Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Lys-indusert molekylær absorpsjon av proteiner ved hjelp av PRIMO system for mikro-mønstre å studere Cell Svar å ekstracellulære Matrix proteiner

Published: October 11, 2019 doi: 10.3791/60092
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3,4, 5, 1
1Faculty of Biology, Medicine and Health. Division of Cell Matrix, Biology and Regenerative Medicine, Wellcome Trust Centre for Cell-Matrix Research, The University of Manchester, 2School of Materials, The University of Manchester, 3Blond McIndoe Laboratories, School of Biological Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, Division of Cell Matrix Biology and Regenerative Medicine, The University of Manchester, Manchester Academic Health Science Centre, 4Department of Plastic Surgery & Burns, Wythenshawe Hospital, Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Centre, 5Department of Pathology, UMC Utrecht
* These authors contributed equally

Summary

Vårt overordnede mål er å forstå hvordan cellene forstand ekstracellulære signaler som fører til rettet axonal vekst. Her beskriver vi metodikken for lys-indusert molekylær absorpsjon av proteiner, som brukes til å produsere definerte mikro-mønstre av ekstracellulære matrise komponenter for å studere bestemte hendelser som styrer axon utvekst og pathfinding.

Abstract

Celler forstand en rekke ekstracellulære signaler, inkludert sammensetning og geometri av ekstracellulære matrise, som er syntetisert og ombygd av cellene selv. Her presenterer vi metoden for Light-indusert molekylær absorpsjon av proteiner (LIMAP) som bruker PRIMO-systemet som mønster teknikk for å produsere mikro-mønstret ekstracellulære Matrix (ECM) ved hjelp av en enkelt eller kombinasjon av proteiner. Metoden muliggjør utskrift av ECM-mønstre i mikron oppløsning med utmerket reproduserbarhet. Vi gir en trinnvis protokoll og demonstrerer hvordan dette kan anvendes for å studere prosessene i neuronal pathfinding. LIMAP har betydelige fordeler i forhold til eksisterende mikro-utskrift metoder i forhold til den enkle mønstre mer enn én komponent og evnen til å generere et mønster med noen geometri eller gradient. Protokollen kan enkelt tilpasses for å studere bidraget fra nesten alle kjemiske komponenter mot celle skjebne og celle adferd. Til slutt diskuterer vi vanlige problemer som kan oppstå, og hvordan disse kan unngås.

Introduction

De siste årene har de biologiske vitenskaper i økende grad gjort bruk av fremskrittene som er gitt av materiell vitenskap. Et fremtredende eksempel er mikro-mønstre av underlag, som kan brukes til å studere cellulære reaksjoner som celle spredning1,2Differensiering3,4,5,6, celle migrering7,8,9og pathfinding10,11. Det finnes en rekke teknikker tilgjengelig som muliggjør mikro-mønstre av underlag, slik som multiphoton spent fotokjemi12, AFM DIP-penn nanolithography13, PIN og blekkskriver direkte utskrift14, elektronstråle Litografi15eller materialer16. Men to teknikker som er mye brukt i det biologiske feltet er microcontact utskrift17,18,19eller laser-assistert mønster3(Figur 1). Laser-assistert mønster anses å levere mer pålitelige resultater i form av protein og PEG stabilitet og celle isolasjon på mønstrene, sammenlignet med microcontact utskrift20. En mer ny tilnærming for mikro-mønstre som er beskrevet her er bruken av lys-indusert molekylær absorpsjon av proteiner21(LIMAP,Figur 1 D) ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig system (PRIMO,Tabell av materialer). Hver av metodene har fordeler og begrensninger som er kort beskrevet nedenfor. Microcontact utskrift bruker PDMS muggsopp (frimerker) med ønskede mikro-funksjoner som er generert fra litograferte mestere. Stemplene er inkubert med en utvalgt protein som deretter overføres (stemplet) på cellen kultur substrat18(Figur 1 A). Laser-assistert mønster bruker UV-lys for å holde en anti-forurensning film22,23,24,25, utsette områder som senere kan belagt med protein av interesse (Figur 1 B). Mens oppløsningen oppnås med foto-mønstre tilnærminger er i mikron området25,26, de fleste av disse teknikkene krever en foto-maske, enten i kontakt med prøven, eller ligger i objektet flyet av mikroskopet objektiv23,27,28. Kravene til masker i både microcontact utskrift og foto mønstre kan være en begrensning; spesifikke masker er nødvendig for alle geometriske mønster og størrelse, som kan være kostbart og tidkrevende å generere. I motsetning til disse teknikkene, LIMAP ikke krever en maske (Figur 1 D). Bruk av PRIMO-systemet for LIMAP kan være kostnadskrevende i begynnelsen fordi det krever kjøp av utstyr. Men åpen kildekode programvare brukes til å designe mønstre av ønsket geometri, noe som gir mye mer frihet og gir mer komplekse eksperimenter, inkludert bruk av proteinkonsentrasjon graderinger. PRIMO laser styres og ledes av en digitalt kontrollert Micromirror Device enhet (DMD) for å skape mønstre i en rekke brukerdefinerte geometri. LIMAP krever at kultur overflaten er belagt med molekyler som hindrer celle feste. Polyetylen glykol (PEG) brukes vanligvis som en slik "Bunnstoff" reagens; det danner en tett anti-lim film på glass eller plastoverflate29. Deretter legges en foto-initiator som gjør at PEG filmen skal fjernes med høy presisjon gjennom en photoscission mekanisme30av lokal eksponering for UV-lys under kontroll av DMD. Disse PEG-frie regionene kan være belagt med proteiner som adsorbere til laser etset overflate, genererer et mikro-mønster. Ved å variere laser kraft, ulike mengder PEG kan fjernes fra overflaten tillater brukeren å generere protein graderinger. PEG fjerning og belegget prosedyren kan gjentas for å lage mønstre med to eller flere forskjellige proteiner i samme mikro-brønn21. De genererte mikro-mønstrene gir selvklebende overflater for celler, slik at studiet av celle atferd. I våre studier bruker vi mikro-mønstre for å studere neurite eller axon pathfinding av en neuronal cellelinje (CAD (Cathecholaminergic-en differensiert) celler31) eller primær rotte rygg-root Ganglion (DRG) neurons, henholdsvis. Her skisserer vi en trinnvis protokoll for LIMAP (Figur 2) ved bruk av det kommersielt tilgjengelige PRIMO-systemet og med følgende Leonardo-programvare. Vi viser hvordan den kan brukes til generering av mønstre med definert geometri og flere proteiner, som vi bruker til å studere axonal pathfinding. Vi diskuterer vanlige problemer som kan oppstå, og hvordan disse kan unngås.

Protocol

1. design av mønster maler

Merk: maler for mønstre genereres med digital tegneprogram vare (tabell med materialer). Tegning i forskjellige grå nivåer vil avgjøre laser intensitet. Ved hjelp av programvare for å designe mønster maler tillater rask generering av mønstre med alle ønskede geometri og graderinger (Figur 3).

  1. Tegne den ønskede mønster malen digitalt ved hjelp av tegneprogram vare. Velg en bildestørrelse på 1824 piksler lengde og 1140 piksler bredde (som i denne studien tilsvarer 415 μm lengde og 260 μm bredde). Lagre mønster malen som en 8-biters TIFF-fil.
    Merk: en trinnvis protokoll for å generere maler er tilgjengelig på forespørsel til merket som kommersialiserer mikro-mønster utstyr (tabell av materialer).

2. plasma rengjøring

Merk: optimale resultater krever plasma rensing av overflatene før mønsteret, noe som vil fjerne all organisk materiale og aktivere overflaten. I den foreliggende sak er omgivelsesluft tilstrekkelig for overflate aktivering. En plasma renere (tabell av materialer) ble brukt med et prosesstrykk på 1000-1300 mTorr og en effekt på 29,6 W for 1-5 min.

  1. Bruk glassbunn parabolen/es med en 20 mm indre brønn størrelse og glass tykkelse på 0.16-0.19 mm. For å teste flere forhold, bruk en 6-brønn glassbunn parabolen. Ellers, bruk en enkelt brønn glassbunn parabolen (tabell av materialer).
    Merk: en trinnvis protokoll for plasma rensing er tilgjengelig på forespørsel til merket som kommersialiserer plasma rengjøringsutstyret (tabell av materialer).

3. passivering

Merk: dette trinnet genererer en Bunnstoff film som hindrer at protein absorpsjon blir til glassflaten. PEG gir høy motstandsdyktighet mot protein absorpsjon29 som et Bunnstoff middel. LIMAP bruker en foto-initiator til å fjerne PEG via UV-photoscission lokalt. Proteinet/s av interesse vil da adsorbere til disse PEG-frie overflater21, genererer mikro-mønstre.

