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Medicine

Um método de alta produtividade in situ para estimação da ploidiii y nuclear hepatocida em camundongos

Published: April 19, 2020 doi: 10.3791/60095
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1,3
1Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)

Summary

Apresentamos um método robusto, econômico e flexível para medir mudanças no número de hepatócitos e ploidy nuclear em amostras de tecido fixo/criopreservado que não requerem citometria de fluxo. Nossa abordagem fornece uma poderosa assinatura amostral de citologia hepática ideal para rastrear a progressão de lesões hepáticas e doenças.

Abstract

Quando o fígado está ferido, os números de hepatócitos diminuem, enquanto o tamanho da célula, o tamanho nuclear e a ploidy aumentam. A expansão de células não parenquiais como colangiocytes, miofibroblastos, progenitores e células inflamatórias também indicam danos crônicos no fígado, remodelação tecidual e progressão da doença. Neste protocolo, descrevemos uma abordagem simples de alto throughput para calcular mudanças na composição celular do fígado que estão associadas a lesões, doenças crônicas e câncer. Mostramos como as informações extraídas de seções de tecido bidimensional (2D) podem ser usadas para quantificar e calibrar ploidy nuclear hepatocito dentro de uma amostra e permitir que o usuário localize subconjuntos específicos de ploidy dentro do fígado in situ. Nosso método requer acesso a material hepático fixo/congelado, reagentes básicos de imunocitoquímica e qualquer plataforma de imagem padrão de alto conteúdo. Ele serve como uma poderosa alternativa às técnicas padrão de citometria de fluxo, que requerem interrupção do tecido recém-coletado, perda de informações espaciais e viés de desagregação potencial.

Introduction

Hepatócitos no fígado de mamíferos podem sofrer citocinese paralisada para produzir células binucleares, e endoreplicação de DNA para produzir núcleos poliplóides contendo até 16N conteúdo de DNA. Aumento geral da ploididy celular e nuclear durante o desenvolvimento pós-natal, envelhecimento e em resposta a diversos estresses celulares1. O processo de poliploidização é dinâmico e reversível2,embora sua função biológica precisa ainda não esteja clara3. O aumento da ploidia está associado à redução da capacidade proliferativa4, diversidade genética2, adaptação à lesão crônica5 e proteção contra o câncer6. Alterações de ploidy hepatocito ocorrem como resultado de um ritmo circadiano alterado7, e desmame8. Mais notavelmente, o perfil ploidiano do fígado é alterado por lesão e doença9, e evidências convincentes sugerem que alterações específicas de ploidia, como o aumento de núcleos ≥8N ou perda de hepatócitos 2N, fornecem assinaturas úteis para o rastreamento da progressão da doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD)3,10, ou o impacto diferencial das infecções virais11.

Em termos gerais, a lesão hepática e a regeneração estão associadas ao aumento do tamanho das células hepatocitos e da área nuclear12,juntamente com o número global reduzido de hepatócitos, particularmente aqueles com teor de DNA 2N10,11. A lesão parenquimal no fígado também é frequentemente acompanhada pela expansão de células não parenquiais (NPCs), incluindo miofibroblastos estrômicos, células inflamatórias e células progenitoras hepáticas bipotentes. Métodos de alto throughput que fornecem um perfil citológico quantitativo de número de células parênquias e ploidia nuclear, ao mesmo tempo em que contabilizam mudanças nos NPCs, portanto, têm um potencial considerável como pesquisas e ferramentas clínicas para acompanhar a resposta do fígado durante lesões e doenças. Análises recentes convincentes in situ de espectroplóide em amostras humanas de carcinoma hepatocelular também demonstram que a ploidia nuclear é dramaticamente aumentada dentro dos tumores e é especificamente amplificada em subtipos tumorais mais agressivos com diferenciação reduzida e perda de TP5313. Assim, há uma forte possibilidade de que os avanços metodológicos na avaliação quantitativa da ploididia nuclear ajudem no futuro perfil prognóstico do câncer de fígado.

Neste protocolo, descreve-se uma metodologia flexível de alto desempenho para a análise comparativa das seções de tecido hepático do camundongo, que fornece perfis citométricos detalhados de números de hepatócitos, a resposta do NPC e um método previamente calibrado internamente para estimar ploidy nuclear (Figura 1). Os hepatócitos são distinguidos dos NPCs pela imunorotulagem do fator nuclear 4 alfa (HNF4α), antes da caracterização do tamanho nuclear e da morfometria nuclear. "Conteúdo mínimo de DNA" é estimado para todas as máscaras nucleares circulares, integrando a intensidade média de Hoechst 33342 (um proxy para a densidade de DNA) com volume nuclear tridimensional interpolado (3D). O conteúdo mínimo de DNA do hepatócito é então calibrado usando NPCs para gerar um perfil de ploidia nuclear.

Aquisição de imagens, segmentação nuclear e análise de imagens são realizadas por meio de imagens de alto conteúdo, permitindo que grandes áreas de seções hepáticas bidimensionais (2D) contendo dezenas de milhares de células sejam rastreadas. Um programa personalizado é fornecido para o pós-processamento automatizado de dados de análise de imagens de alto conteúdo para produzir um perfil ploidy em toda a amostra para todos os núcleos de hepatócitocircularcircular. Isto é realizado usando software gratuito para baixar software para calcular ploidia nuclear com base na análise de imagem estereológica (SIA)10,11,14,15. A metodologia SIA foi previamente validada pela citometria de fluxo como um método preciso, embora trabalhoso, para estimar ploidiy nuclear hepatocito no fígado14, assumindo morfologia nuclear circular e uma relação monótônica entre tamanho nuclear e conteúdo de DNA. Neste protocolo, ambos os parâmetros nucleares são medidos pela avaliação da mormetria nuclear e da rotulagem Hoechst 33342. O cálculo do "conteúdo mínimo de DNA" para cada máscara nuclear é seguido pela calibração da ploidia nuclear hepatocito usando NPCs, que têm um conteúdo conhecido de DNA 2-4N e, portanto, servem como um controle interno útil.

Em comparação com os métodos convencionais de citometria de fluxo16, a abordagem descrita permite que a ploidiiiiiide nuclear hepatocida seja avaliada in situ e não requer acesso a métodos de tecido fresco ou desagregação que podem influenciar os resultados e ser difíceis de padronizar. Como em todas as abordagens baseadas no SIA, as subclasses ploidiais nucleares >2N são sub-representadas pela amostragem 2D devido à secção de núcleos maiores fora do plano equatorial. O perfil ploidy em todo o tecido também descreve o conteúdo mínimo de DNA para todas as máscaras nucleares hepatocidas circulares, e não discrimina diretamente entre hepatocitos mononucleares e células binucleares que têm dois núcleos discretos ("não tocantes") da mesma ploidy. No entanto, a simplicidade deste protocolo permite um espaço considerável para que ele seja adaptado para responder por parâmetros adicionais, como espaçamento internuclear ou análise de perímetro celular, o que facilitaria a identificação de células binucleares, proporcionando uma avaliação mais detalhada da ploidiia celular.

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Protocol

Todos os experimentos com animais foram previamente aprovados pelo comitê de ética do CIPF. Os camundongos foram alojados em uma instalação sem patógenos no Centro de Investigação Príncipe Felipe (Valência, Espanha), registrado como um criador de animais experimental, usuário e centro de abastecimento (reg. no. ES 46 250 0001 002) nos regulamentos de bem-estar animal europeus e espanhóis vigentes (RD 53/2013).

