Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Een High-Throughput In Situ Methode voor schatting van Hepatocyte Nucleaire Ploidy in muizen

Published: April 19, 2020 doi: 10.3791/60095
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1,3
1Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)

Summary

We presenteren een robuuste, kosteneffectieve en flexibele methode voor het meten van veranderingen in hepatocyte nummer en nucleaire ploidy binnen vaste / cryopreserved weefsel monsters die geen flow cytometrie vereist. Onze aanpak biedt een krachtige monster-brede handtekening van de lever cytologie ideaal voor het bijhouden van de progressie van leverletsel en ziekte.

Abstract

Wanneer de lever gewond is, hepatocyte nummers afnemen, terwijl de cel grootte, nucleaire grootte en ploidy toenemen. De uitbreiding van niet-parenchymale cellen zoals cholangiocyten, myofibroblasten, voorlopers en ontstekingscellen duidt ook op chronische leverschade, weefselremodellering en ziekteprogressie. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige high-throughput benadering voor het berekenen van veranderingen in de cellulaire samenstelling van de lever die worden geassocieerd met letsel, chronische ziekte en kanker. We laten zien hoe informatie uit tweedimensionale (2D) weefselsecties kan worden gebruikt om hepatocyte nucleaire ploidy in een monster te kwantificeren en te kalibreren en de gebruiker in staat te stellen specifieke ploidy-subsets in de lever in situ te lokaliseren. Onze methode vereist toegang tot vast/bevroren levermateriaal, basisimmunocytochemiereagentia en elk standaard high-content imaging platform. Het dient als een krachtig alternatief voor standaard stroomcytometrie technieken, die verstoring van vers verzameld weefsel, verlies van ruimtelijke informatie en potentiële disaggregatie bias vereisen.

Introduction

Hepatocyten in de zoogdierlever kunnen vastgelopen cytokinese ondergaan om binucleaire cellen te produceren, en DNA-endoreplicatie om polyploïde kernen te produceren die maximaal 16N DNA-inhoud bevatten. Totale cellulaire en nucleaire ploidy toename tijdens postnatale ontwikkeling, veroudering en in reactie op diverse cellulaire spanningen1. Het proces van polyploidisatie is dynamisch en omkeerbaar2, hoewel de precieze biologische functie onduidelijk blijft3. Verhoogde ploidy wordt geassocieerd met verminderde proliferative capaciteit4,genetische diversiteit2,aanpassing aan chronische schade5 en bescherming tegen kanker6. Hepatocyte ploidy veranderingen optreden als gevolg van veranderde circadiane ritme7, en spenen8. Het meest in het bijzonder wordt het ploidy-profiel van de lever gewijzigd door letsel en ziekte9, en overtuigend bewijs suggereert dat specifieke ploidieveranderingen, zoals verhoogde ≥8N-kernen of verlies van 2N hepatocyten, nuttige handtekeningen bieden voor het bijhouden van niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) progressie3,10, of het differentiële effect van virale infecties11.

In het algemeen worden leverletsel en regeneratie geassocieerd met verhoogde hepatocytecelgrootte en nucleair gebied12, samen met een verminderd totaal aantal hepatocyten, met name die met 2N DNA-gehalte10,11. Parenchymale letsel in de lever gaat ook vaak gepaard met uitbreiding van niet-parenchymale cellen (NPC's), waaronder stromal myofibroblasten, ontstekingscellen en bipotente leververerstoffen. Methoden met een hoge doorvoer die een kwantitatief cytologisch profiel van parenchymale celnummer en nucleaire ploidie bieden, terwijl ze ook rekening houden met veranderingen in NPC's, hebben daarom een aanzienlijk potentieel als onderzoek en klinische instrumenten om de respons van de lever tijdens letsel en ziekte te volgen. Overtuigende recente in situ analyse van ploidy spectra in menselijke monsters van hepatocellulair carcinoma tonen ook aan dat nucleaire ploidie is dramatisch verhoogd binnen tumoren en is specifiek versterkt in meer agressieve tumor subtypes met verminderde differentiatie en verlies van TP5313. Daarom is er een grote kans dat methodologische vooruitgang in de kwantitatieve beoordeling van nucleaire ploidy zal helpen bij de toekomst prognostische profilering van leverkanker.

In dit protocol wordt een flexibele high-throughput methodologie beschreven voor de vergelijkende analyse van muisleverweefselsecties, die gedetailleerde cytometrische profilering van hepatocytengetallen, de NPC-respons en een intern gekalibreerde methode voor het schatten van nucleaire ploidie (figuur 1) biedt. Hepatocyten onderscheiden zich van NPC's door hepatocyte nucleaire factor 4 alpha (HNF4α) immunolabelling, voorafgaand aan de karakterisering van nucleaire grootte en nucleaire morfometrie. "Minimaal DNA-gehalte" wordt geschat voor alle circulaire nucleaire maskers door de integratie van gemiddelde Hoechst 33342 intensiteit (een proxy voor DNA-dichtheid) met geïnterpoleerd driedimensionaal (3D) nucleair volume. Hepatocyte minimale DNA-inhoud wordt vervolgens gekalibreerd met behulp van NPC's om een nucleaire ploidy profiel te genereren.

Beeldverwerving, nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden uitgevoerd met behulp van high-content imaging, waardoor grote gebieden van tweedimensionale (2D) leversecties met tienduizenden cellen kunnen worden gescreend. Een op maat geschreven programma is voorzien voor geautomatiseerde nabewerking van high-content beeldanalyse gegevens om een steekproef-breed ploidy profiel voor alle cirkelvormige hepatocyte kernen te produceren. Dit wordt uitgevoerd met behulp van gratis om software te downloaden om nucleaire ploidy te berekenen op basis van stereologische beeldanalyse (SIA)10,11,14,15. De SIA-methodologie is eerder gevalideerd door flow cytometrie als een nauwkeurige, zij het moeizame, methode voor het schatten van hepatocyte nucleaire ploidy in de lever14, uitgaande van circulaire nucleaire morfologie en een monotoon relatie tussen nucleaire grootte en DNA-inhoud. In dit protocol worden beide nucleaire parameters gemeten door beoordeling van nucleaire morfometrie en Hoechst 33342-etikettering. De berekening van het "minimale DNA-gehalte" voor elk kernmasker wordt gevolgd door kalibratie van hepatocyte nucleaire ploidy met NPC's, die een bekend 2-4N DNA-gehalte hebben en daarom dienen als een nuttige interne controle.

In vergelijking met conventionele stroomcytometrie methoden16 de beschreven aanpak maakt hepatocyte nucleaire ploidy te worden beoordeeld in situ en vereist geen toegang tot vers weefsel of disaggregatie methoden die kunnen bias resultaten en moeilijk te standaardiseren. Zoals met alle sia-gebaseerde benaderingen, nucleaire ploidy subklassen >2N zijn ondervertegenwoordigd door 2D-bemonstering als gevolg van de doorsnede van grotere kernen buiten het equatoriale vlak. Het weefselbrede ploidy-profiel beschrijft ook het minimale DNA-gehalte voor alle cirkelvormige hepatocytenucleaire maskers, en maakt geen direct onderscheid tussen mononucleaire hepatocyten en binucleaire cellen die twee discrete ("niet-aanrakende" kernen van dezelfde ploidie hebben. De eenvoud van dit protocol biedt echter aanzienlijke mogelijkheden om het aan te passen aan aanvullende parameters, zoals internucleaire afstand of celperimeteranalyse, die de identificatie van binucleaire cellen zouden vergemakkelijken, waardoor een meer gedetailleerde beoordeling van cellulaire ploidie mogelijk is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierproeven werden eerder goedgekeurd door de ethische commissie van cipf. Muizen werden gehuisvest in een ziektevrije faciliteit in het Centro de Investigación Príncipe Felipe (Valencia, Spanje), geregistreerd als proefdierfokker, gebruiker en bevoorradingscentrum (reg. nr. ES 46 250 0001 002) in het kader van de geldende Europese en Spaanse dierenwelzijnsvoorschriften (RD 53/2013).

1. Weefseloogst en monsterbereiding

OPMERKING: Dit protocol beschrijft hoe weefsel te bevriezen zonder voorafgaande fixatie of cryopreservatie. Voor eerder vaste /cryopreserved monsters gaan naar sectie 2 en weglaten stap 3.1. Alle analyses zijn uitgevoerd met volwassen vrouwelijke C57BL/6 muizen in de leeftijd van 12−16 weken.