  1. Passivering med PLL-PEG
    1. Under sterile forhold, kutt PDMS sjablonger (se Figur 4A, B og tabell over materialer) for å sikre at de passer i den indre glass bunnen godt, og fjerne den indre mikro-brønn fyllinger med steril tang. Stick sjablonger på glasset godt ved hjelp av tang.
    2. Sørg for at sjablongene stikker tett på glasset godt, hindrer dannelse av luftbobler som kan forårsake lekkasjer under passivering prosessen.
      Merk: PDMS-sjablonger kan også være fabrikkert internt ved hjelp av publiserte protokoller18,32.
    3. Forbered PLL-PEG-løsning (Material tabell, 0,1 mg/ml) i fosfat-bufret saltvann (PBS). Tilsett 20 μL av PLL-PEG-løsning på hver mikro-brønn og ruge ved romtemperatur, for 1 time.
    4. Fjern 15 μL av PLL-PEG fra mikro-brønnene og vask dem fem ganger med 20 μL av PBS (tabell av materialer) uten å la dem tørke.
      Merk: la det alltid være ca. 5 μL av PBS mellom vask. Gitt sitt lille volum, mikro-brønner er spesielt utsatt for tørking. Tørking vil resultere i mikro-mønstre av dårlig kvalitet.
    5. Enten Hold kulturen parabolen i PBS (3 mL per brønn) ved 4 ° c i opptil 3 dager eller fortsette med neste trinn (trinn 3.1.5).
    6. Fjern 18 μL av PBS fra en enkelt mikro-brønn (for eksempel øverste venstre mikro-brønn, se Figur 4D), tilsett 5 μL av foto-initiator (PLPP, tabell over materialer) og la 20 μL av PBS i de resterende mikro-brønner. Denne mikro-brønn med PLPP vil bli brukt til å lage et referanse mønster (se Figur 4D, E) under system kalibrerings trinnet (trinn 4). Hold PLPP beskyttet mot lys.
  2. Passivering med lang levetid PEG-SVA
    Merk: for å generere den anti-selvklebende overflaten kan man bruke: 1) en PEG koblet til Poly-L-lysin (PLL-PEG, trinn 3,1) eller 2) en PEG-succinate N-hydroxisuccinimide (PEG-SVA). Beslutningen om å velge det ene eller det andre passivering alternativet avhenger av lagringsalternativene (se trinn 10). Kultur retter inkubert med PEG-SVA krever dobbel mengde passivering og photopatterning tid.
    1. Klargjør sjablonger som beskrevet i trinn 3.1.1.
    2. Tilsett 20 μL av 0,01% Poly-L-lysin (PLL, tabell av materialer) til hver mikro-brønn og ruge ved romtemperatur i 30 min til pre-COAT med PLL.
    3. Fjern 15 μL av PLL fra mikro-brønnene og vask dem tre ganger med 20 μL av 1 M HEPES buffer (tabell av materialer) uten å la brønnene tørke ut.
      Merk: la det alltid være ca. 5 μL av HEPES eller PBS mellom vask. Gitt sitt lille volum, mikro-brønner er spesielt utsatt for tørking. Tørking vil resultere i mikro-mønstre av dårlig kvalitet.
    4. Forbered PEG-SVA løsning. PEG-SVA løsning (50 mg/mL i HEPES buffer 1M) bør tilberedes friskt hver gang umiddelbart før bruk. Forbered 20 μL av PEG-SVA per mikro-brønn.
    5. HEPES buffer må ha en pH mellom 8-8.5. Test HEPES pH før du klargjør PEG-SVA-løsningen med pH-papir. Veie PEG-SVA i et sentrifugerør ved hjelp av en presisjons skala. Legg HEPES buffer og Vortex 30 s til oppløst. PEG-SVA er helt oppløst når løsningen er transparent.
      Merk: SVA er Ester som tillater binding av PEG til den tidligere belagt PLL. Når HEPES buffer er lagt til PEG-SVA, den SVA har en halveringstid på 15 min og bør brukes umiddelbart.
    6. Tilsett 20 μL PEG-SVA-løsning på hver mikro-brønn og ruge ved romtemperatur, for 1 t. Fjern 15 μL PEG-SVA fra mikro-brønnene og vask fem ganger med 20 μL av PBS (tabell av materialer) uten å la brønnene tørke ut.
    7. Enten forberede kulturen parabolen for langtidslagring (opptil 1 måned, se trinn 10,2) eller gå videre til neste trinn (trinn 3.2.8).
    8. Fjern 18 μL av PBS fra en enkelt mikro-brønn (for eksempel øverste venstre mikro-brønn, se Figur 4D), tilsett 5 μL av PLPP (tabell over materialer) og la 20 μL av PBS i de resterende mikro-brønner. Denne mikro-brønnen vil bli brukt til å lage et referanse mønster (se Fi Gure 4D, E). Sørg for at PLPP er homogen på hele overflaten av mikro-brønnen. Hold PLPP beskyttet mot lys.

4. system kalibrering

Merk: i disse trinnene, vil fokuset for laseren justeres til den spesielle typen kultur rett (trinn 4,1). Et referanse mønster vil bli generert i bare en mikro-brønn (trinn 4,2) etterfulgt av inkubasjons med en protein løsning (trinn 4,3) for å sikre de optimale fokus forholdene til laseren (trinn 4,4), nødvendig for å oppnå skarpe og definerte mønstre.

  1. Laser kalibrering
    Merk: under kalibreringsprosessen vil et kalibrerings laser bilde projiseres på en fluorescensmerkete glass overflate (kalibrerings brønn, merket med en fluorescerende merkepenn, Figur 4C), som må plasseres i fokus på Mikroskop.
    1. Bruk en fluorescerende merkepenn (materialfortegnelsen) for å markere en tom Inner glass brønn.
      Merk: kalibreringen brønnen må ha samme glass tykkelse (0.16-0.19 mm) som kultur parabolen som mikro-mønstre vil bli generert. Hvis en 6-brønn glassbunn parabolen brukes, en tom brønn kan brukes til kalibrering og bør merkes med fluorescerende merkepenn under sterile forhold.
    2. Slå på mikroskopet, scenen og datamaskinen. Slå på PRIMO mikro-mønster utstyr, åpne Micro-Manager og Leonardo programvare. Leonardo-programvaren drives gjennom Micro-Manager under plugins. Sjekk merkevarer/katalognummer av utstyr og programvare i materialfortegnelsen.
    3. Velg Kalibreri den første menyen i Leonardo. Kontroller at den dedikerte PRIMO filter kuben er i riktig posisjon (optisk bane) i filter turret; velge 20X objektiv (0,75 DIC S plan fluor, ingen fase ring) både på mikroskopet og på Leonardo programvare.
      Merk: denne protokollen er justert til Leonardo versjon 4,4. Det kan hende at protokollen må justeres for andre versjoner.
    4. Plasser den tidligere markerte kalibrerings brønnen (Figur 4C) over målsettingen. Velg kamera bane. Juster objektiv fokuset til laser projeksjon av både Primo -logoen og tag-linjen tar vare på cellene dine er i fokus.
    5. La standard kameraets eksponeringstid ved 25 MS. Juster laser intensiteten for å se bokstaven i fra Primo logo projeksjon i grå farge og resten av bokstavene i hvitt.
    6. Record Z-posisjon av fokalplanet, (høyde av målsettingen til prøven) senere referert til som Z-posisjon for kalibrering. Dette vil være en tilnærming til det optimale fokuset oppnådd etter referanse mønster generering (se trinn 4.2-4.4).
  2. Referanse mønster
    1. Plasser kultur parabolen med mikro-brønn som inneholder Foto-initiativtaker (referanse mønster mikro-brønn, Figur 4D) over målsettingen og velg mønster nå i Leonardo-programvaren.
    2. Visualiser kanten på mikro-brønnen med overført lys gjennom kameraet og velg ROI-symbolet fra menyen til høyre. Sett diameteren på AVKASTNINGEN sirkelen til 4000 μm og justere kanten av den digitale AVKASTNINGEN med kanten av den nåværende mikro-brønn.
    3. Sørg for at det er en nøyaktig overlapping mellom den digitale AVKASTNINGEN og den nåværende mikro-brønnen ved å flytte scenen rundt kantene på mikro-brønnen. AVKASTNINGEN posisjon vil bli koblet til scenen bevegelser.
    4. Velg Lås i Leonardo-programvaren for å låse avkastningen i ønsket posisjon. Slå av det overførte lyset.
    5. Velg Primo for å laste opp ønsket mønster mal, som vil bli PROJISERT på avkastningen som en design enhet (se figur 5). Mønstrene vises i en rullegardinliste som kalles handlinger og vises i handlinger- menyen på programvaren.
      Merk: mønster maler må utformes tidligere (se trinn 1) og lagres som en 8-biters TIFF-fil før malen lastes inn i programvaren.
    6. Bare et lite mønster er nødvendig for referanse mønsteret; for eksempel 3 linjer, 1 kolonne (se Figur 4E og figur 5B). Angi ønsket antall kolonner og rader (linjer i Leonardo-programvare) på rep like Rings menyen. Klikk Oppdater for å observere en digital forhåndsvisning av mønster utformingen.
    7. Angi laser dosen i Replication -menyen. Den optimale laser dosen i denne innstillingen og ved bruk av PLL-PEG er 1390 mJ/mm2.
      Merk: Laser strømmen kan variere mellom 5 og 7,5 mW/mm2. I dette tilfellet er det 7,5 mW/mm2, som tar ca 30 s til mønster hver design enhet, med en laser dose på 1390 mJ/mm2. Høyere laser doser kan være nødvendig hvis kulturen parabolen overflaten er paddivert med PEG-SVA (ca dobbel laser dose sammenlignet med PLL-PEG). Dette må testes på forhånd.
    8. Naviger til en perifer region av mikro-brønn, (for eksempel, øverste del) bort fra den viktigste regionen av interesse for mønster generasjon (sentral region) av mikro-brønnen (se Figur 4E) og velg Lås. Vent til mønsteret vises.
    9. Juster fokuset til Z-posisjonen for kalibrering (se trinn 4.1.6).
      Merk: det anbefales å gjøre et ekstra system kalibrerings trinn hvis en annen bruker bruker samme mikroskop mellom photopatterning runder.
    10. Velg avspillings symbolet for å starte mønsteret. Kontroller at laseren er på i programvaren. Vent til mønster prosessen er ferdig. Mønster varigheten vises i estimert tid -panelet. På Leonardo er programvareversjon 4,4 mønstre fullført når alle handlinger vises blå i effekt menyen.
  3. Protein inkubasjons på referanse mønster
    1. Under sterile forhold, vask referanse mønsteret mikro-brønn tre ganger med 20 μL av PBS å fjerne PLPP.
    2. Tilsett 20 μL av fluorescensmerkete-merket ECM-protein (10 μg/mL laminin, fibronektin eller fibrinogen i PBS, se tabell over materialer og trinn 6) til referanse mønsteret mikro-brønn. Ruge ved romtemperatur i 10-20 min (avhengig av protein) beskyttet mot lys (vikle fatet i aluminiumsfolie).
    3. Etter inkubasjons, Fjern 18 μL protein oppløsning og vask tre ganger med 20 μL av PBS; holde mikro-brønner som ikke brukes til å lage et referanse mønster (se Figur 4D, E) i 20 μL av PBS.
  4. Visualisering og innstilling optimal laser fokus
    1. Visualiser referanse mønsteret ved hjelp av et epifluorescence mikroskop, 20X objektiv og egnet programvare (Sjekk programvare som brukes i denne studien i tabell over materialer). Referanse mønsteret skal være synlig i den perifere regionen (for eksempel topp brønn region), der referanse mønsteret ble generert (se Figur 4E).
    2. Juster fokus på mønster kantene gjennom kamera banen. Ta opp Z-posisjonen i henhold til det beste fokuset på referanse mønsteret. Denne justerte Z-posisjonen vil være det optimale laser fokuset som brukes til påfølgende mønstre.