1. Colheita de tecidos e preparação da amostra

NOTA: Este protocolo descreve como congelar tecidos sem fixação prévia ou criopreservação. Para amostras previamente fixas/criopreservadas, prossiga para a seção 2 e omita a etapa 3.1. Todas as análises foram realizadas utilizando camundongos C57BL/6 adultos com idade entre 12 e 16 semanas.

  1. Animais de sacrifício por injeção intraperitoneal de fentanil/pentobarbital seguido de luxação cervical. Com o mouse voltado para o lado ventral para cima, abra a cavidade abdominal e exponha o fígado agarrando a pele com pinças e realizando uma incisão vertical desde a base do abdômen inferior até a base do esterno usando uma tesoura cirúrgica.
  2. Remova cuidadosamente a vesícula biliar usando pinças finas, disseque o fígado e enxágue o lóbulo do fígado selecionado em uma placa de placa de 10 cm de Petri cheia de solução salina tamponada de fosfato (PBS).
    NOTA: Recomenda-se comparar o mesmo lóbulo hepático para cada animal, neste caso foi utilizado o lobo mediano.
  3. Encha um criomolde rotulado com temperatura de corte ideal (OCT) média à temperatura ambiente (RT). Evite bolhas oct. Se eles aparecerem, empurre-os para a borda do molde usando uma agulha ou ponta de pipeta.
  4. Incorpore lobule de fígado em um criomold oct preenchido e coloque-o imediatamente em gelo seco para garantir o congelamento rápido. Armazene criomoldes a -80 °C até a criosecção.

2. Criosecção

  1. Transporte criomoldes em gelo seco para evitar a degradação do tecido. Antes da criosecção equilibrar o equilíbrio dentro do criostato definido para -20 °C por 20 min.
  2. Ejetar amostra aplicando pressão na base do criomolde plástico. Aplique oct líquido para aquecer o disco de amostra em RT, posicione-o em criostato e conecte uma amostra de fígado incorporada oct. Aplique pressão suave e espere 3 min para que o OCT congele, garantindo que a amostra grude no disco.
    NOTA: Evite manusear a amostra com os dedos o máximo possível para evitar a degradação do tecido.
  3. Bloqueie a amostra no braço do criostato e ajuste a orientação para que a borda da amostra seja paralela à lâmina criostato. Corte na amostra até que o tecido seja atingido.
  4. Seção da amostra a 6 μm de espessura. Coloque um slide revestido de poliamida rotulado sobre a amostra para 5 s para deixar a amostra grudar no slide. Coloque o slide em RT por 3-5 min, em seguida, para obter melhores resultados, siga diretamente para a seção 3.
    NOTA: Para o processamento de múltiplas amostras recém-congeladas, os resultados reprodutíveis foram obtidos armazenando temporariamente slides em uma caixa de slides em gelo seco até que todas as amostras tenham sido processadas. Ao usar esta abordagem, permita que todos os slides se equilibrem com o RT antes de prosseguir para a seção 3. Podem ser utilizadas amostras de parafina fixa de formalina (FFPE), embora a autofluorescência de fundo seja aumentada por este método. Para proceder a partir de amostras de FFPE, seção a 4 μm. Monte capturando seções de banho de água de 40 °C em lâminas tratadas com poliamida. O calor desliza por 1 h a 60 °C, depois deparafina por lava-jatos RT serial (5 min) em frascos de Coplin contendo xileno (x2), etanol 100% (x2), 96% (x2), 70% (x1) e dH2O (x1). Para expor antígenos coloque slides no tampão citrato por 20 min a 90 °C antes de temperar slides em PBS em RT. Siga para o passo 3.2.

3. Imunorotulagem de fluorescência

  1. Fixar seções teciduals em uma capa de fumaça aplicando 1 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS por 10 min em RT. Transfira slides para um frasco de Coplin cheio de PBS e lave por 3 min usando agitação suave (repetir 3x).
    NOTA: A partir de agora até o final do processo de imunocoloração, evite a secagem da amostra.
  2. Seque a área ao redor de cada seção de tecido e cerque usando uma caneta hidrofóbica. Permeabilizar com surfactante ninônico de 0,5% (ou seja, Triton X-100) em PBS por 15 min no RT. Em seguida, lave no pote de Coplin recheado da PBS por 3 min usando agitação suave (repita 2x).
  3. Bloqueie utilizando uma solução filtrada de albumina de soro bovino de 1% (BSA), 5% de soro de cavalo, 0,2% de surfactante nonionico em PBS (para pelo menos 1 h no RT).
  4. Incubar com anticorpo HNF4α primário diluído em tampão de bloqueio durante a noite a 4 °C em uma câmara de coloração úmida escura (ver Tabela de Materiais para anticorpos e diluições específicas).
  5. Coloque slides em um frasco de Coplin cheio de PBS e lave por 3 min usando agitação suave (repita 4x).
  6. Incubar com anticorpo secundário conjugado Alexa-488 e Hoechst diluído em 1% de BSA filtrado e 0,2% de surfactante nonionico em PBS por 2 h em RT em uma câmara de coloração úmida escura (ver Tabela de Materiais para anticorpos e diluições específicas).
  7. Coloque slides em um frasco de Coplin cheio de PBS e lave por 3 min usando agitação suave (repita 4x). Lave em ddH2O por 3 min usando agitação suave (repita 2x).
  8. Monte slides colocando duas gotas de mídia de montagem fluorescente em um deslizamento de cobertura (24 x 60 mm) e colocando slides sobre ele, eliminando bolhas aplicando pressão suave. Para armazenamento a longo prazo, solte a tampa nas bordas com esmalte claro e armazene no escuro a 4 °C.
  9. Antes de prosseguir, verifique os slides usando um microscópio convencional de fluorescência para garantir uma boa fixação e imunorotulagem.
    NOTA: Consulte a Figura 2A,B para obter resultados esperados.

4. Aquisição de imagem de fluorescência

NOTA: Para esta etapa, é necessária uma plataforma de imagem de alto conteúdo(Tabela de Materiais)que suporte a aquisição automática de imagens de fluorescência.

  1. Ligue o sistema de imagem e abra um novo protocolo de aquisição.
  2. Selecione o objetivo 10x, observe a área do campo de visão (neste caso 0,6 mm2).
  3. Defina parâmetros para adquirir imagens de fluorescência usando os filtros apropriados de excitação e emissão (conforme etapa 3.6). Para Hoechst e Alexa-488, selecione os canais "DAPI" e "GFP" com emissão de 390/18 e 438/24 nm e emissão de 432,5/48 e 475/24 nm, respectivamente.
  4. Concentre a amostra e garanta que a intensidade do sinal não seja saturada. Certifique-se de que a captura de imagens seja feita com o mesmo tempo de exposição para todas as imagens ou use um sistema onde a intensidade da fluorescência seja corrigida para o tempo de exposição.
  5. Escaneie a amostra e adquira imagens suficientes para obter a cobertura completa da seção de tecidos (aproximadamente 20-50 campos de visão, dependendo do tamanho da amostra).
  6. Revise o banco de dados de imagens, eliminando manualmente (i) campos mal focados, (ii) aqueles nas bordas de cada seção de tecido (para evitar cálculos de densidade celular tendenciosos) e (iii) aqueles que contenham áreas dobradas/fisicamente danificadas da seção de tecidos, se presentes.

5. Análise automatizada de imagens de fluorescência

NOTA: Esta etapa requer um software de análise de imagem adequado (Tabela de Materiais) capaz de: (1) identificar automaticamente núcleos rotulados hoechst dentro de imagens a 405 nm (segmentação nuclear), (2) avaliar a intensidade nuclear média de Hoechst e a mormormetria e (3) análise de limiar para determinar o status +/- de fluorescência nuclear a 488 nm (HNF4α). Alguns treinamentos/conhecimentos básicos do operador são necessários para avaliar e ajustar visualmente parâmetros de segmentação e limiar dentro do programa para garantir que os núcleos e o status HNF4α+/- sejam otimizados(Figura 2).

  1. No software de análise de imagens, abra o arquivo de aquisição contendo imagens hoechst (405 nm) e HNF4α (488 nm) da etapa 4.5 e crie um novo protocolo de análise.
  2. Defina comprimentos de onda a serem utilizados para segmentação nuclear (Hoechst, 405 nm) e para análise de limiar hepatócito/NPC (HNF4α, 488 nm).
  3. Ajuste os parâmetros de segmentação nuclear do software (como "área nuclear mínima" e "sensibilidade" de detecção nuclear) para garantir que os núcleos sejam segregados de forma ideal.
    NOTA: A boa segmentação dos hepatócitos deve ser priorizada sobre a dos NPCs. Os núcleos hepatócitos são caracteristicamente arredondados (faixa de tamanho interquartil: 40-64 μm2). Os núcleos NPC, como os da endotelia sinusoidal, são achatados/elípticos ou irregulares em forma e geralmente menores e mais embaladas do que as dos hepatócitos (faixa de tamanho interquartil: 30-43 μm2). Para o fígado de camundongos, foram utilizadas área nuclear mínima ≥23 μm2 e detecção de "sensibilidade" de 65% (ver Figura 2C,D para resultados esperados). A sensibilidade determina como os clusters de pixels são reconhecidos como núcleos individuais com base em sua intensidade e devem ser empiricamente testados para cada amostra definida pelo usuário antes de prosseguir com a análise automatizada de imagens.
  4. Modifique a intensidade do limiar em 488 nm para garantir a gating ideal de hepatócitos (HNF4α+) e células não parênquias (HNF4α-).
    NOTA: Consulte a Figura 2C,D para obter os resultados esperados. O valor da intensidade do limiar é relativo e dependerá da eficiência da coloração e das configurações de aquisição, como intensidade do laser. Portanto, deve ser padronizado pelo usuário. Use células HNF4α- conhecidas como células endoteliais e NPCs periportal como controle negativo interno e núcleos hepatocitos binucleares como referência positiva para a coloração. Teste os parâmetros de análise usando um pequeno número de imagens para garantir uma boa segmentação nuclear e segregação do limiar de intensidade antes de aplicar parâmetros de análise a todo o conjunto de dados.
  5. Selecione os seguintes parâmetros nucleares a serem quantificados: (1) área nuclear baseada na coloração de Hoechst (μm2), (2) intensidade média de Hoechst nuclear (RU), (3) fator de alongamento nuclear (razão média do eixo curto do núcleo ao eixo longo do núcleo, onde um objeto centro-simétrico [não alongado] tem um valor de 1, (4) Nuc 1/(fator de forma), índice de "arredondação" nuclear médio calculado pelo perímetro 2/(4π x área). Os valores variam de 1 ao infinito, onde 1 é um círculo perfeito, (5) status HNF4α (positivo-1 ou negativo-0) e (6) coordenadas nucleares x/y baseadas em "centro de gravidade" (cg), um método para localizar o centro do objeto a partir de imagens em escala de cinza com precisão de subpixel.
  6. Execute a análise de todos os conjuntos de dados da amostra e exporte dados numéricos da etapa 5.5 para o software de planilha.

6. Análise de dados

NOTA: A etapa de análise de dados pode ser realizada usando qualquer software de planilha padrão.

  1. Calcular números de células hepatocitos e não hepatócitos.
    1. Calcular a área total da seção hepática analisada para cada amostra multiplicando o número de campos de visão pela área do campo de visão (etapa 4.2).
    2. Trabalhando com arquivos de planilha gerados para cada seção hepática, filtre os dados selecionando apenas núcleos HNF4α+. Calcular o número total de núcleos HNF4α+ analisados e dividi-lo pela área total analisada para obter densidade média de hepatócitos para cada amostra (Figura 2F).
    3. Realize o mesmo cálculo para células não parêmicas filtrando a planilha para hnf4α- células(Figura 2E).
  2. Calcule a distribuição do tamanho nuclear do hepatócito.
    1. Usando software de planilha, filtre dados para selecionar apenas núcleos HNF4α+.
    2. Valores de enredo da área nuclear em um histograma (Figura 2G). Defina a largura da lixeira para 5 μm2.
      NOTA: Os valores de frequência podem ser corrigidos para área (núcleos/mm2) conforme etapa 6.1.1.
  3. Faça análise de ploididy nuclear hepatocito.
    NOTA: Os dados da planilha da etapa 5.6 são utilizados para gerar um perfil de ploididy nuclear para cada amostra. Este processo foi automatizado e pode ser realizado usando um software escrito personalizado que está livremente disponível para download com informações de suporte e conjuntos de dados de demonstração emhttps://github.com/lukeynoon(vejaArquivos Suplementares). O código fonte é fornecido para usuários que desejam adaptar a metodologia. Uma descrição do algoritmo, juntamente com as instruções de instalação e uso são descritas abaixo. O programa utiliza dados de planilhas para separar automaticamente núcleos hepatocitos em dois grupos; (1) aqueles com núcleos circulares "simples" e (2) núcleos não circulares "complexos" representativos de células binucleares com ploidiação >2c. O conteúdo mínimo de DNA nuclear (uma função da área nuclear e densidade de DNA) é o próximo calculado para todos os núcleos "simples". Um passo subseqüente então calibra automaticamente hnf4α+ hepatocyte ploidy nuclear usando hnf4α- núcleos como um controle interno 2−4N conhecido.
    1. Baixe e instale software.
      1. Baixe o aplicativo embalado em: https://github.com/lukeynoon
      2. Lançar O MATLAB. Navegue até a aba APP da viagem de ferramentas, clique em Instalar app e abra o aplicativo baixado chamado "Ploidy_Application.mlappinstall". Uma mensagem aparecerá para confirmar a instalação bem sucedida.
        NOTA: O aplicativo já está pronto para uso e permanecerá na aba APP da viagem de ferramentas.
    2. Formato de dados de entrada.
      NOTA: Antes da análise automatizada da ploididi, todos os arquivos de planilha contendo dados de imagem de alto conteúdo (etapa 5.6) devem ser armazenados e formatados de acordo com as seguintes instruções.
      1. Em cada arquivo de dados exportado (. A senha XLS 97-2004) da etapa 5.6, inclui uma planilha denominada "Medidas celulares" contendo todos os dados necessários para a análise ploidy definida nas colunas(Figura 3A). Certifique-se de que o layout da planilha, incluindo nomes de cabeçalho de coluna, permanece inalterado em relação ao da Figura 3A,porque o método de análise encontra os dados corretos da coluna pesquisando por esses nomes (consulte conjuntos de dados de demonstração em Arquivos Suplementares para referência). Se, por exemplo, o software de análise de imagens de alto conteúdo não produzir uma coluna "Fluxo de luz"(Figura 3A),insira manualmente uma coluna "Fluxo de luz" no mesmo local, ou seja, a coluna K e preencha-a com zeros.
      2. Para cada condição experimental (por exemplo, "Lesionado-d14"), forneça um conjunto de dados de controle, que será usado para calcular o controle interno para calibração de ploidia nuclear de 2-4N (passo 6.3.4.3). Aqui, selecione amostras de fígado de companheiros adultos não tratados ("Control-d0"; Figura 3B−D).
      3. Para réplicas biológicas (por condição), armazene cada planilha em sua própria pasta (como na Figura 3B). Nomeie os prefixos da pasta incrementalmente, por exemplo, "Sample1, Sample2, Sample3... SampleN", de acordo com os nomes de arquivos contidos dentro. Assim, cada pasta de conjunto de dados (por exemplo, "Control-d0") deve conter uma série de subpastas ("Sample1", "Sample2", etc.) cada uma contendo um arquivo de planilha com o mesmo nome correspondente.
    3. Execute a aplicação.
      1. Dentro do MATLAB, inicie o "Ploidy_Application" clicando no ícone dentro da guia MEUS APPS da toolstrip(Figura 3C). Aparecerá a Ploidy_Application interface gráfica do usuário (GUI)(Figura 3C).
      2. Clique no botão Caminho para controlar dados para navegar até a pasta em que os dados de controle se replicam (por exemplo, "Control-d0"). Esse caminho de dados aparecerá na interface (por exemplo, /Users/Desktop/Control-d0).
      3. Em seguida, no "prefixo de pasta" digite o nome a ser dado aos arquivos de saída (por exemplo, "Amostra").
        NOTA: Este prefixo pode ser alterado para qualquer texto, desde que as pastas e nomes de arquivos permaneçam nomeados incrementalmente.
      4. Clique no botão Caminho para outros dados e navegue até a pasta em que os dados comparativos se replicam (por exemplo, "Lesionado-d14"). Esse caminho de dados aparecerá na interface (por exemplo, /Users/Desktop/Injured-d14).
      5. Clique em Correr!. Quando a análise estiver concluída, a barra de status lerá "Análise Completa!..".
        NOTA: A aplicação informará, para cada amostra, estratificação de núcleos "simples" em ≤2n, 2n−4n, 4n−8n e 8n+ em termos de contagem absoluta e como percentual do total(Figura 3D). Esses arquivos serão salvos automaticamente em cada pasta de amostra como: "Count_2n.txt", "Count_2n_to_4n.txt", "Count_4n_to_8n.txt", "Count_8n_and_higher.txt", "Percentage_2n.txt", "Percentage_2nto4n.txt", "Percentage_4nto8n.txt", "Percentage_8n_and_higher.txt". O Ploidy_Application salvará automaticamente uma lista para cada amostra, de todas as estimativas individuais de ploidy para núcleos hepatocitos "simples" e não hepatócitos em "Ploidy_All_Hepatocytes.txt" e "Ploidy_NonHepatocytes.txt". Para o conjunto de dados de controle, o método também salva os limites mínimos de conteúdo de DNA calculados para estratificação de ploidy (ver passo 6.3.4.3.7) em um arquivo chamado "Normalised_Thresholds_Control". Finalmente, o aplicativo produzirá uma pasta tanto para o controle quanto para os dados de condição comparativa selecionados denominados "Resumo". Esta pasta contém duas subpastas, "Ploidy" e "Estratificação" que contêm as médias de todas as amostras fornecidas (Figura 3D).
    4. Descrição da metodologia.
      NOTA: A seção a seguir descreve detalhadamente a metodologia utilizada pelo software de Análise de Ploidy Nuclear. Se o usuário optar por não usar o aplicativo, essas etapas podem ser seguidas usando um software de planilha para calcular manualmente o perfil de ploidy nuclear.
      1. Núcleos separados em "simples" ou "complexos" de acordo com a mormetria nuclear.
        1. Calcular um "índice de circularidade" para todos os núcleos, definido como o "fator de alongamento" nuclear dividido pelo "Nuc 1/(fator de forma)", onde um valor de 1,0 indica um círculo perfeito.
          NOTA: "Alongamento nuclear" e "Nuc 1/(fator de forma)" são duas medidas discretas da "circularidade" de um objeto que avaliam critérios morfométricos complementares e não sobrepostos. O primeiro mede os eixos longos e curtos de um objeto, enquanto o segundo compara o comprimento do perímetro de um objeto ao de sua área. Para fortalecer a definição de circularidade nuclear utilizada neste protocolo, essas duas medidas foram combinadas em um único "índice de circularidade". Uma abordagem anterior para estimar a ploidia nuclear utilizando a metodologia descrita utilizou apenas alongamento nuclear17. Embora os resultados aceitáveis tenham sido obtidos por meio dessa abordagem, os autores observaram que um "índice de circularidade" composto melhora a discriminação de núcleos selecionados manualmente de hepatócitos mononucleares e binucleares (dados não mostrados).
        2. Classificar núcleos com índice de circularidade ≤ 0,8 como "complexos" e aqueles > 0,8 como "simples".
      2. Estimar o conteúdo de DNA "mínimo" (m) para todos os núcleos "simples".
        1. Calcular o raio nuclear (r) usando a fórmula:
        2. Calcular o volume nuclear (v) utilizando o volume de uma fórmula de esfera:
        3. Gerar um valor relativo para o conteúdo mínimo de DNA (m) usando a fórmula:
      3. Calibrar o conjunto de dados usando os núcleos NPC (HNF4α-) como um controle interno de 2-4N.
        NOTA: Os NPCs têm um conteúdo de DNA de 2-4N, dependendo do status do ciclo celular. Assim, o valor médio do conteúdo de DNA "mínimo" do NPC (NPCm)aumenta com a lesão(Figura 4A). O erro de calibração é minimizado estabelecendo um limite superior de NPCm representando um limiar de 4c(Figura 4B).
        1. Dentro da planilha, selecione apenas núcleos NPC com valores para "m" que estejam dentro de 1 desvio padrão (SD) do modo (isso filtra o ruído de um possível erro de segmentação).
        2. Dentro deste intervalo filtrado, examine as áreas nucleares e suas intensidades médias correspondentes de Hoechst(Figura 4C).
        3. Estimar a menor área nuclear dentro desta faixa filtrada com intensidade máxima nuclear de Hoechst (ou seja, o ponto em que a linha da curva muda de direção no conjunto de dados filtrado, conforme ilustrado pelo círculo vermelho na Figura 4C). Este valor representa um estado transitório de 2N−4N (t) acima do qual a amostragem de núcleos 4c predomina sobre núcleos 2c, resultando em uma máxima de intensidade média de Hoechst.
          NOTA: Este valor é automaticamente determinado pelo software; no entanto, os usuários de planilha podem selecionar manualmente este ponto como o tamanho de transição.
        4. Calcule o teor mínimo de DNA representado por esse tamanho transitório (tm) seguindo o passo 6.3.4.2.
        5. Para estimar o ombro 4N do conjunto de dados NPCm, adicione 1 SD ao valor de tm. O número resultante(Figura 4B) descreve o limite superior do conteúdo mínimo de DNA do NPC a ser usado para estratificação de ploidia nuclear (S4c).
        6. Repita as etapas 6.3.4.3.1−6.3.4.3.5 para todas as amostras de "controle".
          NOTA: Por exemplo, na Figura 3,fígados de controle ilesos ("Control-d0") são usados como condição de controle.
        7. Calcule um limiar médio de estratificação de 4c (S4c) para amostras de "controle" e use-o para extrapolar os limites 2c (S2c) e 8c (S8c) para o conteúdo mínimo de DNA (m). Os limiares de estratificação são gerados automaticamente e armazenados pelo software (etapa 6.3.3.3).
          NOTA: Dependendo do desenho do estudo, os valores médios do limiar de estratificação podem ser calculados para cada condição ou para condições específicas (por exemplo, fígado de controle saudável). No entanto, o software Nuclear Ploidy Analysis requer que um de um conjunto de 2 arquivos seja designado como "controle" para fins de cálculo de valores ploidy relativos.
        8. Calcule um valor ploidy para todos os núcleos usando o valor S2c gerado na etapa 6.3.4.3.7 conforme:
        9. Estrateie os núcleos hepatocitos "simples" (HNF4α+) em suportes 2c/4c/8c/>8c de acordo com os seguintes critérios: "2c" HNF4α+ = p ≤ 2; "4c" HNF4α+ = 2 < p ≤ 4; "8c" HNF4α+ = 4 < p ≤ 8; ">8c" HNF4α+ = 8 < p.
        10. Para reconstruir a padronização espacial dos subgrupos ploidiais, separe os dados nucleares dentro de cada planilha amostral de acordo com os campos correspondentes em que foram adquiridos. Em seguida, use coordenadas nucleares x/y associadas (a partir da etapa 5.5) para traçar subgrupos ploidiais em 2D (Figura 5C).

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Representative Results

Este método tem sido utilizado para medir o impacto da lesão colestática no fígado de camundongos adultos, alimentando animais por 0-21 dias com uma dieta hepatotóxica contendo 0,1% 3,5-dietoxicarbonilo-1,4-dihidrocollidina (DDC)17. A alimentação crônica de DDC resulta em lesão hepatocelular aumento da ploidia e expansão periportal de NPCs. O usuário deve estar ciente de que a tensão do camundongo e as diferenças dependentes da idade podem existir na ploidiiie nuclear e que todas as análises foram realizadas usando camundongos c57BL/6 adultos com idade entre 12 e 16 semanas.

Após a imunorotulagem HNF4α (seção de protocolo 3), é importante verificar todos os slides utilizando microscopia convencional de fluorescência, para garantir uma boa fixação e coloração de boa qualidade(Figura 2A). A mancha ou desfoque de Hoechst pode indicar fixação inadequada ou degradação da amostra antes da fixação(Figura 2B),nesse caso retornar à seção de protocolo 2 e encurtar o tempo entre secção e fixação (etapa 3.1). A imunorotulagem bem sucedida com o anticorpo HNF4α pode ser facilmente julgada nesta fase por clara discriminação de núcleos hepatócitos rotulados positivamente, tipicamente maiores e mais arredondados do que os dos NPCs(Figura 2A). Núcleos endoteliais achatados/elípticos dentro do parênquima, ou manchas densas de células que se expandem em áreas de periportal após a lesão do DDC podem servir como uma referência visual útil para identificar HNF4α- NPCs ao avaliar o sucesso/falha da imunocoloração.

A segregação nuclear e os parâmetros limiares HNF4α (etapas 5.2-5.4) devem ser cuidadosamente otimizados antes da análise automática da imagem (etapa 5.6) para refletir amplamente o padrão visual de imunocoloração observado pela microscopia convencional de fluorescência no final da seção de protocolo 3(Figura 2C). Exemplos de segmentação nuclear ótima vs subótima e protocolos limiares HNF4α são resumidos na Figura 2D. Após a análise de imagem (etapa 6.1.3), os dados devem refletir o aumento do número de NPCs no fígado com lesão de DDC(Figura 2E),de 52% ± 2,0% dos núcleos no controle de fígados para 72,8% ± 1,4% após 21 dias de tratamento de DDC. Os hepatócitos representam 48,0% ± 2,0% dos núcleos totais em fígados de controle, concordando com análises anteriores da histologia hepática mostrando que os hepatócitos ocupam 70-85% do volume tecidual, mas apenas 45-50% do total das células hepáticas18,19. Observa-se uma pequena, mas significativa redução no número de núcleos HNF4α+ durante os primeiros 14 dias de alimentação ddc (Figura 2F). Um gráfico de distribuição de freqüência da área nuclear hepatocito (etapa 6.2) mostra um pico de área nuclear HNF4α+ em fígados de controle na faixa de tamanho de 40-50 μm2, e uma clara mudança direita no tamanho nuclear após a lesão do DDC(Figura 2G); consistente com aumento da ploididez e hipertrofia hepatocelular12.

Em fígados de controle saudáveis (dia 0), 63,4% ± 1,7% dos núcleos HNF4α+ possuem uma mormetria circular "simples"(Figura 5A). Este número diminui para 46,8% ± 5,7% (P = 0,042) após 21 dias de lesão do DDC, refletindo o aumento da complexidade na morfometria nuclear presumivelmente associada à mudança entre estados ploides durante a poliploidização (ver "Interpretação da morfometria nuclear" abaixo). Exemplos representativos de distribuições de ploidia nuclear obtidas usando este método em seções hepáticas de controle são mostrados na Figura 5A, que descreve como a interpolação do conteúdo de DNA permite a estratificação de células individuais dentro de uma única amostra. Os valores médios para subconjuntos de células HNF4α+ "complexas" e "simples" também são mostrados (Figura 5A). Os dados são consistentes com estimativas anteriores de poliplóide em 80-90% dos hepatócitos de murinaadultos 2. A frequência de núcleos complexos (36,6% ± 1,7%) em fígados de controle também se aproxima do das células binucleares (35%)20, embora os dados devem ser estritamente considerados como uma medida de ploidianuclear em vez de celular (ver "Interpretação da morfometria nuclear" abaixo). A comparação entre os grupos tratados com controle (dia 0) e DDC deve refletir perda significativa de núcleos hepatocitos 2c e 4c com lesão, juntamente com o aumento do número de células >8c(Figura 5B). Informações posicionais relativas para cada subgrupo ploidy podem ser interrogadas por gráfico de dispersão de coordenadas x-y associadas a cada núcleo dentro do conjunto de dados ou pela recuperação da localização 2D de subconjuntos hepatócitos específicos dentro do software de análise de imagens de alto conteúdo(Figura 5C).

Calibração
Para avaliar a validade do método de calibração do NPC utilizado, foi realizada a dupla imunorotulagem das seções hepáticas utilizando anticorpos para HNF4α e marcador proliferativo Ki-67 (Figura 6A,B). Esses dados mostraram enriquecimento para o Ki-67, que rotula as células em todas as fases ativas do ciclo celular, no lado direito da curva de distribuição mínima de DNA NPC (entre S2c e S4c) - onde os NPCs deveriam estar replicando DNA e, portanto, ter >2c ploidy(Figura 6A). Após calibração interna de todo o controle e amostras de fígado feridas estudadas, Ki-67, foi significativamente enriquecido (P < 0,0001) em núcleos NPC "simples" com ploidy estimado de >2c (82,5% ± 6,6% SD, n = 12) em comparação com aqueles com ≤2c ploidy (17,5% ± 6,6% SD, n = 12)(Figura 6B), indicando ploidy bem-sucedido Esses dados suportam a validade do método utilizado. Além disso, assumindo um limiar preciso do Ki67, eles fornecem alguma visão quantitativa sobre até que ponto as máscaras nucleares subequatoris de grupos ploidiais mais altos "contaminam" grupos abaixo.

Para testar ainda mais a validade do método de calibração NPC, foi introduzido um calibrador externo com base no volume nuclear anteriormente relatado de hepatócitos do rato 2N (155,8 μm3)14. Quando este valor foi utilizado em combinação com um valor médio de intensidade de Hoechst para HNF4a- núcleos a estimativa resultante para ploidy hepatocito médio nos fígados de controle foi indistinguível da do calibrador interno (S2c)(Figura 6C). Além disso, as estimativas de ploidy hepatocito médio em camundongos da cepa c57BL/6 de idade comparável, também foram semelhantes, confirmando que o conhecimento empírico prévio do tamanho nuclear hepatocito 2N não é necessário, tornando esta metodologia internamente controlada para estimar ploidy nuclear totalmente autônomo.

Interpretação da mormormetria nuclear
O método descrito fornece uma leitura ploidy para núcleos hepatocitos com mormetria circular "simples". A exclusão de núcleos "complexos" baseia-se na hipótese de que eles representam uma proporção de hepatócitos binucleares com máscaras nucleares sobrepostas/tocadas, tornando a determinação precisa para este subconjunto mais desafiadora(Figura 7A). É importante ressaltar que a segregação dos núcleos de acordo com a circularidade não permite ao usuário distinguir entre os núcleos de hepatócitos mononucleares e os de células binucleares, nos quais dois núcleos de ploidia semelhantes são claramente separados dentro da célula. Isso foi testado empiricamente selecionando manualmente células binucleares e mononucleares dos conjuntos de dados de imagem e avaliando sua segregação pelo algoritmo(Figura 7B). Núcleos de hepatocitos binucleares que eram fisicamente próximos (Figura 7C) mas "não tocar" foram categorizados pelo algoritmo como "simples", enquanto aqueles que eram "toques" eram claramente discriminados como "complexos". Portanto, este ensaio não fornece uma leitura de ploidiacelular no fígado, dado que os núcleos das células binucleares são subdivididos entre as subclasses "simples" e "complexas" (ver Discussão). No entanto, algumas percepções sobre a mudança entre estados de ploidiiie celular e nuclear podem ser obtidas a partir desses dados simplesmente plotando histogramas de morfogia nuclear e tamanho nuclear e aplicando um modelo de como estados "complexos" e "simples" são transicionados entre durante a poliploidização(Figura 7D). No controle de fígados são claramente observadas três fases (I−III) de mormetria nuclear (Figura 7E). Eles representam o agrupamento de máscaras nucleares circulares 2N (I), 4N (II) e 8N (III) respectivamente (conforme ilustrado na Figura 7D). Hepatocitos mononucleares 16N são extremamente raros em fígados de camundongos adultos16,18,21, daí o grupo de ploidy celular 16N é composto quase inteiramente de células binucleares com núcleos 8N, localizados dentro, e à direita, da fase III ( Figura7E), explicando a queda da circularidade à direita da fase III. Curiosamente, após a lesão (Dia 14 dDC), uma mudança quantitativa para o aumento da complexidade ("binuclearidade") começa nas fases I (refletindo 2n a 2x2n) e fases III (refletindo 8n a 2x8n), antes de finalmente se consolidar em todas as três fases (I−III). Os autores especulam que essa mudança para o aumento da complexidade deve-se ao aumento da ploididez celular resultante da citocinese paralisada, enquanto à direita da fase III observa-se a tendência oposta, devido ao aumento da representação de células mononuclearcirculares de 16N no fígado lesionado devido à endoreplicação. Essas observações, naturalmente, precisarão ser testadas adaptando o método para explicar adequadamente a ploidia celular (ver Discussão).

Figure 1
Figura 1: Resumo do fluxo de trabalho. O tecido hepático é colhido (1),criosecção(2),fixo e imunorotulado com um anticorpo HNF4α permitindo que as células parênquicas e não parênquicas (NPCs) sejam discriminadas(3). Uma vez processadas, as amostras são digitalizadas usando uma plataforma de imagem de alto conteúdo usando captura automatizada de imagens (4) e análise(5). As células são segmentadas pela fluorescência nuclear de Hoechst e pelo limiar de imunofluorescência HNF4α. Em seguida, a área nuclear de Hoechst ("A") e a circularidade ("C") são calculadas. Por fim, os dados são analisados (6); Os núcleos hepatocitos HNF4α-NPCs são quantificados (i) e os núcleos hepatocitos HNF4α+ são separados em dois subconjuntos ("simples" e "complexos") de acordo com a circularidade nuclear (ii). A interpolação da ploidiide nuclear hepatocito é então realizada para todos os núcleos "simples" em função do raio nuclear (r) e a intensidade média da fluorescência de Hoechst (como proxy para a densidade do DNA nuclear) (iii). Os dados são então estratificados usando NPCs como um calibrador interno de 2N (iv) antes de compilar um resumo da amostra (v). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Análise de imagem de alto conteúdo e perfil citométrico do fígado do camundongo durante a alimentação crônica do DDC. (A) Imagem confocal representativa da coloração de imunofluorescência hnf4α/hoechst do fígado de camundongo adulto após 21 dias de alimentação com uma dieta contendo 0,1% dDC; imagem mostra núcleos hepatocitos HNF4α+ arredondados ("H") e expansão de HNF4α-NPCs em áreas ao redor da veia portal ("PV"). (B) Exemplos de coloração nuclear de Hoechst ("correto") e subótima ("incorreta") indicando má fixação. (C) Utilização de plataforma de análise de imagens de alto throughput para segregar hepatócitos e NPCs de acordo com a coloração nuclear de Hoechst e a imunorotulagem HNF4α. As máscaras de software (linhas vermelhas/verdes) mostram como os núcleos são corretamente segmentados de acordo com a fluorescência de Hoechst e classificados em hepatócitos (+) ou NPCs (-) de acordo com o status HNF4α. (D) Um guia para otimizar a configuração para análise de segmentação/limiar. As máscaras nucleares sobrepostas reconhecidas pelo software são indicadas por linhas verde/azul para segmentação nuclear e verde/azul (HNF4α+) ou vermelho/azul (HNF4α-) para análise de limiar (H = hepatocito). Solução de problemas: A sensibilidade à detecção nuclear é muito baixa (i) ou muito alta (ii). Limiar para HNF4α definido muito baixo (iii), ou muito alto (iv). (E,F) A análise quantitativa dos núcleos de NPC e hepatocito durante a alimentação do DDC: (E) HNF4α- e (F) HNF4α+ densidades nucleares são comparadas com o tempo de tratamento ddc (dias). Foram analisadas 5,7 x 105 células, de 4 a 6 animais por ponto de tempo. Os dados são apresentados como média + SEM. **P < 0,01 e ***P < 0,001. A ANOVA unidirecional foi usada para comparar meios. Os valores de Significância P foram calculados utilizando-se o teste de diferença menos significante (LSD) de Fisher. (G) Distribuição de frequência da área nuclear HNF4α+ durante o tratamento de DDC. Os dados mostram uma mudança à direita na área nuclear hepatocito durante a lesão consistente com hipertrofia celular e poliploidização. Foram analisados um total de 2,5 x 105núcleos HNF4α+, de 4 a 6 animais por ponto de tempo. Esta figura foi modificada de Manzano-Núñez et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Análise automatizada da ploidiiiie nuclear hepatocito usando software escrito personalizado. (A) Captura de tela mostrando a formatação correta dos dados da planilha para entrada no software de análise de ploidy nuclear. As colunas contendo dados essenciais (etapa 5.5 do protocolo) são destacadas em amarelo. Todos os títulos das colunas devem corresponder precisamente aos indicados. (B) Captura de tela mostrando como os arquivos de planilha individual contendo dados de réplicas biológicas ("Sample1", "Sample2", etc.) devem ser nomeados e organizados em subpastas para cada condição (intitulado "Control-d0" e "Injured-d14" neste exemplo). (C) Captura de tela após a instalação bem sucedida do aplicativo ploidy (círculo vermelho). Quando o aplicativo é lançado (clicando em "Ploidy_Appl..") na guia MEUS APLICATIVOS da toolstrip o "Ploidy_GUI" aparece (painel inferior). O nome do experimento ("Amostra") e os caminhos para os conjuntos de dados de controle (por exemplo, "Control-d0") e teste (por exemplo, "Lesionado-d14") são inseridos antes de clicar em Executar. O software então calcula, calibra e estratifica ploidia nuclear para todas as amostras usando o conjunto de dados "Control-d0" para gerar limiares para conteúdo mínimo de DNA. (D) A saída de dados de Ploidy_Application mostra arquivos de dados individuais salvos automaticamente em cada pasta de amostra (i) contendo números absolutos e percentuais de núcleos "simples" em cada grupo ploidy. Para cada condição (neste caso, tanto "Control-d0" quanto "Injured-d14"), uma pasta de resumo também é gerada automaticamente contendo estimativas médias de ploidy nuclear para todos os núcleos hepatocitos "simples" e não hepatocitos (ii) e uma descrição de como a ploidy nuclear é estratificada para cada amostra (iii). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: O uso de NPCs como calibrador interno de ploidia. (A) Gráfico mostrando o impacto da lesão do DDC no conteúdo mínimo de DNA médio (m) dos núcleos hepatocito (HNF4α+) e NPC (HNF4α-). Todos os dados são normalizados até o dia 0 NPCs (n = 4 animais por ponto de tempo). (B) Histograma descrevendo a distribuição dos valores de NPCm em uma única amostra de fígado representativa (dia 0, total de 7.180 núcleos). O esquema (acima) mostra como máscaras Circulares NPC podem derivar de células com um conteúdo de DNA de 2 a 4c. O objetivo do método de calibração é definir o limiar de estratificação representando 4c (S4c) no limite superior da distribuição NPCm (linha pontilhada), minimizando o ruído devido a erros de segmentação nos extremos da curva de distribuição. (C) Alterações na intensidade média de Hoechst e na área nuclear para núcleos NPC (HNF4α-) são plotadas. Para evitar erro de segmentação, somente os núcleos com um valor npcm correspondente dentro de 1 SD do valor NPCm da modalidade são examinados (caixa amarela). Dentro deste intervalo, o tamanho de transição 2c-4c (t) é calculado e usado como ponto de ancoragem dentro dos dados para estimar o S4c. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Alta produtividade na análise situ da ploidy nuclear no fígado do camundongo durante a alimentação crônica do DDC. ( A) Análise do controle do fígado adulto utilizando a metodologia descrita. Os núcleos hepatocitos HNF4α+ de seções hepáticas 2D são subdivididos de acordo com a circularidade nuclear de Hoechst em dois grupos: "simples" e "complexo". (Topo) Imagens representativas de fluorescência Hoechst de células pertencentes a esses dois grupos são mostradas. (Esquerda) Dispersão mostrando estratificação de núcleos hnf4α+ simples de uma amostra (dia 0) de acordo com o valor de ploidy interpolado, área nuclear e intensidade média de Hoechst nuclear. (À direita) Gráfico de torta detalhando a típica decomposição de células HNF4α+ no fígado de controle (dia 0) indicando as proporções de cada subclasse ploidianuclear. Foram analisados um total de 6,7 x 104 núcleos HNF4α+ de 4 animais. (B) Impacto da lesão hepática ddc na ploidiy nuclear hepatocito por alta produtividade na análise situ. Os gráficos demonstram a diminuição relativa na proporção de núcleos hepatocitos 2c e 4c nos primeiros 14 dias de alimentação do DDC, enquanto os núcleos poliplóides de >8c aumentam drasticamente o número. Foram analisados um total de 1,5 x 105 núcleos HNF4α+ (n = 4 animais por ponto de tempo). Os dados são apresentados como média + SEM. **P < 0,01 e ***P < 0,001. A ANOVA unidirecional foi usada para comparar meios. Os valores de Significância P foram calculados usando o teste de comparação múltipla de Tukey. (C) Exemplo para mostrar como as subclasses ploidiais nucleares podem ser rastreadas espacialmente dentro do parênquima usando este método, interrogando dados de imagem de alto teor com os mesmos critérios quantitativos utilizados para estratificação ploidy (circularidade, tamanho nuclear e intensidade média de Hoechst). As imagens de fluorescência de hoechst são mostradas com máscaras de software (pontos vermelhos) marcando núcleos 2c no fígado em dois pontos de tempo durante a alimentação crônica do DDC (dias 14 e 21). Veia portal (linha pontilhada azul) e áreas de periportal em que os NPCs se expandem (linha amarela) são indicados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Avaliação crítica do método de calibração do NPC. (A,B) Os NPCs proliferantes são categorizados com sucesso com uma pontuação ploidy >2c. (A) Histograma de conteúdo mínimo de DNA NPC de fígados de controle imunorotulados com anticorpos para HNF4α e marcador proliferativo Ki-67 (n = 4, os dados são apresentados como média + SEM). Os limiares de estratificação para 2c (S2c) e 4c (S4c) são indicados. (B) A estratificação dos NPCs de acordo com a metodologia descrita resulta em um enriquecimento significativo da imunorotulagem Ki-67 em núcleos atribuídos a >2c escore ploidy (n = 12). Os dados são apresentados como média + Teste t sem pareamento foi utilizado para comparar os meios ****P < 0,0001. (C) Validação externa do método de calibração NPC. As estimativas de ploididy nuclear hepatócito médio obtida susceptinos utilizando-se o método interno do calibrador NPC foram comparadas às obtidas pela calibração das mesmas amostras (Controle C57BL/6 fígado de camundongos 3-4 meses, n = 4) com volume nuclear conhecido para 2N hepatocitos14. Os dados também são apresentados a partir de duas análises independentes21,22 descrevendo ploidianuclear hepatocito de camundongos da mesma cepa na idade de 2 a 6 meses (mostrado à direita da linha pontilhada). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: A mormetria nuclear hepatocito tem uma relação "complexa" com a ploidia celular. (A) Resumo de como a ploididiia celular hepatocito (2N, 4N, 8N e 16N) é parcialmente segregada pela análise 2D da mormetria nuclear. As células binucleares (vermelhas) são subdivididas entre morfometrias "simples" ("S") e "complexas" ("C"), dependendo se os núcleos parecem estar tocando ou não. (B,C) Os hepatócitos individuais foram selecionados manualmente e analisados para mormetria nuclear e espaçamento internuclear. (B) Os hepatócitos binucleares com núcleos "tocantes" eram "complexos" (100% ≤0,8), enquanto as células mononucleares (pretas) e os hepatócitos binucleares com máscaras nucleares não tocantes eram "simples" (94% >0,8). ( C) Núcleos "simples" de hepatócitos binucleares poderiam ser distinguidos daqueles de células mononucleares por conta do espaçamento internuclear significativamente reduzido (n = 3, total de 94 núcleos analisados). (D) Modelo que aproxima como os estados de ploidy celular do painel A podem ser distribuídos em termos de mormetria nuclear 2D e área nuclear, resultando em agrupamento de formas circulares simples em quatro fases (I−IV). (E) Comparação das parcelas de mormetria/tamanho nuclear HNF4α+ em fígados de controle (dia 0) e após 14 dias (esquerda) e 21 dias (direita) de lesão ddc. As fases de morfogada são indicadas acima (I−V). As setas indicam mudanças na mormetria nuclear resultantes de lesões consistentes com a binuclearização de núcleos 2c ("a"), 4c ("b") e 8c ("c"), juntamente com o aumento da mononuclearização da classe ploidy celular 16N (d). Total de 29-30 x 103 núcleos analisados por condição (n = 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivos suplementares: Conjuntos de dados de demonstração. Clique aqui para ver esses arquivos.

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Discussion

Uma abordagem de alto teor e alto throughput para a análise da remodelagem de tecidos e estimativa da ploidiiiiiie nuclear hepatocito no fígado de murina é descrita. Uma vez familiarizado com o procedimento, o usuário pode processar, imagem e analisar várias amostras em um período de 3 a 5 dias, gerando grandes conjuntos de dados técíveis que fornecem uma assinatura detalhada da saúde hepática. Dada a simplicidade do método de preparação da amostra, juntamente com o grande número de células e área tecidual analisada (em média 14 mm2/amostra), os resultados são robustos e altamente reprodutíveis. A automação da captura e análise de imagens também remove o erro do usuário e o viés potencial dessas etapas importantes. Uma inovação importante é o uso de NPCs como um calibrador de ploidiato interno que permite a avaliação relativa do conteúdo de DNA nuclear hepatócito dentro e entre amostras. A incorporação de uma etapa de rotulagem HNF4α é, portanto, fundamental para fornecer a este protocolo uma vantagem técnica única em comparação com os métodos 2D publicados anteriormente3,12,22. Em contrapartida, a relativa simplicidade da metodologia em comparação com os fluxos de trabalho de reconstrução 3D18 torna-a tecnicamente menos trabalhosa e potencialmente mais flexível.

Em comparação com o método de precisão da citometria de fluxo, uma importante ressalva à extrapolação do conteúdo de DNA nuclear de seções de tecido 2D, é a confiança limitada que pode ser atribuída à categorização de núcleos individuais no que diz respeito ao status ploide. Soma-se a isso o viés inerente dentro das abordagens baseadas no SIA para superrepresentar subgrupos menores de ploidia devido à amostragem subequatorial. No entanto, ao normalizar os dados para um padrão interno e tomar uma abordagem de grande base populacional, o erro devido a esses efeitos é mitigado e comparável entre as amostras. Os hepatócitos são caracterizados por uma morfologia nuclear altamente arredondada, comparada a, por exemplo, NPCs, o que significa que são particularmente passíveis de estimativa precisa do conteúdo de DNA baseado apenas na área transversal nuclear10,11,14,15,23. A abordagem baseada em SIA foi refinada neste protocolo para explicar tanto a circularidade nuclear quanto a densidade do DNA, integrando medidas de mormetria e intensidade média de fluorescência de Hoechst, resultando em um descritor estimado de "conteúdo mínimo de DNA" para núcleos individuais. É importante ressaltar que o uso de NPCs como controle ploidiano de 2-4N fornece um importante padrão interno para calibração objetiva e estratificação de conteúdo mínimo de DNA nuclear, tornando a metodologia descrita aplicável a amostras de qualquer espécie, ou formato, dado que um anticorpo apropriado para HNF4α (ou marcador nuclear hepatocito semelhante) pode ser originado.

Embora a avaliação da ploidy nuclear tenha sido demonstrada para fornecer assinaturas úteis para a progressão da doença hepática10,13, a fim de verificar completamente a diversidade de alterações ploidianas dentro do fígado seria desejável e necessário adaptar a metodologia descrita para explicar o perímetro hepatocelular e, portanto, a ploidy celular. O mapeamento da ploididy celular já foi obtido pela rotulagem do perímetro hepatócito utilizando marcadores como beta catenina10,,13,24, actina12,22 e citoquexina10,11 em amostras de fígado humano e camundongo. No entanto, quando este foi testado após a lesão do DDC, a remodelagem epitelial dramática impediu a avaliação confiável do perímetro hepatocelular tanto por faloidin (dados não mostrados) quanto por anticorpos para beta catenina17. Portanto, embora essa abordagem seja viável, pode não ser aplicável a todos os modelos de lesões, mas se alcançada o mapeamento antecipado da ploididie celular, bem como fazer estimativas do tamanho e número de hepatócitos mais precisos. Também permanece plausível que, contabilizando parâmetros nucleares adicionais, como o espaçamento internuclear(Figura 7C),as células mononucleares possam ser discriminadas a partir de hepatócitos binucleares "simples", e que uma maior segregação de células binucleares "complexas" poderia ser alcançada por medidas radiais dos núcleos que suas máscaras 2D contêm.

Dado que existem anticorpos HNF4α humanos validados para o tecido FFPE25 e que a calibração interna libera essa metodologia de quaisquer limitações específicas da espécie, o protocolo é quase imediatamente aplicável às amostras humanas. Assim, tem um potencial considerável para fornecer uma referência para a análise de alto rendimento da ploidiiie nuclear hepatocito e lesão hepática em doenças humanas. Além disso, ao multiplexar com outros anticorpos, este método pode revelar novos papéis para subconjuntos hepatócitos particulares e sua resposta à lesão hepática e doença. Para isso, combinamos com sucesso a metodologia com a imunocoloração para o marcador nuclear proliferativo Ki-67 (Figura 6),que permite que informações úteis sejam obtidas - incluindo a identificação de populações 2N não proliferantes de NPCs para melhor calibração interna da ploidiiy (Meio-dia, dados não publicados 2019). Assim, ao acoplar flexibilidade com os dados posicionais e quantitativos que o método fornece, sugerimos que suas futuras aplicações melhorarão a compreensão do papel da poliploidy no fígado.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Governo de Mineco espanhol concede bfu2014-58686-P (LAN) e SAF-2017-84708-R (DJB). A LAN foi apoiada pelo prêmio nacional MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 e plan GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) e FMN por uma estudantil regional ValI+D da Generalitat ACIF/2016/020. Rp gostaria de reconhecer o Prof. Ewa K. Paluch para financiamento. Agradecemos à Dra. Alicia Martínez-Romero (serviço citometria da CIPF) pela ajuda com a plataforma IN Cell Analyzer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) TestDiet 1810704 Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) Invitrogen A11055 Dilution 1:500
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cryostat Leica CM1850 UV Leica biosystems CM1850 UV Tissue sectioning
Fluorescent Mounting medium Dako S3023
GraphPad Prism GraphPad Software Prism 8 Statistical software for graphing data
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Final concentration 5 µg/mL
IN Cell Analyzer 1000 GE Healthcare Bio-Sciences Corp High-Content Cellular Imaging and Analysis System
MATLAB MathWorks R2019a Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy
Microscope coverslides VWR International 630-2864 Size of 24 x 60 mm
Microsoft Office Excel Microsoft Speadsheet software
OCT Tissue Tek Pascual y Furió 4583
Paraformaldehyde Panreac AppliChem 141451.121
Pen for immunostaining Sigma-Aldrich Z377821-1EA 5mm tip width
Polysine Microscope Slides VWR International 631-0107
Rabbit polyclonal Anti-HNF4α Thermo Fisher Scientific PA5-79380 Dilution 1:250 (alternative)
Rabit polyclonal Anti-HNF4α Santa Cruz Biotechnology sc-6556 Dilution 1:200 (antibody used in the study)
Tween 20 Sigma-Aldrich P5927

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References

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Medicina Edição 158 fígado poliplóide hepatócito imagem de alto teor hepatologia fator nuclear hepatócito 4 alfa (HNF4α)
Um método de alta produtividade in situ para estimação da ploidiii y nuclear hepatocida em camundongos
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Manzano-Núñez, F., Peters, R., Burks, D. J., Noon, L. A. A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice. J. Vis. Exp. (158), e60095, doi:10.3791/60095 (2020).

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