  1. Dieren opofferen door fentanyl/pentobarbitalintraperitoneale injectie gevolgd door cervicale dislocatie. Met de muis naar ventrale kant omhoog, open de buikholte en bloot de lever door het grijpen van de huid met een pincet en het uitvoeren van een verticale incisie van de basis van de onderbuik aan de basis van het borstbeen met behulp van chirurgische schaar.
  2. Verwijder voorzichtig de galblaas met fijne pincet, ontleed de lever en spoel de geselecteerde leverlobukan in een petrischaalplaat van 10 cm gevuld met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om dezelfde leverkwab voor elk dier te vergelijken, in dit geval werd de mediane kwab gebruikt.
  3. Vul een gelabeld cryomold met optimale snijtemperatuur (OCT) medium bij kamertemperatuur (RT). Vermijd OCT-bubbels. Als ze verschijnen, duw ze naar de rand van de mal met behulp van een naald of pipet tip.
  4. Insluiten lever lobule in een gevulde OCT cryomold en onmiddellijk plaats het op droogijs om snel bevriezen te garanderen. Bewaar cryomolds bij -80 °C tot cryosectieing.

2. Cryosectioning

  1. Transport cryomolds op droog ijs om weefselafbraak te voorkomen. Voorafgaand aan cryosectieequilibrate binnen cryostat ingesteld op -20 °C gedurende 20 min.
  2. Uitwerpen monster door het toepassen van druk op de basis van de plastic cryomold. Breng vloeibare OCT op warme monsterschijf op RT, positie in cryostat en bevestig een OCT embedded levermonster. Breng zachte druk en wacht 3 min voor OCT te bevriezen zodat het monster blijft plakken op de schijf.
    OPMERKING: Vermijd het verwerken van het monster met de vinger zoveel mogelijk om weefselafbraak te vermijden.
  3. Vergrendel het monster in de arm van de cryostat en pas de oriëntatie aan zodat de rand van het monster parallel loopt met het cryostat-blad. Snijd in het monster tot het weefsel is bereikt.
  4. Doorsnede van het monster met een dikte van 6 μm. Plaats een geëtiketteerde polyamide-gecoate schuif over het monster gedurende 5 s om het monster op de glijbaan te laten plakken. Plaats de dia op RT voor 3−5 min, ga dan, voor de beste resultaten, direct naar sectie 3.
    OPMERKING: Voor de verwerking van meerdere diepgevroren monsters zijn reproduceerbare resultaten verkregen door dia's tijdelijk in een schuifkast op droogijs op te slaan totdat alle monsters zijn verwerkt. Bij het gebruik van deze aanpak kunnen alle dia's met RT worden gelijkgemaakt voordat ze overgaan tot sectie 3. Formaline vaste paraffine embedded (FFPE) monsters kunnen worden gebruikt, hoewel achtergrond autofluorescentie wordt verhoogd door deze methode. Om verder te gaan met FFPE monsters, sectie op 4 μm. Mount door het vangen van secties van 40 °C waterbad op polyamide-behandelde glijbanen. Warmtedia's gedurende 1 uur bij 60 °C en vervolgens deparaffinize door seriële RT-wasbeurten (5 min) in Coplin-potten die xyleen (x2), ethanol 100% (x2), 96% (x2), 70% (x1) en dH2O (x1) bevatten. Om antigenen bloot te leggen plaats dia's in de ktorebuffer gedurende 20 min bij 90 °C voordat ze dia's in PBS bij RT temperen. Ga naar stap 3.2.

3. Fluorescentie immunolabelling

  1. Fix weefsel secties in een rookkap door het toepassen van 1 mL van 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 10 min bij RT. Breng dia's naar een PBS gevulde Coplin pot en was gedurende 3 min met behulp van zachte agitatie (herhaal 3x).
    OPMERKING: Van nu tot het einde van het immunokleuringsproces moet u het monster niet meer drogen.
  2. Droog het gebied rond elk weefsel gedeelte en surround met behulp van een hydrofobe pen. Permeabilize met 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof (d.w.z. Triton X-100) in PBS gedurende 15 min bij RT. Dan wassen in PBS gevuld Coplin pot voor 3 minuten met behulp van zachte agitatie (herhaal 2x).
  3. Blokkeer met een gefilterde oplossing van 1% runderserumalbumine (BSA), 5% paardenserum, 0,2% niet-ionische oppervlakteactieve stof in PBS (voor ten minste 1 uur bij RT).
  4. Incubeer met primair HNF4α-antilichaam verdund in blokkerende buffer 's nachts bij 4 °C in een donkere vochtige kleurkamer (zie Materiaaltafel voor antilichamen en specifieke verdunningen).
  5. Plaats dia's in een PBS gevulde Coplin pot en was gedurende 3 min met behulp van zachte agitatie (herhaal 4x).
  6. Incubeer met Alexa-488 geconjugeerde secundaire antilichaam en Hoechst verdund in gefilterd e.a. BSA en 0,2% niet-ionische oppervlakteactieve stof in PBS gedurende 2 uur bij RT in een donkere vochtige kleurkamer (zie Tabel van materialen voor antilichamen en specifieke verdunningen).
  7. Plaats dia's in een PBS gevulde Coplin pot en was gedurende 3 min met behulp van zachte agitatie (herhaal 4x). Was in ddH2O gedurende 3 minuten met zachte agitatie (herhaal 2x).
  8. Monteer dia's door twee druppels fluorescerende montagemedia op een coverslip (24 x 60 mm) te plaatsen en er dia's overheen te leggen, waardoor bellen worden geëlimineerd door zachte druk uit te oefenen. Voor langdurige opslag, seal coverslip aan de randen met duidelijke nagellak en bewaar in het donker op 4 °C.
  9. Controleer voordat u verdergaat dia's met behulp van een conventionele fluorescentiemicroscoop om een goede fixatie en immunolabeling te garanderen.
    LET OP: Zie figuur 2A,B voor de verwachte resultaten.

4. Overname van fluorescentiebeeld

OPMERKING: Voor deze stap is een high-content imaging platform(Table of Materials)vereist dat automatische fluorescentiebeeldacquisitie ondersteunt.

  1. Schakel het beeldsysteem in en open een nieuw acquisitieprotocol.
  2. Selecteer de doelstelling van 10x, let op het gebied van het gezichtsveld (in dit geval 0,6 mm2).
  3. Stel parameters in om fluorescentiebeelden te verkrijgen met behulp van de juiste excitatie- en emissiefilters (volgens stap 3.6). Selecteer voor Hoechst en Alexa-488 "DAPI" en "GFP" kanalen met respectievelijk 390/18 en 438/24 nm excitatie en 432,5/48 en 475/24 nm emissie.
  4. Richt het monster en zorg ervoor dat de signaalintensiteit niet verzadigt. Zorg ervoor dat het vastleggen van afbeeldingen wordt gedaan met dezelfde belichtingstijd voor alle beelden of gebruik een systeem waarbij de intensiteit van fluorescentie wordt gecorrigeerd voor de belichtingstijd.
  5. Scan het monster en verkrijg voldoende beelden om een volledige dekking van de weefselsectie te verkrijgen (ongeveer 20-50 gezichtsvelden, afhankelijk van de steekproefgrootte).
  6. Bekijk de beelddatabase, elimineer (i) slecht gerichte velden, (ii) velden aan de grenzen van elke weefselsectie (om vooroordelen te voorkomen), en (iii) velden die gevouwen/fysiek beschadigde gebieden van de weefselsectie bevatten indien aanwezig.

5. Geautomatiseerde fluorescentiebeeldanalyse

OPMERKING: Voor deze stap is passende beeldanalysesoftware (Table of Materials) vereist dat: (1) automatisch worden geïdentificeerd met hoechst-gelabelde kernen in beelden op 405 nm (nucleaire segmentatie), (2) het beoordelen van gemiddelde hoechst-kernintensiteit en morfometrie, en (3) drempelanalyse om de +/- status van nucleaire fluorescentie te bepalen bij 488 nm (HNF4α). Er is een basisopleiding/expertise van de operator nodig om segmentatie- en drempelparameters binnen het programma visueel te beoordelen en aan te passen om ervoor te zorgen dat kernen en HNF4α+/- status optimaal worden omheind (figuur 2).