5. programvareoppsett og photopatterning

Merk: Når kalibreringen av systemet er oppnådd (trinn 4), vil brukeren laste opp ønsket mønster maler (mal konfigurasjon, figur 5) for photopatterning, med mulighet til å generere mønstre for en eller flere proteiner i hver mikro-brønn. Mikro-mønster prosessen innebærer photopatterning og protein inkubasjons trinn (se figur 2).

  1. Under sterile forhold, fjerne 18 μL av PBS fra alle mikro-brønner og tilsett 5 μL av PLPP til hver mikro-brønn. Sørg for at PLPP er homogen på hele overflaten av mikro-brønner.
  2. Plasser kultur fatet med referanse mønsteret mikro-brønn (Figur 4D, E) over målsettingen, og velg mønster nå i Leonardo-programvaren.
  3. Visualiser mikro-brønn med overført lys gjennom kameraet banen og velg ROI symbol. Angi diameteren på AVKASTNINGEN til 4 000 μm og overlapp kanten av den digitale AVKASTNINGEN til kanten av den nåværende mikro-brønnen. Velg Lås.
    Merk: formen og diameteren på AVKASTNINGEN avhenger av utformingen og størrelsen på PDMS-sjablongen som brukes. Hvis du for eksempel bruker 5 000 x 5 000 μm PDMS kvadrerte sjablonger, kan du bruke en 5 000 x 5 000 μm kvadrat ROI.
  4. Gjenta det overlappende trinnet (trinn 5,3) for hver mikro-brønn av fatet. Når du er ferdig, slår du av det overførte lyset.
  5. Naviger til midten av referanse mønsteret mikro-brønn, vekk fra referanse mønster området, og velg Primo for å laste opp ønsket mønster mal, som vil bli PROJISERT på avkastningen som en design enhet (se figur 5). Mønstrene vises i en rullegardinliste som kalles handlinger og vises i handlinger- menyen på programvaren.
    Merk: mønster maler må utformes foran eksperimentet og lagres som en 8-biters TIFF-fil før malen lastes inn i programvaren.
  6. For å skape et mønster på tvers av hele mikro-brønn, må design enheten som skal replikeres. En design enhet dekker rundt 0,1 mm2 av mikro-brønn området. I Replication -menyen angir du ønsket antall kolonner og rader (linjer i programvaren) (se figur 5).
  7. Hvis du vil generere et kontinuerlig mønster, justerer du avstanden mellom kolonner og linjer. i denne studien oppnås mønstre av sammenhengende striper ved hjelp av-20 til-35 μm mellomrom (negativ avstand) mellom kolonnene. Denne negative avstanden skaper en overlapping mellom design enheter (figur 5B, C).
  8. Angi laser dosen i Replication -menyen. Den optimale laser dosen i denne innstillingen og ved bruk av PLL-PEG er 1390 mJ/mm2. Mønster varigheten vises i estimert tid -panelet.
    Merk: i dette tilfellet er laser effekt 7,5 mW/mm2, som tar ca 30 s til mønster hver design enhet, med en dose på 1390 mJ/mm2. For eksempel, en design enhet (0,1 mm2) kopiert i 4 kolonner og 4 linjer (rundt 1,6 mm2), ville ta 8 min å være mønstret. Høyere laser doser kan være nødvendig hvis kulturen parabolen overflaten er paddivert med PEG-SVA (ca dobbel laser dose sammenlignet med PLL-PEG).
  9. Velg Lås og vent til mønsteret nesten vises.
  10. Hvis du vil oppdatere parameterne for et mønster, klikker du den beslektede handlingen, og deretter låser du opp og oppdaterer parameterne. Velg Lås på nytt når mønster oppdateringen er fullført.
  11. Mønsteret av flere proteiner i samme mikro-brønn (sekvensiell mikro-mønster runder) krever en nøyaktig justering av mønstrene. For å oppnå slik justering, laste opp alle sett av ønsket mønster maler samtidig (mønstre av første og andre photopatterning runder).
  12. Angi rep like Rings-og dose parametere for mønster malene. Når parameterne er angitt, vises mønstrene som handlinger i handlings listen. Lagre denne mal konfigurasjonen som en fil i programvare (se figur 5D).
  13. På handlinger -listen velger du bare de spesifikke handlingene som skal mønstret under det første mønsteret, og fjerner markeringen for handlingene som skal være mønstret under andre mønster runde (se figur 5D).
  14. Naviger til området der referanse mønsteret ble produsert i trinn 4,2 (for eksempel den øverste regionen i referanse mønsteret mikro-brønn, se Figur 4E). Juster fokuset til den optimale Z-posisjonen (oppnådd i trinn 4,4).
    Merk: det anbefales på det sterkeste å velge et perfekt fokus system på mikroskopet som brukes (hvis tilgjengelig), som sikrer at den optimale Z-posisjonen for mønstre opprettholdes gjennom hele photopatterning prosessen.
  15. Velg avspillings symbolet for å starte mønsteret. Mønster varigheten vises i estimert tid -panelet. På Leonardo er programvareversjon 4,4 mønsteret fullført når alle handlinger vises blå i visualiserings menyen.

6. protein inkubasjons

Merk: mikro-brønner er inkubert med ECM proteiner (fortrinnsvis fluorescensmerkete-merket). Disse vil bare binde til de områdene hvor PEG ble kløyvde gjennom photopatterning prosessen beskrevet i trinn 5. Hver brønn inneholder en PDMS sjablong med 4 mikro-brønner, som vil tillate testing 4 forskjellige forhold samtidig, for eksempel, inkubasjons av et annet protein i hver mikro-brønn (se Figur 4D).

  1. Bruk fluorescensmerkete proteiner (for eksempel laminin, fibronektin eller fibrinogen som bøyes likt til rød eller grønn fluorophores) for å visualisere mikro-mønstrene (se trinn 6,7 og 9,4). Alternativt kan adsorberes umerkede proteiner vises på senere stadier ved hjelp av immunofluorescence.
    Merk: ECM-proteiner (for eksempel fibronektin) kan merkes ved hjelp av eksisterende protokoller33 og kommersielt tilgjengelige fluorescens merkings pakker (dvs. Alexa 488 merking Kit), eller kjøpt lett merket (for eksempel, bøyd fibrinogen-488 eller laminin-rød fluorescerende rhodamine, se tabell over materialer).
  2. Under sterile forhold, Forbered ønsket konsentrasjon av ECM proteiner (10 μg/mL laminin, fibronektin eller fibrinogen i PBS, se tabell over materialer og trinn 4,3).
    Merk: Fluorescensmerkete-merket ECM proteiner er lysfølsomme og bør beskyttes mot lys (wrap parabol i aluminiumsfolie) og bør holdes på isen til enhver tid.
  3. Under sterile forhold, vask mikro-brønnene tre ganger med 20 μL av PBS å fjerne PLPP.
  4. Fjern 18 μL av PBS fra alle mikro-brønner og tilsett 20 μL av ECM-protein løsning til hver mikro-brønn. Ruge ved romtemperatur, for 20-30 min og beskytte mot lys.
    Merk: optimalt belegg inkubasjons tider kan variere avhengig av type og konsentrasjon av proteiner.
  5. Etter inkubasjons, Fjern 15 μL av ECM-protein løsning og vask mikro-brønnene tre ganger med 20 μL av PBS.
    Merk: la det alltid være ca. 5 μL av PBS mellom vask.
  6. Hvis mønsteret med bare ett protein (en runde med mikro-mønster), skal du fortsette enten til oppbevaring av kultur fatet (trinn 10) eller til celle plating (trinn 11, og se figur 2). Hvis du utfører en ny runde med et annet protein mønster i samme mikro-brønn, skal du enten lagre kultur fatet (trinn 10) eller blokkere løs bindings steder (trinn 7, og se figur 2).
  7. Valgfri kvalitetskontroll trinn: visualisere og bilde trykte mønstre ved hjelp av en epifluorescence mikroskop før plating celler. Velg egnede fluorescerende kanaler og Juster eksponeringstidene tilsvarende.
    Merk: for å sammenligne fluorescens intensitet av mønstre mellom eksperimenter, er det viktig å bruke samme eksponeringstid for de samme proteinene.

7. blokkering løs bindende nettsteder (bare for flere protein mønstre)

Merk: mikro-mønstre med flere proteiner i samme mikro-brønn innebærer sekvensiell mønster trinn (se figur 2). Et blokkerings middel (PLL-PEG eller BSA) legges til mikro-brønnene for å hindre kryssbinding, som oppstår når det andre inkubert proteinet (trinn 9) binder seg til det første inkubert proteinet (trinn 6), og unngår dermed en blanding av proteiner i mønstrene.

  1. Under sterile forhold, tilsett 20 μL av PLL-PEG (0,1 mg/mL i PBS) eller BSA (1% BSA i PBS) som et blokkerings trinn for å hindre kryssbinding.
    Merk: blokkering effektivitet kan variere avhengig av arten av proteiner som brukes og affinitet mellom dem. Det anbefales å teste både PLL-PEG og BSA som blokkerende agenter på forhånd (Figur 10D-I).
  2. Ruge blokkerings middel ved romtemperatur i 1 time og beskytter mot lys. Fjern 15 μL blokkerings middel og vask alle mikro-brønner tre ganger med 20 μL av PBS. La alltid ca 5 μL av PBS mellom vask.
  3. Fjern 18 μL av PBS fra alle mikro-brønner og tilsett 5 μL av PLPP til hver mikro-brønn, slik at PLPP er homogen på hele overflaten av mikro-brønner.

8. andre runde med photopatterning (kun for flere protein mønstre)

Merk: etter den første runden med photopatterning og protein inkubasjons genereres et mikro-mønster. I løpet av den andre runden av photopatterning, vil mønsteret for det andre proteinet bli generert i samme mikro-brønn (se figur 2C og figur 5D). I programvaren velger du riktig mønster maler (handlinger), som vil bli mønstret i løpet av denne runden (se figur 5D).

  1. Naviger til den første mikro-brønnen (Figur 4D). Sørg for riktig overlapping mellom den digitale AVKASTNINGEN og mikro-brønnen.
  2. Last inn mal konfigurasjonen som ble lagret tidligere (trinn 5,12), og Velg hvilke handlinger som skal være mønstret under den andre photopatterning runden (Opphev valg av handlinger fra første runde, se figur 5D).
  3. Velg avspillings symbolet for å starte mønsteret. Kontroller at laseren er på i programvaren.

9. andre runde av protein inkubasjons (bare for flere protein mønstre)

Merk: i denne delen av protokollen, fluorescensmerkete-merket protein/s vil bli inkubert på kultur parabolen etter den andre runden av photopatterning.

  1. Under sterile forhold, vask mikro-brønnen tre ganger med 20 μL av PBS å fjerne PLPP. Fjern 18 μL av PBS og tilsett 20 μL av ECM-protein løsning på hver mikro-brønn. Ruge ved romtemperatur i 20-30 min. og beskyttes mot lys.
    Merk: optimalt belegg inkubasjons tider kan variere avhengig av type og konsentrasjon av proteiner.
  2. Etter inkubasjons, Fjern 15 μL av ECM-protein løsning og vask mikro-brønnene tre ganger med 20 μL av PBS. La alltid ca 5 μL av PBS mellom vask.
  3. Enten videre til lagring av kultur rett (trinn 10) eller til celle plating (trinn 11, og se figur 2).
  4. Valgfritt kvalitetskontroll trinn: ved hjelp av en epifluorescence mikroskop, visualisere og bilde trykte mønstre før plating celler. Velg egnede fluorescerende kanaler og Juster eksponeringstiden.
    Merk: for å sammenligne fluorescens intensitet av mønstre mellom eksperimenter, er det viktig å bruke samme eksponeringstid for de samme proteinene.

10. lagring av mikro-mønstre

Merk: mikro-mønstre med adsorberes proteiner kan lagres i ulike trinn av protokollen (se figur 2). Hvis mikro-mønster med flere proteiner, kan mikro-mønstre lagres etter første runde av mikro-mønster eller etter de to sekvensielle rundene av mikro-mønsteret er fullført (se figur 2B).

  1. Ved paddivert med PLL-PEG, Oppbevar mikro-mønstrene i PBS (3 mL per brønn) ved 4 ° c i opptil 3 dager.
  2. Hvis kulturen parabolen var paddivert med PEG-SVA, mikro-mønstre kan lagres i opptil 1 måned. For å gjøre dette, skyll mikro-mønstre intensivt med dobbelt destillert deionisert vann og tørk med en steril luftpistol Argon eller nitrogen, selv om normal luft kan også brukes. Etter tørking kan mikro-mønstre lagres ved 4 ° c i opptil 1 måned (PRIMO system support team, personlig kommunikasjon).

11. plating celler

Merk: i løpet av de neste trinnene, vil cellene bli belagt på forberedt mikro-mønstret kultur parabolen/es. I disse studiene brukes en neuronal cellelinje (CAD-celler)31. Men denne protokollen kan justeres til å studere andre celletyper av interesse (justere celle plating protokollen som kreves).

  1. Differensiere CAD-celler for 48 h ved hjelp av differensiering medium (DMEM supplert med 1% glutamin, uten serum, og med 1% pen/strep, se tabell over materialer).
  2. Plate 1 mL medium med celler i det indre glasset godt, dekker alle mikro-brønner og plassere kulturen parabolen i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator.

Representative Results

Etter protokollen ovenfor resulterer i mikro-mønstret overflater, belagt med ECM protein/s av interesse. Vi bruker disse mønstrene til å spore neuronal pathfinding.

Genererte mønstre bør være en presis representasjon av malen. Et eksempel er vist i figur 6 der en digital mønster mal (figur 6a) representerer en design enhet (figur 5B), resulterte i definerte mikro-mønstre, alt fra 20 til 2 μm bredde, belagt med merket Fibrinogen (figur 6B). Ved hjelp av ImageJ, fluorescens intensitet målinger ble innhentet både vertikalt (figur 6C) og horisontalt (figur 6E) langs stripe og fra en tilsvarende bakgrunn region 15 μm over hver stripe. Bakgrunns målingene ble trukket fra mønster målingene for hver stripe bredde.

En begrensning av systemet er at en kant effekt kan observeres (figur 6B, øverste stripe) når du skriver ut funksjoner ≥ 20 μm, med et høyere intensitet signal på mønsteret kantene sammenlignet med sentrum (figur 6D, første toppen av fluorescerende intensitet profil). I våre eksperimenter var oppløsnings grensen ca 2 μm; på denne bredden observerte vi en betydelig nedgang (med ca 50%) i fibrinogen fluorescens intensitet i forhold til intensiteten av de bredere striper (figur 6F, G). Mønstre ved hjelp av PRIMO systemet og protokollen skissert her produsert reproduserbar mønstre, med det høyeste standardavviket av gjennomsnittlig fluorescerende intensitet målt for 2 μm bredde fra fire individuelle replikerte design enheter (figur 6 G). variasjon i de mønstrede stripene ble også funnet å være lav; koeffisient av variasjon varierte fra 3 til 10%, med 20 μm og 2 μm striper har den største interne variasjonen. Dette vil trolig være et resultat av kanten effekt og oppløsning grensen av systemet, henholdsvis. Merk at for disse målingene bare vi målte intensiteten i midten av striper, for å unngå ujevn belysning som følge av målet brukes til å tilegne seg disse bildene (vignettering, figur 6E).

Enkelte eksperimenter kan innebære spørsmål som krever definerte protein konsentrasjoner, som kan oppnås på to måter: 1) varierende protein konsentrasjonen (figur 7A, B). Inkubasjons med ulike konsentrasjoner av laminin, resulterer i signifikant forskjellig fluorescens intensitet, øker med høyere protein konsentrasjoner (figur 7B). 2) laser dosen som brukes til å holde den anti-selvklebende film (PEG) kan varieres. Høyere laser doser vil fjerne Bunnstoff filmen i større grad, genererer mer bindende områder for proteiner av interesse (figur 7C, D) som resulterer i signifikant forskjellige fluorescens intensitet, øker med høyere laser doser (figur 7D).

Varierende laser dose tillater generering av protein graderinger i samme mønster. Dette vises i Figur 8a, der en gradient mal ble utformet ved hjelp av ulike gråskala nivåer, fra svart (ingen laser effekt) til hvit (maksimal laser effekt).

Laser intensitet er proporsjonal med den gråskala nivå av malen (fra 0 til 255 i en 8-bits bilde), genererer graderinger av UV-belysning. Målingen av fluorescens intensitet profil langs gradient stripe er lineær i mønsteret malen (Figur 8B) og i det genererte gradient mønster (Figur 8C, D). Dette er reproduserbar blant alle graderte striper i samme mal og gradient mønster (Figur 8B, D). Generering av slike graderinger er svært nyttig og bidrar til å etterligne in vivo miljøer hvor cellene ofte reagerer på graderinger av bioaktive proteiner34,35,36,37.

Celler forstand skiftende ekstracellulære miljøer, men analyser som gjør studiet av celle atferd når cellene støter på slike endringer er begrenset. LIMAP kan brukes til mikro-mønster med flere proteiner i samme mikro-brønn. Eksempler er vist i figur 9 hvor kryss-mønstre ble generert med striper av fibronektin (horisontal) og laminin (vertikal). Når du lager mønstre med flere proteiner, er det avgjørende å bruke et blokkerings trinn mellom første og andre protein inkubasjons for å forhindre kryssbinding av proteiner (se trinn 7). Blokkerings effektiviteten kan variere avhengig av de biokjemiske egenskapene til proteinene som brukes til belegg, og vi anbefaler at du tester flere blokkerings buffere, inkludert PLL-PEG (0,1 mg/mL) og BSA (1%). For å evaluere denne tverr bindende effekten utførte vi målinger av fluorescens intensitet ved hjelp av ImageJ (figur 9), og vi viste at kryssbinding kan reduseres dramatisk ved bruk av PLL-Peg-buffer (0,1 mg/ml) for fibronektin og laminin kryss-mønstre (figur 9D, H).

De genererte kryss mønstrene ble brukt til cellulære analyser med CAD-celler (Figur 10A, B) eller rotte rygg-root Ganglion (DRG) neurons (Figur 10C). Deres neurites (CAD) og axons (DRG) vokser langs ulike linjer. CAD-celler brukes som en neuronal modell siden de viser en lignende integrin uttrykk profil i forhold til primære neurons og de fortsatt vise utgangen vekst kjegler etter 48 h i kultur (Figur 10B), noe som gjør dem egnet for pathfinding Studier.

For å undersøke mulige cytotoksisk effekter av de genererte mikro-mønstre mot primære neurons, DRG neurons ble isolert og kultivert på mikro-mønstre etter en tidligere publisert protokoll38. Resultatene viser at primære neurons tolerere mikro-mønstre miljø (Figur 10C). Vi studerer for tiden hvordan en rekke ECM proteiner påvirker axonal (neurite) pathfinding. Foreløpige bevis på begreper som finnes i CAD-celler vil bli ytterligere undersøkt ved hjelp av DRG neurons. For å validere kvaliteten på genererte mikro-mønstre, er det ønskelig å bildemønstre av fluorescens mikroskopi for å sikre at mønsteret kantene er godt definert før du går videre til celle plating. Under bilde prosessen er det viktig å sikre den optiske justeringen mellom mikroskopet og kameraet for å unngå den perifere mørkere effekten (vignettering) som påvirker den bakre analysen og tolkningen av data. I tillegg kan du skaffe deg et bilde av et mønster fritt område som bruker samme eksponeringstider som skal brukes til å avbilde mønstrene og subtrahere dette bildet fra mønster bildet.

Oppsummert, for god kvalitet mikro-mønster generasjon, er det tilrådelig å vurdere proteinkonsentrasjon (figur 7A, B), laser doser (figur 7C, D), protein bakgrunn nivåer (figur 6E, F, H) og en effektivt blokkerings trinn (figur 9) ved bruk av flere proteiner. Kvaliteten på mikro-mønstrene som genereres med LIMAP er avgjørende for å oppnå pålitelige og reproduserbar data fra cellulære analyser.

Figure 1
Figur 1: oppsett av mikro-mønster teknikker: microcontact utskrift og laser-assistert mønster. (A) Microcontact utskrift bruker en litograferte Master med definerte mikro-funksjoner for å generere en PDMS stempel som er inkubert med protein av interesse. Dette proteinet blir deretter overført (stemplet) på en glass overflate, genererer protein mikro-mønstre. (B) laser-assistert mønster teknikker inkluderer photopatterning og direkte laser mønster. (C) de fleste photopatterning tilnærminger bruker en UV lyskilde og en photomask (enten i kontakt med underlaget overflaten eller i fokalplanet av målet) med ønsket geometri for å holde seg til Peg Bunnstoff overflaten i bestemte posisjoner, opprette et definert mønster. En påfølgende protein inkubasjons trinn resulterer i protein absorpsjon bare til laser-kløyvde regioner. (D) LIMAP er en photopatterning teknikk som ikke krever en photomask i kontakt med underlaget (dvs. en maskless og kontaktløse tilnærming). LIMAP bruker en foto-initiator, som aktiveres ved lave doser av en laser, spalte lys utsatte områder av PEG. Dette skaper feste områder for absorpsjon av sekvensiell protein. (E) direkte laser mønster bruker høyt energi lys for å direkte etse Peg-filmen, slik at det blir proteinbinding i disse etset regionene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjema som viser et sammendrag av trinnene i mikro-mønster-protokollen. (A) mikro-mønster med ett protein innebærer bare en runde av mikro-mønster (photopatterning og protein inkubasjons) og kan utføres på under 8 h. (B) mikro-mønstre med flere proteiner krever to sekvensielle runder med mikro-mønstre og kan gjennomføres i 1-2 dager, avhengig av antall mikro-mønstre forberedes. Det er mulig å gå gjennom B-versjonen av protokollen i 1 dag med arbeid. Kontinuerlige piler angir direkte flyt av trinn i protokollen. Usammenhengende piler angir at det er en betydelig tidsforskjell mellom ett trinn og det andre (se trinn 6,6 og 9,3). (C) skjematisk visning av eksempel mønstre oppnådd etter en runde med mikro-mønster (røde striper) eller to sekvensielle runder med mikro mønster (røde og grønne striper). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: mønster mal generering er allsidig med LIMAP. (A, B) Eksempler på mønster maler designet med ImageJ (A armbrøst, B bokstaver). Figurer som trekkes i hvitt, ble projisert ved maksimal laser effekt, og figurer som ble trukket i svart ble ikke projisert. (C, D) Mikro-mønstre oppnådd med LIMAP fra maler etter inkubasjons med 10 μg/mL fibrinogen (grønn). (C) armbrøst er 50 μm bredde og 50 μm høyde avstand av 75 μm horisontalt og 50 μm vertikalt. (D) bokstaver er 80 μm bredde og 85 μm høyde. Skala barer i C og D representerer 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: essensielle materialer for LIMAP-protokollen. (A) sjablonger som brukes i denne protokollen er 20 mm diameter, tynn SIRKULÆR form PDMS brikker (250 μm tykkelse) som inneholder 4 mikro-brønner (4 mm diameter hver). Volumene som brukes i mikro-brønnene varierer fra 5 til 20 μL, betydelig redusere mengden av reagenser og proteiner som trengs for hvert eksperiment. (B) 6 godt glassbunn parabolen der sjablonger er allerede plassert i hver brønn. Micro-brønner inneholder 20 μL av PBS for å gjøre dem synlige. (C) kalibrerings parabolen der den indre glass brønnen er merket med en grønn merkepenn, som vil bli brukt til å kalibrere laser fokuset. (D) skjematisk visning av topp venstre godt fra 6-brønn glassbunn parabolen i B (skissert med stiplet rød sirkel). Den indre glassbunn brønnen er representert i hvitt og sjablongen er vist i grått. Sjablongen inneholder 4 mikro-brønner (nummerert 1-4), for testing av 4 ulike eksperimentelle forhold (f. eks, ulike protein konsentrasjoner, mønster geometri, kombinasjoner av proteiner, etc.). Stjernen representerer mikro-brønn som inneholder referanse mønsteret. (E) skjematisk visning av mikro-brønn der et referanse mønster har blitt generert i den øverste delen (pil med fylt spissen). Dette referanse mønsteret er nødvendig for å oppnå optimalt laser fokus for mønsteret (se trinn 4). Pil med Tom pil spiss angir det sentrale området av mikro-brønnen, som vil bli brukt til påfølgende mønster etter system kalibrering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: programvareoppsett for mikro-mønster. (A) mønster mal med parallelle striper designet med ImageJ og lagret som en 8-bits TIFF-fil. (B-D) Skjematisk visning av digitale ROIs (regioner av interesse) som vil overlappe med dagens mikro-brønner der mikro-mønstre vil bli generert. (B) mønsteret malen som skal brukes (lengde 1824 pixel = 415 μm, bredde 1140 pixel = 260 μm) er valgt på Leonardo og er anslått på avkastningen som en design enhet (røde striper i svart stiplet rektangel), som vil dekke ca 0,1 mm2 av mikro-brønn området. Design enheten er replikert i 4 kolonner og 4 linjer i Replication -menyen (mal konfigurasjon), og skaper et mønster på tvers av mikro-brønnen. Legg merke til mellomrommet mellom kolonnene. (C) til mønster sammenhengende striper, avstanden mellom kolonnene må justeres. I dette tilfellet, for å oppnå en overlapping mellom design enheter, blir avstanden mellom kolonnene angitt i rep like Rings menyen som negativ avstand,-20 μm. (D) for å mønster flere proteiner i samme mikro-brønn, en nøyaktig justering av mønstrene er Nødvendig. UnderProgramvare oppsett trinnet (trinn 5), laste opp alle ønskede mønster maler samtidig. På handlinger -listen velger du bare de spesifikke handlingene som skal mønstret under hvert mønster, og fjerner markeringen for resten av handlingene (trinn 5,12, 5,13 og 8,2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: analyse av mønster variasjon ved hjelp av LIMAP. (A) mønster mal designet med ImageJ brukes til mikro-mønster fire striper av varierende bredde (20, 10, 5, 2 μm, fra topp til bunn). (B) mikro-mønster oppnådd etter inkubasjons med 10 μg/ml av fluorescensmerkete-merket fibrinogen (grønn). (C) intensitet målinger langs en vertikal linje krysse striper av mikro-mønster. (D) vertikal fluorescens intensitet profil innhentet fra måling i (C). Merk at ved større bredder (20 μm) er det en variasjon i vertikal profil forårsaket av akkumulering av protein på kantene av stripen, noe som resulterer i to distinkte fluorescens intensitet topper (kant effekt). Denne effekten sees bare i stripe bredder ≥ 20 μm. (E) intensitet målinger langs avbildet horisontale linjer (fluorescens og bakgrunn). (F) horisontal fluorescens intensitet profiler innhentet fra målinger i (E). (G) graf som viser gjennomsnittlig intensitet for hver stripe bredde, målt fra fire individuelle replikerte design enheter (Inter-mønster variasjon). Merk den reduserte protein absorpsjon til mønstre av 2 μm stripe bredde. (H) variasjonen i de mønstrede stripene (variasjonskoeffisienten) var lav for alle stripe bredder, alt fra 3 til 10%. Data i G og H vist som gjennomsnittet ± SD. statistisk analyse i G og H ble utført ved hjelp av enveis ANOVA (Kruskal-Wallis) ikke-parametrisk test med flere sammenligninger. P-verdien er < 0.001 for * * betydning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: effekten av variasjoner i laser effekt og proteinkonsentrasjon for å absorpsjons effektiviteten av protein. (A) PLL-Peg-overflaten var laser-kløyvde med en konstant laser dose (1390 mJ/mm2) og inkubert med de indikerte konsentrasjonene av fluorescensmerkete-merket laminin (magenta). (B) kvantifisering av fluorescens intensitet av laminin striper i (A). (C) de ulike indikerte laser dosene ble påført etterfulgt av inkubasjons med samme konsentrasjon (10 μg/ml) av fluorescensmerkete-merket fibronektin (grønn). (D) kvantifisering av fluorescens intensitet av fibronektin striper i (C) viser at høyere laser doser relateres til høyere nivåer av adsorberes protein. Alle mål er bakgrunnen trekkes fra. Eksempel numre er angitt nederst i kolonner. data vises som gjennomsnittet ± SEM. statistisk analyse ble utført ved hjelp av ikke-parametrisk mann-Whitney-test med tosidig beregning. P-verdi er < 0.0001 for * * * * betydning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: generering av en proteinkonsentrasjon gradient i et mikro-mønster. (A) gradient mønster mal i gråskala. (B) fluorescens intensitet profil målt fra (A). (C) mønster oppnådd med LIMAP fra mønster mal i (A) etter inkubasjons med 10 μg/ml fluorescensmerkete-merket fibronektin (grønn). (D) fluorescens intensitet profil n = 3 striper og bakgrunn representert som GJENNOMSNITTET ± SEM, viser den lineære økningen i intensiteten av protein gradient. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: kryssbinding effekt når mønstre flere proteiner sekvensielt. (A-C, E-G) Cross-mønstre med 10 μm striper av fluorescensmerkete-merket fibronektin (cyan, horisontal) og fluorescensmerkete-merket laminin (magenta, vertikal). (A-C) Prøver behandlet med BSA blokkerings buffer. (E-F) Prøver behandlet med PLL-PEG for blokkering av løs bindings steder (trinn 7). (A, E) Sammenslåtte fluorescens kanaler som viser både fibronektin og laminin. (B, F) Bilde som viser fibronektin bare. (C, G) Bilde som viser laminin bare. For C, note tilstedeværelsen av laminin også på horisontale fibronektin positive striper som skyldes ineffektiv blokkering av ledige bindende nettsteder med BSA. For G, Vær oppmerksom på at blokkering med PLL-PEG hindrer effektiv binding av laminin til fibronektin striper. (D, H) Fluorescens intensitet profiler Hentet fra indikerte målinger (diagonalt gul linje) i A og E, henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: Cross-mønstre for å undersøke neurite/axon pathfinding. (A-C) Cross-mønstre med 10 μm striper av fluorescensmerkete-merket fibronektin (cyan, horisontal) og fluorescensmerkete-merket laminin (magenta, vertikal). (A, B) Fluorescerende bilder av CAD-celler med neurites vokser langs mikro-mønstre. For å visualisere neurites, celler ble kultivert for 48 h, fast med 4% PFA og beiset for tubulin (A) eller tubulin og utgangen (B). (C) Rat rygg-root GANGLION (DRG) neurons med axons vokser langs mikro-mønstre. For å visualisere axons, DRG neurons var kultivert for 72 h, fast med 4% PFA og beiset for tubulin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11: eksempler på vanlige negative resultater oppnådd ved generering av mikro-mønstre med LIMAP. (A-C) Sub-optimale mønstret striper på 10 μg/mL fluorescensmerkete-merket fibrinogen (grønn) innhentet under forskjellige forhold. (A) mikro-godt tørket ut under mønster generasjon. Legg merke til de høye nivåene av fluorescens i bakgrunnen (pil) og tilstedeværelsen av PBS krystaller (stjernene). (B) sømmen mellom stripene var ikke riktig justert underProgramvare oppsett som resulterer i usammenhengende striper med hull (pil) blant design enheter (se trinn 3.4.7). (C) laser fokus var sub-optimale forårsaker diffust striper (piler) som ikke representerer den faktiske stripe bredder av mønsteret malen, som skal være 20, 10, 5, 2 μm fra topp til bunn, som i (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

LIMAP (PRIMO) fordeler med mikro-mønster og sammenligning med microcontact utskrift
Mens microcontact utskrift er muligens den mest brukte mikro-mønstre teknikk i biologisk felt39, synes det å være et økende antall forskere bruker LIMAP teknologi40,41,42 ,43,44. Her presenterte vi en protokoll ved hjelp av PRIMO, et kommersielt tilgjengelig system for LIMAP. Nedenfor diskuterer vi kort mulige fordeler og begrensninger ved microcontact utskrift og LIMAP Foto mønstre.

Microcontact utskrift krever litograferte mestere produsert av Spin-belegg en foto-maske (vanligvis SU-8) på et glass eller silisium wafer, som deretter laser-etset med ønsket mikro-funksjoner. Disse malene brukes som maler for å opprette et PDMS-stempel45. Stempelet er inkubert med et valgt protein som absorberer til det, og blir deretter overført (stemplet) på cellen kultur parabolen. Prosessen med absorpsjon av proteinet til PDMS stempel er avhengig av proteinkonsentrasjon, buffer og inkubasjonstid. Disse parametrene må testes på forhånd for optimale resultater46.

Masters kan brukes i et betydelig antall eksperimenter, som varer i måneder eller år, hvis riktig bevart. Men en begrensende faktor av denne teknologien er nødvendigheten av å re-designe nye litograferte mestere for hver ønsket endring. Endringer i eksperimentell design kan føre til tidkrevende produksjon av nye mestere (opp til flere uker) og dermed forsinke eksperimenter. Til sammenligning krever ikke LIMAP photopatterning en fysisk original. den brukerprogramvare gener ert mønster maler som kan brukes til fleksibelt tilpasse ønsket geometri av mikro-mønstre til å endre forskningsspørsmål. LIMAP kan også brukes til å generere protein graderinger innenfor samme mikro-mønster (Figur 8), som er vanskeligere å få i en reproduserbar måte ved hjelp av microcontact utskrift47.

Videre er mikro-mønster oppløsning oppnås med LIMAP, i vårt tilfelle, er 2 μm (figur 6B).

Ved å nærme seg denne resolusjonen økte variasjonen mellom-og mønster. Generering av mønstre rundt eller over 10 μm bredde var svært reproduserbar (figur 6G, H). Tvert imot, med microcontact utskrift er det vanskelig å konsekvent få oppløsninger under 10 μm og det er vanlig å finne gjenstander når stempling små funksjoner (data ikke vist).

Vi har vist at LIMAP kan brukes til mikro-mønster flere proteiner (figur 9) innenfor samme mikro-brønn, slik at ytterligere nivåer av kompleksitet som skal legges til eksperimenter. Selv om dette kan oppnås med microcontact utskrift, samkjøre forskjellige proteiner med høy presisjon kan være teknisk ganske krevende. Mens mønstre flere proteiner bruker LIMAP synes rett frem, er det viktig å nevne at kryss-binding av proteiner gjennom sekvensiell belegg prosedyrer kan reduseres gjennom blokkering reagenser, men ikke helt eliminert (figur 9).

Når det gjelder kostnaden av den ene eller den andre teknikken, LIMAP som beskrevet her krever kjøp av mikro-mønster utstyr (PRIMO) som kan installeres på ulike fluorescens mikroskop og krever en motorisert scenen. Selv om denne investeringen er i utgangspunktet kostnadskrevende, er det ingen ekstra kjøp annet enn forbruksvarer (sjablonger, PEG og PLPP) på lang sikt forbundet med LIMAP. Alternativt kan PDMS sjablonger også produseres i laboratoriet av egne eksperimentator følgende publiserte protokoller18,32. De største kostnadene for microcontact utskrift kan knyttes til produksjon av nye mestere, som kan bli betydelige hvis eksperimenter krever nye mønstre.

En ulempe med LIMAP er den relativt lave gjennomstrømningen tilnærming av denne teknikken. Microcontact utskrift kan produsere et stort antall mikro-mønstre raskt og effektivt i et samtidig stempling trinn, sammenlignet med den nødvendige sekvensielle laser mikro-mønstre med LIMAP. For eksempel er det mulig å produsere 6 stemplet glass coverslips i ca 2 h med microcontact utskrift ved hjelp PDMS frimerker (unntatt stempel forberedelse); mønstre et lignende område (6-vel parabol) med LIMAP ville ta rundt 4 h, unntatt prosedyren av overflaten passivering (vurderer mønsteret malen konfigurasjonen beskrevet i trinn 5,12 og se figur 5B).

En annen rate begrensende faktor av LIMAP-teknologi er den lange belysnings tiden som kreves for mønster store områder (30 s per design enhet med en 7,5 mW/mm2 laser). I slike tilfeller kan microcontact utskrift være et foretrukket alternativ. En nylig tilgjengelig Foto-initiator (PLPP gel, tabell av materialer) bør betydelig redusere tiden det tar for mønsteret, slik at generering av hundrevis av mikro-mønstre i store områder (opp til 8 mm2) i løpet av få minutter.

En annen viktig faktor å ta hensyn til når mikro-mønster overflater for cellekultur er reproduserbarhet av mikro-mønstre blant ulike eksperimentelle repetisjoner, i forhold til variasjon oppnådd med microcontact utskrift. For eksempel er diagrammene vist i figur 7B, D representative data for tre uavhengige eksperimentelle repetisjoner med svært like resultater (data ikke vises). Basert på vår erfaring og tidligere publikasjoner, er dette nivået av reproduserbarhet vanskelig å oppnå med microcontact Printing48,49,50,51,52.

I motsetning til andre foto mønstre teknikker som krever enten dedikert kjemi til ingeniør fotosensitive materialer eller bruk av foto-allergifremkallende stoffer, som vanligvis ikke er veldig biokompatible3, den lysfølsomme komponenten av LIMAP (PLPP ) er biokompatible og godt tolerert av cellene21; i våre hender har vi ikke opplevd noen cytotoksisitet over en rekke celler, inkludert CAD, DRG neurons (Figur 10), fibroblaster, epitelceller, og melanom celler (data ikke vist). En annen fordel med LIMAP som bruker PRIMO sammenlignet med andre foto mønster teknikker er at ingen photomask er nødvendig. Analog med microcontact trykking, ny photomasks ville nød å bli designet og utviklet for enhver ønsket mønster.

Alle begrensningene nevnt ovenfor for microcontact utskrift, se den manuelle tilnærmingen til teknikken. Det er imidlertid mulig å øke gjennomstrømningen og reproduserbarhet for microcontact utskrift ved hjelp av en automatisert enhet med stempel belastning og trykk kontroll53.

Viktige trinn i protokollen og problemløsing for LIMAP ved hjelp av PRIMO
En av de vanligste problemene som finnes i denne protokollen er å ha høye nivåer av bakgrunnen fluorescens innenfor mikro-mønstre. Dette kan skyldes uttørking av mikro-brønner som ofte oppstår på grunn av deres små volum. Når dette skjer, vises PBS-krystaller ofte rundt ECM-mønstrene (Figur 11A).

Utilstrekkelig eller ineffektiv vasketrinn etter protein inkubasjons kan også føre til høye nivåer av bakgrunns fluorescens. Dette kan observeres spesielt ved bruk av protein konsentrasjoner på 10 μg/mL (fig. 11B) eller høyere. Det overskytende av protein i bakgrunnen kan reduseres ved å inkludere ekstra vasketrinn med PBS.

Tilstedeværelsen av protein bakgrunn må måles og karakteriseres i hvert eksperiment, beregning bakgrunnen fluorescens intensitet (figur 6E) og trekke den fra mikro-mønstre intensitet (figur 6F-H og figur 7B, D). Høy protein bakgrunn kan ha en innvirkning på vedlegget og spirende av DAK-celler, og kompromittere tolkningen av resultatene.

Å ha mellomrom mellom design enheter er et vanlig problem når brukere har begrenset erfaring (Figur 11B), som oppstår som et resultat av utilstrekkelig overlapping mellom mønstre. To parametre i Leonardo programvare kan justeres for å overvinne dette: 1) en negativ avstand mellom kolonnene kan være nødvendig, avhengig av utformingen av mønsteret (trinn 5,7 og se figur 5B, C). Alternativt, 2) bruke gradient alternativet i Expert menyen for å sy kolonnene. En rask test for å bestemme optimale avstands parametre kan utføres ved hjelp av UV-lim (tabell av materialer). En liten dråpe av dette limet påføres et glass lysbilde, som deretter dekkes med et glass dekkglass, lage en film. Den innebygde UV limet er photopatterned med mønster malen av interesse ved hjelp av en lav laser dose (30 mJ/mm2). Den UV-eksponerte områder av den innebygde limet vil bli kurert, blir synlig under lyse-feltet mikroskopi. Testresultatene er visualisere for å evaluere oppnådd avstand innenfor mønsteret. I våre neuronal eksperimenter kan et gap mellom striper ha negativ innvirkning på celle atferden og produsere variasjoner i vekst dynamikk (enten redusert hastighet eller oppgivelse av banen).

I den siste oppdateringen av Leonardo programvare (på tidspunktet for publisering, Leonardo 4,11), er det mulig å laste opp tidligere utformet større mønster maler som dekker et mye større område (opp til 8 mm2 ved hjelp av 20x objektiv) av mikro-brønn overflaten sammenlignet med dagens 0,1 mm2 per design enhet, eliminerer behovet for å sy sammen de mindre design enheter. Udefinert kanter kan skyldes mangel på laser fokus justering under mønster generering (Figur 11C). Det er derfor viktig å kalibrere laseren og utføre referanse mønster trinn (se trinn 4) før mønsteret. Dårlig definerte striper resultere i variasjoner i stripe bredde, noe som gjør sammenhengen mellom axon vekst dynamikk og stripe bredde vanskelig. Axons har også en tendens til å forlate striper som har diffust kanter. I tillegg kan variasjon i kantene også bli funnet ved utskrift av striper på 10-20 μm bredde eller høyere, noe som resulterer i et høyere proteininnhold på kantene i forhold til de sentrale regionene i mønsteret (figur 6B, D). Denne kanten effekten er produsert av en ikke-homogen diffusjon av foto-initiativtaker under photopatterning prosessen. Den photoscission reaksjonen er oksygen avhengig, noe som diffunderer mer på kantene. Denne kanten effekten kan minimeres homogenisere bildet-initiativtaker med en pipette i mikro-brønnen under photopatterning prosessen. Videre kan en ny kommersialisert Foto-initiator (PLPP gel), også redusere kant effekten (PRIMO system support team, personlig kommunikasjon).

Mikro-utskrift av mer enn ett protein kan resultere i kryssbinding (figur 9A-D). Dette kan minimeres ved å øke blokkerings effektiviteten som brukes til å oppta løs bindings områder mellom de inkubasjons trinnene for de to forskjellige proteinene. Cross-binding av proteiner kan forurolige reproduserbarhet av eksperimentelle utfall og kan føre til feil tolkning av data, siden det er vanskelig å bestemme bidraget av hvert protein for å axon vekst dynamikk og andre celle atferd.

Konklusjon
Vi håper at den oppgitte protokollen ved hjelp av LIMAP forenkler generering av protein mikro-mønstre gjennom bruk av PRIMO systemet. Mens vår protokoll fokuserer på hvordan du pålitelig produsere mikro-mønstre i 2D glassoverflater, andre har vist at det er mulig å bruke LIMAP for mikro-mønstre av myke underlag54, og microstructured overflater for 3D-kulturer42. Disse mikro-mønstre kan være et allsidig verktøy for å studere cellulære svar på endringer i deres mikro-miljø.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er støttet av BBSRC, EPSRC, MRC og Wellcome Trust. C.B. Laboratory er en del av Wellcome Trust senter for Cell-Matrix forskning, University of Manchester, som er støttet av kjernen finansiering fra Wellcome Trust (Grant nummer 088785/Z/09/Z). Forfatterne ønsker å anerkjenne finansieringen gitt av bioteknologi og biologisk vitenskap Research Council (BBSRC) til C.M., K.J. (BB/M020630/1) og PA (BB/P000681/1) og av Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) og medisinsk Forskningsråd (MRC) senter for doktorgrads opplæring i regenererende medisin til A.K. (EP/L014904/1). Forfatterne takker Alvéole for deres korrespondanse og deres etter-salg support team. Forfatterne takker Peter mars og Roger Meadows fra Bioimaging Facility, University of Manchester for deres hjelp med mikroskopi. Den Bioimaging Facility mikroskop brukt i denne studien ble kjøpt med tilskudd fra BBSRC, Wellcome Trust og University of Manchester Strategic Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa 488 protein labeling kit Invitrogen A10235 Working concentration: N.A.
Alexa 647 protein labeling kit Invitrogen A20173 Working concentration: N.A.
CAD cells ECACC 8100805 Working concentration: N.A.
Conjugated fibrinogen-488 Molecular Probes F13191 Working concentration: 10 μg/ml
DMEM culture medium Gibco 11320033 Working concentration: N.A.
Epifluorescence Microscope** Nikon Eclipse Ti inverted Working concentration: N.A.
Fibronectin Sigma F4759 Working concentration: 10 μg/ml
(after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above)
(diluted in PBS)
Fiji-Image J www.imagej.nih.gov Version 2.0.0-rc-54/1.51f Working concentration: N.A.
Fluorescent highlighter Stabilo Stabilo Boss Original Working concentration: N.A.
HEPES Gibco 15630080 Working concentration: 1M
Inkscape software Inkscape Check last update Working concentration: N.A.
Laminin-red fluorescent rhodamine Cytoskeleton, Inc. LMN01 Working concentration: 10 μg/ml
(diluted in PBS)
Leonardo software Alvéole version 4.11 Working concentration: N.A.
L-Glutamine Sigma G7513 Working concentration: 1%
Micro-manager software Open imaging Check last update Working concentration: N.A.
Motorized x/y stage PRIOR Scientific Proscan II Working concentration: N.A.
NIS Elements Software Nikon NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs) Working concentration: N.A.
PBS (without Ca2+, Mg2+) Sigma D8537 Working concentration: 1X
PDMS Stencils Alvéole visit www.alveolelab.com Working concentration: N.A.
PEG-SVA Laysan bio, Inc. MPEG-SVA-5000-1g Working concentration: 50 mg/ml
Phalloidin 405 Abcam ab176752 Working concentration: 1:1000
Photo-initiator (PLPP) Alvéole Classic PLPP Working concentration: 14.5 mg/ml
Photo-initiator (PLPP gel) Alvéole PLPP gel Working concentration: 4.76% diluted in ethanol
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V) Working concentration: N.A.
PLL-PEG SuSoS (also distributed by Alvéole) www.alveolelab.com Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS)
Poly-L-Lysine Sigma P4707 Working concentration: 0.01%
Primo equipment Alvéole www.alveolelab.com Working concentration: N.A.
Pen/Strep Thermo Fisher 15140122 Working concentration: 1%
Tubulin anti-alpha antibody Abcam DM1A Working concentration: 1:1000
CAD cells
Tubulin anti-beta 3 antibody Sigma T8660 Working concentration: 1:500
DRG neurons
UV adhesive Norland Products NOA81 Working concentration: N.A.
1 well glass bottom dish Cellvis D35-20-1.5-N Working concentration: N.A.
6 well glass bottom dish Cellvis P06-20-1.5-N Working concentration: N.A.
20x objective** Nikon no phase ring (check updated catalogue) Working concentration: N.A.
**Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alvéole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alamdari, O. G., Seyedjafari, E., Soleimani, M., Ghaemi, N. Micropatterning of ECM Proteins on Glass Substrates to Regulate Cell Attachment and Proliferation. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (4), 234-240 (2013).
  2. Sunami, H., Yokota, I., Igarashi, Y. Influence of the pattern size of micropatterned scaffolds on cell morphology, proliferation, migration and F-actin expression. Biomaterials Science. 2 (3), 399-409 (2014).
  3. Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
  4. Marino, A., et al. Two-photon polymerization of sub-micrometric patterned surfaces: investigation of cell-substrate interactions and improved differentiation of neuron-like cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (24), 13012-13021 (2013).
  5. Joo, S., et al. Effects of ECM protein micropatterns on the migration and differentiation of adult neural stem cells. Scientific Reports. 5, (2015).
  6. Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. K. Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning. Elife. 7, (2018).
  7. Javaherian, S., O'Donnell, K. A., McGuigan, A. P. A Fast and Accessible Methodology for Micro-Patterning Cells on Standard Culture Substrates Using Parafilm (TM) Inserts. Plos One. 6 (6), (2011).
  8. Smirnov, M. S., Cabral, K. A., Geller, H. M., Urbach, J. S. The effects of confinement on neuronal growth cone morphology and velocity. Biomaterials. 35 (25), 6750-6757 (2014).
  9. Albert, P. J., Schwarz, U. S. Dynamics of Cell Ensembles on Adhesive Micropatterns: Bridging the Gap between Single Cell Spreading and Collective Cell Migration. PLOS Computational Biology. 12 (4), (2016).
  10. Evans, A. R., et al. Laminin and fibronectin modulate inner ear spiral ganglion neurite outgrowth in an in vitro alternate choice assay. Developmental Neurobiology. 67 (13), 1721-1730 (2007).
  11. Nichol, R. H., Hagen, K. M., Lumbard, D. C., Dent, E. W., Gomez, T. M. Guidance of Axons by Local Coupling of Retrograde Flow to Point Contact Adhesions. Journal of Neuroscience. 36 (7), 2267-2282 (2016).
  12. Burdick, J. A., Khademhosseini, A., Langer, R. Fabrication of gradient hydrogels using a microfluidics/photopolymerization process. Langmuir. 20 (13), 5153-5156 (2004).
  13. Schwartz, P. V. Molecular transport from an atomic force microscope tip: A comparative study of dip-pen nanolithography. Langmuir. 18 (10), 4041-4046 (2002).
  14. Barbulovic-Nad, I., et al. Bio-microarray fabrication techniques--a review. Critical Reviews in Biotechnology. 26 (4), 237-259 (2006).
  15. Shafagh, R. Z., Vastesson, A., Guo, W. J., van der Wijngaart, W., Haraldsson, T. E-Beam Nanostructuring and Direct Click Biofunctionalization of Thiol-Ene Resist. Acs Nano. 12 (10), 9940-9946 (2018).
  16. Kobayashi, J., Yamato, M., Itoga, K., Kikuchi, A., Okano, T. Preparation of microfluidic devices using micropatterning of a photosensitive material by a maskless, liquid-crystal-display projection method. Advanced Materials. 16 (22), (2004).
  17. Bernard, A., et al. Printing patterns of proteins. Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).
  18. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  19. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  20. Fink, J., et al. Comparative study and improvement of current cell micro-patterning techniques. Lab Chip. 7 (6), 672-680 (2007).
  21. Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light-Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
  22. Belisle, J. M., Correia, J. P., Wiseman, P. W., Kennedy, T. E., Costantino, S. Patterning protein concentration using laser-assisted adsorption by photobleaching, LAPAP. Lab Chip. 8 (12), 2164-2167 (2008).
  23. Belisle, J. M., Kunik, D., Costantino, S. Rapid multicomponent optical protein patterning. Lab Chip. 9 (24), 3580-3585 (2009).
  24. Heinz, W. F., Hoh, M., Hoh, J. H. Laser inactivation protein patterning of cell culture microenvironments. Lab Chip. 11 (19), 3336-3346 (2011).
  25. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Thery, M., Piel, M. Protein Micropatterns: A Direct Printing Protocol Using Deep UVs. Microtubules: In Vivo. 97, 133-146 (2010).
  26. Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. Polyacrylamide hydrogel micropatterning. Methods in Cell Biology. 120, 93-116 (2014).
  27. Waldbaur, A., Waterkotte, B., Schmitz, K., Rapp, B. E. Maskless projection lithography for the fast and flexible generation of grayscale protein patterns. Small. 8 (10), 1570-1578 (2012).
  28. Kang, J., Choi, J. C., Kim, M., Jung, H. R., Doh, J. Photopatterning with a printed transparency mask and a protein-friendly photoresist. Methods in Cell Biology. 119, 55-72 (2014).
  29. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  30. Morlat, S., Gardette, J. L. Phototransformation of water-soluble polymers. Part II: photooxidation of poly(ethylene oxide) in aqueous solution. Polymer. 44 (26), 7891-7897 (2003).
  31. Qi, Y., Wang, J. K., McMillian, M., Chikaraishi, D. M. Characterization of a CNS cell line, CAD, in which morphological differentiation is initiated by serum deprivation. Journal of Neuroscience. 17 (4), 1217-1225 (1997).
  32. Shrirao, A. B., et al. A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
  33. Pankov, R., Momchilova, A. Fluorescent labeling techniques for investigation of fibronectin fibrillogenesis (labeling fibronectin fibrillogenesis). Methods in Molecular Biology. 522, 261-274 (2009).
  34. Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12542-12547 (2002).
  35. Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), (2014).
  36. Tang, Y., Qiu, Q. F., Zhang, F. L., Xie, M., Huang, W. H. Quantifying orientational regeneration of injured neurons by natural product concentration gradients in a 3D microfluidic device. Lab Chip. 18 (6), 971-978 (2018).
  37. Srinivasan, P., Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R. Synergistic effects of 3D ECM and chemogradients on neurite outgrowth and guidance: a simple modeling and microfluidic framework. PLoS One. 9 (6), (2014).
  38. de Luca, A. C., Faroni, A., Reid, A. J. Dorsal root ganglia neurons and differentiated adipose-derived stem cells: an in vitro co-culture model to study peripheral nerve regeneration. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  39. Khadpekar, A. J., Khan, M., Sose, A., Majumder, A. Low Cost and Lithography-free Stamp fabrication for Microcontact Printing. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
  40. Delepine, C., et al. Altered microtubule dynamics and vesicular transport in mouse and human MeCP2-deficient astrocytes. Human Molecular Genetics. 25 (1), 146-157 (2016).
  41. Decock, J., Schlenk, M., Salmon, J. B. In situ photo-patterning of pressure-resistant hydrogel membranes with controlled permeabilities in PEGDA microfluidic channels. Lab Chip. 18 (7), 1075-1083 (2018).
  42. Stoecklin, C., et al. A New Approach to Design Artificial 3D Microniches with Combined Chemical, Topographical, and Rheological Cues. Advanced Biosystems. 2 (7), (2018).
  43. Toraille, L., et al. Optical Magnetometry of Single Biocompatible Micromagnets for Quantitative Magnetogenetic and Magnetomechanical Assays. Nano Letters. , (2018).
  44. Theodoly, O., et al. Live nanoscopic to mesoscopic topography reconstruction with an optical microscope for chemical and biological samples. PLoS One. 13 (12), (2018).
  45. Ermis, M., Antmen, E., Hasirci, V. Micro and Nanofabrication methods to control cell-substrate interactions and cell behavior: A review from the tissue engineering perspective. Bioactive Materials. 3 (3), 355-369 (2018).
  46. von Philipsborn, A. C., et al. Microcontact printing of axon guidance molecules for generation of graded patterns. Nature Protocols. 1 (3), 1322-1328 (2006).
  47. Ricoult, S. G., Kennedy, T. E., Juncker, D. Substrate-bound protein gradients to study haptotaxis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, (2015).
  48. Bietsch, A., Michel, B. Conformal contact and pattern stability of stamps used for soft lithography. Journal of Applied Physics. 88 (7), 4310-4318 (2000).
  49. Hui, C. Y., Jagota, A., Lin, Y. Y., Kramer, E. J. Constraints on microcontact printing imposed by stamp deformation. Langmuir. 18 (4), 1394-1407 (2002).
  50. Sharp, K. G., Blackman, G. S., Glassmaker, N. J., Jagota, A., Hui, C. Y. Effect of stamp deformation on the quality of microcontact printing: theory and experiment. Langmuir. 20 (15), 6430-6438 (2004).
  51. Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Biebuyck, H. Stability of molded polydimethylsiloxane microstructures. Advanced Materials. 9 (9), 741-746 (1997).
  52. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21 (22), 2257-2268 (2009).
  53. Chakra, E. B., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, C. D., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
  54. Pasturel, A., Strale, P., Studer, V. Tailoring 3D cell culture templates with common hydrogels. bioRxiv. , (2019).

Tags

Immunologi og infeksjon mikro-mønster mønstre mikro-mønstre LIMAP ekstracellulære matrise (ECM) Nevron celle atferd migrasjon axonal vekst pathfinding beslutningstaking
Lys-indusert molekylær absorpsjon av proteiner ved hjelp av PRIMO system for mikro-mønstre å studere Cell Svar å ekstracellulære Matrix proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Melero, C., Kolmogorova, A.,… More

Melero, C., Kolmogorova, A., Atherton, P., Derby, B., Reid, A., Jansen, K., Ballestrem, C. Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins. J. Vis. Exp. (152), e60092, doi:10.3791/60092 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter