Summary
我们提出了一种稳健、经济、灵活的方法，用于测量固定/冷冻组织样本中肝细胞数和核球菌的变化，而不需要流动细胞测量。我们的方法提供了肝细胞学的强大样本范围特征，非常适合跟踪肝损伤和疾病的进展。
Abstract
当肝脏受伤时，肝细胞数量减少，而细胞大小、核大小和脂肪增加。非乳腺细胞的膨胀，如胆囊细胞、肌瘤细胞、祖细胞和炎症细胞也表明慢性肝损伤、组织重塑和疾病进展。在此协议中，我们描述了一种简单的高通量方法，用于计算与损伤、慢性疾病和癌症相关的肝脏细胞组成的变化。我们展示了如何利用从二维（2D）组织部分提取的信息来量化和校准样品内的肝细胞核球，并使用户能够在原位定位肝脏内的特定多西子。我们的方法需要获得固定/冷冻肝材料、基本免疫细胞化学试剂和任何标准的高含量成像平台。它是标准流细胞学技术的有力替代品，需要破坏新收集的组织、空间信息丢失和潜在的分解偏差。
Introduction
哺乳动物肝脏中的肝细胞可以经历停滞的细胞因子细胞生成双核细胞，DNA内复制产生多倍体核，含量高达16N的DNA含量。产后发育、衰老和应对各种细胞压力时，细胞和核障碍总体增加1。多倍化过程是动态的和可逆的2，尽管它的精确生物功能仍不清楚。增加的普洛伊与增殖能力降低4、遗传多样性2、适应慢性损伤5和癌症保护6有关。肝细胞性改变发生由于昼夜节律改变7，并律下8。最值得注意的是，肝脏的脂肪轮廓因损伤和疾病9而改变，令人信服的证据表明，特定的蛋白核变化，如增加+8N核或2N肝细胞的丧失，为跟踪非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）进展3，10，10或病毒感染的差分影响11提供了有用的签名。3
一般来说，肝损伤和再生与肝细胞细胞大小和核面积增加有关，同时肝细胞总数减少，特别是那些具有2NDNA含量10，11,11的肝细胞。肝脏中的帕伦奇马尔损伤也经常伴有非泛状细胞（NPCs）的扩增，包括基质肌纤维细胞、炎症细胞和二能肝祖细胞。高通量方法，提供肝细胞数和核球的定量细胞学概况，同时也考虑到NPC的变化，因此具有相当大的潜力，作为研究和临床工具，以跟踪肝脏在损伤和疾病期间的反应。最近对肝细胞癌人体样本中的普西迪光谱进行实地分析也表明，核球在肿瘤内急剧增加，在更具攻击性的肿瘤亚型中特别扩增，减少分化和TP53 13的损耗。因此，在核策略定量评估方面的方法学进步很可能有助于今后对肝癌的预后分析。
本协议介绍了一种灵活的高通量方法，用于对小鼠肝组织部分进行比较分析，它提供了肝细胞数的详细细胞分析、NPC响应和用于估计核高倍的内部校准方法（图1）。肝细胞在核尺寸和核测量表之前，通过肝细胞核因子4α（HNF4+）免疫标签与NPC区别开来。"最小DNA含量"通过将平均Hoechst 33342强度（DNA密度的代理）与插值的三维（3D）核体积集成，估计为所有圆形核掩膜"最低DNA含量"。然后，使用NPC校准肝细胞最小DNA含量，以生成核球状轮廓。
使用高含量成像进行图像采集、核分割和图像分析，使包含数万个细胞的大面积二维（2D）肝部分进行筛选。提供一个定制程序，用于自动处理高含量图像分析数据，以生成所有圆形肝细胞核的样本范围的ploidy轮廓。这是使用免费下载软件，计算基于立体图像分析（SIA）10，11，14，15的核策略。10,11,14,15SIA方法以前曾被流细胞测定证实为一种准确（尽管费力）的方法，用于估计肝脏14中的肝细胞核糖核，假设循环核形态和核大小与DNA含量之间的单调关系。在本议定书中，这两个核参数都是通过核测量和Hoechst 33342标签的评估来衡量的。计算每个核掩膜的"最小DNA含量"后，使用NPC校准肝细胞核糖核糖，这些NPC具有已知的2-4NDNA含量，因此作为有用的内部控制。
与传统的流细胞测量方法16相比，所述方法使肝细胞核球菌能够就地评估，并且不需要获得新的组织或分解方法，这些方法可能会偏袒结果，难以标准化。与所有基于 SIA 的方法一样，由于赤道平面外较大核的切片，2D 采样对核策略子类 >2N 的代表性不足。全组织蛋白体剖面还描述了所有圆形肝细胞核掩码的最低DNA含量，并且不直接区分单核肝细胞和具有同一双核核核的两个离散（"不接触"）核。然而，这项议定书的简单性使得可以相当的余地加以调整，以考虑到核间隔或细胞周界分析等其他参数，这将有助于识别双核细胞，从而更详细地评估细胞结构。
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Protocol
所有动物实验以前都得到CIPF道德委员会的批准。老鼠被安置在费利佩中心（西班牙瓦伦西亚）的无病原体设施中，注册为实验动物饲养者、用户和供应中心（注册号。根据现行适用的欧洲和西班牙动物福利条例（RD 53/2013），ES 46 250 0001 002）。
1. 组织收获和样品制备
注：此协议描述了如何在不事先固定或冷冻保存的情况下冻结组织。对于以前固定/冷冻保存的样本，请转到第 2 节并省略步骤 3.1。所有分析均使用12-16周的成年雌性C57BL/6小鼠进行。
- 通过芬太尼/五巴比妥内腹注射来牺牲动物，然后进行宫颈脱位。当小鼠朝方腹腔一侧时，打开腹腔，用钳子抓住皮肤，用手术剪刀从下腹部底部到胸骨底部进行垂直切口，从而打开腹腔并露出肝脏。
- 使用细钳小心地取出胆囊，解剖肝脏，并在充满磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的 10 厘米培养皿中冲洗选定的肝球。
注：建议比较每种动物的同一肝叶，在这种情况下，使用了中位叶。 - 在室温 （RT） 下，使用最佳切割温度 （OCT） 介质填充标记的低温。避免 OCT 气泡。如果它们出现，请使用针或移液器尖端将其推到模具边缘。
- 将肝卵泡嵌入一个填充的OCT低温中，并立即将其放在干冰上，以确保快速冻结。在-80°C下储存冷冻，直到冷冻。
2. 冷冻切除
- 在干冰上运输低温，以避免组织退化。在低温解剖之前，冷冻素内平衡设置为-20°C20分钟。
- 通过在塑料低温器底部施加压力来喷射样品。将液体 OCT 涂抹到 RT 的加热样品盘上，在低温塔中放置，并附加 OCT 嵌入式肝脏样本。施加温和的压力，等待 3 分钟，让 OCT 冻结，确保样品粘在磁盘上。
注意：避免尽可能用手指处理样品，以避免组织退化。 - 将样品锁定到冷冻器的臂中并调整方向，使样品边缘与低温铲刀平行。切成样品，直到达到组织。
- 在 6 μm 厚度下对样品进行切片。将标有聚酰胺涂层的幻灯片放在样品上 5 s，让样品粘在幻灯片上。将幻灯片放在 RT 上 3-5 分钟，然后，为了获得最佳效果，请直接转到第 3 节。
注：为了处理多个新鲜冷冻样品，通过暂时将幻灯片存放在干冰上的滑箱中，直到处理所有样品，可以重现结果。使用此方法时，允许所有幻灯片在继续第 3 节之前对 RT 进行平衡。可以使用形式固定石蜡嵌入式（FFPE）样品，但通过这种方法增加了背景自荧光。从FFPE样品中继续，通过在聚酰胺处理的滑轨上捕捉40°C水浴的部分，在4μm.安装处进行切片。在 60°C 下加热 1 小时，然后在含有二甲苯 （x2）、乙醇 100%（x2）、96% （x2）、70% （x1） 和 dH2O （x1） 的 Coplin 罐子中通过串行 RT 哈希（5 分钟）进行脱麻。要暴露抗原，在 90°C 下将幻灯片放入西酸缓冲液中 20 分钟，然后再在 RT 的 PBS 中回火幻灯片。
3. 荧光免疫标签
- 在RT将幻灯片转移到装有PBS的Coplin罐中，用温和的搅拌（重复3倍）将幻灯片转移到PBS填充的Coplin罐中，然后洗涤3分钟，在PBS中涂抹1 mL4%甲醛（PFA），将组织部分固定在烟雾罩中。
注：从现在起到免疫染色过程结束，避免样品干燥。 - 使用疏水笔干燥每个组织部分周围的区域并环绕。在 RT 中使用 0.5% 的非离子表面活性剂（即 Triton X-100）在 RT 中渗透 15 分钟。然后用温和的搅拌（重复2倍）在PBS填充Coplin罐子中洗涤3分钟。
- 块使用过滤溶液1%牛血清白蛋白（BSA），5%马血清，0.2%非离子表面活性剂在PBS（在RT至少1小时）。
- 在深色潮湿的染色室中，在4°C的夜间阻塞缓冲液中稀释原发HNF4®抗体（有关抗体和特定稀释物的材料表）。
- 将幻灯片放入充满 PBS 的 Coplin 罐子中，并使用温和的搅拌（重复 4x）洗涤 3 分钟。
- 孵化与Alexa-488结合的二次抗体和Hoechst稀释在过滤1%BSA和0.2%非离子表面活性剂在PBS在RT在黑暗的湿润染色室2小时（见材料表抗体和特定的稀释）。
- 将幻灯片放入充满 PBS 的 Coplin 罐子中，并使用温和的搅拌（重复 4x）洗涤 3 分钟。使用温和的搅拌（重复2倍），在 ddH 2 O 中洗涤 3 分钟。
- 将两滴荧光安装介质放在盖玻片（24 x 60 mm）上，并在滑道上放置滑轨，通过施加柔和的压力消除气泡，从而安装滑道。对于长期存储，用透明指甲油在边缘密封盖玻片，并储存在 4 °C 的黑暗中。
- 在继续之前，使用传统的荧光显微镜检查幻灯片，以确保良好的固定和免疫标记。
注： 有关预期结果，请参阅图 2A，B。
4. 荧光图像采集
注：对于此步骤，需要一个支持自动荧光图像采集的高含量成像平台（材料表）。
- 打开成像系统并打开新的采集协议。
- 选择 10x 目标，记下视野区域（本例中为 0.6 mm2）。
- 设置参数，使用适当的激励和发射滤清器（根据步骤 3.6）获取荧光图像。对于 Hoechst 和 Alexa-488，选择分别具有 390/18 和 438/24 nm 发射和 432.5/48 和 475/24 nm 发射的"DAPI"和"GFP"通道。
- 聚焦样品并确保信号强度不饱和。确保所有图像捕获的时间与所有图像的曝光时间相同，或使用在曝光时间内校正荧光强度的系统。
- 扫描样品并获取足够的图像，以获得组织部分的完整覆盖（根据样本大小，大约 20-50 个视场）。
- 查看图像数据库，手动消除 （i） 聚焦不良的场，（ii） 每个组织部分边界处的场（以避免偏置细胞密度计算），以及 （iii） 包含组织部分折叠/物理损坏区域（如果存在）。"
5. 自动荧光图像分析
注：此步骤需要适当的图像分析软件（材料表），能够：（1） 自动识别 405 nm（核分段）图像中的 Hoechst 标记核;（2） 评估平均 Hoechst 核强度和近值测量值;（3） 阈值分析以确定 488 nm （HNF4]） 下核荧光的 +/- 状态。需要一些基本的操作员培训/专业知识来目视评估和调整程序中的分段和阈值参数，以确保核和 HNF4+/- 状态得到最佳门控（图 2）。
- 在图像分析软件中，从步骤 4.5 中打开包含 Hoechst （405 nm） 和 HNF4+ （488 nm） 图像的采集文件，并创建新的分析协议。
- 定义用于核分割（霍赫斯特，405 nm）和肝细胞/NPC阈值分析（HNF4+，488 nm）的波长。
- 调整软件的核分割参数（如"最小核区域"和核检测"灵敏度"），以确保核以最佳方式分离。
注：肝细胞的良好分段应优先于NPC。肝细胞核是特征圆的（四分位数范围：40~64 μm2）。NPC核，如正弦内皮核核，在形状上是扁平的/椭圆形的或不规则的，通常比肝细胞小，包装更紧密（四分位数范围：30~43 μm2）。对于小鼠肝脏，使用了最小核面积±23 μm2和检测"灵敏度"65%（有关预期结果，参见图2C，D）。灵敏度根据像素团的强度确定如何识别为单个核，在进行自动图像分析之前，应对用户设置的每个样本进行经验测试。 - 在 488 nm 处修改阈值强度，以确保肝细胞 （HNF4+） 和非甲形细胞 （HNF4+-） 的最佳浇注。
注： 有关预期结果，请参阅图 2C，D。阈值强度值是相对的，取决于染色效率和采集设置，如激光强度。因此，用户应将其标准化。使用已知的HNF4+-细胞，如内皮细胞和圆体NPC作为内部负对照和双核肝细胞核作为染色的积极参考。在对整个数据集应用分析参数之前，使用少量图像测试分析参数，以确保良好的核分割和强度阈值分离。 - 选择要量化的下列核参数：（1）基于Hoechst染色（μm2）的核区域，（2）平均核高强度（RU），（3）核伸长系数（原子核短轴与原子短轴的平均比， 其中中心对称[非长）物体的值为 1，（4） Nuc 1/（形式因子），均值核"圆度"指数按周界 2/（4= x 面积）计算）。值范围从 1 到无穷大，其中 1 是一个完美的圆，（5） HNF4+ 状态（正-1 或负 -0），以及 （6） 基于"重心"（cg）的核 x/y 坐标，这是一种以亚像素精度从灰度图像中定位对象中心的方法。
- 运行所有示例数据集的分析，并将数值数据从步骤 5.5 导出到电子表格软件。
6. 数据分析
注：数据分析步骤可以使用任何标准电子表格软件执行。
- 计算肝细胞和非肝细胞细胞数。
- 通过将视场数乘以视场区域（步骤4.2），计算每个样本分析的肝脏部分总面积。
- 使用为每个肝脏部分生成的电子表格文件，仅选择 HNF4+ 核来筛选数据。计算分析的HNF4+核的总数，并将其除以分析的总面积，以获得每个样品的平均肝细胞密度（图2F）。
- 通过筛选 HNF4+-单元格的电子表格（图 2E），对非计算单元执行相同的计算。
- 通过将视场数乘以视场区域（步骤4.2），计算每个样本分析的肝脏部分总面积。
- 计算肝细胞核大小分布。
- 使用电子表格软件，筛选数据仅选择HNF4+核。
- 直方图中核区域的绘图值（图2G）。将箱宽度设置为 5 μm2。
注：根据步骤 6.1.1，可以校正区域（核/mm2）的频率值。
- 执行肝细胞核球分析。
注：步骤 5.6 中的电子表格数据用于为每个样本生成核策略配置文件。此过程已自动化，可以使用自定义书面软件执行，该软件可免费下载，支持信息和演示数据集，https://github.com/lukeynoon（参见补充文件).为希望调整方法的用户提供源代码。下面概述了该算法的说明以及安装和使用说明。程序使用电子表格数据自动将肝细胞核分成两组;（1）具有"简单"圆核和（2）代表具有±2c倍性的双核细胞的"复杂"非圆核。下一步计算所有"简单"核的最低核DNA含量（核区域和DNA密度的函数）。然后，后续步骤使用HNF4+-核作为已知的2-4N内部控制自动校准HNF4++肝细胞核策略。- 下载并安装软件。
- 从：下载打包的应用程序：https://github.com/lukeynoon
- 启动 MATLAB。导航到工具行程的 APP 选项卡，单击"安装应用程序"并打开称为"Ploidy_Application.mlapp 安装"的下载应用程序。将显示一条消息以确认成功安装。
注： 应用程序现已准备就绪，并将保留在工具跳闸的 APP 选项卡中。
- 格式化输入数据。
注：在自动核策略分析之前，所有包含高含量成像数据的电子表格文件（步骤 5.6）都应按照以下说明进行存储和格式化。- 在每个导出的数据文件中 （.XLS 97-2004 工作簿）从步骤 5.6 中，包括一个称为"细胞度量值"的工作表，其中包含列中列的 ploidy 分析所需的所有数据（图 3A）。确保包含列标题名称的电子表格布局与图 3A保持不变，因为分析方法通过搜索这些名称来查找正确的列数据（请参阅补充文件中的演示数据集以供参考）。例如，如果高含量图像分析软件不生成"光通量"列（图 3A），则在同一位置手动插入"光通量"列，即列 K 并将其填充为零。
- 对于每个实验条件（例如"受伤-d14"），提供一个控制数据集，用于计算2-4N核复核校准的内部控制（步骤6.3.4.3）。在这里，从未经处理的成年垃圾伴侣中选择肝脏样本（"控制-d0";图3B+D。
- 对于生物复制（根据条件），将每个电子表格存储在其自己的文件夹中（如图3B所示）。以增量方式命名文件夹前缀，例如"示例 1、示例 2、示例 3...样值N"，根据其中包含的文件名。因此，每个数据集文件夹（例如"Control-d0"）都应包含一系列子文件夹（"示例 1"、"Sample2"等），每个文件夹都包含具有相同相应名称的电子表格文件。
- 运行应用程序。
- 在 MATLAB 中，通过单击工具跳闸的 MY APPS 选项卡中的图标（图3C），启动"Ploidy_Application"。将显示Ploidy_Application图形用户界面 （GUI） （图 3C）。
- 单击"路径以控制数据"按钮以导航到控件数据复制所在的文件夹（例如，"控制-d0"）。然后，此数据路径将显示在接口中（例如/用户/桌面/控制 d0）。
- 接下来，在"文件夹前缀"中键入要为输出文件指定的名称（例如，"示例"）。
注： 此前缀可以更改为任何文本，前提是文件夹和文件名保持增量命名。 - 单击"路径到其他数据"按钮并导航到比较数据复制所在的文件夹（例如，"受伤-d14"）。然后，此数据路径将显示在接口中（例如/用户/桌面/受伤-d14）。
- 单击"运行"！分析完成后，状态栏将改为"分析完成!.."。
注：应用程序将报告，每个样本，"简单"核分层到+2n，2n+4n，4n_8n和8n+的绝对计数和总的百分比（图3D）。这些文件将自动保存在每个示例文件夹中，如："Count_2n.txt"、"Count_2n_to_4n.txt"、"Count_4n_to_8n.txt"、"Count_8n_and_higher.txt"、"Percentage_2n.txt"、"Percentage_2nto4n.txt"、"Percentage_4nto8n.txt"、"Percentage_8n_and_higher.txt"。Count_2n.txtCount_2n_to_4n.txt" "Count_4n_to_8n.txt" "Count_8n_and_higher.txt" "Percentage_2n.txt" "Percentage_2nto4n.txt" "Percentage_4nto8n.txt" "Percentage_8n_and_higher.txt"Ploidy_Application将自动为每个样本保存一个列表，即"Ploidy_All_Hepatocytes.txt"和"Ploidy_NonHepatocytes.txt"中"简单"肝细胞和非肝细胞核的所有单独ploidy估计值。对于控制数据集，该方法还保存了为 ploidy 分层计算的最小 DNA 含量阈值（请参阅步骤 6.3.4.3.7）中的名为"Normalised_Thresholds_Control"。最后，应用程序将为控件和称为"摘要"的选定比较条件数据生成一个文件夹。此文件夹包含两个子文件夹，"Ploidy"和"分层"，其中包含提供的所有样本的平均值（图 3D）。
- 方法的说明。
注：以下部分详细介绍了核普洛伊迪分析软件使用的方法。如果用户选择不使用该应用程序，可以使用电子表格软件手动计算核策略配置文件，然后执行这些步骤。- 根据核测量，将核分离成"简单"或"复杂"。
- 计算所有核的"循环指数"，定义为核"伸长因子"除以"Nuc 1/（形式因子）"，其中值 1.0 表示一个完美的圆。
注："核伸长"和"Nuc 1/（形式因子）"是评估互补、非重叠形态测量标准的物体"循环性"的两个离散度量。前者测量对象的长轴和短轴，而后者将对象的周长与其区域的长度进行比较。为了加强本议定书中使用的核循环的定义，这两项测量结果已合并为一个单一的"循环指数"。以前使用所述方法估计核废料的方法只使用核伸长17。虽然使用这种方法获得了可接受的结果，但作者指出，复合的"循环指数"改善了单核和双核半核细胞中人工选择的核的鉴别（未显示的数据）。 - 将循环指数 = 0.8 的核分类为"复杂"，将 > 0.8 分类为"简单"。
- 计算所有核的"循环指数"，定义为核"伸长因子"除以"Nuc 1/（形式因子）"，其中值 1.0 表示一个完美的圆。
- 估计所有"简单"核的"最小"DNA含量（m）。
- 使用公式计算核半径 （r）：
- 使用球体公式的体积计算核体积 （v）：
- 使用公式为最小DNA含量 （m） 生成相对值：
- 使用公式计算核半径 （r）：
- 使用 NPC （HNF4+-） 核作为内部 2-4N 控制校准数据集。
注：NPC 具有 2-4N DNA 含量，具体取决于细胞周期状态。因此，NPC"最小"DNA含量（NPCm）的平均值随伤害而增加（图4A）。通过建立表示 4c 阈值的 NPCm的上限（图 4B），校准误差最小化。- 在电子表格中，仅选择带有值为"m"值的 NPC 核，该值位于模式的 1 个标准差 （SD） 内（这可过滤出可能的分段误差中的噪声）。
- 在此过滤范围内，检查核区域及其相应的均值 Hoechst 强度（图4C）。
- 以最大核霍赫斯特强度估计此过滤范围内最小的核区域（即曲线在筛选数据集中改变方向的点，如图4C中的红色圆圈所示）。此值表示 2N-4N 过渡状态 （t），其 4c 核的采样占主导地位于 2c 核之上，从而产生平均 Hoechst 强度的最大值。
注： 此值由软件自动确定;但是，电子表格用户可以手动选择此点作为过渡大小。 - 通过按照步骤 6.3.4.2 计算此过渡大小 （tm） 表示的最小 DNA 含量。
- 要估计 NPCm数据集的 4N 肩，在 tm的值中添加 1 SD 。所得数字（图4B）描述了用于核糖体分层（S4c）的NPC最小DNA含量的上限。
- 对所有"控制"样本重复步骤 6.3.4.3.1_6.3.4.3.5。
注：例如，在图 3中，未受伤的控制肝（"控制 d0"）用作控制条件。 - 计算"控制"样本的平均4c分层阈值（S4c），并用它来推断2c（S2c）和8c（S8c）边界，以最小的DNA含量（m）。分层阈值由软件自动生成和存储（步骤 6.3.3.3）。
注：根据研究设计，可以为每个情况或特定条件（例如健康控制肝脏）计算平均分层阈值。但是，核 Ploidy 分析软件要求将一组 2 个文件中的一个指定为"控制"，以便计算相对 ploidy 值。 - 使用步骤 6.3.4.3.7 中生成的 S2c值计算所有原子核的 ploidy 值，如下：
- 根据以下标准，将"简单"肝细胞 （HNF4+） 核放入 2c/4c/8c/>8c 支架中："2c" HNF4+ = p = 2;"4c" HNF4+ = 2 < p = 4;"8c" HNF4+ = 4 < p = 8;">8c" HNF4+ = 8 < p.
- 为了重建ploidy子群的空间模式，根据获取这些子组的相应字段，将每个样本电子表格中的核数据分开。然后使用关联的核 x/y 坐标（从步骤 5.5 开始）以 2D 为单位绘制 ploidy 子组（图 5C）。
- 根据核测量，将核分离成"简单"或"复杂"。
- 下载并安装软件。
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Representative Results
该方法已用于测量胆静损伤对成年小鼠肝脏的影响，通过喂养动物0-21天与肝毒性饮食含有0.1%3，5-二氧碳基-1，4-二氢胶碱（DDC）17。慢性DDC喂养导致肝细胞损伤增加，NPC的皮球和外皮扩张。用户应注意，在核策略中可能存在小鼠应变和年龄依赖性差异，所有分析均使用12-16周的成年雌性C57BL/6小鼠进行。
在HNF4+免疫标签（协议第3节）之后，使用常规荧光显微镜检查所有幻灯片非常重要，以确保良好的质量固定和染色（图2A）。对 Hoechst 的涂抹或模糊可能表示在固定之前固定不足或样品降解不足（图 2B），在这种情况下，返回到协议第 2 节并缩短切片和固定之间的时间（步骤 3.1）。HNF4+ 抗体的成功免疫标记，在现阶段可以很容易地通过明确区分正标记的肝细胞核来判断，通常比NPC的核核更大、更圆润（图2A）。平展/椭圆形内皮核在帕伦奇马内，或DDC损伤后在近视门区域扩张的密密片细胞，在评估免疫染色的成败时，可作为识别HNF4+-NPC的有用视觉参考。
核分离和HNF4+阈值参数（步骤5.2_5.4）应在自动图像分析（步骤5.6）之前仔细优化，以广泛反映协议第3节（图2C）末尾常规荧光显微镜观察到的免疫染色的视觉模式（图2C）。图2D汇总了最佳与次优核分割和HNF4+阈值协议的例子。在图像分析（步骤6.1.3）之后，数据应反映肝中与DDC损伤的NPC数量不断增加（图2E），从对照肝中52%~2.0%的核到21天DDC治疗后的72.8%=1.4%。肝细胞占对照肝总核的48.0%~2.0%，与先前对肝组织学的分析一致，肝细胞占组织体积的70~85%，但仅占肝细胞总细胞的45~50%18、19。,19在DDC喂食的前14天，HNF4+核的数量被小而显著地减少（图2F）。肝细胞核区的频率分布图（步骤6.2）显示40~50μm2尺寸范围内控制肝脏中的HNF4+核区峰值，DDC损伤后核尺寸明显右移（图2G）;符合增加的普洛迪和肝细胞肥大12。
在健康（第0天）对照肝中，63.4% ± 1.7% 的 HNF4+ 核具有"简单"圆形 morpletry（图 5A）。这个数字在DDC损伤21天后降至46.8%=5.7%（P = 0.042），反映了核莫里皮测量的复杂性增加，这大概与多倍化期间ploidy状态之间的转移有关（见下文"核莫里皮的解释"）。图5A显示了使用这种方法在控制肝部分获得的核糖分布的代表性示例，它描述了DNA含量的插值如何允许在单个样本中分层单个细胞。还显示了"复杂"和"简单"HNF4+ 单元格子集的平均值（图 5Figure 5A）。这些数据与先前对80-90%成年毛虫肝细胞2的多倍估计一致。复杂核的频率（36.6% ± 1.7%）在对照肝也近似于双核细胞（35%）20，虽然数据应严格地被视为一种核测量，而不是细胞的测量（见下面的"核记忆解释"）。对照组（第0天）和DDC治疗组之间的相对多倍比较应反映2c和4c肝细胞核的显著损失以及损伤以及增加的>8c细胞数量（图5B）。每个ploidy子组的相对位置信息可以通过与数据集内每个原子核关联的x-y坐标的散点图进行查询，或者通过在高内容图像分析软件中检索特定肝细胞子集的二维位置（图5C）。
校准
为了评估所使用的NPC校准方法的有效性，使用对HNF4+和增殖标记Ki-67的抗体对肝部分进行双重免疫标记（图6A，B）。这些数据显示了Ki-67的丰富性，它标记细胞周期所有活动阶段的细胞，在NPC最小DNA分布曲线的右侧（在S2c和S4c之间）-NPC预计将复制DNA，因此具有>2c ploidy（图6A）。研究了所有控制和受伤的肝脏样本的内部校准后， Ki-67，在"简单"NPC核中显著富集（P < 0.0001），估计为 >2c（82.5% = 6.6% SD，n = 12），而与 +2c ploidy （17.5% = 6.6% SD， n = 12） （图 6B）相比，表明已成功进行校准。这些数据支持所用方法的有效性。此外，假设对Ki67进行精确阈值，它们提供了一些定量的见解，了解来自较高高倍的细菌群的亚赤道核掩膜在何种程度上"污染"了下面的群体。
为进一步检验NPC校准方法的有效性，根据先前报告的小鼠2N肝细胞核体积（155.8 μm3）14，引入了外部校准器。3当这个数字与HNF4a-核的Hoechst强度平均值结合使用时，对照肝脏中平均肝细胞蛋白的估计值与内部（S2c）校准器（图6C）的估计值是无可区分的。此外，对同龄C57BL/6小鼠菌株小鼠平均肝细胞球的估计值也相似，证实不需要事先对2N肝细胞核大小的经验知识，使得这种内部控制的方法完全自主地估计核球。
核测量的解释
所述方法为肝细胞核提供了一个"简单"循环莫里塞。排除"复杂"核是基于这样的假设，即它们代表具有重叠/接触核掩码的双核半核细胞的比例，使得该子集的精确策略测定更具挑战性（图7A）。重要的是，根据循环分离核并不能使用户区分单核肝细胞核和双核细胞核核，其中两个类似球状的核在细胞内被明确分离。通过从图像数据集中手动选择双核和单核电池，并通过算法评估它们的分离（图7B），对上述情况进行了实证测试。物理接近但"不接触"但"不接触"的双核Figure 7C肝细胞核被算法归类为"简单"，而那些"接触"的核则显然被歧视为"复杂"。因此，这种测定不能提供肝脏中细胞蛋白的读出，因为双核细胞的核在"简单"和"复杂"子类之间细分（见讨论）。然而，通过绘制核年代和核大小的直方图，并应用多倍化期间"复杂"和"简单"状态如何转换的模型（图7D），可以从这些数据中获得一些关于细胞状态和核策略状态转换的见解。在对照肝脏中，核间舍测定的三个阶段（I+III）被清楚地观察到（图7E）。它们分别表示圆形 2N （I）、4N （II） 和 8N （III） 核掩码的聚类（如图7D所示）。单核16N肝细胞在成年小鼠肝脏16、18、2118,21中极为罕见，因此16N细胞细胞细胞群几乎完全由具有8N核的双核细胞组成，位于第三阶段（图7E）内和右侧，解释了三期右侧循环下降的情况。16有趣的是，在受伤（DDC第14天），向复杂性增加（"双核性"）的定量转变开始于第一阶段（反射2n至2x2n）和第三阶段（反射8n至2x8n），最后在三个阶段（I+III）巩固。作者推测，这种向复杂性增加的转变是由于细胞因子停滞引起的细胞多端性增加，而在第三阶段右侧观察到相反的趋势，因为内复制导致受伤肝脏中循环16N单核细胞的代表性增加。当然，这些观察结果需要通过调整方法来正确解释细胞障碍（见讨论）。
图 1：工作流摘要。肝脏组织被收获（1），冷冻科 （2）， 固定和免疫标签与 HNF4+ 抗体允许帕伦奇和非乳腺细胞 （NPC） 被区分 （3）.处理后，使用使用自动图像捕获（4） 和分析 （5） 的高含量成像平台对样本进行数字化。细胞由Hoechst核荧光和HNF4+免疫荧光阈值分割。接下来，计算霍奇斯特核区（"A"）和圆形（"C"）。最后，对数据进行了分析（6）;HNF4+- NPC根据核循环性（ii）进行量化（i）和HNF4+肝细胞核被分成两个子集（"简单"和"复杂"）。然后对所有"简单"核进行插值，作为核半径（r）和平均Hoechst荧光强度（作为核DNA密度的代理）（iii） 的功能。然后，在编译样本摘要 （v） 之前，使用 NPC 作为内部 2N 校准器 （iv） 对数据进行分层。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：慢性DDC喂养期间小鼠肝脏的高含量图像分析和细胞学分析。（A） HNF4+/Hoechst免疫荧光染色的代表性共聚焦图像，在喂食21天后，膳食含有0.1%DDC;图像显示圆形 HNF4+ 肝细胞核 （"H"） 和 HNF4+ - NPC 在门户静脉周围区域（"PV"）的扩展。（B） 最佳（"正确"）和次优（"不正确"）核 Hoechst 染色的例子，表明固定不良。（C） 使用高通量图像分析平台，根据核霍赫斯特染色和HNF4+免疫标签来分离肝细胞和NPC。软件掩码（红色/绿色线）显示核如何根据Hoechst荧光正确分割，并根据HNF4+状态分类成肝细胞（+）或NPC（-）。（D） 优化分段/阈值分析设置的指南。软件识别的叠加核掩码由用于核分割的绿色/蓝色线和绿色/蓝色 （HNF4+） 或红色/蓝色 （HNF4+-） 表示，用于阈值分析（H = 肝细胞）。故障排除：核检测灵敏度设置过低（i）或过高（ii）。HNF4+ 的阈值设置过低 （iii），或过高 （iv）。（E， F）DDC喂食期间NPC和肝细胞核的定量分析：（E）HNF4+-和E（F）HNF4+核密度与DDC处理时间（天）进行比较。F共分析了5.7 x 105个细胞，每个时间点有4~6个动物。数据以平均值和 SEM 显示，P < 0.01 和 #P < 0.001。单向ANOVA用于比较手段。使用费舍尔最小分差 （LSD） 测试计算显著性 P 值。（G） 在DDC处理期间HNF4+核区域的频率分布。数据显示，肝细胞核区在损伤期间与细胞肥大和多倍化一致，发生了右移。共分析了2.5 x 105 HNF4+核，每个时间点有4~6只动物。这一数字已由曼扎诺-努涅斯等人修改。17请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：使用定制书面软件自动分析肝细胞核球。（A） 显示正确格式化电子表格数据的屏幕截图，以便输入到核策略分析软件中。包含基本数据的列（协议的步骤 5.5）以黄色突出显示。所有列标题应与指示的标题精确匹配。（B） 屏幕截图，显示包含生物复制数据的各个电子表格文件（"Sample1"、"Sample2"等）应针对每种条件在子文件夹中命名和组织（本例中名为"Control-d0"和"受伤-d14"）。（C） 成功安装 ploidy 应用程序（红色圆圈）后截图。启动应用程序时（通过单击工具的 MY APPS 选项卡中的"Ploidy_Appl."）时，将显示"Ploidy_GUI"（下面板）。在单击"运行"之前，将输入实验名称（"示例"）和控件路径（例如"控制 d0"）和测试（例如"已伤害-d14"）数据集。然后，该软件使用"Control-d0"数据集计算、校准和分层所有样本的核策略，以生成最低DNA含量的阈值。（D） Ploidy_Application 的数据输出显示单个数据文件自动保存在每个样本文件夹中 （i）， 每个样本组中包含"简单"核的绝对和百分比数。对于每个条件（在本例中为"Control-d0"和"伤害-d14"），还自动生成一个摘要文件夹，其中包含所有"简单"肝细胞和非肝细胞核（ii）的平均核策略估计值，以及每个样本（iii）如何分层核蛋白的细目。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：使用NPC作为内部策略校准器。（A） 显示DDC损伤对肝细胞（HNF4+）和NPC（HNF4+-）核平均最低DNA含量（m）的影响的图形。所有数据都归为第 0 天 NPC（n = 每个时间点 4 个动物）。（B） 直方图描述NPCm值在单个代表性肝脏样本中的分布（第0天，共7，180核）。原理图（上图）显示了圆形 NPC 蒙版如何从具有 2⁄4c DNA 成分的细胞派生。校准方法的目的是在 NPCm分布（虚线）的上限处定义表示 4c （S4c）的分层阈值，同时最小化由于分布曲线极点的分割误差而造成的噪声。（C） 绘制了 NPC （HNF4+-） 核的平均霍赫斯特强度和核面积变化。为了避免分段误差，仅对模式 NPCm值 1 SD 以内的m相应 NPC m 值的核进行仔细检查（黄色框）。在此范围内，计算 2c_4c 过渡大小 （t） 并将其用作数据中的锚点，以估计 S4c。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：在慢性DDC喂养期间，小鼠肝脏核球的通位位分析。（A） 使用所述方法对控制成人肝脏进行分析。HNF4++肝细胞核从2D肝段被细分根据Hoechst核循环分为两组："简单"和"复杂"。（上）显示了属于这两组细胞的代表性荧光霍赫斯特图像。（左）根据插值的倍数值、核区域和平均核霍赫斯特强度，从一个样本（第 0 天）显示简单HNF4+核分层的散点图。（右）饼图详细说明了控制肝中HNF4+细胞的典型分解（第0天），指示每个核高倍子类的比例。共分析了4只动物的6.7 x 104 HNF4+核。（B） DDC肝损伤对肝细胞核球的影响通过高通量位分析。图表显示，在DDC喂养的前14天内，2c和4c肝细胞核的比例相对下降，而>8c多倍体核的数量显著增加。共分析了1.5 x 105 HNF4+核（n = 每个时间点4只动物）。数据以平均值和 SEM 显示，P < 0.01 和 #P < 0.001。单向ANOVA用于比较手段。使用图基的多重比较测试计算了显著性 P 值。（C） 示例，通过查询高含量成像数据（用于计算分层（循环、核大小和均值 Hoechst 强度）来查询高含量成像数据，以显示如何使用此方法在 parenchyma 内进行空间跟踪。在慢性DDC喂养期间（第14天和第21天），在两个时间点用软件掩码（红点）在肝脏中标记2c核，显示Hoechst荧光图像。指示 NP 展开的门户脉脉（蓝色虚线）和旁行区域（黄线）。请点击此处查看此图形的较大版本。
图6：NPC校准方法的批判性评估。（A， B）增殖的 NPC 以 >2c ploidy 分数成功分类。（A） NPC最小DNA含量的直方图，从对照肝免疫标记与抗体到HNF4+和增殖标记Ki-67（n = 4，数据呈现为均值 + SEM）。指示 2c （S2c） 和 4c （S4c） 的分层阈值。（B） 根据所述方法对 NPC 进行分层，导致在核中显著丰富 Ki-67 免疫标签，并分配了 >2c ploidy 分数 （n = 12）。数据以均值表示 = SEM。 未配对 t 测试用于比较平均值 =P < 0.0001。（C） NPC 校准方法的外部验证。使用N校准器内部方法获得的平均肝细胞核球的估计值与通过校准相同的样品（控制C57BL/6小鼠肝脏3⁄4个月，n = 4）获得的平均肝细胞核球，与已知核体积为2N肝细胞14。数据也来自两个独立的分析21，22,22描述肝细胞核从同一菌株的小鼠在2-6个月（显示在虚线右侧）。请点击此处查看此图形的较大版本。
图7：肝细胞核细胞与细胞性细胞有"复杂"关系。（A） 通过核莫里测量的二维分析，对肝细胞细胞ploidy（2N、4N、8N和16N）如何部分分离的摘要。双核细胞（红色）被细分为"简单"（"S"）和"复杂"（"C"）morphome，这取决于核是否出现接触。（B， C）手动选择并分析单个肝细胞，用于核间测量和核间间距。（B） 具有"接触"核的双核肝细胞是"复杂"的（100%±0.8），而单核细胞（黑色）和非接触核掩码的双核肝细胞是"简单"的（94%>0.8）。（C） 由于核间间距显著缩短（n = 3，共分析94个核），双核肝细胞的"简单"核可与单核细胞核核分离。（D） 模型近似于面板 A 中的细胞系统态如何以 2D 核测量和核区域分布，从而将简单的圆形成四个阶段（I+IV）进行聚类。（E） 比较HNF4+核间舍测量/大小地块在对照肝（第0天）和后14天（左）和21天（右）DDC损伤。上面（I+V）上所示的填充阶段。箭头表示与2c（"a"）、4c（"b"）和8c（"c"）核的两核化相一致的损伤造成的核测量的变化，以及16N细胞单核（d）的增强单核化。共分析每个条件（n = 2）的 29×30 x 103核。请点击此处查看此图形的较大版本。
补充文件：演示数据集。请点击此处查看这些文件。
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Discussion
介绍了一种高含量、高通量的方法，用于分析毛毛肝中肝细胞核细胞核球的组织重塑和估计。熟悉该过程后，用户可以在 3-5 天内处理、成像和分析多个样本，生成大型可测试数据集，从而提供肝脏健康的详细签名。鉴于样品制备方法的简单性，以及分析的大量细胞和组织区域（平均14 mm2/样本），结果非常可靠，具有很高的可重复性。图像捕获和分析的自动化还可以消除这些重要步骤中的用户错误和潜在偏差。一项重要的创新是利用NPC作为内部双体校准器，能够相对评估样品内和之间的肝细胞核DNA含量。因此，与先前发布的2D方法33、12、2212,22相比，HNF4+标签步骤的加入是为该协议提供独特技术优势的关键。相比之下，与 3D 重建工作流18相比，该方法相对简单，在技术上不那么费力，而且可能更灵活。
与流细胞测定的精密方法相比，从2D组织部分推断核DNA含量的一个重要警告是，个体核在蛋白质dy状态方面的分类可归因于个体核的分类的有限可信度。此外，基于 SIA 的方法内部固有的偏差，即由于亚赤道采样而过度表示较小的单反子组。但是，通过将数据规范化为内部标准并采用基于大量总体的方法，这些影响造成的误差得到缓解，并且跨样本进行可比性。肝细胞的特点是高度圆润的核形态，与NPC相比，这意味着它们特别适合根据核横截面面积10、11、14、15、23精确估计DNA含量。10,11,14,15,23基于SIA的方法在该协议中进行了改进，通过整合上午测量和均值Hoechst荧光强度的测量来解释核循环性和DNA密度，从而对单个核产生估计的"最小DNA含量"描述符。重要的是，使用NPC作为2-4N ploidy控制提供了客观校准和最小核DNA含量分层的重要内部标准，使所述方法适用于任何物种的样品或格式，因为可以采购HNF4®（或类似肝细胞核标记）的适当抗体。
虽然核策略的评估已被证明为肝病进展10，13,13提供有用的签名，为了充分确定肝脏内脂肪变化的多样性，这将是可取和必要的调整所述方法，以解释肝细胞周长，从而细胞普洛迪。以前，通过标记肝细胞周长，如β catenin10、13、24、actin13,241012、22,22和细胞角蛋白10、11,11在人类和小鼠肝脏样本中标记肝细胞周长来实现。然而，当DDC损伤后测试，戏剧性的上皮重塑排除了通过phalloidin（未显示的数据）或β卡丁宁17抗体对肝细胞周界进行可靠的评估。因此，虽然这种方法是可行的，但它可能并不适用于所有伤害模型，但如果实现，将推进细胞细胞的映射，并使肝细胞大小和数量的估计更加准确。通过计算其他核参数，如核间隔（图7C），单核细胞可以区别于"简单"的双核肝细胞，并且可以通过径向测量其二维掩码所含的核实现对"复杂"双核细胞的进一步分离。
鉴于 FFPE 组织25中存在经过验证的人类 HNF4® 抗体，并且内部校准免除了任何物种特定限制的方法，该协议几乎立即适用于人类样本。因此，它具有相当大的潜力，为高通量分析人类疾病中的肝细胞核球和肝损伤提供高通量分析。此外，通过与其他抗体的多路复用，这种方法可以揭示特定肝细胞子集的新作用及其对肝损伤和疾病的反应。为此，我们成功地将该方法与增殖核标记基-67的免疫染色（图6）相结合，从而能够收集有用的信息，包括识别NPC的2N量非增殖，以改善对ploidy的内部校准（Noon，未发布的数据，2019年）。因此，通过将灵活性与该方法提供的位置和定量数据耦合，我们建议其未来的应用将增进对多倍在肝脏中的作用的理解。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由西班牙MINECO政府赠款BFU2014-58686-P（LAN）和SAF-2017-84708-R（DJB）资助。LAN得到全国MINECO Ramón和Cajal奖学金RYC-2012-11700和计划GenT奖（瓦伦西亚大学，CDEI-05/20-C）和FMN的支持，由瓦伦西亚将军ACIF/2016/020的区域ValI+D学生。RP要感谢EwaK.Paluch教授的资助。我们感谢艾丽西亚·马丁内斯-罗梅罗博士（CIPF细胞测量服务）对IN细胞分析仪平台的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
References
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