  1. Open in de beeldanalysesoftware het acquisitiebestand met Hoechst -beelden (405 nm) en HNF4α (488 nm) beelden uit stap 4.5 en maak een nieuw analyseprotocol.
  2. Definieer golflengten die moeten worden gebruikt voor nucleaire segmentatie (Hoechst, 405 nm) en voor hepatocyte/NPC-drempelanalyse (HNF4α, 488 nm).
  3. Pas de nucleaire segmentatieparameters van de software (zoals "minimumnucleair gebied" en nucleaire detectie "gevoeligheid") aan om ervoor te zorgen dat kernen optimaal gescheiden zijn.
    OPMERKING: Een goede segmentatie van hepatocyten moet worden geprioriteerd boven die van NPC's. Hepatocytenkernen zijn karakteristiek afgerond (interquaforiel groottebereik: 40−64 μm2). NPC-kernen, zoals die van sinusoïdale endothelia, zijn afgevlakt/elliptisch of onregelmatig van vorm en over het algemeen kleiner en dichter verpakt dan die van hepatocyten (interquarielgroottebereik: 30−43 μm2). Voor muislever werden een minimaal kerngebied ≥23 μm2 en detectie "gevoeligheid" van 65% gebruikt (zie figuur 2C,D voor verwachte resultaten). Gevoeligheid bepaalt hoe pixelclusters worden herkend als afzonderlijke kernen op basis van hun intensiteit en moet empirisch worden getest voor elk monster dat door de gebruiker is ingesteld voordat de geautomatiseerde beeldanalyse wordt uitgevoerd.
  4. Wijzig de drempelintensiteit bij 488 nm om een optimale gating van hepatocyten (HNF4α+) en niet-parenchymale cellen (HNF4α-).
    LET OP: Zie figuur 2C, D voor de verwachte resultaten. De waarde van de drempelintensiteit is relatief en is afhankelijk van kleuringsefficiëntie en acquisitie-instellingen zoals laserintensiteit. Het moet daarom worden gestandaardiseerd door de gebruiker. Gebruik bekende HNF4α-cellen zoals endotheelcellen en periportal NPC's als interne negatieve controle en binucleaire hepatocytenkernen als een positieve referentie voor kleuring. Test de analyseparameters met behulp van een klein aantal afbeeldingen om een goede nucleaire segmentatie en intensiteitsdrempelsegregatie te garanderen voordat analyseparameters worden toegepast op de gehele gegevensset.
  5. Selecteer de volgende te kwantificeren nucleaire parameters: (1) kerngebied op basis van Hoechst-kleuring (μm2), (2) gemiddelde nucleaire Hoechst-intensiteit (RU), (3) nucleaire verlengingsfactor (gemiddelde verhouding van de korte as van de kern tot de lange as van de kern; wanneer een centrumsymmetrisch [niet-langwerpig] object een waarde heeft van 1, (4) Nuc 1/(formfactor), gemiddelde nucleaire "rondheidsindex" berekend door omtrek 2/(4π x gebied). Waarden variëren van 1 tot oneindig, waarbij 1 een perfecte cirkel is, (5) HNF4α-status (positief-1 of negatief-0) en (6) nucleaire x/y-coördinaten op basis van "zwaartepunt" (cg), een methode voor het lokaliseren van het midden van het object van grijswaardenafbeeldingen met subpixelprecisie.
  6. Voer de analyse uit voor alle voorbeeldgegevenssets en exporteer numerieke gegevens van stap 5.5 naar spreadsheetsoftware.

6. Gegevensanalyse

OPMERKING: De stap voor gegevensanalyse kan worden uitgevoerd met behulp van standaard spreadsheetsoftware.

  1. Bereken hepatocyte en niet-hepatocyte celnummers.
    1. Bereken het totale gebied van de leversectie dat voor elk monster wordt geanalyseerd door het aantal gezichtsvelden te vermenigvuldigen met het gebied van het gezichtsveld (stap 4.2).
    2. Als u werkt met spreadsheetbestanden die voor elke leversectie worden gegenereerd, filtert u de gegevens door alleen HNF4α+ kernen te selecteren. Bereken het totale aantal geanalyseerde HNF4α+-kernen en deel dit door het totale geanalyseerde gebied om de gemiddelde hepatocytedichtheid voor elk monster te verkrijgen (figuur 2F).
    3. Voer dezelfde berekening uit voor niet-haakjescellen door de spreadsheet te filteren op HNF4α-cellen (figuur 2E).
  2. Bereken de verdeling van de nucleaire grootte van hepatocyte.
    1. Filter met spreadsheetsoftware gegevens om alleen HNF4α+ kernen te selecteren.
    2. Plotwaarden van kerngebied in een histogram (figuur 2G). Stel de opslaglocatiebreedte in op 5 μm2.
      OPMERKING: Frequentiewaarden kunnen worden gecorrigeerd voor gebied (kernen/mm2)per stap 6.1.1.
  3. Voer hepatocyte nucleaire ploidy analyse uit.
    OPMERKING: De spreadsheetgegevens van stap 5.6 worden gebruikt om voor elk monster een nucleair ploidy-profiel te genereren. Dit proces is geautomatiseerd en kan worden uitgevoerd met behulp van een aangepaste geschreven software die vrij beschikbaar is om te downloaden met ondersteunende informatie en demonstratiedatasets ophttps://github.com/lukeynoon(zieAanvullende bestanden). Er wordt broncode verstrekt voor gebruikers die de methodologie willen aanpassen. Een beschrijving van het algoritme, samen met instructies voor installatie en gebruik worden hieronder beschreven. Het programma gebruikt spreadsheetgegevens om hepatocytenkernen automatisch te scheiden in twee groepen; (1) die met "eenvoudige" cirkelvormige kernen en (2) "complexe" niet-cirkelvormige kernen die representatief zijn voor binucleaire cellen met "2c ploidy". Het minimale nucleaire DNA-gehalte (een functie van kerngebied en DNA-dichtheid) wordt vervolgens berekend voor alle "eenvoudige" kernen. Een volgende stap kalibreert vervolgens automatisch HNF4α+ hepatocyte nucleaire ploidy met behulp van HNF4α- kernen als een bekende 2−4N interne controle.
    1. Software downloaden en installeren.
      1. Download de verpakte applicatie van: https://github.com/lukeynoon
      2. Lanceer MATLAB. Navigeer naar het tabblad APP van de toolstrip, klik op App installeren en open de gedownloade toepassing met de naam"Ploidy_Application.mlappinstall". Er verschijnt een bericht om de geslaagde installatie te bevestigen.
        OPMERKING: De applicatie is nu klaar voor gebruik en blijft op het tabblad APP van de toolstrip.
    2. Invoergegevens opmaken.
      OPMERKING: Voorafgaand aan geautomatiseerde nucleaire ploidy-analyse moeten alle spreadsheetbestanden met high-content imaging-gegevens (stap 5.6) worden opgeslagen en opgemaakt volgens de volgende instructies.
      1. In elk geëxporteerd gegevensbestand (. XLS 97-2004 werkmap) van stap 5.6, bevat een blad met de naam "Celmaatregelen" met alle gegevens die nodig zijn voor de ploidie analyse uiteengezet in kolommen (Figuur 3A). Zorg ervoor dat de spreadsheet-indeling met namen van kolomkoppen ongewijzigd blijft ten opzichte van die van figuur 3A,omdat de analysemethode de juiste kolomgegevens vindt door naar deze namen te zoeken (zie demonstratiegegevenssets in aanvullende bestanden ter referentie). Als bijvoorbeeld high-content image analysis software geen "Light flux" kolom(figuur 3A)produceert, voegt u handmatig een kolom "Lichtflux" in op dezelfde locatie, d.w.z. kolom K en vul deze met nullen.
      2. Voor elke experimentele toestand (bijvoorbeeld "Gewonde-d14"), een controlegegevensset, die zal worden gebruikt om de interne controle voor 2−4N nucleaire ploidie kalibratie (stap 6.3.4.3) te berekenen. Selecteer hier levermonsters van onbehandelde volwassen nestmates ("Control-d0"; Figuur 3B−D).
      3. Voor biologische replica's (per voorwaarde) slaat u elke spreadsheet op in een eigen map (zoals in figuur 3B). Geef de voorvoegsels van de map stapsgewijs een naam, bijvoorbeeld "Voorbeeld1, Voorbeeld2, Voorbeeld3... SampleN", volgens de bestandsnamen in. Daarom moet elke map met gegevenssets (bijvoorbeeld "Control-d0") een reeks submappen bevatten ("Sample1", "Sample2", enz.) die elk een spreadsheetbestand met dezelfde overeenkomstige naam bevatten.
    3. Voer de toepassing uit.
      1. Start binnen MATLAB de "Ploidy_Application" door op het pictogram te klikken op het tabblad MIJN APPS van de toolstrip(figuur 3C). De Ploidy_Application grafische gebruikersinterface (GUI) wordt weergegeven (figuur 3C).
      2. Klik op de knop Pad om gegevens te beheren om naar de map te navigeren waarin de controlegegevens zich bevinden (bijvoorbeeld 'Control-d0'). Dit gegevenspad wordt dan weergegeven in de interface (bijvoorbeeld /Users/Desktop/Control-d0).
      3. Typ vervolgens in 'mapvoorvoegsel' de naam die aan de uitvoerbestanden moet worden gegeven (bijvoorbeeld 'Voorbeeld').
        OPMERKING: Dit voorvoegsel kan worden gewijzigd in elke tekst, op voorwaarde dat de mappen en bestandsnamen stapsgewijs met de naam worden genoemd.
      4. Klik op de knop Pad naar andere gegevens en navigeer naar de map waarin de vergelijkende gegevens zich bevinden (bijvoorbeeld 'Gewonde-d14'). Dit gegevenspad wordt dan weergegeven in de interface (bijvoorbeeld /Users/Desktop/Injured-d14).
      5. Klik op Uitvoeren!. Wanneer de analyse is voltooid, wordt op de statusbalk 'Analysis Complete!..' weergegeven.
        OPMERKING: De aanvraag rapporteert voor elk monster de gelaagdheid van "eenvoudige" kernen in ≤2n, 2n−4n, 4n−8n en 8n+ in termen van absolute tellingen en als percentage van het totaal (figuur 3D). Deze bestanden worden automatisch opgeslagen in elke voorbeeldmap als: "Count_2n.txt", "Count_2n_to_4n.txt", "Count_4n_to_8n.txt", "Count_8n_and_higher.txt", "Percentage_2n.txt", "Percentage_2nto4n.txt", "Percentage_4nto8n.txt", "Percentage_8n_and_higher.txt". De Ploidy_Application zal automatisch een lijst opslaan voor elk monster, van alle individuele ploidy schattingen voor "eenvoudige" hepatocyte en niet-hepatocytekernen kernen in "Ploidy_All_Hepatocytes.txt" en "Ploidy_NonHepatocytes.txt". Voor de controlegegevensset slaat de methode ook de minimale DNA-inhoudsdrempels op die zijn berekend voor gelaagdheid van ploidie (zie stap 6.3.4.3.7) in een bestand met de naam "Normalised_Thresholds_Control". Ten slotte produceert de toepassing een map voor zowel het besturingselement als de geselecteerde vergelijkende voorwaardegegevens met de naam "Samenvatting". Deze map bevat twee submappen, "Ploidy" en "Stratificatie" die de gemiddelden van alle monsters bevatten (Figuur 3D).
    4. Beschrijving van de methodologie.
      OPMERKING: In de volgende sectie wordt in detail de methodologie beschreven die wordt gebruikt door de Nuclear Ploidy Analysis-software. Als de gebruiker ervoor kiest de toepassing niet te gebruiken, kunnen deze stappen worden gevolgd met behulp van spreadsheetsoftware om het nucleaire ploidy-profiel handmatig te berekenen.
      1. Scheid kernen in "eenvoudig" of "complex" volgens nucleaire morfometrie.
        1. Bereken een "circulariteitsindex" voor alle kernen, gedefinieerd als de nucleaire "verlengingsfactor" gedeeld door de "Nuc 1/(form factor)", waarbij een waarde van 1,0 een perfecte cirkel aangeeft.
          OPMERKING: "Nucleaire verlenging" en "Nuc 1/(form factor)" zijn twee afzonderlijke maatregelen van de "circulariteit" van een object die complementaire, niet-overlappende morfometrische criteria beoordelen. De eerste meet de lange- en korte assen van een object, terwijl de laatste de lengte van de omtrek van een object vergelijkt met die van het gebied. Om de definitie van nucleaire circulariteit die in dit protocol wordt gebruikt te versterken, zijn deze twee metingen gecombineerd tot één "circulariteitsindex". Een eerdere benadering van de raming van nucleaire ploidy met behulp van de beschreven methode alleen gebruikt nucleaire verlenging17. Hoewel met deze aanpak aanvaardbare resultaten werden verkregen, hebben de auteurs opgemerkt dat een samengestelde "circulariteitsindex" de discriminatie van handmatig geselecteerde kernen van mononucleaire en binucleaire hepatocyten (niet getoonde gegevens) verbetert.
        2. Classificeren kernen met een circulariteitsindex ≤ 0,8 als "complex" en die > 0,8 als "eenvoudig".
      2. Schat "minimaal" DNA-gehalte (m) voor alle "eenvoudige" kernen.
        1. Bereken de kernstraal (r) met behulp van de formule:
        2. Bereken het kernvolume (v) met behulp van het volume van een bolformule:
        3. Genereer een relatieve waarde voor minimale DNA-inhoud (m) met behulp van de formule:
      3. Kalibreer de gegevensset met behulp van de NPC -) kernen als een interne 2−4N-besturingselement.
        OPMERKING: NPC's hebben een 2−4N DNA-gehalte, afhankelijk van de celcyclusstatus. Vandaar dat de gemiddelde waarde van NPC "minimaal" DNA-gehalte (NPCm)toeneemt met letsel(figuur 4A). Kalibratiefout wordt geminimaliseerd door een bovengrens van NPCm vast te stellen die een 4c-drempelwaarde vertegenwoordigt(figuur 4B).
        1. Selecteer in de spreadsheet alleen NPC-kernen met waarden voor "m" die binnen 1 standaarddeviatie (SD) van de modus liggen (dit filtert ruis uit mogelijke segmentatiefout).
        2. Binnen dit gefilterde bereik, onderzoeken nucleaire gebieden en de bijbehorende gemiddelde Hoechst intensiteiten (Figuur 4C).
        3. Schat het kleinste nucleaire gebied binnen dit gefilterde bereik met maximale nucleaire Hoechst-intensiteit (d.w.z. het punt waarop de lijn van de curve van richting verandert in de gefilterde gegevensset, zoals geïllustreerd door de rode cirkel in figuur 4C). Deze waarde vertegenwoordigt een 2N−4N overgangstoestand (t) waarboven de bemonstering van 4c-kernen de overhand heeft op 2c-kernen, wat resulteert in een maxima van gemiddelde Hoechst-intensiteit.
          OPMERKING: Deze waarde wordt automatisch bepaald door de software; Spreadsheetgebruikers kunnen dit punt echter handmatig selecteren als overgangsgrootte.
        4. Bereken de minimale DNA-inhoud die wordt weergegeven door deze overgangsgrootte (tm)door stap 6.3.4.2 te volgen.
        5. Als u de 4N-schouder van de NPCm-gegevensset wilt schatten, voegt u 1 SD toe aan de waarde van tm. Het resulterende getal (figuur 4B) beschrijft de bovengrens van de NPC minimale DNA-inhoud te gebruiken voor nucleaire ploidy stratificatie (S4c).
        6. Herhaal stap 6.3.4.3.1−6.3.4.3.5 voor alle "controle"-monsters.
          OPMERKING: In figuur 3worden bijvoorbeeld ongewonde controlelevers ("Control-d0") gebruikt als controlevoorwaarde.
        7. Bereken een gemiddelde 4c stratificatiedrempel (S4c)voor "controle" monsters en gebruik deze om de 2c (S2c)en 8c (S8c)grenzen te extrapoleren voor minimaal DNA-gehalte (m). Stratificatiedrempels worden automatisch gegenereerd en opgeslagen door de software (stap 6.3.3.3).
          OPMERKING: Afhankelijk van het ontwerp van de studie kunnen de gemiddelde stratificatiedrempelwaarden worden berekend voor elke aandoening of voor specifieke omstandigheden (bijvoorbeeld een gezonde controlelever). Echter, de Nuclear Ploidy Analysis software vereist dat een van een set van 2 bestanden is aangewezen als "controle" voor de berekening van relatieve ploidy waarden.
        8. Bereken een ploidy waarde voor alle kernen met behulp van de S2c waarde gegenereerd in stap 6.3.4.3.7 per:
        9. Stificeren "eenvoudige" hepatocyten (HNF4α+) kernen in 2c/4c/8c/>8c beugels volgens de volgende criteria: "2c" HNF4α+ = p ≤ 2; "4c" HNF4α+ = 2 < p ≤ 4; "8c" HNF4α+ = 4 < p ≤ 8; ">8c" HNF4α+ = 8 < p.
        10. Om de ruimtelijke patronen van ploidy subgroepen te reconstrueren, scheidt u de nucleaire gegevens in elke steekproefspreadsheet op basis van de overeenkomstige velden waarin ze zijn verkregen. Gebruik vervolgens bijbehorende nucleaire x/y-coördinaten (vanaf stap 5.5) tot plotploidy-subgroepen in 2D (figuur 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze methode is gebruikt om het effect van cholestatic letsel op de volwassen muislever te meten door dieren 0−21 dagen te voeren met een hepatototoxisch dieet dat 0,1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC)17bevat. Chronische DDC voeding resulteert in hepatocellulaire letsel toegenomen ploidy en periportal uitbreiding van NPC's. De gebruiker dient zich ervan bewust te zijn dat muisstam en leeftijdsafhankelijke verschillen kunnen bestaan in nucleaire ploidie en dat alle analyses zijn uitgevoerd met volwassen vrouwelijke C57BL/6 muizen in de leeftijd van 12−16 weken.

