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Medicine

चूहों में हेपेटोसाइट न्यूक्लियर प्लॉइडी के अनुमान के लिए सीटू विधि में एक उच्च-थ्रूपुट

Published: April 19, 2020 doi: 10.3791/60095
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1,3
1Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)

Summary

हम निश्चित/क्रायोपआरक्षित ऊतक नमूनों के भीतर हेपेटोसाइट संख्या और परमाणु प्लोइडी में परिवर्तन को मापने के लिए एक मजबूत, लागत प्रभावी और लचीली विधि प्रस्तुत करते हैं जिसमें प्रवाह साइटोमेट्री की आवश्यकता नहीं होती है । हमारा दृष्टिकोण जिगर की चोट और रोग की प्रगति पर नज़र रखने के लिए जिगर साइटोलॉजी आदर्श का एक शक्तिशाली नमूना-व्यापी हस्ताक्षर प्रदान करता है।

Abstract

जब जिगर घायल हो जाता है, हेपेटोसाइट संख्या कम हो जाती है, जबकि सेल आकार, परमाणु आकार और प्लॉयडी बढ़ जाती है। नॉन-पैरान्चिमल कोशिकाओं जैसे कोलैंगियोसाइट्स, मायोफिब्रोब्लास्ट, जनक और भड़काऊ कोशिकाओं का विस्तार भी क्रोनिक लिवर डैमेज, टिश्यू रीमॉडलिंग और रोग प्रगति का संकेत देता है । इस प्रोटोकॉल में, हम चोट, पुरानी बीमारी और कैंसर से जुड़े जिगर की सेलुलर संरचना में परिवर्तन की गणना के लिए एक सरल उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। हम दिखाते हैं कि कैसे दो आयामी (2डी) ऊतक वर्गों से निकाली गई जानकारी का उपयोग एक नमूने के भीतर हेपेटोसाइट परमाणु प्लॉइडी को इंगित करने और जांचने के लिए किया जा सकता है और उपयोगकर्ता को सीटू में यकृत के भीतर विशिष्ट प्लाइडी सबसेट का पता लगाने में सक्षम बनाता है। हमारी विधि के लिए फिक्स्ड/फ्रोजन लिवर मटेरियल, बेसिक इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री रिएजेंट्स और किसी भी स्टैंडर्ड हाई-कंटेंट इमेजिंग प्लेटफॉर्म तक पहुंच की जरूरत होती है । यह मानक प्रवाह साइटोमेट्री तकनीकों के लिए एक शक्तिशाली विकल्प के रूप में कार्य करता है, जिसके लिए ताजा एकत्र ऊतकों के व्यवधान, स्थानिक जानकारी की हानि और संभावित विशिथिलता पूर्वाग्रह की आवश्यकता होती है।

Introduction

स्तनधारी जिगर में हेपेटोसाइट्स द्विपरमाणु कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए ठप साइटोकिनेसिस से गुजर सकते हैं, और डीएनए एंडोप्रतिकृतियां 16N डीएनए सामग्री तक युक्त पॉलीप्लाइड नाभिक का उत्पादन करने के लिए। प्रसवोत्तर विकास, वृद्धावस्था और विविध सेलुलर तनाव1के जवाब में समग्र सेलुलर और परमाणु प्लॉइडी में वृद्धि । पॉलीप्लॉयडाइजेशन की प्रक्रिया गतिशील और प्रतिवर्ती2है , हालांकि इसका सटीक जैविक कार्यअस्पष्ट3 बना हुआ है . बढ़ी हुई प्लॉइडी कम होने की प्रजनन क्षमता4, आनुवंशिक विविधता2, पुरानी चोट5 और कैंसर संरक्षण6के अनुकूलन से जुड़ी हुई है । हेपेटोसाइट प्लॉइडी परिवर्तन बदल सर्कैडियन लय7औरप्रात:8 के परिणामस्वरूप होते हैं । सबसे विशेष रूप से, जिगर की प्लॉयडी प्रोफ़ाइल चोट और रोग9से बदल जाती है, और सम्मोहक साक्ष्य से पता चलता है कि विशिष्ट प्लॉयडी परिवर्तन, जैसे कि बढ़ी हुई '8एन नाभिक या 2एन हेपेटोसाइट्स की हानि, गैर-मादक फैटी यकृत यकृत रोग (NAFLD) प्रगति3,,10,या वायरल संक्रमण11के अंतर प्रभाव पर नज़र रखने के लिए उपयोगी हस्ताक्षर प्रदान करते हैं।

सामान्य शब्दों में, जिगर की चोट और उत्थान हेपेटोसाइट सेल आकार और परमाणु क्षेत्र12में वृद्धि के साथ जुड़े हुए हैं, साथ ही हेपेटोसाइट्स की समग्र संख्या में कमी के साथ, विशेष रूप से 2N डीएनए सामग्री10,,11के साथ उन । जिगर में पैरान्चिमल चोट भी अक्सर गैर-पैराचिमल कोशिकाओं (एनपीसी) के विस्तार के साथ होती है, जिसमें स्ट्रोमल मायोफीब्रोब्लास्ट, भड़काऊ कोशिकाएं और बाइपोटलिवर प्रोजेनिटर कोशिकाएं शामिल होती हैं। उच्च थ्रूपुट विधियां जो पैरान्चिमल सेल संख्या और परमाणु प्लॉइडी का मात्रात्मक साइटोलॉजिकल प्रोफाइल प्रदान करते हैं, जबकि एनपीसी में परिवर्तन के लिए भी लेखांकन करते हैं, इसलिए चोट और बीमारी के दौरान यकृत की प्रतिक्रिया को ट्रैक करने के लिए अनुसंधान और नैदानिक उपकरणों के रूप में काफी क्षमता होती है। हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा के मानव नमूनों में प्लॉइडी स्पेक्ट्रा के सीटू विश्लेषण में हाल ही में सम्मोहक यह भी प्रदर्शित करता है कि ट्यूमर के भीतर परमाणु प्लॉयडी नाटकीय रूप से बढ़ जाती है और विशेष रूप से टीपी5313के कम भेदभाव और हानि के साथ अधिक आक्रामक ट्यूमर उपप्रकारों में परिलक्षित होती है। इसलिए, इस बात की प्रबल संभावना है कि परमाणु प्लॉइडी के मात्रात्मक मूल्यांकन में पद्धतिगत प्रगति भविष्य में यकृत कैंसर की शकुन प्रोफाइलिंग में सहायता करेगी ।

इस प्रोटोकॉल में, माउस यकृत ऊतक वर्गों के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए एक लचीली उच्च-थ्रूपुट पद्धति वर्णित है, जो हेपेटोसाइट संख्याओं, एनपीसी प्रतिक्रिया और परमाणु प्लॉइडी(चित्रा 1)का आकलन करने के लिए आंतरिक रूप से कैलिब्रेटेड विधि की विस्तृत साइटोमेट्रिक प्रोफाइलिंग प्रदान करती है। हेपेटोसाइट्स को परमाणु आकार और परमाणु मोर्पोमेट्री के लक्षण वर्णन से पहले हेपेटोसाइट परमाणु कारक 4 अल्फा (एचएनएफ4α) इम्यूनोलेबलिंग द्वारा एनपीसी से प्रतिष्ठित किया जाता है। "न्यूनतम डीएनए सामग्री" का अनुमान सभी परिपत्र परमाणु मास्क के लिए मतलब Hoechst 33342 तीव्रता (डीएनए घनत्व के लिए एक प्रॉक्सी) इंटरपोलेट त्रि-आयामी (3 डी) परमाणु मात्रा के साथ एकीकृत करके किया जाता है। हेपेटोसाइट न्यूनतम डीएनए सामग्री को परमाणु प्लॉइडी प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए एनपीसी का उपयोग करके कैलिब्रेट किया जाता है।

छवि अधिग्रहण, परमाणु विभाजन और छवि विश्लेषण उच्च सामग्री इमेजिंग का उपयोग करके किया जाता है, जिससे दो आयामी (2डी) यकृत वर्गों के बड़े क्षेत्रों की जांच की जा सके । सभी परिपत्र हेपेटोसाइट न्यूक्लिक के लिए नमूना-व्यापी प्लॉइडी प्रोफ़ाइल का उत्पादन करने के लिए उच्च सामग्री छवि विश्लेषण डेटा के स्वचालित पोस्ट-प्रोसेसिंग के लिए एक कस्टम-लिखित कार्यक्रम प्रदान किया जाता है। यह स्टीरियोलॉजिकल छवि विश्लेषण (एसआईए)10,11,,14,15के आधार पर परमाणु प्लाइडी की गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर डाउनलोड करने के लिए स्वतंत्र उपयोग करके किया जाता है। SIA पद्धति पहले एक सटीक, हालांकि श्रमसाध्य, जिगर14में हेपेटोसाइट परमाणु ploidy का आकलन करने के लिए विधि के रूप में प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मान्य किया गया है, परिपत्र परमाणु आकृति विज्ञान और परमाणु आकार और डीएनए सामग्री के बीच एक मोनोटोनिक संबंध संभालने । इस प्रोटोकॉल में परमाणु मॉर्थोमेट्री और होचस्ट 33342 लेबलिंग के आकलन से दोनों परमाणु मापदंडों को मापा जाता है। प्रत्येक परमाणु मुखौटा के लिए "न्यूनतम डीएनए सामग्री" की गणना एनपीसी का उपयोग करके हेपेटोसाइट परमाणु प्लाइडी के अंशांकन के बाद की जाती है, जिसमें एक ज्ञात 2−4N डीएनए सामग्री है और इसलिए एक उपयोगी आंतरिक नियंत्रण के रूप में काम करती है।

पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री विधियों की तुलना में16 वर्णित दृष्टिकोण हेपेटोसाइट परमाणु प्लॉइडी को सीटू में मूल्यांकन करने में सक्षम बनाता है और ताजा ऊतक या विसग्रीकरण विधियों तक पहुंच की आवश्यकता नहीं होती है जो परिणामों को पूर्वाग्रह कर सकते हैं और मानकीकरण करना मुश्किल हो सकता है। सभी एसआईए-आधारित दृष्टिकोणों के साथ, भूमध्य रेखीय विमान के बाहर बड़े नाभिक की धारा ओं के कारण परमाणु प्लॉइडी उपवर्ग ों और gt;2N को 2डी नमूने द्वारा कम प्रतिनिधित्व दिया जाता है। ऊतक-व्यापी प्लॉइडी प्रोफ़ाइल सभी परिपत्र हेपेटोसाइट परमाणु मास्क के लिए न्यूनतम डीएनए सामग्री का वर्णन करती है, और एक ही प्लॉयडी के दो असतत ("गैर-स्पर्श") न्यूली हैं, मोनोन्यूक्लियर हेपेटोसाइट्स और द्विपरमाणु कोशिकाओं के बीच सीधे भेदभाव नहीं करती है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल की सादगी के लिए यह काफी गुंजाइश की अनुमति देता है जैसे अंतरपरमाणु रिक्ति या सेल परिधि विश्लेषण के रूप में अतिरिक्त मापदंडों के लिए खाते में अनुकूलित किया जा करने के लिए, कि सेलुलर ploidy का एक अधिक विस्तृत आकलन प्रदान द्विपरमाणु कोशिकाओं की पहचान की सुविधा होगी ।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों को पहले सीआईपीएफ एथिक्स कमेटी ने मंजूरी दी थी । चूहों को सेंट्रो डी Investigación Príncipe फेलिप (वेलेंसिया, स्पेन) में एक रोगजनक मुक्त सुविधा में रखे गए थे, जो एक प्रयोगात्मक पशु ब्रीडर, उपयोगकर्ता और आपूर्ति केंद्र (रेग नहीं) के रूप में पंजीकृत थे। वर्तमान लागू यूरोपीय और स्पेनिश पशु कल्याण विनियमों (आरडी 53/2013) के तहत ईएस 46 250 0001 002) ।

1. ऊतक कटाई और नमूना तैयारी

नोट: यह प्रोटोकॉल पूर्व निर्धारण या क्रायोप्रिजर्वेशन के बिना ऊतक को फ्रीज करने का वर्णन करता है। पहले तय/क्रायोपआरक्षित नमूनों के लिए धारा 2 और छोड़ कदम ३.१ के लिए आगे बढ़ना । सभी विश्लेषण वयस्क महिला C57BL/6 चूहों 12−16 सप्ताह की आयु का उपयोग कर किया गया है ।

  1. फेन्टनाइल/पेंटोबार्बिटल इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा जानवरों का बलिदान करें जिसके बाद सर्वाइकल अव्यवस्था होती है । वेंट्रल साइड का सामना करने वाले माउस के साथ, पेट की गुहा को खोलें और चिमटी के साथ त्वचा को लोभी करके जिगर को बेनकाब करें और सर्जिकल कैंची का उपयोग करके निचले पेट के आधार से स्टर्नम के आधार पर एक ऊर्ध्वाधर चीरा प्रदर्शन करें।
  2. ध्यान से ठीक चिमटी का उपयोग कर पित्ताशय की थैली को हटा दें, जिगर को काटदें और फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) से भरी 10 सेमी पेट्री डिश प्लेट में चयनित जिगर लोबुल को कुल्ला दें।
    नोट: प्रत्येक जानवर के लिए एक ही जिगर पालि की तुलना करने की सिफारिश की जाती है, इस मामले में औसत पालि का उपयोग किया गया था।
  3. कमरे के तापमान (आरटी) पर इष्टतम काटने के तापमान (OCT) माध्यम के साथ एक लेबल क्रायोमोल्ड भरें । OCT बुलबुले से बचें। यदि वे दिखाई देते हैं, तो उन्हें सुई या पिपेट टिप का उपयोग करके मोल्ड के किनारे पर धकेल दें।
  4. एक भरे हुए OCT cryomold में जिगर लोबुल एंबेड और तुरंत सूखी बर्फ पर जगह के लिए तेजी से ठंड सुनिश्चित करते हैं । क्रायोसेक्शनिंग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोमोल्ड स्टोर करें।

2. क्रायोसेक्शनिंग

  1. ऊतक क्षरण से बचने के लिए सूखी बर्फ पर क्रायोमोल्ड्स का परिवहन करें। क्रायोसेक्शनिंग से पहले क्रायोस्टेट के अंदर 20 मीटर की गति से -20 डिग्री सेल्सियस तक सेट हो जाता है।
  2. प्लास्टिक क्रायोमोल्ड के आधार पर दबाव डालकर नमूना बाहर निकालें। आरटी में गर्म नमूना डिस्क के लिए तरल OCT लागू करें, क्रायोस्टेट में स्थिति और एक अक्टूबर एंबेडेड जिगर का नमूना देते हैं । कोमल दबाव लागू करें और डिस्क के लिए नमूना चिपक जाती है सुनिश्चित करने के लिए अक्टूबर के लिए 3 मिन रुको ।
    नोट: ऊतक क्षरण से बचने के लिए जितना संभव हो उंगलियों के साथ नमूना हैंडलिंग से बचें।
  3. नमूने को क्रायोस्टेट के हाथ में लॉक करें और ओरिएंटेशन को समायोजित करें ताकि नमूने का किनारा क्रायोस्टेट ब्लेड के समानांतर हो। ऊतक तक पहुंचने तक नमूने में काट ें।
  4. 6 μm मोटाई पर नमूना अनुभाग। 5 एस के लिए नमूना पर एक लेबल पॉलीमाइड-लेपित स्लाइड रखें ताकि नमूना स्लाइड पर चिपक जाए। 3−5 मिन के लिए आरटी पर स्लाइड रखें, फिर, सर्वोत्तम परिणामों के लिए, सीधे धारा 3 पर जाएं।
    नोट: कई ताजा जमे हुए नमूनों के प्रसंस्करण के लिए प्रजनन योग्य परिणाम अस्थायी रूप से सूखी बर्फ पर एक स्लाइड बॉक्स में स्लाइड भंडारण द्वारा प्राप्त किया गया है जब तक सभी नमूनों पर कार्रवाई की गई है । इस दृष्टिकोण का उपयोग करते समय सभी स्लाइडों को धारा 3 में आगे बढ़ने से पहले आरटी को समतुल्य करने की अनुमति देते हैं। फॉर्मेलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (एफएफपीई) नमूनों का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस इस विधि से बढ़ जाता है। एफएफपीई नमूनों से आगे बढ़ने के लिए, पॉलीमाइड-इलाज स्लाइड पर 40 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान से वर्गों को पकड़कर 4 μm. माउंट पर अनुभाग। 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए हीट स्लाइड, फिर सीरियल आरटी वॉश (5 मिन) द्वारा जाइलीन (x2), इथेनॉल 100% (x2), 96% (x2), 70% (x1) और DH2O (x1) युक्त कोप्लिन जार में deparaffinize। एंटीजन जगह साइट बफर में 20 min के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर टी. 3.2 कदम आगे बढ़ना.

3. फ्लोरेसेंस इम्यूनोलेबलिंग

  1. एक धुएं हुड में ऊतक वर्गों को ठीक करें टी आरटी में 10 मिन के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 1 mL लागू करके । एक पीबीएस भरे Coplin जार को स्लाइड हस्तांतरण और कोमल आंदोलन का उपयोग कर 3 मिन के लिए धोने (3x दोहराने) ।
    नोट: अब से इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया के अंत तक, नमूने के सूखने से बचें।
  2. प्रत्येक ऊतक अनुभाग के आसपास के क्षेत्र को सुखाएं और हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करके चारों ओर जाएं। आरटी में 15 मिन के लिए पीबीएस में 0.5% nonionic सरफेसटैंट (यानी, ट्राइटन एक्स-100) के साथ Permeabilize। फिर पीबीएस में धोने कोमल आंदोलन (2x दोहराने) का उपयोग कर 3 मिन के लिए Coplin जार भरा ।
  3. 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 5% हॉर्स सीरम, पीबीएस में 0.2% एनप्याजिक सरफेसेंट (आरटी में कम से कम 1 घंटे के लिए) के फ़िल्टर किए गए समाधान का उपयोग करके ब्लॉक करें।
  4. प्राथमिक HNF4α एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट एक अंधेरे आर्द्र धुंधला कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में बफर अवरुद्ध करने में पतला (एंटीबॉडी और विशिष्ट कमजोर पड़ने के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
  5. स्लाइड ्स को पीबीएस भरे कोप्लिन जार में रखें और कोमल आंदोलन (दोहराने 4x) का उपयोग करके 3 मिन के लिए धोएं।
  6. एलेक्सा-488 कंजुगेटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी और Hoechst के साथ इनक्यूबेट फ़िल्टर किए गए 1% बीएसए और 0.2% nonionic सर्फेक्टेंट में एक अंधेरे आर्द्र धुंधला कक्ष में आरटी में 2 घंटे के लिए (एंटीबॉडी और विशिष्ट कमजोर के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
  7. स्लाइड ्स को पीबीएस भरे कोप्लिन जार में रखें और कोमल आंदोलन (दोहराने 4x) का उपयोग करके 3 मिन के लिए धोएं। कोमल आंदोलन (दोहराने 2x) का उपयोग कर3 मिन के लिए डीडीएच2ओ में धोएं।
  8. एक कवरस्लिप (24 x 60 मिमी) पर फ्लोरोसेंट बढ़ते मीडिया की दो बूंदों को रखकर माउंट स्लाइड और इस पर स्लाइड बिछाने, कोमल दबाव लागू करके बुलबुले को नष्ट करने। लंबे समय तक भंडारण के लिए, स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ किनारों पर सील कवरस्लिप और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।
  9. आगे बढ़ने से पहले, अच्छे निर्धारण और इम्यूनोलेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्लाइड की जांच करें।
    नोट: अपेक्षित परिणामों के लिए चित्रा 2ए, बी देखें।

4. फ्लोरेसेंस छवि अधिग्रहण

नोट: इस चरण के लिए, एक उच्च सामग्री इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म(सामग्री की तालिका)की आवश्यकता होती है जो स्वचालित फ्लोरेसेंस छवि अधिग्रहण का समर्थन करता है।

  1. इमेजिंग सिस्टम चालू करें और एक नया अधिग्रहण प्रोटोकॉल खोलें।
  2. 10x उद्देश्य का चयन करें, देखने के क्षेत्र के क्षेत्र पर ध्यान दें (इस मामले में 0.6 मिमी2)।
  3. उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर (चरण 3.6 के अनुसार) का उपयोग करके फ्लोरेसेंस छवियों को प्राप्त करने के लिए पैरामीटर सेट करें। Hoechst और Alexa-४८८ के लिए, 390/18 और 438/24 एनएम उत्तेजना और 432.5/48 और 475/24 एनएम उत्सर्जन के साथ "DAPI" और "GFP" चैनलों का चयन करें ।
  4. नमूना ध्यान केंद्रित करें और यह सुनिश्चित करें कि सिग्नल तीव्रता गैर-संतृप्त है। सुनिश्चित करें कि छवि कैप्चरिंग सभी छवियों के लिए एक ही एक्सपोजर समय के साथ की जाती है या एक ऐसी प्रणाली का उपयोग करती है जहां एक्सपोजर समय के लिए फ्लोरेसेंस की तीव्रता को ठीक किया जाता है।
  5. नमूना स्कैन करें और नमूना आकार के आधार पर ऊतक अनुभाग (लगभग 20−50 दृश्य के क्षेत्रों) का पूरा कवरेज प्राप्त करने के लिए पर्याप्त छवियां प्राप्त करें।
  6. छवि डेटाबेस की समीक्षा करें, मैन्युअल रूप से नष्ट (i) खराब केंद्रित क्षेत्रों, (ii) प्रत्येक ऊतक अनुभाग की सीमाओं पर उन (पूर्वाग्रह सेल घनत्व गणना से बचने के लिए), और (iii) ऊतक अनुभाग के मुड़ा/शारीरिक रूप से क्षतिग्रस्त क्षेत्रों युक्त उन अगर मौजूद हैं ।

5. स्वचालित फ्लोरेसेंस छवि विश्लेषण

नोट: इस कदम के लिए उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)में सक्षम की आवश्यकता है: (1) स्वचालित रूप से ४०५ एनएम (परमाणु विभाजन) पर छवियों के भीतर Hoechst लेबल नाभिक की पहचान, (2) मतलब Hoechst परमाणु तीव्रता और मोर्पोमेट्री का आकलन, और (3) दहलीज विश्लेषण ४८८ एनएम (HNF4α) पर परमाणु फ्लोरेसेंस की +/-स्थिति निर्धारित करने के लिए । कार्यक्रम के भीतर विभाजन और थ्रेसहोल्ड मापदंडों का नेत्रहीन आकलन और समायोजन करने के लिए कुछ बुनियादी ऑपरेटर प्रशिक्षण/विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नाभिक और एचएनएफ4α+/-स्थिति इष्टतम रूप से गेटेड(चित्रा 2)हो ।

  1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, अधिग्रहण फ़ाइल खोलें जिसमें होचस्ट (405 एनएम) और एचएनएफ4α (488 एनएम) छवियां चरण 4.5 से शामिल हैं, और एक नया विश्लेषण प्रोटोकॉल बनाएं।
  2. परमाणु विभाजन (Hoechst, ४०५ एनएम) के लिए और हेपेटोसाइट/एनपीसी दहलीज विश्लेषण (HNF4α, ४८८ एनएम) के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तरंगदैर्ध्य को परिभाषित करें ।
  3. नाभिक को बेहतर ढंग से अलग करने के लिए सॉफ्टवेयर के परमाणु विभाजन मापदंडों (जैसे "न्यूनतम परमाणु क्षेत्र" और परमाणु पहचान "संवेदनशीलता") को समायोजित करें।
    नोट: एनपीसी के ऊपर हेपेटोसाइट्स के अच्छे विभाजन को प्राथमिकता दी जानी चाहिए। हेपेटोसाइट न्यूक्लिक न्यूक्लिी को विशेष रूप से गोल किया जाता है (इंटरक्वॉलटाइल साइज रेंज: 40−64 माइक्रोन2)। एनपीसी नाभिक, जैसे साइनसॉइडल एंडोथेलिया, आकार में चपटा/अंडाकार या अनियमित होते हैं और आम तौर पर हेपेटोसाइट्स (इंटरक्वॉलिटाइल आकार रेंज: 30−43 माइक्रोन2)की तुलना में छोटे और अधिक निकटता से पैक किए जाते हैं। माउस लिवर के लिए, न्यूनतम परमाणु क्षेत्र ‧23 μm2 और 65% की "संवेदनशीलता" का पता लगाने का उपयोग किया गया (अपेक्षित परिणामों के लिए चित्रा 2सी, डी देखें)। संवेदनशीलता यह निर्धारित करती है कि पिक्सेल समूहों को उनकी तीव्रता के आधार पर व्यक्तिगत नाभिक के रूप में कैसे पहचाना जाता है और स्वचालित छवि विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित प्रत्येक नमूने के लिए अनुभवजन्य रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए।
  4. हेपेटोसाइट्स (एचएनएफ4α+) और गैर-पैरान्चिमल कोशिकाओं (HNF4α-) की इष्टतम गेटिंग सुनिश्चित करने के लिए 488 एनएम पर दहलीज तीव्रता को संशोधित करें।
    नोट: अपेक्षित परिणामों के लिए चित्रा 2सी, डी देखें। दहलीज तीव्रता का मूल्य सापेक्ष है और धुंधला दक्षता और लेजर तीव्रता के रूप में अधिग्रहण सेटिंग्स पर निर्भर करेगा । इसलिए इसे उपयोगकर्ता द्वारा मानकीकृत किया जाना चाहिए। ज्ञात HNF4α- कोशिकाओं जैसे एंडोथेलियल कोशिकाओं और पेरिपोर्टल एनपीसी को आंतरिक नकारात्मक नियंत्रण और द्विपरमाणु हेपेटोसाइट न्यूक्लिआई के रूप में धुंधला करने के लिए एक सकारात्मक संदर्भ के रूप में उपयोग करें। पूरे डेटासेट पर विश्लेषण मापदंडों को लागू करने से पहले अच्छे परमाणु विभाजन और तीव्रता सीमा अलगाव सुनिश्चित करने के लिए छवियों की एक छोटी संख्या का उपयोग कर विश्लेषण मापदंडों का परीक्षण करें।
  5. निम्नलिखित परमाणु मापदंडों का चयन करने के लिए मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए: (1) Hoechst धुंधला (μm2),(2) मतलब परमाणु Hoechst तीव्रता (आरयू), (3) परमाणु विस्तार कारक (नाभिक की लंबी धुरी के लिए नाभिक की छोटी धुरी का मतलब अनुपात पर आधारित परमाणु क्षेत्र, जहां एक केंद्र-सममित [गैर-विस्तारित] वस्तु का मूल्य 1, (4) एनयूएसएक्स 1/(फॉर्म फैक्टर), मतलब परमाणु "गोलाई" सूचकांक है जो परिधि 2/(40 एक्स क्षेत्र) द्वारा गणना किया जाता है। मान 1 से अनंत तक हैं, जहां 1 एक आदर्श सर्कल है, (5) HNF4α स्थिति (सकारात्मक-1 या नकारात्मक-0), और (6) परमाणु एक्स/वाई "गुरुत्वाकर्षण के केंद्र" (सीजी) के आधार पर निर्देशांक, उप पिक्सेल परिशुद्धता के साथ ग्रेस्केल छवियों से वस्तु के केंद्र का पता लगाने के लिए एक विधि ।
  6. सभी नमूना डेटासेट के लिए विश्लेषण चलाएं और चरण 5.5 से स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर तक संख्यात्मक डेटा का निर्यात करें।

6. डेटा विश्लेषण

नोट: डेटा विश्लेषण चरण किसी भी मानक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जा सकता है।

  1. हेपेटोसाइट और गैर-हेपेटोसाइट सेल संख्या की गणना करें।
    1. देखने के क्षेत्र (चरण 4.2) के क्षेत्र द्वारा देखने के क्षेत्रों की संख्या गुणा करके प्रत्येक नमूने के लिए विश्लेषण किए गए यकृत अनुभाग के कुल क्षेत्र की गणना करें।
    2. प्रत्येक जिगर अनुभाग के लिए उत्पन्न स्प्रेडशीट फ़ाइलों के साथ काम करना, केवल HNF4α + नाभिक का चयन करके डेटा फ़िल्टर करें। प्रत्येक नमूने(चित्रा 2एफ)के लिए मतलब हेपेटोसाइट घनत्व प्राप्त करने के लिए विश्लेषण किए गए कुल क्षेत्र से विश्लेषण और विभाजित किए गए एचएनएफ4α + नाभिक की कुल संख्या की गणना करें और विभाजित करें।
    3. एचएनएफ4α- कोशिकाओं(चित्रा 2ई)के लिए स्प्रेडशीट को फ़िल्टर करके गैर-पैरान्चिमल कोशिकाओं के लिए एक ही गणना करें।
  2. हेपेटोसाइट परमाणु आकार वितरण की गणना करें।
    1. स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, केवल HNF4α+ नाभिक का चयन करने के लिए डेटा फ़िल्टर करें।
    2. एक हिस्टोग्राम में परमाणु क्षेत्र के मूल्यों की साजिश(चित्रा 2जी)। बिन चौड़ाई को 5 माइक्रोन2पर सेट करें।
      नोट: आवृत्ति मूल्यों के क्षेत्र के लिए सही किया जा सकता है (नाभिक/मिमी2)कदम 6.1.1 के अनुसार।
  3. हेपेटोसाइट न्यूक्लियर प्लॉइडी एनालिसिस करें।
    नोट: चरण 5.6 से स्प्रेडशीट डेटा का उपयोग प्रत्येक नमूने के लिए परमाणु प्लॉइडी प्रोफ़ाइल उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। इस प्रक्रिया को स्वचालित किया गया है और एक कस्टम लिखित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जा सकता है जो समर्थन जानकारी और प्रदर्शन डेटासेट के साथ डाउनलोड करने के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैhttps://github.com/lukeynoon(देखेंपूरक फाइलें). उन उपयोगकर्ताओं के लिए स्रोत कोड प्रदान किया जाता है जो कार्यप्रणाली को अनुकूलित करना चाहते हैं। एल्गोरिदम का विवरण, स्थापना और उपयोग के निर्देशों के साथ नीचे उल्लिखित हैं। कार्यक्रम स्प्रेडशीट डेटा का उपयोग स्वचालित रूप से दो समूहों में हेपेटोसाइट नाभिक को अलग करने के लिए करता है; (1) >2c प्लॉइडी के साथ द्विपरमाणु कोशिकाओं के "सरल" परिपत्र नाभिक और (2) "जटिल" गैर-परिपत्र नाभिक प्रतिनिधि के साथ । न्यूनतम परमाणु डीएनए सामग्री (परमाणु क्षेत्र और डीएनए घनत्व का एक कार्य) अगले सभी "सरल" नाभिक के लिए गणना की जाती है। एक बाद का कदम तो स्वचालित रूप से एचएनएफ4α + हेपेटोसाइट परमाणु प्लोइडी को एक ज्ञात 2−4N आंतरिक नियंत्रण के रूप में एचएनएफ4α-नाभिक का उपयोग करके कैलिब्रेट करता है।
    1. सॉफ्टवेयर डाउनलोड और इंस्टॉल करें।
      1. पैक आवेदन से डाउनलोड करें: https://github.com/lukeynoon
      2. मैटलैब लॉन्च। टूलट्रिप के ऐप टैब पर नेविगेट करें, इंस्टॉल ऐप पर क्लिक करें और डाउनलोड किए गए एप्लिकेशन को खोलें जिसका नाम'Ploidy_Application.mlappइंस्टॉल'। सफल स्थापना की पुष्टि करने के लिए एक संदेश दिखाई देगा।
        नोट: आवेदन अब उपयोग के लिए तैयार है और टूलट्रिप के एपीपी टैब में रहेगा।
    2. इनपुट डेटा प्रारूप।
      नोट: स्वचालित परमाणु प्लॉयडी विश्लेषण से पहले, उच्च सामग्री इमेजिंग डेटा (चरण 5.6) वाली सभी स्प्रेडशीट फ़ाइलों को निम्नलिखित निर्देशों के अनुसार संग्रहीत और स्वरूपित किया जाना चाहिए।
      1. प्रत्येक निर्यात किए गए डेटा फ़ाइल में (. 5.6 चरण से XLS 97-2004 कार्यपुस्तिका) में कॉलम में निर्धारित प्लीडी विश्लेषण के लिए आवश्यक सभी डेटा वाले "सेल उपाय" नाम की एक शीट शामिल है(चित्रा 3ए)। सुनिश्चित करें कि कॉलम हेडर नामों सहित स्प्रेडशीट लेआउट चित्रा 3एसे अपरिवर्तित रहता है, क्योंकि विश्लेषण विधि इन नामों की खोज करके सही कॉलम डेटा ढूंढती है (संदर्भ के लिए पूरक फ़ाइलों में प्रदर्शन डेटासेट देखें)। उदाहरण के लिए, यदि उच्च सामग्री छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर "लाइट फ्लक्स" कॉलम(चित्रा 3ए)का उत्पादन नहीं करता है, तो मैन्युअल रूप से एक ही स्थान में "लाइट फ्लक्स" कॉलम डालें, यानी कॉलम कश्मीर और इसे शून्य से भरें।
      2. प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति (उदाहरण के लिए, "घायल-डी 14"), एक नियंत्रण डेटासेट प्रदान करता है, जिसका उपयोग 2−4N परमाणु प्लाइडी अंशांकन (चरण 6.3.4.3) के लिए आंतरिक नियंत्रण की गणना करने के लिए किया जाएगा। यहां, अनुपचारित वयस्क लिटरमेट्स ("नियंत्रण-डी0"; चित्रा 3बी−डी)।
      3. जैविक प्रतिकृति (प्रति स्थिति) के लिए, प्रत्येक स्प्रेडशीट को अपने फ़ोल्डर (जैसा कि चित्रा 3बीमें) में स्टोर करें। फ़ोल्डर का नाम संवर्द्धित रूप से उपसर्ग, उदाहरण के लिए, "नमूना 1, नमूना 2, नमूना 3 ... सैंपलन", भीतर निहित फाइलनामों के अनुसार। इसलिए, प्रत्येक डेटासेट फ़ोल्डर (उदाहरण के लिए, "नियंत्रण-डी0") में सबफोल्डर ("नमूना 1", "नमूना 2", आदि) की एक श्रृंखला होनी चाहिए जिसमें प्रत्येक में एक ही संबंधित नाम की स्प्रेडशीट फ़ाइल होती है।
    3. आवेदन चलाएं।
      1. MATLAB के भीतर, टूलट्रिप(चित्रा 3सी)के MY APPS टैब के भीतर आइकन पर क्लिक करके "Ploidy_Application" लॉन्च करें। Ploidy_Application ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) दिखाई देगा(चित्रा 3सी)।
      2. फ़ोल्डर पर नेविगेट करने के लिए डेटा बटन को नियंत्रित करने के लिए पथ पर क्लिक करें जिसमें नियंत्रण डेटा प्रतिकृति निवास करता है (उदाहरण के लिए, "नियंत्रण-डी0")। इसके बाद यह डाटा पाथ इंटरफेस (जैसे, यूजर्स/डेस्कटॉप/कंट्रोल-डी0)में दिखाई देगा ।
      3. इसके बाद, "फ़ोल्डर उपसर्ग" में आउटपुट फ़ाइलों (जैसे, "नमूना") को दिए जाने वाले नाम को टाइप करें।
        नोट: इस उपसर्ग को किसी भी पाठ में बदला जा सकता है, बशर्ते कि फ़ोल्डर्स और फाइलनाम संवर्द्धित रूप से नामित रहें।
      4. अन्य डेटा बटन के लिए पथ पर क्लिक करें और फ़ोल्डर पर नेविगेट करें जिसमें तुलनात्मक डेटा प्रतिकृति रहती है (उदाहरण के लिए, "घायल-d14")। इसके बाद यह डेटा पाथ इंटरफेस (जैसे, यूजर्स/डेस्कटॉप/घायल-डी14)में दिखाई देगा ।
      5. रन पर क्लिक करें!. जब विश्लेषण पूरा हो जाएगा, स्थिति बार "विश्लेषण पूरा !.." पढ़ा जाएगा ।
        नोट: आवेदन प्रत्येक नमूने के लिए, पूर्ण मामलों के संदर्भ में "सरल" नाभिक की स्तरीकरण और कुल(चित्रा 3डी)के प्रतिशत के रूप में रिपोर्ट करेगा। ये फ़ाइलें प्रत्येक नमूना फ़ोल्डर में स्वचालित रूप से सहेजी जाएंगी:"Count_2n.txt","Count_2n_to_4n.txt", "Count_4n_to_8n.txt", "Count_8n_and_higher.txt", "Percentage_2n.txt", "Percentage_2nto4n.txt", "Percentage_4nto8n.txt", "Percentage_8n_and_higher.txt"। Ploidy_Application स्वचालित रूप से प्रत्येक नमूने के लिए एक सूची को बचाएंगे, "सरल" हेपेटोसाइट और गैर-हेपेटोसाइट न्यूक्लिी के लिए सभी व्यक्तिगत प्लॉइडी अनुमानों में "Ploidy_All_Hepatocytes.txt" और "Ploidy_NonHepatocytes.txt"। नियंत्रण डेटासेट के लिए, विधि "Normalised_Thresholds_Control" नामक फ़ाइल में प्लोइडी की स्तरीकरण के लिए गणना की गई न्यूनतम डीएनए सामग्री थ्रेसहोल्ड को भी बचाती है (Normalised_Thresholds_Control"नामक फ़ाइल में चरण 6.3.4.3.7 देखें। अंत में, आवेदन दोनों नियंत्रण और चयनित तुलनात्मक स्थिति डेटा "सारांश" कहा जाता है के लिए एक फ़ोल्डर का उत्पादन होगा । इस फ़ोल्डर में दो सबफोल्डर, "प्लॉइडी" और "स्तरीकरण" शामिल हैं जिनमें प्रदान किए गए सभी नमूनों के औसत होते हैं(चित्रा 3डी)।
    4. कार्यप्रणाली का विवरण।
      नोट: निम्नलिखित अनुभाग परमाणु प्लॉयडी विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा उपयोग की जाने वाली पद्धति का विस्तार से वर्णन करता है। यदि उपयोगकर्ता आवेदन का उपयोग नहीं करना चुनता है, तो इन चरणों को मैन्युअल रूप से परमाणु प्लॉयडी प्रोफाइल की गणना करने के लिए स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पालन किया जा सकता है।
      1. परमाणु मॉर्पोमेट्री के अनुसार "सरल" या "जटिल" में अलग नाभिक।
        1. "एनयूएस1/(फॉर्म फैक्टर) द्वारा विभाजित परमाणु "विस्तार कारक" के रूप में परिभाषित सभी नाभिक के लिए "परिपत्रता सूचकांक" की गणना करें, जहां 1.0 का मूल्य एक आदर्श चक्र को इंगित करता है।
          नोट: "परमाणु विस्तार" और "Nuc 1/(फार्म फैक्टर)" एक वस्तु के "परिपत्रता" है कि पूरक, गैर अतिव्यापी morphometric मानदंडों का आकलन के दो असतत उपाय कर रहे हैं । पूर्व किसी वस्तु के लंबे और छोटे कुल्हाड़ियों को मापता है, जबकि उत्तरार्द्ध अपने क्षेत्र की किसी वस्तु की परिधि की लंबाई की तुलना करता है। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किए जाने वाले परमाणु परिपत्रकी परिभाषा को मजबूत करने के लिए, इन दोनों मापों को एक "परिपत्रता सूचकांक" में जोड़ा गया है। वर्णित पद्धति का उपयोग करके परमाणु प्लॉइडी का अनुमान लगाने के लिए एक पिछला दृष्टिकोण केवल परमाणु विस्तार17का उपयोग करता है । हालांकि स्वीकार्य परिणाम इस दृष्टिकोण का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे, लेखकों ने देखा है कि एक समग्र "परिपत्रता सूचकांक" मोनोन्यूक्लियर और बाइन्यूक्लियर हेपेटोसाइट्स (डेटा नहीं दिखाया गया) से मैन्युअल रूप से चयनित नाभिक के भेदभाव में सुधार करता है।
        2. एक परिपत्रता सूचकांक के साथ नाभिक को वर्गीकृत करें । 0.8 को "जटिल" और उन और 0.8 को "सरल" के रूप में वर्गीकृत करें।
      2. सभी "सरल" नाभिक के लिए "न्यूनतम" डीएनए सामग्री (एम) का अनुमान लगाएं।
        1. सूत्र का उपयोग करके परमाणु त्रिज्या (आर) की गणना करें:
        2. एक गोला सूत्र की मात्रा का उपयोग कर परमाणु मात्रा (v) की गणना करें:
        3. सूत्र का उपयोग करके न्यूनतम डीएनए सामग्री (एम) के लिए एक सापेक्ष मूल्य उत्पन्न करें:
      3. एनपीसी (एचएनएफ4α-) नाभिक का उपयोग करके डेटासेट को आंतरिक 2−4N नियंत्रण के रूप में कैलिब्रेट करें।
        नोट: एनपीसी में सेल चक्र की स्थिति के आधार पर 2−4N डीएनए सामग्री होती है। इसलिए, एनपीसी का औसत मूल्य "न्यूनतम" डीएनए सामग्री (एनपीसीएम)चोट(चित्र4ए)के साथ बढ़ जाता है। एक 4c दहलीज(चित्रा 4बी)का प्रतिनिधित्व करने वाले एनपीसीएम की ऊपरी सीमा स्थापित करके अंशांकन त्रुटि को कम किया जाता है।
        1. स्प्रेडशीट के भीतर, मोड के 1 मानक विचलन (एसडी) के भीतर झूठ बोलने वाले "एम" के मूल्यों के साथ केवल एनपीसी नाभिक का चयन करें (यह संभावित विभाजन त्रुटि से शोर को फ़िल्टर करता है)।
        2. इस फ़िल्टर की गई सीमा के भीतर, परमाणु क्षेत्रों और उनके इसी मतलब Hoechst तीव्रता(चित्रा 4सी)की जांच करें।
        3. अधिकतम परमाणु Hoechst तीव्रता के साथ इस फ़िल्टर रेंज के भीतर सबसे छोटे परमाणु क्षेत्र का अनुमान लगाएं (यानी, जिस बिंदु पर वक्र की रेखा फ़िल्टर डेटासेट में दिशा बदलती है जैसा कि चित्र4सीमें लाल सर्कल द्वारा सचित्र है)। यह मूल्य 2N−4N संक्रमणकालीन राज्य (टी) का प्रतिनिधित्व करता है जिसके ऊपर 4c नाभिक का नमूना 2c नाभिक पर प्रबल होता है, जिसके परिणामस्वरूप मतलब Hoechst तीव्रता का एक अधिकतम होता है।
          नोट: यह मूल्य स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित किया जाता है; हालांकि, स्प्रेडशीट उपयोगकर्ता मैन्युअल रूप से इस बिंदु को संक्रमणकालीन आकार के रूप में चुन सकते हैं।
        4. चरण 6.3.4.2 के बाद इस संक्रमणकालीन आकार (टीएम)द्वारा प्रतिनिधित्व की गई न्यूनतम डीएनए सामग्री की गणना करें।
        5. एनपीसीएम डेटासेट के 4N कंधे का अनुमान लगाने के लिए, टीएमके मूल्य में 1 एसडी जोड़ें। परिणामस्वरूप संख्या(चित्रा 4बी)एनपीसी न्यूनतम डीएनए सामग्री की ऊपरी सीमा का वर्णन करता है जो परमाणु प्लॉयडी स्तरीकरण (एस4 सी)के लिए उपयोग किया जाएगा।
        6. सभी "नियंत्रण" नमूनों के लिए चरण 6.3.4.3.1−6.3.4.3.5 दोहराएं।
          नोट: उदाहरण के लिए, चित्रा 3में, अघायल नियंत्रण यकृत ("नियंत्रण-डी0") का उपयोग नियंत्रण स्थिति के रूप में किया जाता है।
        7. "नियंत्रण" नमूनों के लिए औसत4c स्तरीकरण सीमा (एस4c)की गणना करें और न्यूनतम डीएनए सामग्री (एम) के लिए 2c (एस2c)और 8c (एस8c)सीमाओं को एक्सट्रपलेशन करने के लिए इसका उपयोग करें। स्तरीकरण थ्रेसहोल्ड स्वचालित रूप से उत्पन्न होते हैं और सॉफ्टवेयर (चरण 6.3.3.3.3) द्वारा संग्रहीत होते हैं।
          नोट: अध्ययन डिजाइन के आधार पर, औसत स्तरीकरण सीमा मूल्यों की गणना प्रत्येक स्थिति के लिए या विशिष्ट शर्तों (जैसे, स्वस्थ नियंत्रण यकृत) के लिए की जा सकती है। हालांकि, न्यूक्लियर प्लॉयडी एनालिसिस सॉफ्टवेयर के लिए आवश्यक है कि सापेक्ष प्लॉयडी मूल्यों की गणना के प्रयोजनों के लिए 2 फ़ाइलों के एक सेट में से एक को "नियंत्रण" के रूप में नामित किया गया है।
        8. चरण 6.3.4.3.7 में उत्पन्न एस2सी मूल्य का उपयोग करके सभी नाभिक के लिए एक प्लाइडी मूल्य की गणना करें:
        9. निम्नलिखित मानदंडों के अनुसार 2c/4c/8c/>gt;8c कोष्ठक में "सरल" हेपेटोसाइट (HNF4α+) नाभिक को स्ट्रैटिफाई करें: "2c" HNF4α+= पी = 2; "4c" HNF4α + = 2 < p ‧ 4; "8c" HNF4α + = 4 < p > 8; ">8c" HNF4α+ = 8 < p ।
        10. प्लॉयडी उपसमूहों की स्थानिक पैटर्निंग का पुनर्निर्माण करने के लिए, प्रत्येक नमूना स्प्रेडशीट के भीतर परमाणु डेटा को उन संबंधित क्षेत्रों के अनुसार अलग करें जिनमें वे अधिग्रहीत किए गए थे। फिर 2डी(चित्रा 5सी)में प्लाइडी उपसमूहों की साजिश रचने के लिए संबद्ध परमाणु एक्स/वाई निर्देशांक (चरण 5.5 से) का उपयोग करें।

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Representative Results

इस विधि का उपयोग वयस्क माउस जिगर पर कोलेस्टैटिक चोट के प्रभाव को मापने के लिए 0−21 दिनों के लिए पशुओं को खिलाकर किया गया है जिसमें हेपेटोटॉक्सिक आहार 0.1% 3,5-डाइथोऑक्सीकार्बोनिल-1,4-डाइहाइड्रोकोलिडीन (डीडीसी)17शामिल है। क्रोनिक डीडीसी फीडिंग के परिणामस्वरूप हेपेटोसेलुलर चोट ने एनपीसी के प्लाइडी और पेरीपोर्टल विस्तार में वृद्धि की। उपयोगकर्ता को पता होना चाहिए कि माउस तनाव और उम्र पर निर्भर मतभेद परमाणु चालू में मौजूद हो सकते हैं और सभी विश्लेषण12−16 सप्ताह की आयु के वयस्क महिला C57BL/6 चूहों का उपयोग करके किए गए हैं।

HNF4α इम्यूनोलेबलिंग (प्रोटोकॉल सेक्शन 3) के बाद, अच्छी गुणवत्ता निर्धारण और धुंधला(चित्रा 2ए)सुनिश्चित करने के लिए पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सभी स्लाइडों की जांच करना महत्वपूर्ण है। Hoechst के स्मीयर या धुंधला निर्धारण से पहले अपर्याप्त निर्धारण या नमूना गिरावट(चित्रा 2बी),जिसमें मामले प्रोटोकॉल धारा 2 पर लौटने और अनुभागऔर निर्धारण (चरण 3.1) के बीच समय को छोटा करने का संकेत कर सकते हैं। एचएनएफ4α एंटीबॉडी के साथ सफल इम्यूनोलेबलिंग को आसानी से इस स्तर पर सकारात्मक लेबल हेपेटोसाइट नाभिक के स्पष्ट भेदभाव से आंका जा सकता है, जो आमतौर पर एनपीसी(चित्रा 2ए)की तुलना में बड़ा और अधिक गोल होता है। पैरानचिमा के भीतर चपटा/अंडाकार एंडोथेलियल न्यूक्लियी, या डीडीसी चोट के बाद पेरिपोर्टल क्षेत्रों में विस्तार करने वाली कोशिकाओं के घने पैच इम्यूनोस्टेनिंग की सफलता/विफलता का आकलन करते समय एचएनएफ4α-NPCs की पहचान करने के लिए एक उपयोगी दृश्य संदर्भ के रूप में काम कर सकते हैं ।

प्रोटोकॉल सेक्शन 3(चित्रा 2सी)के अंत में पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाए गए इम्यूनोस्टेनिंग के दृश्य पैटर्न को मोटे तौर पर प्रतिबिंबित करने के लिए परमाणु अलगाव और एचएनएफ4α दहलीज मापदंडों (चरण 5.2−5.4) को स्वचालित छवि विश्लेषण (चरण 5.6) से पहले सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया जाना चाहिए। इष्टतम बनाम सबऑप्टिमल न्यूक्लियर सेगमेंटेशन और एचएनएफ4α थ्रेसहोल्ड प्रोटोकॉल के उदाहरण चित्र ा 2डीमें संक्षेप में दिए गए हैं। छवि विश्लेषण (चरण 6.1.3) के बाद, डेटा डीडीसी चोट के साथ जिगर में NPCs की बढ़ती संख्या को प्रतिबिंबित करना चाहिए(चित्रा 2ई),नियंत्रण यकृत में नाभिक के 52% ± 2.0% से 72.8% ± 1.4% डीडीसी उपचार के 21 दिनों के बाद. हेपेटोसाइट्स नियंत्रण यकृत में कुल नाभिक का 48.0% ± 2.0% का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो यकृत हिस्टोलॉजी के पिछले विश्लेषणों के साथ सामंजस्यपूर्ण है, जिसमें यह दर्शाया गया है कि हेपेटोसाइट्स ऊतक की मात्रा का 70−85% है, लेकिन कुल यकृत कोशिकाओं का केवल 45−50%18,,19। डीडीसी फीडिंग(चित्रा 2एफ)के पहले 14 दिनों के दौरान एचएनएफ4α + नाभिक की संख्या में एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण कमी देखी जाती है। हेपेटोसाइट परमाणु क्षेत्र (चरण 6.2) का एक आवृत्ति वितरण भूखंड 40−50 माइक्रोन2 आकार रेंज में नियंत्रण यकृत में एक चोटी HNF4α + परमाणु क्षेत्र दिखाता है, और डीडीसी चोट के बाद परमाणु आकार में एक स्पष्ट सही बदलाव(चित्रा 2जी); बढ़ी हुई प्लाइडी और हेपेटोसेलुलर हाइपरट्रॉफी12के अनुरूप .

स्वस्थ (दिन 0) नियंत्रण यकृत में, 63.4% ± 1.7% HNF4α + नाभिक में "सरल" परिपत्र मॉर्पोमेट्री(चित्रा 5ए)है। यह आंकड़ा डीडीसी चोट के 21 दिनों के बाद 46.8% ± 5.7% (पी = 0.042) तक कम हो जाता है, जो संभवतः पॉलीप्लॉयडाइजेशन के दौरान प्लॉइडी राज्यों के बीच स्थानांतरण से जुड़े परमाणु मॉर्पोमेट्री में बढ़ी हुई जटिलता को दर्शाती है (नीचे "परमाणु मॉर्पोमेट्री की व्याख्या" देखें)। नियंत्रण जिगर वर्गों में इस विधि का उपयोग कर प्राप्त परमाणु ploidy वितरण के प्रतिनिधि उदाहरण चित्र 5एमें दिखाए जाते हैं, जो बताता है कि डीएनए सामग्री का इंटरपोलेशन एक नमूने के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं की स्तरीकरण की अनुमति देता है। "जटिल" और "सरल" HNF4α + कोशिकाओं के सबसेट के लिए मतलब मूल्यों को भी दिखाया गया है(चित्र5ए)। डेटा वयस्क मूत्र हेपेटोसाइट्स2के 80−90% में पॉलीप्लाइडी के पिछले अनुमानों के अनुरूप हैं। जटिल नाभिक की आवृत्ति (36.6% ± 1.7%) नियंत्रण में यकृत भी द्विपरमाणु कोशिकाओं (३५%)20के लिए अनुमानित है, हालांकि डेटा कड़ाई से परमाणु के बजाय सेलुलर ploidy के एक उपाय के रूप में माना जाना चाहिए (देखें "परमाणु morphometry की व्याख्या" नीचे) । नियंत्रण (दिन 0) और डीडीसी उपचारित समूहों के बीच सापेक्ष प्लाइडी की तुलना में 2c और 4c हेपेटोसाइट न्यूक्लिक न्यूक्लिी के महत्वपूर्ण नुकसान को चोट के साथ एक साथ -साथ 8c कोशिकाओं(चित्रा 5बी)की बढ़ी हुई संख्या के साथ प्रतिबिंबित करना चाहिए । प्रत्येक प्लॉयडी सबग्रुप के लिए सापेक्ष स्थितीय जानकारी डेटासेट के भीतर प्रत्येक नाभिक से जुड़े एक्स-वाई निर्देशांक के स्कैटर प्लॉट या उच्च सामग्री छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर(चित्र 5सी)के भीतर विशेष हेपेटोसाइट सबसेट के 2डी स्थान को पुनः प्राप्त करके पूछताछ की जा सकती है।

अंशांकन
एनपीसी अंशांकन विधि की वैधता का आकलन करने के लिए, एचएनएफ4α और प्रोलाइफर मार्कर की-67(चित्रा 6ए, बी)के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करके जिगर वर्गों की दोहरी इम्यूनोलेबलिंग की गई थी। इन आंकड़ों ने Ki-६७ के लिए संवर्धन दिखाया, जो सेल चक्र के सभी सक्रिय चरणों में कोशिकाओं को लेबल करता है, एनपीसी न्यूनतम डीएनए वितरण वक्र के दाईं ओर (एस2सी और एस4सीके बीच)-जहां एनपीसी डीएनए की नकल करने की उम्मीद होगी और इसलिए >2c ploidy(चित्रा 6ए)है । सभी नियंत्रण और घायल जिगर के नमूनों के आंतरिक अंशांकन के बाद अध्ययन किया, Ki-67, काफी समृद्ध (पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.0001) में "सरल" एनपीसी नाभिक में और जीटी 2c (82.5% ± 6.6% एसडी, एन = 12) की अनुमानित प्लाइडी के साथ 2c ploidy (17.5% ± 6.6% एसडी, एन = 12)(चित्राबी)के साथ उन लोगों की तुलना में, सफल चाल अंशांकित का संकेत है। ये डेटा उपयोग की गई विधि की वैधता का समर्थन करते हैं। इसके अलावा, Ki67 की सटीक थ्रेसहोल्डिंग को मानते हुए, वे कुछ मात्रात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं कि उच्च प्लॉइडी समूहों से उपक्वाटोरियल परमाणु मास्क नीचे समूहों को किस हद तक दूषित करते हैं।

एनपीसी अंशांकन विधि की वैधता का परीक्षण करने के लिए, माउस 2एन हेपेटोसाइट्स (155.8 माइक्रोन3)14की पहले से रिपोर्ट की गई परमाणु मात्रा के आधार पर एक बाहरी अंशांकन पेश किया गया था। जब इस आंकड़े का उपयोग एचएनएफ4ए-नाभिक के लिए Hoechst तीव्रता के औसत मूल्य के साथ संयोजन में किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप नियंत्रण यकृत में हेपेटोसाइट प्लॉइडी का मतलब आंतरिक (एस2 सी)अंशांकन(चित्रा 6सी)से अविवेच्य था। इसके अलावा, तुलनात्मक उम्र के C57BL/6 माउस तनाव के चूहों में मतलब हेपेटोसाइट प्लॉइडी के अनुमान भी समान थे, इस बात की पुष्टि करते हुए कि 2N हेपेटोसाइट परमाणु आकार के पूर्व अनुभवजन्य ज्ञान की आवश्यकता नहीं है, जिससे परमाणु प्लॉइडी पूरी तरह से स्वायत्त का आकलन करने के लिए आंतरिक रूप से नियंत्रित कार्यप्रणाली बन जाती है ।

परमाणु मॉर्पोमेट्री की व्याख्या
वर्णित विधि "सरल" परिपत्र मॉर्पोमेट्री के साथ हेपेटोसाइट नाभिक के लिए एक प्लोइडी रीडआउट प्रदान करती है। "जटिल" नाभिक का बहिष्कार परिकल्पना पर आधारित है कि वे अतिव्यापी/छू परमाणु मास्क के साथ द्विपरमाणु हेपेटोसाइट्स के अनुपात का प्रतिनिधित्व करते हैं, इस सबसेट के लिए सटीक प्लॉइडी दृढ़ संकल्प को और अधिक चुनौतीपूर्ण बनाते हैं(चित्रा 7ए)। महत्वपूर्ण बात यह है कि परिपत्रके अनुसार नाभिक का अलगाव उपयोगकर्ता को मोनोन्यूक्लियर हेपेटोसाइट्स के नाभिक और द्विपरमाणु कोशिकाओं के बीच अंतर करने में सक्षम नहीं बनाता है, जिसमें समान प्लॉइडी के दो नाभिक स्पष्ट रूप से कोशिका के भीतर अलग हो जाते हैं। यह छवि डेटासेट से द्विपरमाणु और मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का मैन्युअल रूप से चयन करके और एल्गोरिदम(चित्रा 7बी)द्वारा उनके अलगाव का आकलन करके अनुभवजन्य रूप से परीक्षण किया गया था। द्विपरमाणु हेपेटोसाइट्स के नाभिक जो शारीरिक रूप से बंद थे(चित्रा 7सी)लेकिन "छू नहीं" एल्गोरिदम द्वारा "सरल" के रूप में वर्गीकृत किया गया था, जबकि जो "छू" थे उन्हें स्पष्ट रूप से "जटिल" के रूप में भेदभाव किया गया था। इसलिए, यह परख यकृत में सेलुलर प्लॉयडी का एक readout प्रदान नहीं करता है, यह देखते हुए कि द्विपरमाणु कोशिकाओं के नाभिक "सरल" और "जटिल" उपवर्गों के बीच विभाजित हैं (चर्चा देखें)। हालांकि, सेलुलर और परमाणु ploidy के राज्यों के बीच स्विचन में कुछ अंतर्दृष्टि बस परमाणु morphometry और परमाणु आकार के हिस्टोग्राम की साजिश रचने और कैसे "जटिल" और "सरल" राज्यों के बीच पॉलीप्लॉयडाइजेशन(चित्रा 7डी)के बीच संक्रमण कर रहे है की एक मॉडल लागू करने से प्राप्त किया जा सकता है । नियंत्रण में यकृत में परमाणु मॉर्पोमेट्री के तीन चरण (आई−III) स्पष्ट रूप से देखे जाते हैं(चित्र 7ई)। वे क्रमशः परिपत्र 2N (I), 4N (II) और 8N (III) परमाणु मास्क (जैसा कि चित्र7डीमें सचित्र) के क्लस्टरिंग का प्रतिनिधित्व करते हैं। मोनोन्यूक्लियर 16N हेपेटोसाइट्स वयस्क माउस यकृत16,,18,,21में अत्यंत दुर्लभ हैं, इसलिए 16एन सेलुलर प्लॉयडी समूह में लगभग पूरी तरह से 8N नाभिक के साथ द्विपरमाणु कोशिकाओं को शामिल किया गया है, जो भीतर स्थित है, और तीसरे चरण(चित्रा 7ई)के दाईं ओर, तीसरे चरण के अधिकार के लिए परिपत्रता में गिरावट को समझाते हुए। दिलचस्प बात यह है कि चोट (डीडीसी दिन 14) पर, बढ़ी हुई जटिलता ("द्विपरमाणुता") की दिशा में एक मात्रात्मक बदलाव चरणों में शुरू होता है (2n से 2x2n को दर्शाती है) और तीसरे चरण (8n से 2x8n को दर्शाती है), इससे पहले कि यह अंततः सभी तीन चरणों (आई−III) में समेकित हो। लेखकों का अनुमान है कि बढ़ी हुई जटिलता की ओर यह बदलाव एक बढ़ी हुई सेलुलर प्लोइडी के कारण है जिसके परिणामस्वरूप साइटोकिनेसिस होता है, जबकि तीसरे चरण के अधिकार के लिए विपरीत प्रवृत्ति देखी जाती है, जो एंडोप्रतिकृतिके कारण घायल जिगर में परिपत्र 16N मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के प्रतिनिधित्व में वृद्धि के कारण देखी जाती है। इन टिप्पणियों को निश्चित रूप से सेलुलर प्लॉयडी (चर्चा देखें) के लिए ठीक से खाते में विधि को अनुकूल करके परीक्षण करने की आवश्यकता होगी।

Figure 1
चित्रा 1: कार्यप्रवाह का सारांश। यकृत ऊतक काटा जाता है(1),क्रायोसेक्शन(2),फिक्स्ड और इम्यूनोलेबल एक एचएनएफ4α एंटीबॉडी के साथ पैरान्चिमल और गैर-पैरेंचिमल कोशिकाओं (एनपीसी) के साथ भेदभाव किया जा सकता है(3)। एक बार संसाधित होने के बाद, नमूनों को स्वचालित छवि कैप्चर(4)और विश्लेषण(5)का उपयोग करके उच्च सामग्री इमेजिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके डिजिटाइज्ड किया जाता है। कोशिकाओं को Hoechst परमाणु फ्लोरेसेंस और HNF4α इम्यूनोफ्लोरेसेंस थ्रेसहोल्डिंग द्वारा खंडित किया जाता है। इसके बाद, Hoechst परमाणु क्षेत्र ("ए") और परिपत्रता ("सी") की गणना की जाती है। अंत में, डेटा का विश्लेषण किया जाता है (6); एचएनएफ4α- एनपीसी को परमाणु परिपत्रता (ii) के अनुसार दो सबसेट ("सरल" और "जटिल") में विभाजित (i) और HNF4α + हेपेटोसाइट नाभिक में अलग किया जाता है। हेपेटोसाइट परमाणु प्लॉइडी का इंटरपोलेशन तब परमाणु त्रिज्या (आर) के एक समारोह के रूप में सभी "सरल" नाभिक के लिए किया जाता है और मतलब Hoechst फ्लोरेसेंस तीव्रता (परमाणु डीएनए घनत्व के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में) (iii) । डेटा तो एक नमूना सारांश (v) संकलन से पहले एक आंतरिक 2N अंशांकन (iv) के रूप में NPCs का उपयोग कर स्तरीकृत कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: क्रोनिक डीडीसी फीडिंग के दौरान माउस लिवर की उच्च सामग्री छवि विश्लेषण और साइटोमेट्रिक प्रोफाइलिंग। (क)0.1% डीडीसी वाले आहार के साथ खिलाने के 21 दिनों के बाद वयस्क माउस जिगर के एचएनएफ4α/Hoechst इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला की एक प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवि; छवि पोर्टल नस ("पीवी") के आसपास के क्षेत्रों में गोल HNF4α + हेपेटोसाइट नाभिक ("एच") और एचएनएफ4α-NPCs के विस्तार को दिखाती है। (ख)इष्टतम ("सही") और उप-इष्टतम ("गलत") परमाणु Hoechst धुंधला खराब निर्धारण का संकेत देने के उदाहरण । (ग)परमाणु Hoechst धुंधला और HNF4α इम्यूनोलेबलिंग के अनुसार हेपेटोसाइट्स और एनपीसी को अलग करने के लिए उच्च थ्रूपुट छवि विश्लेषण मंच का उपयोग । सॉफ्टवेयर मास्क (लाल/हरी लाइनें) से पता चलता है कि कैसे नाभिक सही ढंग से Hoechst फ्लोरेसेंस के अनुसार खंडित कर रहे है और hepatocytes (+) या NPCs (-) HNF4α स्थिति के अनुसार में हल । (D)विभाजन/दहलीज विश्लेषण के लिए सेटअप को अनुकूलित करने के लिए एक गाइड । सॉफ्टवेयर द्वारा मान्यता प्राप्त अधिरंजित परमाणु मास्क को परमाणु विभाजन और हरे/नीले रंग (एचएनएफ4α+) या लाल/नीले (एचएनएफ4α-) के लिए दहलीज विश्लेषण (एच = हेपेटोसाइट) के लिए हरे/नीले रंग की रेखाओं द्वारा इंगित किया जाता है । समस्या निवारण: परमाणु पहचान संवेदनशीलता बहुत कम सेट (i), या बहुत अधिक (ii) । HNF4α के लिए सीमा बहुत कम सेट (iii), या बहुत अधिक (iv) । (ई, एफ) डीडीसी फीडिंग के दौरान एनपीसी और हेपेटोसाइट न्यूक्लिक के मात्रात्मक विश्लेषण:(ई)एचएनएफ4α- और(एफ)एचएनएफ4α + परमाणु घनत्व की तुलना डीडीसी उपचार (दिनों) के समय के मुकाबले की जाती है। कुल 5.7 x 105 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया, जो 4−6 जानवरों प्रति टाइमपॉइंट से था। डेटा को मतलब + एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। * * पी एंड एलटी; 0.01 और ***पी एंड एलटी; 0.001। एक तरह से ANOVA साधनों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । महत्व पी मूल्यों फिशर के सबसे कम महत्वपूर्ण अंतर (एलएसडी) परीक्षण का उपयोग कर गणना की गई । (जी)डीडीसी उपचार के दौरान एचएनएफ4α + परमाणु क्षेत्र का आवृत्ति वितरण। डेटा सेलुलर हाइपरट्रॉफी और पॉलीप्लॉयडाइजेशन के अनुरूप चोट के दौरान हेपेटोसाइट परमाणु क्षेत्र में एक सही बदलाव दिखाते हैं । कुल 2.5 x 105एचएनएफ4α + नाभिक का विश्लेषण किया गया, जो 4−6 जानवरों प्रति टाइमपॉइंट से था। इस आंकड़े को मंज़ानो-नुनेज़ एट अल17से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कस्टम लिखित सॉफ्टवेयर का उपयोग करहेटोसाइट परमाणु प्लॉइडी का स्वचालित विश्लेषण। (A)स्क्रीनशॉट परमाणु प्लॉयडी विश्लेषण सॉफ्टवेयर में इनपुट के लिए स्प्रेडशीट डेटा के सही स्वरूपण दिखा । आवश्यक डेटा वाले कॉलम (प्रोटोकॉल के चरण 5.5) को पीले रंग में हाइलाइट किया गया है। सभी कॉलम खिताब ठीक संकेत दिया उन मैच चाहिए । (ख)स्क्रीनशॉट दिखारहा है कि कैसे व्यक्तिगत स्प्रेडशीट जैविक प्रतिकृति ("नमूना 1", "नमूना 2", आदि) से डेटा युक्त फ़ाइलों का नाम और प्रत्येक हालत के लिए सबफोल्डर्स में आयोजित किया जाना चाहिए (हकदार "नियंत्रण-d0" और "घायल-d14" इस उदाहरण में) । (C)प्लॉइडी एप्लिकेशन (लाल सर्कल) की सफल स्थापना के बाद स्क्रीनशॉट। जब एप्लिकेशन लॉन्च किया जाता है (टूलट्रिप के MY APPS टैब में "Ploidy_Appl..") पर क्लिक करके "Ploidy_GUI" दिखाई देता है (निचला पैनल)। प्रयोग नाम ("नमूना") और नियंत्रण के लिए पथ (जैसे, "नियंत्रण-d0") और परीक्षण (जैसे, "घायल-d14") डेटासेट रनपर क्लिक करने से पहले दर्ज किए जाते हैं । सॉफ्टवेयर तब न्यूनतम डीएनए सामग्री के लिए थ्रेसहोल्ड उत्पन्न करने के लिए "नियंत्रण-डी0" डेटासेट का उपयोग करके सभी नमूनों के लिए परमाणु प्ली की गणना, अंशांकन और स्तरीकृत करता है। (D)Ploidy_Application से डेटा आउटपुट प्रत्येक प्लोइडी समूह में "सरल" नाभिक की पूर्ण और प्रतिशत संख्या वाले प्रत्येक नमूना फ़ोल्डर (i) में व्यक्तिगत डेटा फ़ाइलों को स्वचालित रूप से सहेजा जाता है। प्रत्येक स्थिति के लिए (इस मामले में "नियंत्रण-डी0" और "घायल-डी14" दोनों), एक सारांश फ़ोल्डर भी स्वचालित रूप से उत्पन्न होता है जिसमें सभी "सरल" हेपेटोसाइट और गैर-हेपेटोसाइट न्यूक्लिय (ii) के लिए मतलब परमाणु प्लॉइडी अनुमान होते हैं और प्रत्येक नमूने (iii) के लिए परमाणु प्लॉइडी को कैसे स्तराकृत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक आंतरिक प्लॉयडी अंशांकन के रूप में NPCs का उपयोग करें। (A)हेपेटोसाइट (एचएनएफ4α+) और एनपीसी (HNF4α-) नाभिक के मतलब न्यूनतम डीएनए सामग्री (एम) पर डीडीसी चोट के प्रभाव को दिखाने वाला ग्राफ। सभी डेटा को दिन 0 एनपीसी (एन = 4 जानवरप्रति टाइमपॉइंट) सामान्यीकृत किया जाता है। (ख)हिस्टोग्राम एक प्रतिनिधि जिगर के नमूने में एनपीसीएम मूल्यों के वितरण का वर्णन (0 दिन, कुल ७,१८० नाभिक) । योजनाबद्ध (ऊपर) से पता चलता है कि कैसे परिपत्र एनपीसी मास्क 2−4c डीएनए सामग्री के साथ कोशिकाओं से प्राप्त कर सकते हैं । अंशांकन विधि का उद्देश्य वितरण वक्र की चरम सीमा पर विभाजन त्रुटियों के कारण शोर को कम करते हुए एनपीसीएम वितरण (बिंदीदार रेखा) की ऊपरी सीमा पर 4c (एस4c)का प्रतिनिधित्व करने वाली स्तरीकरण सीमा को परिभाषित करना है। (ग)एनपीसी (एचएनएफ4α-) नाभिक के लिए मतलब Hoechst तीव्रता और परमाणु क्षेत्र में परिवर्तन की साजिश रची जाती है । विभाजन त्रुटि से बचने के लिए केवल मोड एनपीसीएम मूल्य के 1 एसडी के भीतर के इसी एनपीसीएम मूल्य के साथ उन नाभिक की छानबीन (पीला बॉक्स) की होती है। इस सीमा के भीतर 2c−4c संक्रमण आकार (टी) की गणना की जाती है और एस4सीका अनुमान लगाने के लिए डेटा के भीतर एक एंकर बिंदु के रूप में उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: क्रोनिक डीडीसी फीडिंग के दौरान माउस लिवर में न्यूक्लियर प्लॉइडी के सीटू विश्लेषण में हाई-थ्रूपुट। (क)वर्णित पद्धति का उपयोग करके नियंत्रण वयस्क यकृत का विश्लेषण। 2डी जिगर वर्गों से एचएनएफ4α + हेपेटोसाइट न्यूक्लिक न्यूक्लिी को दो समूहों में Hoechst परमाणु परिपत्रके अनुसार विभाजित किया गया है: "सरल" और "जटिल"। (शीर्ष) इन दोनों समूहों से संबंधित कोशिकाओं की प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस Hoechst छवियां दिखाई जाती हैं। (बाएं) स्कैटरप्लॉट इंटरपोलेट प्लॉइडी वैल्यू, न्यूक्लियर एरिया और मतलब न्यूक्लियर होचस्ट तीव्रता के अनुसार एक नमूने (दिन 0) से सरल एचएनएफ4α + न्यूक्लिकी की स्तरीकरण दिखा रहा है। (दाएं) पाई चार्ट नियंत्रण जिगर (0 दिन) में HNF4α + कोशिकाओं के ठेठ टूटने का ब्यौरा प्रत्येक परमाणु ploidy उपवर्ग के अनुपात का संकेत है । 4 जानवरों से कुल 6.7 x 104 एचएनएफ4α + नाभिक का विश्लेषण किया गया। (ख)सीटू विश्लेषण में उच्च थ्रूपुट द्वारा हेपेटोसाइट परमाणु प्लाइडी पर डीडीसी जिगर की चोट का प्रभाव । ग्राफ डीडीसी फीडिंग के पहले 14 दिनों के भीतर 2c और 4c हेपेटोसाइट नाभिक के अनुपात में सापेक्ष कमी को प्रदर्शित करते हैं जबकि >8c पॉलीप्लाइड नाभिक नाटकीय रूप से संख्या में वृद्धि करते हैं । कुल 1.5 x 105 एचएनएफ4α + नाभिक का विश्लेषण किया गया (n = 4 जानवर प्रति टाइमपॉइंट)। डेटा को मतलब + एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। * * पी एंड एलटी; 0.01 और ***पी एंड एलटी; 0.001। एक तरह से ANOVA साधनों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । महत्व पी मानों की गणना तुकी के कई तुलना परीक्षण का उपयोग करके की गई थी। (ग)उदाहरण यह दिखाने के लिए कि कैसे परमाणु प्लॉइडी उपवर्गों को इस विधि का उपयोग करके पैरानिचिमा के भीतर स्थानिक रूप से ट्रैक किया जा सकता है, एक ही मात्रात्मक मानदंडों के साथ उच्च सामग्री इमेजिंग डेटा से पूछताछ करके, जो प्लाइडी स्तरीकरण (परिपत्रता, परमाणु आकार और मतलब Hoechst तीव्रता) के लिए इस्तेमाल किया जाता है । Hoechst फ्लोरेसेंस छवियों को पुरानी डीडीसी फीडिंग (दिन 14 और 21) के दौरान दो समय पर जिगर में 2c नाभिक अंकन सॉफ्टवेयर मास्क (लाल डॉट्स) के साथ दिखाया गया है। पोर्टल नस (ब्लू डॉटेड लाइन) और पेरीपोर्टल क्षेत्र जिनमें एनपीसी विस्तार (येलो लाइन) दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एनपीसी अंशांकन विधि का महत्वपूर्ण आकलन। (ए, बी) एनपीसी का प्रसार सफलतापूर्वक एक >2c ploidy स्कोर के साथ वर्गीकृत कर रहे हैं । (A)एनपीसी के हिस्टोग्राम नियंत्रण यकृत इम्यूनोलेबल से एनएफ4α और प्रोलाइफर मार्कर Ki-67 (n = 4, डेटा को मतलब + एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है)। 2c (एस2c)और 4c (एस4c)के लिए स्तरीकरण थ्रेसहोल्ड इंगित किए जाते हैं । (ख)वर्णित पद्धति के अनुसार एनपीसी का स्तरीकरण के परिणामस्वरूप न्यूक्लियी में Ki-67 इम्यूनोलेबलिंग का महत्वपूर्ण संवर्धन एक >2c प्लॉइडी स्कोर (एन = 12) सौंपा गया है । डेटा को मतलब + एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है । बिना पेयर टी परीक्षण का उपयोग *****P < 0.0001 के साधनों की तुलना करने के लिए किया गया था। (ग)एनपीसी अंशांकन विधि का बाहरी सत्यापन। आंतरिक एनपीसी कैलिब्रेश विधि का उपयोग करप्राप्त मतलब हेपेटोसाइट परमाणु प्लॉइडी के अनुमानों की तुलना एक ही नमूनों के अंशांकन द्वारा प्राप्त किए गए लोगों की तुलना की गई थी (नियंत्रण C57BL/6 माउस लिवर 3−4 महीने, एन = 4) 2N हेपेटोसाइट्स14के लिए एक ज्ञात परमाणु मात्रा के साथ। डेटा भी दो स्वतंत्र विश्लेषण21,,22 से प्रस्तुत किया जाता है 2−6 महीने की उंर में एक ही तनाव के चूहों से हेपेटोसाइट परमाणु ploidy का वर्णन (बिंदीदार लाइन के दाईं ओर दिखाया गया है) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: हेपेटोसाइट परमाणु मॉर्पोमेट्री सेलुलर प्लॉइडी के साथ एक "जटिल" संबंध है। (A)कैसे हेपेटोसाइट सेलुलर प्लोइडी (2N, 4N, 8N और 16N) का सारांश आंशिक रूप से परमाणु मोर्पोमेट्री के 2डी विश्लेषण द्वारा अलग किया जाता है । द्विपरमाणु कोशिकाओं (लाल) को "सरल" ("एस") और "जटिल" ("सी") मोर्पोमिट्री के बीच विभाजित किया जाता है, जो इस बात पर निर्भर करता है कि नाभिक छूने या नहीं दिखाई देते हैं या नहीं। (बी, सी) परमाणु मॉर्पोट्री और इंटरन्यूक्लियर स्पेसिंग के लिए व्यक्तिगत हेपेटोसाइट्स का मैन्युअल रूप से चयन और विश्लेषण किया गया था। (ख)"छू" नाभिक के साथ Binuclear hepatocytes "जटिल" (१००% ‧0.8), जबकि मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (काले) और गैर को छूने परमाणु मास्क के साथ binuclear hepatocytes थे "सरल" (९४% >0.8) । (C)द्विपरमाणु हेपेटोसाइट्स के "सरल" नाभिक को मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से काफी कम अंतर-परमाणु अंतर (एन = 3, कुल 94 नाभिक विश्लेषण) के कारण प्रतिष्ठित किया जा सकता है। (D)मॉडल लगभग कैसे पैनल ए से सेलुलर ploidy राज्यों 2 डी परमाणु morphometry और परमाणु क्षेत्र के संदर्भ में वितरित किया जा सकता है जिसके परिणामस्वरूप सरल परिपत्र रूपों को चार चरणों (आई−4) में क्लस्टरिंग किया जा सकता है । (ई)नियंत्रण यकृत (दिन 0) में एचएनएफ4α + परमाणु मॉर्पोमेट्री/आकार भूखंडों की तुलना और डीडीसी चोट के 14 दिनों (बाएं) और 21 दिनों (दाएं) के बाद । मोरपोमिट्री चरणऊपर संकेत दिए जाते हैं (आई−वी)। तीर चोट के परिणामस्वरूप परमाणु मोर्पोमेट्री में बदलाव का संकेत देते हैं जो 2c ("ए"), 4c ("बी") और 8c ("c") नाभिक के द्विपरमाणुकरण के अनुरूप हैं, साथ ही 16N सेलुलर प्लाइडी वर्ग (डी) के बढ़ते मोनोन्यूक्लियराइजेशन के साथ। प्रति शर्त 29−30 x 103 नाभिक का विश्लेषण किया गया (एन = 2)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फ़ाइलें: प्रदर्शन डेटासेट। कृपया इन फ़ाइलों को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मूत्र जिगर में हेपेटोसाइट न्यूक्लियर प्लॉइडी के ऊतकों के विश्लेषण और अनुमान के लिए एक उच्च सामग्री, उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण वर्णित है। प्रक्रिया से परिचित होने के बाद, एक उपयोगकर्ता 3−5 दिन की अवधि में कई नमूनों को संसाधित, छवि और विश्लेषण कर सकता है, जो बड़े परीक्षण योग्य डेटासेट उत्पन्न कर सकता है जो यकृत स्वास्थ्य का विस्तृत हस्ताक्षर प्रदान करता है। नमूना तैयारी विधि की सादगी को देखते हुए, कोशिकाओं और ऊतक क्षेत्र2की बड़ी संख्या के साथ विश्लेषण (औसतन 14 मिमी 2/नमूना), परिणाम मजबूत और अत्यधिक प्रजनन योग्य हैं। इमेज कैप्चर और एनालिसिस का ऑटोमेशन इन महत्वपूर्ण चरणों से उपयोगकर्ता त्रुटि और संभावित पूर्वाग्रह को भी हटा देता है। एक महत्वपूर्ण नवाचार एक आंतरिक प्लॉयडी कैलिब्रेशेटर के रूप में एनपीसी का उपयोग है जो नमूनों के भीतर और बीच में हेपेटोसाइट परमाणु डीएनए सामग्री का सापेक्ष मूल्यांकन करने में सक्षम बनाता है । इसलिए पहले प्रकाशित 2डी विधियों3,12,,22की तुलना में इस प्रोटोकॉल को अद्वितीय तकनीकी लाभ प्रदान करने के लिए एचएनएफ4α लेबलिंग चरण का समावेश महत्वपूर्ण है । इसके विपरीत, 3 डी पुनर्निर्माण कार्यप्रवाह18 की तुलना में कार्यप्रणाली की सापेक्ष सादगी इसे तकनीकी रूप से कम श्रमसाध्य और संभावित रूप से अधिक लचीला बनाती है।

प्रवाह साइटोमेट्री की सटीक विधि की तुलना में, 2डी ऊतक वर्गों से परमाणु डीएनए सामग्री को बहिष्कृत करने के लिए एक महत्वपूर्ण चेतावनी, सीमित आत्मविश्वास है जिसे प्लाइडी स्थिति के संबंध में व्यक्तिगत नाभिक के वर्गीकरण के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इसमें जोड़ा गया एसआईए आधारित दृष्टिकोणों के भीतर अंतर्निहित पूर्वाग्रह है जो उपक्विटोरियल नमूने के कारण छोटे प्लॉयडी उपसमूहों को अधिक प्रतिनिधित्व करने के लिए है। हालांकि, डेटा को आंतरिक मानक पर सामान्य बनाकर और एक बड़ी जनसंख्या आधारित दृष्टिकोण अपनाकर, इन प्रभावों के कारण त्रुटि को कम किया जाता है और नमूनों में तुलनीय होता है। उदाहरण के लिए एनपीसी की तुलना में हेपेटोसाइट्स को अत्यधिक गोल परमाणु आकृति विज्ञान की विशेषता है, जिसका अर्थ है कि वे विशेष रूप से परमाणु क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र के आधार पर डीएनए सामग्री का सटीक आकलन करने के लिए उत्तरदायी हैं10,,11,,14,,15,,23। एसआईए आधारित दृष्टिकोण को इस प्रोटोकॉल में परिष्कृत किया गया है ताकि मॉर्पोट्री और मतलब Hoechst फ्लोरेसेंस तीव्रता के उपायों को एकीकृत करके परमाणु परिपत्रता और डीएनए घनत्व दोनों के लिए खाते में दिया जा सके जिसके परिणामस्वरूप व्यक्तिगत नाभिक के लिए अनुमानित "न्यूनतम डीएनए सामग्री" वर्णनकर्ता होता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि 2−4एन प्लॉइडी नियंत्रण के रूप में एनपीसी का उपयोग न्यूनतम परमाणु डीएनए सामग्री के वस्तुनिष्ठ अंशांकन और स्तरीकरण के लिए एक महत्वपूर्ण आंतरिक मानक प्रदान करता है, जिससे किसी भी प्रजाति या प्रारूप के नमूनों पर लागू वर्णित पद्धति को यह देखते हुए कि एचएनएफ4α (या इसी तरह के हेपेटोसाइट परमाणु मार्कर) के लिए एक उपयुक्त एंटीबॉडी प्राप्त की जा सकती है।

हालांकि परमाणु ploidy के आकलन के लिए जिगर की बीमारी प्रगति10,,13के लिए उपयोगी हस्ताक्षर प्रदान करने के लिए दिखाया गया है, ताकि पूरी तरह से जिगर के भीतर ploidy परिवर्तन की विविधता का पता लगाने के लिए यह दोनों वांछनीय और आवश्यक होगा वर्णित पद्धति के अनुकूल करने के लिए hepatocellular परिधि के लिए खाते और इस तरह सेलुलर ploidy । सेलुलर प्लॉइडी की मैपिंग पहले मानव और माउस जिगर के नमूनों में बीटा कैटेरिन10,,13,,24,ऐक्टिन12,,22 और साइटोकेराटिन10,,11 जैसे मार्कर का उपयोग करके हेपेटोसाइट परिधि की लेबलिंग द्वारा हासिल की गई है। हालांकि, जब डीडीसी चोट के बाद इसका परीक्षण किया गया था, तो नाटकीय एपिथेलियल रीमॉडलिंग ने हेपेटोसेलुलर परिधि का विश्वसनीय मूल्यांकन दोनों फेलोडिन (डेटा नहीं दिखाया गया) या एंटीबॉडी से बीटा कैटेनिन17तक किया था। इसलिए, जबकि यह दृष्टिकोण व्यवहार्य है, यह सभी चोट मॉडलों पर लागू नहीं हो सकता है, लेकिन यदि हासिल किया जाता है तो सेलुलर प्लॉयडी की मैपिंग के साथ-साथ हेपेटोसाइट आकार और संख्या का अनुमान अधिक सटीक बनाना होगा। यह भी प्रशंसनीय है कि अतिरिक्त परमाणु मापदंडों के लिए लेखांकन करके, जैसे अंतरपरमाणु रिक्ति(चित्रा 7सी),मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को "सरल" द्विपरमाणु हेपेटोसाइट्स से भेदभाव किया जा सकता है, और "जटिल" द्विपरमाणु कोशिकाओं के आगे अलगाव नाभिक के रेडियल माप द्वारा प्राप्त किया जा सकता है कि उनके 2D मास्क होते हैं ।

यह देखते हुए कि मान्य मानव HNF4α एंटीबॉडी FFPE ऊतक25 के लिए मौजूद है और आंतरिक अंशांकन किसी भी प्रजाति-विशिष्ट सीमाओं की इस पद्धति को मुक्त करता है, प्रोटोकॉल लगभग तुरंत मानव नमूनों पर लागू होता है। इस प्रकार, इसमें मानव रोग में हेपेटोसाइट परमाणु प्लाइडी और यकृत की चोट के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए एक बेंचमार्क प्रदान करने की काफी क्षमता है। इसके अलावा, अन्य एंटीबॉडी के साथ मल्टीप्लेक्सिंग द्वारा, यह विधि विशेष हेपेटोसाइट सबसेट और जिगर की चोट और बीमारी के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के लिए नई भूमिकाओं को प्रकट कर सकती है। इस उद्देश्य के लिए, हमने प्रोलाइफर न्यूक्लियर मार्कर Ki-67(चित्रा 6)के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के साथ कार्यप्रणाली को सफलतापूर्वक संयुक्त किया है, जो उपयोगी जानकारी को बीनने में सक्षम बनाता है-जिसमें प्लॉइडी (दोपहर, अप्रकाशित डेटा 2019) के बेहतर आंतरिक अंशांकन के लिए एनपीसी की गैर-प्रसार2N आबादी की पहचान शामिल है। इसलिए, विधि प्रदान करने वाले स्थितीय और मात्रात्मक डेटा के साथ लचीलेपन को युग्मित करके, हम सुझाव देते हैं कि इसके भविष्य के अनुप्रयोगों से यकृत में पॉलीप्लाइडी की भूमिका की समझ में सुधार होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को स्पेनिश MINECO सरकार अनुदान BFU2014-58686-P (LAN) और एसएएफ-2017-84708-R (DJB) द्वारा वित्त पोषित किया गया था । लैन को एक राष्ट्रीय MINECO Ramón y Cajal फैलोशिप RYC-2012-11700 और योजना GenT पुरस्कार (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), और एक क्षेत्रीय Vali + डी छात्र द्वारा वैलेंसियाई Generalitat ACIF/2016/020 द्वारा समर्थित था । आरपी फंडिंग के लिए प्रो इवा के पालुच को स्वीकार करना चाहेंगे। हम इन सेल एनालाइजर प्लेटफॉर्म के साथ मदद के लिए डॉ एलिसिया मार्टिनेज-रोमेरो (सीआईपीएफ साइटोमेट्री सेवा) का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) TestDiet 1810704 Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) Invitrogen A11055 Dilution 1:500
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cryostat Leica CM1850 UV Leica biosystems CM1850 UV Tissue sectioning
Fluorescent Mounting medium Dako S3023
GraphPad Prism GraphPad Software Prism 8 Statistical software for graphing data
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Final concentration 5 µg/mL
IN Cell Analyzer 1000 GE Healthcare Bio-Sciences Corp High-Content Cellular Imaging and Analysis System
MATLAB MathWorks R2019a Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy
Microscope coverslides VWR International 630-2864 Size of 24 x 60 mm
Microsoft Office Excel Microsoft Speadsheet software
OCT Tissue Tek Pascual y Furió 4583
Paraformaldehyde Panreac AppliChem 141451.121
Pen for immunostaining Sigma-Aldrich Z377821-1EA 5mm tip width
Polysine Microscope Slides VWR International 631-0107
Rabbit polyclonal Anti-HNF4α Thermo Fisher Scientific PA5-79380 Dilution 1:250 (alternative)
Rabit polyclonal Anti-HNF4α Santa Cruz Biotechnology sc-6556 Dilution 1:200 (antibody used in the study)
Tween 20 Sigma-Aldrich P5927

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References

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चूहों में हेपेटोसाइट न्यूक्लियर प्लॉइडी के अनुमान के लिए सीटू विधि में एक उच्च-थ्रूपुट
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Manzano-Núñez, F., Peters, R., Burks, D. J., Noon, L. A. A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice. J. Vis. Exp. (158), e60095, doi:10.3791/60095 (2020).

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