är det 7,5 mW/mm2, som tar cirka 30 s att mönstra varje konstruktionsenhet, med hjälp av en laser dos av 1390 MJ/mm2. Högre laser doser kan krävas om kultur skålen ytan är passive rad med PEG-sva (ungefär dubbel laser dos jämfört med PLL-PEG). Detta måste testas i förväg. - Navigera till en perifer region av mikro-brunn, (till exempel, övre delen) bort från den viktigaste regionen av intresse för mönster generationen (Central Region) av mikro-brunn (se figur 4E) och välj Lås. Vänta tills mönstret visas.
- Justera fokus till Z-positionen för kalibrering (se steg 4.1.6).
Obs: det rekommenderas att göra en ytterligare system kalibrering steg om en annan användare använder samma Mikroskop mellan photopatterning rundor. - Välj symbolen spela upp för att börja mönjande. Kontrollera att lasern är påslagen i programvaran. Vänta tills mönster processen är klar. Mönjande varaktighet visas i den uppskattade tids panelen. På Leonardo programversion 4,4 är mönstret slutförd när alla åtgärder visas blått i visualiserings menyn.
- Proteininkubering på referensmönstret
- Under sterila förhållanden, tvätta referensmönstret mikro-väl tre gånger med 20 μL PBS för att ta bort PLPP.
- Tillsätt 20 μl Fluorescent-märkt ECM-protein (10 μg/ml laminin, Fibronektin eller fibrinogen i PBS, se tabell över material och steg 6) till referensmönstret Micro-well. Inkubera i rumstemperatur under 10-20 min (beroende på proteinet) skyddat från ljus (Linda skålen i aluminiumfolie).
- Efter inkubering, ta bort 18 μL proteinlösning och tvätta tre gånger med 20 μL PBS. Förvara mikrobrunnarna som inte används för att skapa ett referensmönster (se figur 4D, E) i 20 μl PBS.
- Visualisering och inställning av optimalt laser fokus
- Visualisera referensmönstret med hjälp av ett epifluorescensmikroskopi Mikroskop, 20x objektiv och lämplig programvara (Kontrollera programvara som används i denna studie i tabell över material). Referensmönstret ska vara synligt i den perifera regionen (t. ex. den övre brunnen regionen), där referensmönstret genererades (se figur 4E).
- Justera fokus på mönster kanterna genom kamerans sökväg. Spela in Z-positionen enligt det bästa fokus på referensmönstret. Denna justerade Z-position kommer att vara den optimala laser fokus som används för efterföljande möntring.
5. programvara set-up och photopatterning
Anmärkning: När kalibreringen av systemet har uppnåtts (steg 4), kommer användaren att ladda upp de önskade mönstermallarna (mallkonfiguration, figur 5) för photopatterning, med möjlighet att generera mönster för ett eller flera proteiner i varje mikro-brunn. Mikro-mönjande förlopp involverar photopatterning och proteinet inkubation stammen (se bild 2).
- Under sterila förhållanden, ta bort 18 μL av PBS från alla mikro-brunnar och tillsätt 5 μL PLPP till varje mikro-brunn. Se till att PLPP är homogen på Mikrobrunnarnas hela yta.
- Placera kultur skålen med referensmönstret Micro-well (figur 4D, E) ovanför målet och välj mönster nu i Leonardo programvaran.
- Visualisera mikro-väl med genomlysnings ljus genom kamerans väg och välj ROI-symbolen. Ställ in diametern på ROI till 4 000 μm och överlappa kanten av den digitala avkastningen till kanten av den nuvarande mikro-brunn. Välj Lås.
Obs: formen och diametern på ROI beror på utformningen och storleken på PDMS stencil som används. Till exempel, om du använder 5 000 x 5 000 μm PDMS kvadrat stenciler, Använd en 5 000 x 5 000 μm kvadrat ROI. - Upprepa det överlappande steget (steg 5,3) för varje mikro-brunn på skålen. När du är klar stänger du av det överförda ljuset.
- Navigera till mitten av referensmönstret Micro-well, bort från referensmönstret regionen och välj Primo att ladda upp önskad mönster mall, som kommer att PROJICERAS på ROI som en design enhet (se figur 5). Mönster visas i en nedrullningsbar lista som kallas åtgärder och visas i menyn åtgärder på programvaran.
Observera: mönstermallar måste utformas före experimentet och sparas som en 8-bitars TIFF-fil innan mallen läses in i programvaran. - För att skapa ett mönster över hela mikro-och design enheten måste replikeras. En konstruktionsenhet täcker runt 0,1 mm2 av mikro-brunn området. I menyn replikering anger du önskat antal kolumner och rader (rader i programvaran) (se figur 5).
- Om du vill skapa ett kontinuerligt mönster justerar du avståndet mellan kolumner och linjer. i denna studie erhålls mönster av kontinuerliga ränder med-20 till-35 μm mellanrum (negativt mellanrum) mellan kolumnerna. Det negativa avståndet skapar en överlappning mellan design enheterna (figur 5B, C).
- Ställ in laser dosen i menyn replikering . Den optimala laser dosen i denna inställning och med PLL-PEG är 1390 mJ/mm2. Mönjande varaktigheten visas i den uppskattade tids panelen.
Anmärkning: i detta fall lasereffekt är 7,5 mW/mm2, tar cirka 30 s att mönstret varje design enhet, med en dos av 1390 MJ/mm2. Till exempel, en konstruktionsenhet (0,1 mm2) replikeras i 4 kolumner och 4 rader (ca 1,6 mm2), skulle ta 8 min att vara mönstrad. Högre laser doser kan krävas om kultur skålen ytan är passive rad med PEG-sva (ungefär dubbel laser dos jämfört med PLL-PEG). - Välj Lås och vänta tills mönstret visas i stort sett.
- Om du vill uppdatera parametrarna för ett mönster klickar du på relaterad åtgärdoch låser sedan upp och uppdaterar parametrarna. Välj Lås igen när mönster uppdateringen har slutförts.
- Mönstret av flera proteiner i samma mikro-brunn (sekventiella mikro-mönstrar rundor) kräver en noggrann anpassning av mönstren. För att uppnå sådan anpassning, ladda upp alla uppsättningar av önskade mönster mallar samtidigt (mönster av första och andra photopatterning rundor).
- Ange replikens och dos parametrarna för mönstermallarna. När parametrar har angetts visas mönster som åtgärder i listan åtgärder . Spara den här mallkonfigurationen som en fil i programvaran (se figur 5D).
- I listan åtgärder väljer du endast de specifika åtgärder som ska mönstra under den första mönster rundan och avmarkerar de åtgärder som kommer att mönstra under den andra mönster rundan (se figur 5D).
- Navigera till det område där referensmönstret producerades i steg 4,2 (t. ex. den översta regionen i referensmönstret mikro-brunn, se figur 4E). Justera fokus till den optimala Z-positionen (erhålls i steg 4,4).
Obs: det rekommenderas starkt att välja perfekt fokus system på Mikroskop som används (om tillgängligt), vilket säkerställer att den optimala Z-position för mönkning kommer att upprätthållas under hela photopatterning processen. - Välj symbolen spela upp för att börja mönjande. Mönjande varaktighet visas i den uppskattade tids panelen. På Leonardo programversion 4,4 är mönstret slutförd när alla åtgärder visas blått i visualiserings menyn.
6. proteininkubering
Anmärkning: mikrobrunnar inkuberas med ECM-proteiner (helst fluorescerande-märkta). Dessa kommer endast att binda till de områden där PEG var klyvs genom photopatterning process som beskrivs i steg 5. Varje brunn innehåller en PDMS stencil med 4 mikro-brunnar, vilket gör det möjligt att testa 4 olika förhållanden samtidigt, till exempel, inkubering av ett annat protein i varje mikro-brunn (se figur 4D).
- Använd fluorescently-märkta proteiner (t. ex. laminin, Fibronektin eller fibrinogen konjugerat med röda eller gröna fluoroforer) för att visualisera mikromönstren (se steg 6,7 och 9,4). Alternativt kan adsorberade omärkta proteiner visualiseras i senare stadier med hjälp av immunofluorescens.
Anmärkning: ECM-proteiner (till exempel fibronectin) kan märkas med hjälp av befintliga protokoll33 och kommersiellt tillgängliga fluorescens-märksatser (dvs. Alexa 488-märkningssats), eller köpta lätt märkta (t. ex. konjugerat fibrinogen-488 eller laminin-röd fluorescerande rhodamine, se tabell över material). - Bered önskad koncentration av ECM-proteiner (10 μg/ml laminin, Fibronektin eller fibrinogen i PBS, se tabell över material och steg 4,3) under sterila förhållanden.
Anmärkning: Fluorescently-märkta ECM proteiner är ljuskänsliga och bör skyddas från ljus (wrap skålen i aluminiumfolie) och bör hållas på is hela tiden. - Under sterila förhållanden, tvätta mikrobrunnarna tre gånger med 20 μL PBS för att ta bort PLPP.
- Ta bort 18 μL PBS från alla mikrobrunnar och tillsätt 20 μL ECM-proteinlösning till varje mikro-brunn. Inkubera i rumstemperatur, för 20-30 min och skydda mot ljus.
Obs: optimala beläggnings tider kan variera beroende på proteiners typ och koncentration. - Efter inkubering, ta bort 15 μL ECM-proteinlösning och tvätta mikrobrunnarna tre gånger med 20 μL PBS.
Obs: lämna alltid cirka 5 μL PBS mellan tvättedelar. - Om mönster med endast ett protein (en runda av mikro-mönkning), Fortsätt antingen till lagring av kultur skålen (steg 10) eller till cellplätering (steg 11, och se figur 2). Om du utför en andra omgång mikromönster med ett annat protein i samma mikro-brunn, Fortsätt antingen till lagring av odlings skålen (steg 10) eller till att blockera ospecifika bindningsställen (steg 7, och se figur 2).
- Valfritt kvalitetskontroll steg: visualisera och bild utskrivna mönster med hjälp av ett epifluorescensmikroskop före pläteringscellerna. Välj lämpliga Lysrörs kanaler och justera exponeringstider därefter.
Anm: för att jämföra fluorescensintensiteten mellan experiment är det viktigt att använda samma exponeringstider för samma proteiner.
7. blockering av ospecifika bindnings platser (endast för multipla protein mönster)
Anmärkning: mikromönsterning med flera proteiner i samma mikro-brunn involverar sekventiella mönster steg (se figur 2). Ett blockerande medel (PLL-PEG eller BSA) tillsätts till mikrobrunnarna för att förhindra kors bindning, vilket inträffar när det andra inkuberade proteinet (steg 9) binder till det första ruvade proteinet (steg 6), vilket undviker en blandning av proteiner inom mönstren.
- Under sterila förhållanden, tillsätt 20 μL PLL-PEG (0,1 mg/mL i PBS) eller BSA (1% BSA i PBS) som ett blockerande steg för att förhindra tvärbindning.
Obs: Blockeringseffektiviteten kan variera beroende på vilken typ av proteiner som används och tillhörigheten bland dem. Det rekommenderas att man i förväg testar både PLL-PEG och BSA som blockerande medel (figur 10D-I). - Inkubera blockerande medel vid rumstemperatur i 1 h och skydda mot ljus. Ta bort 15 μL blockerande medel och tvätta alla mikrobrunnar tre gånger med 20 μL PBS. Lämna alltid cirka 5 μL PBS mellan tvättedelar.
- Ta bort 18 μL PBS från alla mikrobrunnar och tillsätt 5 μL PLPP till varje mikro-brunn och se till att PLPP är homogen på Mikrobrunnarnas hela yta.
8. andra omgången av photopatterning (endast för flera protein mönster)
Anmärkning: efter den första omgången av photopatterning och protein inkubation, genereras ett mikro-mönster. Under den andra omgången av photopatterning kommer mönstret för det andra proteinet att genereras i samma mikro-brunn (se figur 2C och figur 5D). I programvaran väljer du rätt mönstermallar (åtgärder), som kommer att mönstra under denna runda (se figur 5D).
- Navigera till den första mikro-brunnen (figur 4D). Se till att det finns lämplig överlappning mellan den digitala avkastningen och mikro-brunnen.
- Läs in den mallkonfiguration som sparats tidigare (steg 5,12) och välj de åtgärder som ska mönstra under den andra photopatterning Round (avmarkera åtgärder från första omgången, se figur 5D).
- Välj symbolen spela upp för att börja mönjande. Kontrollera att lasern är påslagen i programvaran.
9. andra omgången av proteininkubation (endast för flera protein mönster)
Anmärkning: i denna del av protokollet, Fluorescent-märkt protein/s kommer att inkuberas på kultur skålen efter den andra omgången av photopatterning.
- Under sterila förhållanden, tvätta mikro-väl tre gånger med 20 μL av PBS för att ta bort PLPP. Ta bort 18 μL PBS och tillsätt 20 μL ECM-proteinlösning till varje mikro-brunn. Inkubera vid rumstemperatur i 20-30 min och skydda mot ljus.
Obs: optimala beläggnings tider kan variera beroende på proteiners typ och koncentration. - Efter inkubering, ta bort 15 μL ECM-proteinlösning och tvätta mikrobrunnarna tre gånger med 20 μL PBS. Lämna alltid cirka 5 μL PBS mellan tvättedelar.
- Antingen gå till lagring av kultur skålen (steg 10) eller till cellplätering (steg 11, och se figur 2).
- Valfritt kvalitetskontroll steg: med hjälp av ett epifluorescensmikroskop, visualisera och bild tryckta mönster före bordläggningen celler. Välj lämpliga Lysrörs kanaler och justera exponeringstiden.
Anm: för att jämföra fluorescensintensiteten mellan experiment är det viktigt att använda samma exponeringstider för samma proteiner.
10. lagring av mikro-mönster
Anmärkning: Mikromönster med adsorberade proteiner kan lagras under olika steg i protokollet (se figur 2). Om mikromönstrar med flera proteiner kan mikromönstren lagras efter den första omgången av mikromönster eller efter det att de två sekventiella rundorna av mikromönsterna har slutförts (se figur 2B).
- När du har passiverats med PLL-PEG, förvara mikromönstren i PBS (3 mL per brunn) vid 4 ° c i upp till 3 dagar.
- Om kultur skålen var passive rad med PEG-SVA, mikro-mönster kan lagras i upp till 1 månad. För att göra detta, skölj mikro-mönster intensivt med dubbeldestillerat avjoniserat vatten och torka med en steril luftpistol av argon eller kväve, även om normal luft kan också användas. Efter torkning kan mikro-mönster förvaras vid 4 ° c i upp till 1 månad (PRIMO system support team, personlig kommunikation).
11. pläteringsceller
ANMÄRKNINGAR: under de kommande stegen kommer cellerna att pläteras på den förberedda mikromönstrade kultur skålen/es. I dessa studier används en neuronala cell linje (CAD-celler)31. Men detta protokoll kan justeras för att studera andra celltyper av intresse (justera cell plätering protokoll som krävs).
- Skilj CAD-celler för 48 h med differentiering medium (DMEM kompletteras med 1% glutamin, utan serum, och med 1% penna/STREP, se tabell över material).
- Platta 1 mL medium med celler i det inre glaset väl, som täcker alla mikro-brunnar och placera kultur skålen i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator.
Representative Results
Efter ovanstående protokoll resulterar i mikromönstrade ytor, belagda med ECM-protein/s av intresse. Vi använder dessa mönster för att spåra neuronala pathfinding.
Genererade mönster bör vara en exakt representation av mallen. Ett exempel visas i figur 6 , där en digital Mönstermall (figur 6a) som representerar en konstruktionsenhet (figur 5B), resulterade i definierade mikromönster, från 20 till 2 μm bredd, belagda med märkta Fibrinogen (figur 6B). Med imagej har mätningar av fluorescensintensitet erhållits både vertikalt (figur 6C) och horisontellt (figur 6E) längs strecket och från en motsvarande bakgrunds region 15 μm över varje rand. Bakgrundsmätningarna subtrafördes från mönster måtten för varje stripe-bredd.
En begränsning av systemet är att en kant effekt kan observeras (figur 6B, topp Rand) när utskriftsfunktioner ≥ 20 μm, med en högre intensitet signal vid mönstret kanter jämfört med centrum (figur 6D, första toppen av fluorescerande profil). I våra experiment var lösnings gränsen cirka 2 μm; vid denna bredd observerade vi en signifikant minskning (med cirka 50%) i fibrinogenfluorescensintensitet jämfört med intensiteten hos de bredare ränderna (figur 6F, G). Mönstrar med hjälp av PRIMO-systemet och det protokoll som beskrivs här har producerat reproducerbara mönster, med den högsta standardavvikelsen för den genomsnittliga fluorescerande intensiteten mätt för bredden på 2 μm från fyra enskilda replikerade konstruktionsenheter (figur 6 G). variation inom de mönstrade ränderna konstaterades också vara låg; variationskoefficienten varierade mellan 3 och 10%, med de ränder på 20 μm och 2 μm som har den största inre variationen. Detta är sannolikt ett resultat av Edge-effekten och systemets upplösning, respektive. Observera att för dessa mätningar mätte vi bara intensiteten i mitten av ränderna, för att undvika ojämn belysning till följd av det mål som används för att förvärva dessa bilder (vinjettering, figur 6E).
Vissa experiment kan omfatta frågor som kräver definierade proteinkoncentrationer, som kan uppnås på två sätt: 1) varierande protein koncentrationen (figur 7A, B). Inkubering med olika koncentrationer av laminin resulterar i signifikant olika fluorescensintensiteter, vilket ökar med högre proteinkoncentrationer (figur 7B). 2) den laser dos som används för att klyva den anti-adhesiva filmen (PEG) kan varieras. Högre laser doser kommer att ta bort botten filmen i större utsträckning, genererar mer bindningsställen för proteiner av intresse (figur 7C, D) vilket resulterar i betydligt olika fluorescens intensiteter, ökar med högre laser doser (figur 7D).
Varierande laser dos möjliggör generering av proteingradienter inom samma mönster. Detta visas i figur 8a, där en övertoningsmall har utformats med olika gråskalenivåer, från svart (ingen lasereffekt) till vit (maximal lasereffekt).
Laserintensiteten är proportionell mot den grå Skale nivån i mallen (från 0 till 255 i en 8-bitars bild), vilket genererar övertoningar av UV-belysning. Mätningen av fluorescensintensitetsprofilen längs övertoningsstrecket är linjär i mönster mal len (figur 8B) och i det genererade övertoningsmönstret (figur 8C, D). Detta är reproducerbart bland alla övertoningsränder inom samma mall och övertoningsmönster (figur 8B, D). Generering av sådana gradienter är mycket användbar och hjälper till att efterlikna in vivo miljöer där celler ofta reagerar på gradienter av bioaktiva proteiner34,35,36,37.
Celler Sense föränderliga extracellulära miljöer men analyser som gör det möjligt att studera cellens beteende när celler stöter på sådana förändringar är begränsade. LIMAP kan användas för att mikro-mönster med flera proteiner i samma mikro-brunn. Exempel visas i figur 9 där korsmönster genererades med remsor av Fibronektin (horisontell) och laminin (vertikal). När du skapar mönster med flera proteiner, är det viktigt att använda ett blockerande steg mellan den första och andra proteininkubationen, för att förhindra kors bindning av proteiner (se steg 7). Blockeringseffektiviteten kan variera beroende på de biokemiska egenskaperna hos de proteiner som används för beläggning och vi rekommenderar att man testar flera blockeringsbuffertar inklusive PLL-PEG (0,1 mg/mL) och BSA (1%). För att utvärdera denna tvär bindnings effekt utförde vi mätningar av fluorescensintensitet med imagej (figur 9) och vi visade att tvärbindningen kan reduceras dramatiskt med hjälp av PLL-PEG-buffert (0,1 mg/ml) för Fibronektin och laminin korsmönster (figur 9D, H).
De genererade Cross-patterns användes för cellulära analyser med CAD-celler (figur 10A, B) eller råtta dorsal-root ganglion (DRG) nervceller (figur 10C). Deras neuriter (CAD) och axoner (DRG) växer längs olika linjer. CAD-celler används som en neuronala modell eftersom de visar en liknande integrin uttrycks profil jämfört med primära nervceller och de fortfarande visar Actin-Rich tillväxt koner efter 48 h i kulturen (figur 10B), vilket gör dem lämpliga för pathfinding Studier.
För att undersöka de möjliga cytotoxiska effekterna av de genererade mikro-mönster mot primära nervceller, var DRG neuroner isolerade och odlade på mikro-mönster efter ett tidigare publicerat protokoll38. Resultaten visar att primära nervceller tolererar mikro-mönster miljö (figur 10C). Vi studerar för närvarande hur en mängd olika ECM-proteiner påverkar axonal (neurite) pathfinding. Preliminära bevis på begrepp som finns i CAD-celler kommer att undersökas ytterligare med hjälp av DRG nervceller. För att validera kvaliteten på genererade mikro-mönster, är det önskvärt att bilden mönster av fluorescens mikroskopi för att säkerställa mönstret kanterna är väl definierade innan du fortsätter till cellplätering. Under avbildningsprocessen är det viktigt att säkerställa den optiska justeringen mellan mikroskopet och kameran för att undvika den perifera mörknande effekten (vinjettering) som påverkar den bakre analysen och tolkningen av data. Dessutom förvärva en bild av en mönster fri region med samma exponeringstider som kommer att användas för att avbilda mönster och subtrahera den här bilden från mönstret bilden.
Sammanfattnings, för god kvalitet mikro-mönster generation, är det tillrådligt att bedöma protein koncentrationen (figur 7A, B), laser doser (figur 7C, D), protein bakgrundsnivåer (figur 6E, F, H) och en effektivt blockerande steg (figur 9) vid användning av multipla proteiner. Slutgiltigt, är kvaliteten på mikro-mönster som genereras med LIMAP viktigt för att få tillförlitliga och reproducerbara data från cellulära analyser.
Figur 1: schema för mikro-möntring tekniker: microcontact utskrift och laserassisterad mönkning. (A) microcontact utskrift använder en litograferad Master med definierade mikro-funktioner för att generera en PDMS stämpel som inkuberas med proteinet av intresse. Detta protein överförs sedan (stämplas) på en glasyta, genererar protein mikro-mönster. (B) laserassisterad möntring tekniker inkluderar photopatterning och direkt laser mönkning. (C) de flesta foto mönster använder en UV-ljuskällan och en photomasken (antingen i kontakt med substrat ytan eller i mål fokalplanet) med önskade geometrier för att klyva pinnens antifoulingyta i specifika positioner, skapa ett definierat mönster. En efterföljande proteininkubations steg resulterar i proteinadsorption endast till laser-cleaved regioner. (D) limap är en foto mönster teknik som inte kräver en fodask i kontakt med underlaget (dvs. en maskless och kontaktlös metod). LIMAP använder en foto-initiativtagare, som aktiveras av låga doser av en laser, klyva ljus exponerade regioner av PEG. Detta skapar bilage platser för sekventiell proteinadsorption. (E) direkt lasermöntring använder hög energi ljus för att direkt ETSADE PEG-filmen, vilket möjliggör proteinbindning i de eched regionerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: schema som visar en sammanfattning av stegen i protokollet för mikromönkning. (A) mikromönsterning med ett protein innebär endast en runda av mikromönsterning (photopatterning och proteininkubation) och kan utföras på under 8 h. (B) mikromönster med multipla proteiner kräver två sekventiella rundor av Micro-Patterning och kan slutföras i 1-2 dagar, beroende på antalet mikro-mönster som förbereds. Det är möjligt att gå igenom B-versionen av protokollet i 1 dag av arbete. Kontinuerliga pilar indikerar direktflöde av steg i protokollet. Diskontinuerliga pilar indikerar att det finns en betydande tidslucka mellan ett steg och det andra (se steg 6,6 och 9,3). (C) Schematisk bild av exempel mönster som erhållits efter en runda av mikromönstrar (röda ränder) eller två sekventiella rundor av mikromönster (röda och gröna ränder). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mönster mal len generation är mångsidig med LIMAP. (a, B) Exempel på mönstermallar designade med ImageJ (A armborst, B-bokstäver). Former ritade i vitt projiceras vid maximal lasereffekt och former ritade i svart projiceras inte. (C, D) Mikromönster erhållna med LIMAP från mallar efter inkubering med 10 μg/mL fibrinogen (grön). (C) armborst är 50 μm bredd och 50 μm höjd fördelade på 75 μm horisontellt och 50 μm vertikalt. (D) bokstäverna är 80 μm bredd och 85 μm höjd. Skalstreck i C och D motsvarar 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: väsentliga material för LIMAP-protokollet. A) de schabloner som används i detta protokoll är 20 mm i diameter, tunna CIRKELFORMADE PDMS-stycken (250 μm tjocklek) som innehåller 4 mikrobrunnar (vardera 4 mm). De volymer som används i mikrobrunnarna sträcker sig från 5 till 20 μL, vilket avsevärt minskar mängden reagenser och proteiner som behövs för varje experiment. (B) 6 väl glasbotten skålen där stenciler redan har placerats i varje brunn. Mikrobrunnarna innehåller 20 μL PBS för att göra dem synliga. Ckalibrerings maträtt där det inre glaset har märkts med en grön highlighter som används för att kalibrera laser skärpan. (D) Schematisk bild av övre vänstra brunnen från 6-brunnen glasbotten skålen i B (skisserat med streckad röd cirkel). Den inre glasbotten brunnen är representerad i vitt och stencilen visas i grått. Stencilen innehåller 4 mikrobrunnar (numrerade 1-4), för testning av 4 olika experimentella betingelser (t. ex. olika proteinkoncentrationer, mönster geometrier, kombinationer av proteiner, etc.). Asterisken representerar den mikrobrunn som innehåller referensmönstret. (E) Schematisk bild av mikro-brunn där ett referensmönster har genererats i den övre delen (pil med fylld pilspets). Detta referensmönster krävs för att få optimal laser fokus för mönstringen (se steg 4). Pil med Tom pilspets indikerar den centrala delen av mikro-brunnen, som kommer att användas för efterföljande mönkning efter system kalibrering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: programvara för mikromönkning. (A) mönstermall med parallella ränder utformade med imagej och sparas som en 8-bitars TIFF-fil. (B-D) Schematisk bild av digitala ROIs (regioner av intresse) som kommer att överlappa med de nuvarande mikro-brunnar där mikro-mönster kommer att genereras. (B) den mönster mall som ska användas (längd 1824 pixel = 415 μm, bredd 1140 pixel = 260 μm) väljs på Leonardo och PROJICERAS på ROI som en konstruktionsenhet (röda ränder i den svarta streckade rektangeln), som täcker cirka 0,1 mm2 av mikro-brunn område. Design enheten replikeras i 4 kolumner och 4 rader i replikeringmenyn (mallkonfiguration), vilket skapar ett mönster över mikro-brunnen. Anteckna utrymmet bland kolumnerna. (C) för att mönstra kontinuerliga ränder måste avståndet mellan kolumnerna justeras. I det här fallet för att uppnå en överlappning mellan designenheter anges avståndet mellan kolumnerna i menyn replikering som negativt avstånd,-20 μm. (D) för att mönstra flera proteiner i samma mikro-brunn, är en noggrann anpassning av mönstren Krävs. Under programvara set-up steg (steg 5), ladda upp alla önskade mönster mallar samtidigt. I listan åtgärder väljer du endast de specifika åtgärder som ska mönstra under varje mönster runda och avmarkerar resten av åtgärderna (steg 5,12, 5,13 och 8,2). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: analys av mönster variation med LIMAP. (A) mönster mall designad med imagej används för att mikro-mönster fyra ränder av varierande bredd (20, 10, 5, 2 μm, uppifrån och ned). B) mikromönster som erhållits efter inkubering med 10 μg/ml Fluorescent-märkt fibrinogen (grön). Cintensitetsmätningar längs en vertikal linje som korsar mikromönstrets ränder. Dden vertikala fluorescensintensitetsprofil som erhålls vid mätningen under C. Observera att vid större bredder (20 μm) finns det en variation i den vertikala profilen orsakad av ansamling av protein vid kanterna av strecket, vilket resulterar i två distinkta fluorescensintensitet toppar (kant effekt). Denna effekt syns endast i stripe-bredder ≥ 20 μm. (E) intensitetsmätningar längs de avbildade horisontella linjerna (fluorescens och bakgrund). F) profiler för horisontell fluorescensintensitet som erhålls från mätningar i (E). (G) diagram som visar Medelintensiteten för varje rand bredd, mätt från fyra enskilda replikerade konstruktionsenheter (variation mellan mönster). Notera den reducerade proteinadsorptionen till mönster med 2 μm rand bredd. (H) variationen inom de mönstrade ränderna (variationskoefficienten) var låg för alla rand bredder, från 3 till 10%. Data i G och H visas som medelvärde ± SD. statistisk analys i G och H utfördes med enkelriktad ANOVA (Kruskal-Wallis) icke-parametriska test med multipla jämförelser. P-värdet är < 0,001 för * * signifikans. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: effekten av variationer i lasereffekt och proteinkoncentration för proteinadsorptionseffektivitet. (A) PLL-PEG-ytan var laserklyvad med en konstant laser dos (1390 MJ/mm2) och inkuberades med de angivna koncentrationerna av Fluorescent-märkt laminin (magenta). Bkvantifiering av fluorescensintensiteten hos laminin-ränderna i a. Cde olika indikerade laser doserna applicerades följt av inkubering med samma koncentration (10 μg/ml) av Fluorescent-märkt Fibronektin (grön). Dkvantifiering av fluorescensintensiteten hos Fibronektin-ränderna i C som visar att högre laser doser korrelerar till högre halter av adsorberat protein. Alla mätningar är bakgrundskoncentrerade. Prov numren anges längst ned i kolumnerna. data visas som medelvärdet ± SEM. statistisk analys utfördes med icke-parametriska Mann-Whitney-test med tvåsidiga beräkningar. P-värdet är < 0,0001 för * * * * signifikans. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: generering av en proteinkoncentrationsgradient inom ett mikro-mönster. (A) mall för övertoningsmönster i gråskala. B) fluorescensintensitetsprofil mätt från (a). C) mönster som erhållits med limap från mönster mal len i (a) efter inkubering med 10 μg/ml Fluorescent-märkt Fibronektin (grön). D) fluorescensintensitetsprofil för n = 3 ränder och bakgrund representerade som medelvärde ± SEM, som visar den linjära ökningen i intensiteten hos proteingradienten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: tvär bindnings effekten när flera proteiner mönas sekventiellt. (a-C, E-G) Korsmönster med 10 μm remsor av fluorescerande-märkt Fibronektin (cyan, horisontell) och fluorescently-märkt laminin (magenta, vertikal). (a-C) Prover behandlade med BSA blockeringsbuffert. (E-F) Prover som behandlats med PLL-PEG för blockering av ospecifika bindningsställen (steg 7). (a, E) Sammanslagna fluorescenskanaler som visar både Fibronektin och laminin. (B, F) Bild som endast visar Fibronektin. (C, G) Bild som endast visar laminin. För C, notera närvaron av laminin även på horisontella Fibronektin positiva ränder som beror på ineffektiv blockering av obesatta bindningsställen med BSA. För G, Observera att blockering med PLL-PEG förhindrar effektivt bindning av laminin till Fibronektin ränder. (D, H) Fluorescensintensitetsprofiler som erhålls från indikerade mätningar (Diagonal gul linje) i A respektive E. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: korsmönster för att undersöka neurit/Axon pathfinding. (a-C) Korsmönster med 10 μm remsor av fluorescerande-märkt Fibronektin (cyan, horisontell) och fluorescently-märkt laminin (magenta, vertikal). (a, B) Fluorescerande bilder av CAD-celler med neuriter växer längs mikro-mönster. För att visualisera neuriter, var celler odlade för 48 h, fast med 4% PFA och färgas för tubulin (A) eller tubulin och aktin (B). (C) råtta dorsal-root ganglion (DRG) nervceller med axoner växer längs mikro-mönster. För att visualisera axoner, var DRG nervceller odlade för 72 h, fast med 4% PFA och färgade för tubulin. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: exempel på vanliga negativa resultat som erhålls vid generering av mikro-mönster med LIMAP. (a-C) Suboptimala mönstrade ränder på 10 μg/mL fluorescently-märkt fibrinogen (grön) som erhålls under olika omständigheter. (A) mikro-väl torkat ut under mönstret generation. Notera de höga nivåerna av fluorescens i bakgrunden (pil) och närvaron av PBS kristaller (asterisker). (B) sömmarna mellan ränderna justerades inte korrekt under programvaru konstruktionen, vilket resulterade i diskontinuerliga ränder med mellanrum (pil) mellan designenheter (se steg 3.4.7). (C) Laser skärpan var suboptimal och orsakade diffusade ränder (pilar) som inte representerar den faktiska rand bredden i mönster mal len, som bör vara 20, 10, 5, 2 μm uppifrån och ned, som i (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
LIMAP (PRIMO) Micro-Patterning fördelar och jämförelse med microcontact utskrift
Även microcontact utskrift är möjligen den mest använda mikro-Patterning teknik i det biologiska fältet39, det verkar finnas ett ökande antal forskare som använder limap teknik40,41,42 ,43,44. Här presenterade vi ett protokoll med PRIMO, ett kommersiellt tillgängligt system för LIMAP. Nedan diskuterar vi kortfattat potentiella fördelar och begränsningar av microcontact utskrift och LIMAP foto-mönkning.
Microcontact utskrift kräver litograferad plåt Masters produceras av spin-beläggning en foto-mask (i allmänhet SU-8) på ett glas eller kisel wafer, som sedan laseretsad med önskad mikro-funktioner. Dessa bakgrunder används som mallar för att skapa en PDMS Stamp45. Stämpeln är inkuberas med ett utvalt protein som absorberas av det, och sedan överförs (stämplas) på cellkultur skålen. Processen för adsorption av proteinet till PDMS stämpel är beroende av proteinkoncentration, buffert och inkubationstid. Dessa parametrar måste testas i förväg för optimala resultat46.
Masters kan användas i ett stort antal experiment, som varar i månader eller till och med år, om korrekt bevarade. Men en begränsande faktor för denna teknik är nödvändigheten att åter designa nya litograferade mästare för varje önskad modifiering. Förändringar i experimentella konstruktioner kan resultera i tidskrävande produktion av nya Masters (upp till flera veckor) vilket försenar experiment. I jämförelse kräver LIMAP photopatterning inte en läkarundersökning ledar-; den använder programvarugenererade mönstermallar som kan användas för att flexibelt anpassa önskade geometrier av mikro-mönster till förändrade forskningsfrågor. LIMAP kan också användas för att generera protein gradienter inom samma mikro-mönster (figur 8), vilket är svårare att få på ett reproducerbart sätt med hjälp av microcontact utskrift47.
Dessutom, den mikro-mönster upplösning uppnås med LIMAP, i vårt fall, är 2 μm (figur 6B).
Att närma sig denna resolution ökade variationer inom och mellan mönster. Att generera mönster runt eller över 10 μm bredd var mycket reproducerbar (figur 6G, H). Tvärtom, med microcontact utskrift är det svårt att konsekvent få upplösningar under 10 μm och det är vanligt att hitta artefakter när stämpling små funktioner (data som inte visas).
Vi har visat att LIMAP kan användas för att mikro-mönster flera proteiner (figur 9) inom samma mikro-brunn, vilket gör att ytterligare nivåer av komplexitet som skall läggas till experiment. Även om detta kan åstadkommas med microcontact utskrift, kan justera olika proteiner med hög precision vara tekniskt ganska krävande. Medan mönster flera proteiner med limap verkar rakt fram, är det viktigt att nämna att kors bindning av proteiner genom sekventiella beläggnings procedurer kan reduceras genom att blockera reagenser men inte helt elimineras (figur 9).
När det gäller kostnaden för en eller annan teknik, LIMAP som beskrivs här kräver inköp av mikro-Patterning utrustning (PRIMO) som kan installeras på olika fluorescensmikroskop och kräver en motoriserad fas. Även om denna investering är initialt kostnadskrävande, det finns inga ytterligare inköp än förbrukningsartiklar (stenciler, PEG och PLPP) på lång sikt i samband med LIMAP. Alternativt kan PDMS-stencilerna också produceras i labbet av den egna försöksledaren efter publicerade protokoll18,32. De största kostnaderna för tryckning av microcontact kan vara förknippade med produktionen av nya mästare, som kan bli betydande om experiment kräver nya mönster.
En nackdel med LIMAP är den relativt låga genomströmningsmetoden av denna teknik. Microcontact utskrift kan producera ett stort antal mikro-mönster snabbt och effektivt i en samtidig stämpling steg, jämfört med den erforderliga sekventiella laser Micro-Patterning med LIMAP. Till exempel är det möjligt att producera 6 stämplade glas täckband i ca 2 h med microcontact utskrift med PDMS frimärken (exklusive stämpel förberedelse); mönstra ett liknande område (6-väl maträtt) med limap skulle ta runt 4 h, exklusive förfarandet för ytan passivering (med tanke på mönstret mall konfiguration beskrivs i steg 5,12 och se figur 5B).
En annan hastighetsbegränsande faktor för LIMAP-tekniken är den långa belysningstid som krävs för möntring av stora ytor (30 s per konstruktionsenhet med en 7,5 mW/mm2 -laser). I dessa fall kan det vara ett alternativ att skriva ut med microcontact. En nyligen tillgänglig foto-initiativtagare (PLPP gel, tabell över material) bör avsevärt minska den tid det tar för mönstring, vilket möjliggör generering av hundratals mikro-mönster i stora områden (upp till 8 mm2) på bara några minuter.
En annan viktig faktor att ta hänsyn till när mikromönstrar ytor för cellodling är reproducerbarheten av mikro-mönster bland olika experimentella upprepningar, i jämförelse med den variation som erhålls med microcontact utskrift. Diagrammen som visas i figur 7B, D är till exempel representativa data för tre oberoende experimentella upprepningar med mycket likartade resultat (data visas inte). Baserat på vår erfarenhet och tidigare publikationer, denna nivå av reproducerbarhet är svårt att uppnå med microcontact utskrift48,49,50,51,52.
I motsats till andra foto-mönster tekniker som kräver antingen dedikerad kemi för att iscensätta ljuskänsliga material eller användning av foto-sensibiliserande, som i allmänhet inte är mycket biokompatibla3, den ljuskänsliga komponenten i limap (plpp ) är biokompatibelt och tolereras väl av celler21; i våra händer har vi inte upplevt någon cytotoxicitet i en mängd olika celler, inklusive CAD, DRG neuroner (figur 10), fibroblaster, epitelceller, och melanomceller (data som inte visas). En annan fördel med LIMAP med PRIMO jämfört med andra foto-mönster tekniker är att ingen photomasken krävs. Liknar microcontact utskrift, nya photomfrågar skulle behöva utformas och genereras för varje önskat mönster.
Alla de begränsningar som nämns ovan för microcontact utskrift, hänvisa till den manuella metoden av tekniken. Det är dock möjligt att förbättra dataflödet och reproducerbarheten av microcontact utskrift med hjälp av en automatiserad enhet med stämpel belastning och tryckkontroll53.
Viktiga steg i protokollet och problemlösning för LIMAP med PRIMO
Ett av de vanligaste problemen som finns under detta protokoll är att ha höga nivåer av bakgrundsfluorescens i mikro-mönster. Detta kan bero på uttorkning av mikro-brunnar som ofta uppstår på grund av sin lilla volym. När detta inträffar, PBS kristaller ofta visas omger ECM mönster (figur 11A).
Otillräcklig eller ineffektiv tvättsteg efter proteininkubation kan också resultera i höga nivåer av bakgrundsfluorescens. Detta kan observeras särskilt vid användning av proteinkoncentrationer på 10 μg/mL (figur 11B) eller högre. Överskottet av protein i bakgrunden kan minskas genom att inkludera ytterligare tvättsteg med PBS.
Närvaron av protein bakgrund måste mätas och kännetecknas i varje experiment, beräkna bakgrundfluorescensintensiteten (figur 6E) och subtrahera den från Mikromönstren intensitet (figur 6F-H och figur 7B, D). Hög protein bakgrund kan ha en inverkan på fastsättning och groning av CAD-celler, vilket äventyrar tolkningen av resultaten.
Att ha luckor mellan designenheter är ett vanligt problem när användare har begränsad erfarenhet (figur 11B), som uppstår till följd av otillräcklig överlappning mellan mönstren. Två parametrar i Leonardo programvaran kan justeras för att övervinna detta: 1) ett negativt mellanrum mellan kolumnerna kan krävas, beroende på mönstret (steg 5,7 och se figur 5B, C). Alternativt, 2) Använd alternativet gradient i expert menyn för att sy kolumnerna. Ett snabbt test för att bestämma de optimala avstånds parametrarna kan utföras med UV-lim (tabell över material). En liten droppe av detta Lim appliceras på en glas rutschbana, som sedan täcks med en glastäckslip, vilket gör en film. Den inbäddade UV-lim är fotomönstrad med mönstret mall av intresse med hjälp av en låg laser dos (30 mJ/mm2). De UV-exponerade regionerna i den inbäddade lim kommer att botas, blir synlig under Bright-fältmikroskopi. Testresultaten visualiseras för att utvärdera det erhållna avståndet i mönstret. I våra neuronala experiment, en klyfta mellan ränder kan negativt påverka cellens beteende, producerar variationer i tillväxtdynamik (antingen reducerad hastighet eller nedläggning av vägen).
I den senaste uppdateringen av Leonardo programvara (vid tidpunkten för offentliggörandet, Leonardo 4,11), är det möjligt att ladda upp tidigare designade större mönster mallar som täcker ett mycket större område (upp till 8 mm2 med 20x mål) av mikro-brunn yta jämfört med nuvarande 0,1 mm2 per konstruktionsenhet, vilket eliminerar behovet av att sy ihop de mindre konstruktionsenheterna. Odefinierade kanter kan bero på bristande justering av laser skärpan under mönstergenerering (figur 11C). Det är därför viktigt att kalibrera lasern och utföra referensmönster steg (se steg 4) före mönstringen. Dåligt definierade ränder resultera i variationer i stripe bredd, vilket gör sambandet mellan Axon tillväxtdynamik och stripe bredd svårt. Axoner tenderar också att överge ränder som har diffuserade kanter. Dessutom kan variationer i kanterna också hittas vid utskrift av ränder på 10-20 μm bredd eller högre, vilket resulterar i en högre proteinhalt vid kanterna jämfört med de centrala delarna av mönstret (figur 6B, D). Denna kant effekt produceras av en icke-homogen diffusion av Photo-initieraren under photopatterning processen. Photoscission reaktionen är syre anhörigen, som sprider ut mer på kantar. Denna kant effekt kan minimeras homogenisera Photo-initieraren med en pipett i mikro-brunn under photopatterning processen. Dessutom kan en ny kommersialiserad foto-initiativtagare (PLPP gel), också minska Edge Effect (PRIMO system support team, personlig kommunikation).
Mikrotryck av mer än ett protein kan resultera i tvärbindning (figur 9A-D). Detta kan minimeras genom att öka blockeringseffektiviteten som används för att ockupera ospecifika bindnings platser mellan inkubationsstegen för de två olika proteinerna. Kors bindning av proteiner kan stör reproducerbarhet av experimentella resultat och kan leda till feltolkning av data, eftersom det är svårt att avgöra bidraget av varje protein till Axon tillväxtdynamik och andra cell beteenden.
Slutsats
Vi hoppas att det medföljande protokollet med hjälp av LIMAP underlättar generering av protein mikromönster genom användning av PRIMO-systemet. Även om vårt protokoll fokuserar på hur man tillförlitligt producera mikro-mönster i 2D glasytor, andra har visat att det är möjligt att använda LIMAP för mikro-mönster av mjuka substrat54, och mikrostrukturerade ytor för 3D-kulturer42. Dessa mikro-mönster kan vara ett mångsidigt verktyg för att studera cellulära svar på förändringar i deras mikro-miljö.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av BBSRC, EPSRC, MRC och Wellcome Trust. Den C.B. Laboratory är en del av Wellcome Trust Center för cell-Matrix Research, University of Manchester, som stöds av grundläggande finansiering från Wellcome Trust (Grant nummer 088785/Z/09/Z). Författarna vill erkänna finansieringen från Vetenskapsrådet för bioteknik och biologisk vetenskap (BBSRC) till C.M., K.J. (BB/M020630/1) och P.A. (BB/P000681/1) och av ingenjörs-och fysikalisk Vetenskapsrådet (EPSRC) och Medical Forskningsrådet (MRC) centrum för forskarutbildning i regenerativ medicin till Arvidsson (EP/L014904/1). Författarna tackar Alvéole för deras korrespondens och deras kundserviceteam. Författarna tackar Peter March och Roger Meadows från bioimaging Facility, University of Manchester för deras hjälp med mikroskopi. Den bioimaging Facility Mikroskop som används i denna studie köptes med bidrag från BBSRC, Wellcome Trust och University of Manchester strategiska fonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 protein labeling kit | Invitrogen | A10235 | Working concentration: N.A. |
| Alexa 647 protein labeling kit | Invitrogen | A20173 | Working concentration: N.A. |
| CAD cells | ECACC | 8100805 | Working concentration: N.A. |
| Conjugated fibrinogen-488 | Molecular Probes | F13191 | Working concentration: 10 μg/ml |
| DMEM culture medium | Gibco | 11320033 | Working concentration: N.A. |
| Epifluorescence Microscope** | Nikon | Eclipse Ti inverted | Working concentration: N.A. |
| Fibronectin | Sigma | F4759 | Working concentration: 10 μg/ml (after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) (diluted in PBS) |
| Fiji-Image J | www.imagej.nih.gov | Version 2.0.0-rc-54/1.51f | Working concentration: N.A. |
| Fluorescent highlighter | Stabilo | Stabilo Boss Original | Working concentration: N.A. |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Working concentration: 1M |
| Inkscape software | Inkscape | Check last update | Working concentration: N.A. |
| Laminin-red fluorescent rhodamine | Cytoskeleton, Inc. | LMN01 | Working concentration: 10 μg/ml (diluted in PBS) |
| Leonardo software | Alvéole | version 4.11 | Working concentration: N.A. |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Working concentration: 1% |
| Micro-manager software | Open imaging | Check last update | Working concentration: N.A. |
| Motorized x/y stage | PRIOR Scientific | Proscan II | Working concentration: N.A. |
| NIS Elements Software | Nikon | NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs) | Working concentration: N.A. |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Sigma | D8537 | Working concentration: 1X |
| PDMS Stencils | Alvéole | visit www.alveolelab.com | Working concentration: N.A. |
| PEG-SVA | Laysan bio, Inc. | MPEG-SVA-5000-1g | Working concentration: 50 mg/ml |
| Phalloidin 405 | Abcam | ab176752 | Working concentration: 1:1000 |
| Photo-initiator (PLPP) | Alvéole | Classic PLPP | Working concentration: 14.5 mg/ml |
| Photo-initiator (PLPP gel) | Alvéole | PLPP gel | Working concentration: 4.76% diluted in ethanol |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V) | Working concentration: N.A. |
| PLL-PEG | SuSoS (also distributed by Alvéole) | www.alveolelab.com | Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS) |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | Working concentration: 0.01% |
| Primo equipment | Alvéole | www.alveolelab.com | Working concentration: N.A. |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Working concentration: 1% |
| Tubulin anti-alpha antibody | Abcam | DM1A | Working concentration: 1:1000 CAD cells |
| Tubulin anti-beta 3 antibody | Sigma | T8660 | Working concentration: 1:500 DRG neurons |
| UV adhesive | Norland Products | NOA81 | Working concentration: N.A. |
| 1 well glass bottom dish | Cellvis | D35-20-1.5-N | Working concentration: N.A. |
| 6 well glass bottom dish | Cellvis | P06-20-1.5-N | Working concentration: N.A. |
| 20x objective** | Nikon | no phase ring (check updated catalogue) | Working concentration: N.A. **Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alvéole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera. |
References
- Alamdari, O. G., Seyedjafari, E., Soleimani, M., Ghaemi, N. Micropatterning of ECM Proteins on Glass Substrates to Regulate Cell Attachment and Proliferation. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (4), 234-240 (2013).
- Sunami, H., Yokota, I., Igarashi, Y. Influence of the pattern size of micropatterned scaffolds on cell morphology, proliferation, migration and F-actin expression. Biomaterials Science. 2 (3), 399-409 (2014).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
- Marino, A., et al. Two-photon polymerization of sub-micrometric patterned surfaces: investigation of cell-substrate interactions and improved differentiation of neuron-like cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (24), 13012-13021 (2013).
- Joo, S., et al. Effects of ECM protein micropatterns on the migration and differentiation of adult neural stem cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. K. Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning. Elife. 7, (2018).
- Javaherian, S., O'Donnell, K. A., McGuigan, A. P. A Fast and Accessible Methodology for Micro-Patterning Cells on Standard Culture Substrates Using Parafilm (TM) Inserts. Plos One. 6 (6), (2011).
- Smirnov, M. S., Cabral, K. A., Geller, H. M., Urbach, J. S. The effects of confinement on neuronal growth cone morphology and velocity. Biomaterials. 35 (25), 6750-6757 (2014).
- Albert, P. J., Schwarz, U. S. Dynamics of Cell Ensembles on Adhesive Micropatterns: Bridging the Gap between Single Cell Spreading and Collective Cell Migration. PLOS Computational Biology. 12 (4), (2016).
- Evans, A. R., et al. Laminin and fibronectin modulate inner ear spiral ganglion neurite outgrowth in an in vitro alternate choice assay. Developmental Neurobiology. 67 (13), 1721-1730 (2007).
- Nichol, R. H., Hagen, K. M., Lumbard, D. C., Dent, E. W., Gomez, T. M. Guidance of Axons by Local Coupling of Retrograde Flow to Point Contact Adhesions. Journal of Neuroscience. 36 (7), 2267-2282 (2016).
- Burdick, J. A., Khademhosseini, A., Langer, R. Fabrication of gradient hydrogels using a microfluidics/photopolymerization process. Langmuir. 20 (13), 5153-5156 (2004).
- Schwartz, P. V. Molecular transport from an atomic force microscope tip: A comparative study of dip-pen nanolithography. Langmuir. 18 (10), 4041-4046 (2002).
- Barbulovic-Nad, I., et al. Bio-microarray fabrication techniques--a review. Critical Reviews in Biotechnology. 26 (4), 237-259 (2006).
- Shafagh, R. Z., Vastesson, A., Guo, W. J., van der Wijngaart, W., Haraldsson, T. E-Beam Nanostructuring and Direct Click Biofunctionalization of Thiol-Ene Resist. Acs Nano. 12 (10), 9940-9946 (2018).
- Kobayashi, J., Yamato, M., Itoga, K., Kikuchi, A., Okano, T. Preparation of microfluidic devices using micropatterning of a photosensitive material by a maskless, liquid-crystal-display projection method. Advanced Materials. 16 (22), (2004).
- Bernard, A., et al. Printing patterns of proteins. Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).
- Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Fink, J., et al. Comparative study and improvement of current cell micro-patterning techniques. Lab Chip. 7 (6), 672-680 (2007).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light-Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
- Belisle, J. M., Correia, J. P., Wiseman, P. W., Kennedy, T. E., Costantino, S. Patterning protein concentration using laser-assisted adsorption by photobleaching, LAPAP. Lab Chip. 8 (12), 2164-2167 (2008).
- Belisle, J. M., Kunik, D., Costantino, S. Rapid multicomponent optical protein patterning. Lab Chip. 9 (24), 3580-3585 (2009).
- Heinz, W. F., Hoh, M., Hoh, J. H. Laser inactivation protein patterning of cell culture microenvironments. Lab Chip. 11 (19), 3336-3346 (2011).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Thery, M., Piel, M. Protein Micropatterns: A Direct Printing Protocol Using Deep UVs. Microtubules: In Vivo. 97, 133-146 (2010).
- Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. Polyacrylamide hydrogel micropatterning. Methods in Cell Biology. 120, 93-116 (2014).
- Waldbaur, A., Waterkotte, B., Schmitz, K., Rapp, B. E. Maskless projection lithography for the fast and flexible generation of grayscale protein patterns. Small. 8 (10), 1570-1578 (2012).
- Kang, J., Choi, J. C., Kim, M., Jung, H. R., Doh, J. Photopatterning with a printed transparency mask and a protein-friendly photoresist. Methods in Cell Biology. 119, 55-72 (2014).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Morlat, S., Gardette, J. L. Phototransformation of water-soluble polymers. Part II: photooxidation of poly(ethylene oxide) in aqueous solution. Polymer. 44 (26), 7891-7897 (2003).
- Qi, Y., Wang, J. K., McMillian, M., Chikaraishi, D. M. Characterization of a CNS cell line, CAD, in which morphological differentiation is initiated by serum deprivation. Journal of Neuroscience. 17 (4), 1217-1225 (1997).
- Shrirao, A. B., et al. A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Pankov, R., Momchilova, A. Fluorescent labeling techniques for investigation of fibronectin fibrillogenesis (labeling fibronectin fibrillogenesis). Methods in Molecular Biology. 522, 261-274 (2009).
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12542-12547 (2002).
- Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), (2014).
- Tang, Y., Qiu, Q. F., Zhang, F. L., Xie, M., Huang, W. H. Quantifying orientational regeneration of injured neurons by natural product concentration gradients in a 3D microfluidic device. Lab Chip. 18 (6), 971-978 (2018).
- Srinivasan, P., Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R. Synergistic effects of 3D ECM and chemogradients on neurite outgrowth and guidance: a simple modeling and microfluidic framework. PLoS One. 9 (6), (2014).
- de Luca, A. C., Faroni, A., Reid, A. J. Dorsal root ganglia neurons and differentiated adipose-derived stem cells: an in vitro co-culture model to study peripheral nerve regeneration. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Khadpekar, A. J., Khan, M., Sose, A., Majumder, A. Low Cost and Lithography-free Stamp fabrication for Microcontact Printing. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Delepine, C., et al. Altered microtubule dynamics and vesicular transport in mouse and human MeCP2-deficient astrocytes. Human Molecular Genetics. 25 (1), 146-157 (2016).
- Decock, J., Schlenk, M., Salmon, J. B. In situ photo-patterning of pressure-resistant hydrogel membranes with controlled permeabilities in PEGDA microfluidic channels. Lab Chip. 18 (7), 1075-1083 (2018).
- Stoecklin, C., et al. A New Approach to Design Artificial 3D Microniches with Combined Chemical, Topographical, and Rheological Cues. Advanced Biosystems. 2 (7), (2018).
- Toraille, L., et al. Optical Magnetometry of Single Biocompatible Micromagnets for Quantitative Magnetogenetic and Magnetomechanical Assays. Nano Letters. , (2018).
- Theodoly, O., et al. Live nanoscopic to mesoscopic topography reconstruction with an optical microscope for chemical and biological samples. PLoS One. 13 (12), (2018).
- Ermis, M., Antmen, E., Hasirci, V. Micro and Nanofabrication methods to control cell-substrate interactions and cell behavior: A review from the tissue engineering perspective. Bioactive Materials. 3 (3), 355-369 (2018).
- von Philipsborn, A. C., et al. Microcontact printing of axon guidance molecules for generation of graded patterns. Nature Protocols. 1 (3), 1322-1328 (2006).
- Ricoult, S. G., Kennedy, T. E., Juncker, D. Substrate-bound protein gradients to study haptotaxis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, (2015).
- Bietsch, A., Michel, B. Conformal contact and pattern stability of stamps used for soft lithography. Journal of Applied Physics. 88 (7), 4310-4318 (2000).
- Hui, C. Y., Jagota, A., Lin, Y. Y., Kramer, E. J. Constraints on microcontact printing imposed by stamp deformation. Langmuir. 18 (4), 1394-1407 (2002).
- Sharp, K. G., Blackman, G. S., Glassmaker, N. J., Jagota, A., Hui, C. Y. Effect of stamp deformation on the quality of microcontact printing: theory and experiment. Langmuir. 20 (15), 6430-6438 (2004).
- Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Biebuyck, H. Stability of molded polydimethylsiloxane microstructures. Advanced Materials. 9 (9), 741-746 (1997).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21 (22), 2257-2268 (2009).
- Chakra, E. B., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, C. D., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
- Pasturel, A., Strale, P., Studer, V. Tailoring 3D cell culture templates with common hydrogels. bioRxiv. , (2019).