Na HNF4α immunolabelling (protocol punt 3) is het belangrijk om alle dia's te controleren met behulp van conventionele fluorescentiemicroscopie, om een goede kwaliteitsfixatie en kleuring te garanderen (figuur 2A). Het smeren of vervagen van Hoechst kan duiden op onvoldoende fixatie of afbraak van het monster voorafgaand aan fixatie(figuur 2B),in welk geval terugkeer naar protocol sectie 2 en verkorten de tijd tussen sectie en fixatie (stap 3.1). Succesvolle immunolabelling met het HNF4α-antilichaam kan in dit stadium gemakkelijk worden beoordeeld door duidelijke discriminatie van positief gelabelde hepatocytekernen, doorgaans groter en afgeronder dan die van NPC's (figuur 2A). Afgeplatte/elliptische endotheliale kernen in het parenchyma, of dichte cellen die zich uitbreiden in periportalgebieden na DDC-letsel kunnen dienen als een nuttige visuele referentie voor het identificeren van HNF4α- NPC's bij de beoordeling van het succes/falen van immunostaining.

Nucleaire segregatie- en HNF4α-drempelparameters (stappen 5.2−5.4) moeten zorgvuldig worden geoptimaliseerd voordat automatische beeldanalyse (stap 5.6) wordt geoptimaliseerd om in grote lijnen het visuele patroon van immunokleuring weer te geven dat wordt waargenomen door conventionele fluorescentiemicroscopie aan het einde van protocolpunt 3 (figuur 2C). Voorbeelden van optimale versus suboptimale nucleaire segmentatie en HNF4α drempelprotocollen worden samengevat in figuur 2D. Na beeldanalyse (stap 6.1.3) moeten de gegevens een toenemend aantal NPC's in de lever met DDC-letsel (figuur 2E)weerspiegelen, van 52% ± 2,0% van de kernen in controlelevers tot 72,8% ± 1,4% na 21 dagen DDC-behandeling. Hepatocyten vertegenwoordigen 48,0% ± 2,0% van de totale kernen in controlelevers, concordant met eerdere analyses van de leverhistologie waaruit blijkt dat hepatocyten 70−85% van het weefselvolume innemen, maar slechts 45−50% van de totale levercellen18,19. Een kleine maar significante afname van het aantal HNF4α+ kernen wordt waargenomen tijdens de eerste 14 dagen van DDC-voeding (figuur 2F). Een frequentieverdelingsgebied van het kerngebied van hepatocyte (stap 6.2) toont een piekHNF4α+ kerngebied in controlelevers in het bereik van 40−50 μm2 en een duidelijke verschuiving in nucleaire grootte na DDC-letsel (figuur 2G); in overeenstemming met verhoogde ploidy en hepatocellulaire hypertrofie12.

Bij gezonde (dag 0) controlelevers heeft 63,4% ± 1,7% van de HNF4α+ kernen een "eenvoudige" cirkelvormige morfometrie (figuur 5A). Dit cijfer daalt tot 46,8% ± 5,7% (P = 0,042) na 21 dagen DDC-letsel, als gevolg van de toegenomen complexiteit van nucleaire morfuur die vermoedelijk gepaard gaat met verschuiving tussen ploidietoestanden tijdens polyploidisatie (zie "Interpretatie van nucleaire morforfmetrie" hieronder). Representatieve voorbeelden van nucleaire ploidy-distributies die met deze methode worden verkregen in controleleversecties worden weergegeven in figuur 5A, waarin wordt beschreven hoe interpolatie van DNA-inhoud stratificatie van individuele cellen binnen één monster mogelijk maakt. Er worden ook gemiddelde waarden voor deelverzamelingen van "complexe" en "eenvoudige" HNF4α+ cellen weergegeven (figuur 5A). De gegevens komen overeen met eerdere schattingen van polyploïdie bij 80−90% van de volwassen murinehepatocyten2. De frequentie van complexe kernen (36,6% ± 1,7%) in controlelevers ook benaderen om die van binucleaire cellen (35%)20, hoewel gegevens strikt moeten worden beschouwd als een maatregel van nucleaire in plaats van cellulaire ploidy (zie "Interpretatie van nucleaire morforfometrie" hieronder). Vergelijking van relatieve ploidy tussen controle (dag 0) en DDC behandelde groepen moet wijzen op een aanzienlijk verlies van 2c en 4c hepatocyte kernen met letsel samen met een verhoogd aantal >8c cellen (Figuur 5B). Relatieve positionele informatie voor elke ploidy subgroep kan worden ondervraagd door scatter plot van x-y coördinaten in verband met elke kern binnen de dataset of door het ophalen van de 2D-locatie van bepaalde hepatocyte subsets binnen de high-content image analysis software (Figuur 5C).

Kalibratie
Om de validiteit van de gebruikte NPC-kalibratiemethode te beoordelen, werd dubbele immunolabeling van leversecties uitgevoerd met antilichamen tegen HNF4α en proliferative marker Ki-67(figuur 6A,B). Deze gegevens toonden verrijking voor Ki-67, die cellen labelt in alle actieve fasen van de celcyclus, aan de rechterkant van de Minimale DNA-distributiecurve van de NPC (tussen S2c en S4c) - waarbij npc's naar verwachting DNA repliceren en daarom >2c ploidy(figuur 6A). Na interne kalibratie van alle onderzochte controle- en gewonde levermonsters, Ki-67, was aanzienlijk verrijkt (P < 0,0001) in "eenvoudige" NPC-kernen met een geschatte ploidy van >2c (82,5% ± 6,6% SD, n = 12) in vergelijking met die met ≤2c ploidy (17,5% ± 6,6% SD, n = 12) (Figuur 6B), wat duidt op succesvolle ploïdie kaliberbepaling. Deze gegevens ondersteunen de geldigheid van de gebruikte methode. Ook, uitgaande van nauwkeurige drempelvan Ki67, bieden ze een kwantitatief inzicht in de mate waarin subequatoriale nucleaire maskers van hogere ploidy groepen "besmetten" groepen hieronder.

Om de geldigheid van de NPC-kalibratiemethode verder te testen, werd een externe calibrator geïntroduceerd op basis van het eerder gerapporteerde nucleaire volume van muis 2N hepatocyten (155,8 μm3)14. Wanneer dit cijfer werd gebruikt in combinatie met een gemiddelde waarde van hoechst intensiteit voor HNF4a-kernen de resulterende schatting voor gemiddelde hepatocyte ploidy in de controle levers was niet te onderscheiden van die van de interne (S2c)calibrator (Figuur 6C). Bovendien waren schattingen van gemiddelde hepatocyte ploidy bij muizen van de C57BL/6 muisstam van vergelijkbare leeftijd, ook vergelijkbaar, wat bevestigt dat voorafgaande empirische kennis van de nucleaire omvang van 2N-hepatocyte niet vereist is, waardoor deze intern gecontroleerde methodologie voor het schatten van nucleaire ploïdie volledig autonoom is.

Interpretatie van nucleaire morfometrie
De beschreven methode biedt een ploidy uitlezing voor hepatocytekernen met "eenvoudige" ronde morfometrie. Uitsluiting van "complexe" kernen is gebaseerd op de hypothese dat ze een deel van binucleaire hepatocyten vertegenwoordigen met overlappende / ontroerende nucleaire maskers, waardoor nauwkeurige ploidy bepaling voor deze subset uitdagender (figuur 7A). Belangrijk is dat segregatie van kernen volgens circulariteit de gebruiker niet in staat stelt onderscheid te maken tussen de kernen van mononucleaire hepatocyten en die van binucleaire cellen, waarin twee kernen van vergelijkbare ploidie duidelijk gescheiden zijn in de cel. Dit werd empirisch getest door binucleaire en mononucleaire cellen handmatig te selecteren uit de beelddatasets en hun segregatie te beoordelen door het algoritme (figuur 7B). Kernen van binucleaire hepatocyten die fysiek dichtbij waren(figuur 7C),maar "niet aanraken" werden door het algoritme gecategoriseerd als "eenvoudig", terwijl degenen die "ontroerend" waren duidelijk werden gediscrimineerd als "complex". Vandaar dat deze test geen uitlezing van cellulaire ploidy in de lever biedt, gezien het feit dat kernen van binucleaire cellen zijn onderverdeeld tussen de "eenvoudige" en "complexe" subklassen (zie Discussie). Echter, enig inzicht in de omschakeling tussen staten van cellulaire en nucleaire ploidie kan worden verkregen uit deze gegevens gewoon door plotten histogrammen van nucleaire morfometrie en nucleaire grootte en de toepassing van een model van hoe "complexe" en "eenvoudige" staten worden overgang tussen tijdens polyploidization (Figuur 7D). In controlelevers worden drie fasen (I−III) van nucleaire morfometrie duidelijk waargenomen (figuur 7E). Zij vertegenwoordigen de clustering van respectievelijk circulaire 2N (I), 4N (II) en 8N (III) kernmaskers (zoals geïllustreerd in figuur 7D). Mononucleaire 16N hepatocyten zijn uiterst zeldzaam in volwassen muislevers16,18,21, vandaar de 16N cellulaire ploidy groep bestaat bijna volledig uit binucleaire cellen met 8N kernen, gelegen binnen, en aan de rechterkant, van fase III ( Figuur7E), waarin de daling van de circulariteit aan de rechterkant van fase III. Interessant is dat bij letsel (DDC dag 14) een kwantitatieve verschuiving naar verhoogde complexiteit ("binucleariteit") begint in fasen I (als gevolg van 2n tot 2x2n) en fasen III (als gevolg van 8n tot 2x8n), voordat het uiteindelijk wordt geconsolideerd in alle drie de fasen (I−III). De auteurs speculeren dat deze verschuiving naar verhoogde complexiteit te wijten is aan een verhoogde cellulaire ploidy als gevolg van vastgelopen cytokinese, terwijl aan de rechterkant van fase III de tegenovergestelde trend wordt waargenomen, als gevolg van een verhoogde vertegenwoordiging van cirkelvormige 16N mononucleaire cellen in de gewonde lever als gevolg van endoreplicatie. Deze waarnemingen zullen natuurlijk moeten worden getest door de methode aan te passen om goed rekening te houden met cellulaire ploidy (zie Discussie).

Figure 1
Figuur 1: Samenvatting van de werkstroom. Leverweefsel wordt geoogst (1), cryosectioned (2), vast en immunolabelled met een HNF4α-antilichaam waardoor parenchymale en niet-parenchymale cellen (NPC's) kunnen worden gediscrimineerd (3). Eenmaal verwerkt, worden monsters gedigitaliseerd met behulp van een high-content imaging platform met behulp van geautomatiseerde beeldopname(4)en analyse (5). Cellen worden gesegmenteerd door Hoechst nucleaire fluorescentie en HNF4α immunofluorescentie drempels. Vervolgens worden het kerngebied Hoechst (A) en circulariteit ("C") berekend. Ten slotte worden de gegevens geanalyseerd (6); HNF4α- NPC's worden gekwantificeerd (i) en HNF4α+ hepatocytekernen worden gescheiden in twee subgroepen ("eenvoudig" en "complex") volgens nucleaire circulariteit (ii). Interpolatie van hepatocyte nucleaire ploidy wordt vervolgens uitgevoerd voor alle "eenvoudige" kernen als functie van nucleaire straal (r) en gemiddelde Hoechst fluorescentie intensiteit (als een proxy voor nucleaire DNA-dichtheid) (iii). De gegevens worden vervolgens gestratificeerd met behulp van NPC's als een interne 2N calibrator (iv) voordat u een voorbeeldsamenvatting (v) samenstelt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: High-content beeldanalyse en cytometrische profilering van de muislever tijdens chronische DDC-voeding. (A) Een representatief confocale afbeelding van HNF4α/Hoechst immunofluorescentie kleuring van de volwassen muislever na 21 dagen voeding met een dieet dat 0,1% DDC bevat; afbeelding toont afgeronde HNF4α+ hepatocytenkernen ("H") en uitbreiding van HNF4α- NPC's in gebieden rond de poortader ("PV"). (B) Voorbeelden van optimale ("juiste") en suboptimale ("onjuist") nucleaire Hoechst kleuring aangeeft slechte fixatie. (C) Gebruik van high-throughput beeldanalyse platform om hepatocyten en NPC's te scheiden volgens nucleaire Hoechst kleuring en HNF4α immunolabelling. Softwaremaskers (rode/groene lijnen) laten zien hoe kernen correct worden gesegmenteerd volgens Hoechst fluorescentie en gesorteerd in hepatocyten (+) of NPC's (-) volgens de HNF4α-status. (D) Een handleiding voor het optimaliseren van de setup voor segmentatie/drempelanalyse. Bovenop elkaar geplaatste nucleaire maskers die door de software worden herkend, worden aangegeven met groen/blauwe lijnen voor nucleaire segmentatie en groen/blauw (HNF4α+) of rood/blauw (HNF4α-) voor drempelanalyse (H = hepatocyten). Probleemoplossing: De gevoeligheid voor nucleaire detectie is te laag (i) of te hoog (ii). Drempel voor HNF4α te laag (iii) of te hoog (iv). (E,F) Kwantitatieve analyse van NPC- en hepatocytenkernen tijdens DDC-voeding: (E) HNF4α- en (F) HNF4α+ nucleaire dichtheden worden vergeleken met de tijd van DDC-behandeling (dagen). In totaal werden 5,7 x 105 cellen geanalyseerd, van 4−6 dieren per tijdpunt. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde + SEM. **P < 0,01 en ***P < 0,001. One-way ANOVA werd gebruikt om middelen te vergelijken. Significantie P-waarden werden berekend aan de hand van fisher's minst significante verschil (LSD) test. gG) Frequentieverdeling van het HNF4α+-kerngebied tijdens de DDC-behandeling. De gegevens tonen een rechts-verschuiving in hepatocyte nucleaire gebied tijdens letsel in overeenstemming met cellulaire hypertrofie en polyploidisatie. In totaal werden 2,5 x 105HNF4α+ kernen geanalyseerd, van 4−6 dieren per tijdpunt. Dit cijfer is gewijzigd van Manzano-Núñez et al.17. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Geautomatiseerde analyse van hepatocyte nucleaire ploidy met behulp van aangepaste geschreven software. (A) Screenshot met de juiste opmaak van spreadsheetgegevens voor invoer in de nucleaire ploidy analyse software. Kolommen met essentiële gegevens (stap 5.5 van het protocol) worden geel gemarkeerd. Alle kolomtitels moeten precies overeenkomen met de aangegeven kolomtitels. (B) Schermafbeelding van de titel van de afzonderlijke spreadsheetbestanden met gegevens van biologische replicaties ("Sample1", "Sample2", enz.) moet worden benoemd en georganiseerd in submappen voor elke voorwaarde (getiteld "Control-d0" en "Injured-d14" in dit voorbeeld). (C) Screenshot na succesvolle installatie van de ploidy applicatie (rode cirkel). Wanneer de toepassing wordt gestart (door op 'Ploidy_Appl..") te klikken op het tabblad MIJN APPS van de toolstrip verschijnt de 'Ploidy_GUI' (onderste paneel). De experimentnaam ("Voorbeeld") en paden naar het besturingselement (bijvoorbeeld 'Control-d0') en test (bijvoorbeeld 'Gewonde-d14') worden ingevoerd voordat u op Uitvoerenklikt. De software berekent, kalibreert en stratificaties nucleaire ploidy voor alle monsters met behulp van de "Control-d0" dataset om drempels te genereren voor minimale DNA-inhoud. (D) Gegevens uitvoer van Ploidy_Application toont individuele gegevensbestanden automatisch opgeslagen in elke voorbeeldmap (i) met absolute en percentage nummers van "eenvoudige" kernen in elke ploidy groep. Voor elke voorwaarde (in dit geval zowel "Control-d0" als "Injured-d14"), wordt ook automatisch een overzichtsmap gegenereerd met gemiddelde nucleaire ploidy schattingen voor alle "eenvoudige" hepatocyte en niet-hepatocyte kernen (ii) en een uitsplitsing van hoe nucleaire ploidy voor elk monster wordt gestratificeerd (iii). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Het gebruik van NPC's als interne ploidy calibrator. (A) Grafiek met de impact van DDC-letsel op het gemiddelde minimale DNA-gehalte (m) van hepatocyten (HNF4α+) en NPC (HNF4α-) kernen. Alle gegevens worden genormaliseerd tot dag 0 NPC's (n = 4 dieren per tijdpunt). BB) Histogram dat de verdeling van de NPCm-waarden in één representatief levermonster beschrijft (dag 0, totaal van 7.180 kernen). Het schema (hierboven) laat zien hoe cirkelvormige NPC-maskers kunnen voortkomen uit cellen met een 2−4c DNA-gehalte. Het doel van de kalibratiemethode is de stratificatiedrempel te definiëren die 4c (S4c)vertegenwoordigt aan de bovengrens van de NPCm-verdeling (stippellijn), terwijl het geluid als gevolg van segmentatiefouten bij de uitersten van de distributiecurve wordt geminimaliseerd. (C) Veranderingen in de gemiddelde hoechst intensiteit en nucleaire gebied voor NPC (HNF4α-) kernen worden uitgezet. Om segmentatiefout te voorkomen worden alleen die kernen met een overeenkomstige NPCm-waarde van binnen 1 SD van de modus NPCm-waarde onderzocht (geel vak). Binnen dit bereik wordt de 2c−4c-overgangsgrootte (t) berekend en gebruikt als ankerpunt binnen de gegevens om de S4cte schatten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: High-throughput in situ analyse van nucleaire ploidy in de muislever tijdens chronische DDC-voeding. (A) Analyse van de controle volwassen lever met behulp van de beschreven methode. HNF4α+ hepatocytenkernen uit 2D-leversecties zijn onderverdeeld volgens Hoechst nucleaire circulariteit in twee groepen: "eenvoudig" en "complex". (Boven) Representatieve fluorescentie Hoechst beelden van cellen die behoren tot deze twee groepen worden getoond. (Links) Scatterplot met stratificatie van eenvoudige HNF4α+ kernen uit één monster (dag 0) volgens geïnterpoleerde ploidiewaarde, nucleair gebied en gemiddelde nucleaire Hoechst-intensiteit. (Rechts) Cirkeldiagram met de typische uitsplitsing van HNF4α+ cellen in controlelever (dag 0) die de verhoudingen van elke subklasse van nucleaire ploidy aangeeft. In totaal werden 6,7 x 104 HNF4α+ kernen van 4 dieren geanalyseerd. (B) Impact van DDC leverletsel op hepatocyte nucleaire ploidy door high-throughput in situ analyse. Grafieken tonen de relatieve daling van het aandeel van 2c en 4c hepatocytekernen binnen de eerste 14 dagen van DDC-voeding, terwijl >8c polyploid kernen drastisch toenemen in aantal. In totaal werden 1,5 x 105 HNF4α+ kernen geanalyseerd (n = 4 dieren per tijdpunt). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde + SEM. **P < 0,01 en ***P < 0,001. One-way ANOVA werd gebruikt om middelen te vergelijken. Significantie P-waarden werden berekend aan de hand van de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. (C) Voorbeeld om te laten zien hoe nucleaire ploidy subklassen ruimtelijk kunnen worden gevolgd binnen de parenchyma met behulp van deze methode, door het ondervragen van high-content imaging gegevens met dezelfde kwantitatieve criteria die worden gebruikt voor ploidy stratificatie (circulariteit, nucleaire grootte en gemiddelde Hoechst intensiteit). Hoechst fluorescentie beelden worden getoond met software maskers (rode stippen) markering 2c kernen in de lever op twee tijdstippen tijdens chronische DDC voeding (dag 14 en 21). Portal ader (blauwe stippellijn) en periportal gebieden waarin NPC's uit te breiden (gele lijn) zijn aangegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Kritische beoordeling van de NPC-kalibratiemethode. (A,B) Prolifererende NPC's worden met succes gecategoriseerd met een >2c ploidy score. (A) Histogram van NPC minimale DNA-inhoud van controle levers immunolabel met antilichamen tegen HNF4α en proliferative marker Ki-67 (n = 4, gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde + SEM). Stratificatiedrempels voor 2c (S2c)en 4c (S4c)zijn aangegeven. BB) Stratificatie van NPC's volgens de beschreven methodologie resulteert in een aanzienlijke verrijking van Ki-67 immunolabelling in kernen met een >2c ploidy score (n = 12). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde + SEM. Unpaired t-test werd gebruikt om de middelen ****P < 0,0001 te vergelijken. (C) Externe validatie van de NPC-kalibratiemethode. Schattingen van de gemiddelde hepatocyte nucleaire ploidie verkregen met behulp van de interne NPC calibrator methode werden vergeleken met die verkregen door kalibratie van dezelfde monsters (Control C57BL/6 muislever 3−4 maanden, n = 4) met een bekend nucleair volume voor 2N hepatocyten14. Gegevens worden ook gepresenteerd uit twee onafhankelijke analyses21,22 beschrijven hepatocyte nucleaire ploidy van muizen van dezelfde stam op leeftijden 2−6 maanden (aangetoond aan de rechterkant van de stippellijn). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Hepatocyte nucleaire morfometrie heeft een "complexe" relatie met cellulaire ploidie. (A) Samenvatting van hoe hepatocyte cellulaire ploidy (2N, 4N, 8N en 16N) gedeeltelijk wordt gescheiden door 2D-analyse van nucleaire morforrie. Binucleaire cellen (rood) zijn onderverdeeld tussen "eenvoudige" ("S") en "complexe" ("C") morfuur, afhankelijk van de vraag of kernen lijken te raken of niet. (B,C) Individuele hepatocyten werden handmatig geselecteerd en geanalyseerd voor nucleaire morfometrie en internucleaire afstand. BB) Binucleaire hepatocyten met "aanrakende" kernen waren "complex" (100% ≤0,8), terwijl mononucleaire cellen (zwart) en binucleaire hepatocyten met niet-aanrakende kernmaskers "eenvoudig" waren (94% >0,8). cC) "Eenvoudige" kernen van binucleaire hepatocyten kunnen worden onderscheiden van die van mononucleaire cellen vanwege een aanzienlijk verminderde internucleaire afstand (n = 3, totaal 94 geanalyseerde kernen). (D) Model dat ongeveer benadert hoe cellulaire ploidiestaten van paneel A kunnen worden verdeeld in termen van 2D nucleaire morfuur en nucleair gebied, wat resulteert in het clusteren van eenvoudige cirkelvormige vormen in vier fasen (I−IV). (E) Vergelijking van HNF4α+ nucleaire morfometrie/groottepercelen in controlelevers (dag 0) en na 14 dagen (links) en 21 dagen (rechts) van DDC-letsel. Morfometriefasen zijn hierboven aangegeven (I−V). Pijlen geven verschuivingen in nucleaire morfometrie als gevolg van letsel aan die in overeenstemming zijn met binuclearisatie van 2c ("a"), 4c ("b") en 8c ("c") kernen, samen met verhoogde mononuclearisatie van de 16N cellulaire ploidy klasse (d). Totaal van 29−30 x 103 geanalyseerde kernen per aandoening (n = 2). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende bestanden: demonstratiegegevenssets. Klik hier om deze bestanden te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een high-content, high-throughput benadering voor de analyse van weefsel remodelleren en schatting van hepatocyte nucleaire ploidy in de murine lever wordt beschreven. Eenmaal bekend met de procedure, kan een gebruiker meerdere monsters verwerken, bekijken en analyseren in een periode van 3−5 dagen, waardoor grote testbare gegevenssets worden genereren die een gedetailleerde handtekening van de levergezondheid bieden. Gezien de eenvoud van de monsterbereidingsmethode, samen met de grote aantallen cellen en weefselgebied geanalyseerd (gemiddeld 14 mm2/sample), resultaten zijn robuust en zeer reproduceerbaar. Automatisering van het vastleggen en analyseren van afbeeldingen verwijdert ook gebruikersfouten en potentiële bias uit deze belangrijke stappen. Een belangrijke innovatie is het gebruik van NPC's als een interne ploidy calibrator die relatieve beoordeling van het nucleaire DNA-gehalte van hepatocyte mogelijk maakt, zowel binnen als tussen monsters. De integratie van een HNF4α-etiketteringsstap is daarom van cruciaal belang om dit protocol een uniek technisch voordeel te bieden ten opzichte van eerder gepubliceerde 2D-methoden3,12,22. In tegenstelling, de relatieve eenvoud van de methodologie in vergelijking met 3D reconstructie workflows18 maakt het technisch minder omslachtig en potentieel flexibeler.

Vergeleken met de precisiemethode van stroomcytometrie, een belangrijk voorbehoud aan het extrapoleren van kernDNA-inhoud van 2D-weefselsecties, is het beperkte vertrouwen dat kan worden toegeschreven aan de categorisering van individuele kernen met betrekking tot de ploidie-status. Toegevoegd aan dit is de inherente bias binnen SIA gebaseerde benaderingen om kleinere ploidy subgroepen als gevolg van subequatoriale bemonstering overrepresent. Echter, door het normaliseren van gegevens naar een interne standaard en het nemen van een grote populatie gebaseerde aanpak, de fout als gevolg van deze effecten wordt beperkt en vergelijkbaar tussen monsters. Hepatocyten worden gekenmerkt door een zeer afgeronde nucleaire morfologie, in vergelijking met bijvoorbeeld NPC's, wat betekent dat ze bijzonder vatbaar zijn voor een nauwkeurige schatting van het DNA-gehalte op basis van nucleair doorsnedegebied alleen10,11,14,15,23. De OP SIA gebaseerde benadering is in dit protocol verfijnd om zowel de nucleaire circulariteit als de DNA-dichtheid te verklaren door maatregelen van morfometrie en gemiddelde hoechst fluorescentieintensiteit te integreren, wat resulteert in een geschatte "minimale DNA-inhoud" descriptor voor individuele kernen. Belangrijk is dat het gebruik van NPC's als een 2−4N ploidy controle een belangrijke interne standaard biedt voor objectieve kalibratie en gelaagdheid van minimaal nucleair DNA-gehalte, waardoor de beschreven methode van toepassing is op monsters van welke soort dan ook, of formaat, aangezien een geschikt antilichaam voor HNF4α (of soortgelijke hepatocyte nucleaire marker) kan worden verkregen.

Hoewel is aangetoond dat de beoordeling van nucleaire ploidie nuttige handtekeningen biedt voor de progressie van leverziekten10,13, om de diversiteit van ploïdie veranderingen in de lever volledig vast te stellen, zou het wenselijk en noodzakelijk zijn om de beschreven methode aan te passen om rekening te houden met de leverachtige omtrek en dus cellulaire ploidie. Mapping van cellulaire ploidy is eerder bereikt door etikettering van de hepatocyte perimeter met behulp van markers zoals bèta-catenin10,13,24, actin12,22 en cytokeratine10,11 in menselijke en muis lever monsters. Echter, toen dit werd getest na DDC letsel, dramatische epitheliale remodelleren uitgesloten betrouwbare beoordeling van hepatocellulaire perimeter zowel door falloïden (gegevens niet getoond) of antilichamen tegen beta catenin17. Vandaar, terwijl deze aanpak haalbaar is, kan het niet van toepassing zijn op alle schade modellen, maar indien bereikt zou vooraf in kaart brengen van cellulaire ploidy evenals het maken van schattingen van hepatocyte grootte en aantal nauwkeuriger. Het blijft ook aannemelijk dat mononucleaire cellen door rekening te houden met aanvullende nucleaire parameters, zoals internucleaire afstand (figuur 7C),kunnen worden gediscrimineerd uit "eenvoudige" binucleaire hepatocyten, en dat verdere segregatie van "complexe" binucleaire cellen kan worden bereikt door radiale metingen van de kernen die hun 2D-maskers bevatten.

Aangezien gevalideerde menselijke HNF4α-antilichamen bestaan voor FFPE-weefsel25 en interne kalibratie deze methode van soortenspecifieke beperkingen vrijmaakt, is het protocol vrijwel onmiddellijk van toepassing op menselijke monsters. Zo heeft het een aanzienlijk potentieel om een benchmark te bieden voor high-throughput analyse van hepatocyte nucleaire ploidy en leverletsel bij de menselijke ziekte. Ook, door multiplexing met andere antilichamen, deze methode kan onthullen nieuwe rollen voor bepaalde hepatocyte subsets en hun reactie op leverletsel en ziekte. Daartoe hebben we de methodologie met succes gecombineerd met immunostaining voor de proliferative nuclear marker Ki-67 (Figuur 6), waarmee nuttige informatie kan worden verzameld - inclusief de identificatie van niet-prolifererende 2N populaties nPC's voor een betere interne kalibratie van ploidie (Middag, ongepubliceerde gegevens 2019). Door flexibiliteit te koppelen aan de positionele en kwantitatieve gegevens die de methode biedt, stellen we voor dat de toekomstige toepassingen ervan het begrip van de rol van polyploïdie in de lever zullen verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de Spaanse MINECO-regering subsidies BFU2014-58686-P (LAN) en SAF-2017-84708-R (DJB). LAN werd ondersteund door een nationale MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 en Plan GenT award (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) en FMN door een regionaal ValI+D studentenschip van de Valenciaanse Generalitat ACIF/2016/020. RP wil prof. Ewa K. Paluch erkennen voor financiering. We danken Dr. Alicia Martínez-Romero (CIPF Cytometry service) voor hulp met het IN Cell Analyzer platform.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) TestDiet 1810704 Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) Invitrogen A11055 Dilution 1:500
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cryostat Leica CM1850 UV Leica biosystems CM1850 UV Tissue sectioning
Fluorescent Mounting medium Dako S3023
GraphPad Prism GraphPad Software Prism 8 Statistical software for graphing data
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Final concentration 5 µg/mL
IN Cell Analyzer 1000 GE Healthcare Bio-Sciences Corp High-Content Cellular Imaging and Analysis System
MATLAB MathWorks R2019a Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy
Microscope coverslides VWR International 630-2864 Size of 24 x 60 mm
Microsoft Office Excel Microsoft Speadsheet software
OCT Tissue Tek Pascual y Furió 4583
Paraformaldehyde Panreac AppliChem 141451.121
Pen for immunostaining Sigma-Aldrich Z377821-1EA 5mm tip width
Polysine Microscope Slides VWR International 631-0107
Rabbit polyclonal Anti-HNF4α Thermo Fisher Scientific PA5-79380 Dilution 1:250 (alternative)
Rabit polyclonal Anti-HNF4α Santa Cruz Biotechnology sc-6556 Dilution 1:200 (antibody used in the study)
Tween 20 Sigma-Aldrich P5927

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
  2. Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
  3. Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide? Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
  4. Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
  5. Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
  6. Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
  7. Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
  8. Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
  9. Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
  10. Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
  11. Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
  12. Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
  13. Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
  14. Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
  15. Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  16. Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
  17. Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
  18. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
  19. Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
  20. Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
  21. Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
  22. Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
  23. Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
  24. Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
  25. Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).

Tags

Geneeskunde Nummer 158 lever polyploïdie hepatocyte high-content beeldvorming hepatologie Hepatocyte nucleaire factor 4 alpha (HNF4α)
Een High-Throughput In Situ Methode voor schatting van Hepatocyte Nucleaire Ploidy in muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manzano-Núñez, F., Peters, … More

Manzano-Núñez, F., Peters, R., Burks, D. J., Noon, L. A. A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice. J. Vis. Exp. (158), e60095, doi:10.3791/60095 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter