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Medicine

Un metodo ad alto throughput in Situ per la stima della ploidia nucleare epatica nei topi

Published: April 19, 2020 doi: 10.3791/60095
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1,3
1Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)

Summary

Vi presentiamo un metodo robusto, conveniente e flessibile per misurare i cambiamenti nel numero di epatociti e nella ploidia nucleare all'interno di campioni di tessuto fisso/crioconservato che non richiede citometria di flusso. Il nostro approccio fornisce una potente firma a livello campione di citologia epatica ideale per monitorare la progressione delle lesioni epatiche e della malattia.

Abstract

Quando il fegato è ferito, il numero di epatociti diminuisce, mentre le dimensioni della cellula, le dimensioni del nucleare e l'aumento della ploidia. L'espansione di cellule non parenchychymal come cholangiociti, miofibromi, progenitori e cellule infiammatorie indicano anche danni epatici cronici, rimodellamento dei tessuti e progressione della malattia. In questo protocollo, descriviamo un semplice approccio ad alto contenuto di velocità per calcolare i cambiamenti nella composizione cellulare del fegato che sono associati a lesioni, malattie croniche e cancro. Mostriamo come le informazioni estratte dalle sezioni di tessuto bidimensionali (2D) possono essere utilizzate per quantificare e calibrare la ploidia nucleare degli epatociti all'interno di un campione e consentire all'utente di individuare specifici sottoinsiemi di ploidia all'interno del fegato in situ. Il nostro metodo richiede l'accesso a materiale epatico fisso/congelato, reagenti di immunocitochimica di base e qualsiasi piattaforma di imaging standard ad alto contenuto. Serve come una potente alternativa alle tecniche di citometria di flusso standard, che richiedono l'interruzione del tessuto appena raccolto, la perdita di informazioni spaziali e potenziale pregiudizio di disaggregazione.

Introduction

Gli epatociti nel fegato dei mammiferi possono sottoporsi a citocinesi bloccata per produrre cellule binucleari, e l'endoreplicare del DNA per produrre nuclei poliploidi contenenti fino a 16N contenuto di DNA. Aumento complessivo della ploidia cellulare e nucleare durante lo sviluppo postnatale, l'invecchiamento e in risposta a diversi stress cellulari1. Il processo di poliploidizzazione è dinamico e reversibile2, anche se la sua precisa funzione biologica rimane poco chiara3. L'aumento della ploidia è associato alla ridotta capacità proliferiva4,alla diversità genetica2,all'adattamento alle lesioni croniche5 e alla protezione del cancro6. Le alterazioni della ploidia epatocita si verificano a seguito del ritmo circadiano alterato7e dello svezzamento8. In particolare, il profilo ploidiario del fegato è alterato da lesioni e malattia9, e prove convincenti suggeriscono che cambiamenti specifici ploidiari, come aumento dei nuclei di 8N dollari o perdita di 2N epatociti, forniscono firme utili per monitorare la progressione della malattia grassa non alcolica (NAFLD)3,10, o l'impatto differenziale delle infezioni virali11.

In termini generali, le lesioni e la rigenerazione del fegato sono associate all'aumento delle dimensioni delle cellule epatociti e dell'area nucleare12,insieme alla riduzione del numero complessivo di epatociti, in particolare quelli con 2N contenuto di DNA10,11. La lesione parenchimale nel fegato è spesso accompagnata anche dall'espansione di cellule non parenchymal (NPC), tra cui miofibromi stromali, cellule infiammatorie e cellule progenitrici epatiche bipotenti. I metodi ad alto contenuto di velocità di sviluppo che forniscono un profilo citologico quantitativo del numero di cellule parenchiche e della ploidia nucleare, pur tenendo conto dei cambiamenti nei PNG, hanno quindi un notevole potenziale come ricerca e strumenti clinici per monitorare la risposta del fegato durante lesioni e malattie. Icodraggi recenti analisi in situ degli spettri ploidi in campioni umani di carcinoma epatocellulare dimostrano anche che la ploidia nucleare è drammaticamente aumentata all'interno dei tumori ed è specificamente amplificata in sottotipi tumorali più aggressivi con ridotta differenziazione e perdita di TP5313. Pertanto, vi è una forte possibilità che i progressi metodologici nella valutazione quantitativa della ploidia nucleare contribuiscano alla profilazione prognostica futura del cancro del fegato.

In questo protocollo, viene descritta una metodologia flessibile ad alto rendimento per l'analisi comparativa delle sezioni del tessuto epatico del topo, che fornisce una profilazione citometrica dettagliata dei numeri di epatociti, la risposta NPC e un metodo calibrato internamente per la stima della ploidia nucleare (Figura 1). Gli epatociti si distinguono dai PNG per immunoetichettazione del fattore nucleare 4 alfa (HNF4) del fattore nucleare dell'epatocite, prima della caratterizzazione delle dimensioni nucleari e della morfometria nucleare. Il "contenuto minimo di DNA" è stimato per tutte le maschere nucleari circolari integrando l'intensità media di Hoechst 33342 (un proxy per la densità del DNA) con volume nucleare tridimensionale interpolato (3D). Il contenuto minimo di DNA di Epatocite viene quindi calibrato utilizzando i PNG per generare un profilo di ploidia nucleare.

L'acquisizione di immagini, la segmentazione nucleare e l'analisi delle immagini vengono eseguite utilizzando l'imaging ad alto contenuto, consentendo la screening di ampie aree di sezioni epatiche bidimensionali (2D) contenenti decine di migliaia di cellule. Viene fornito un programma scritto su misura per la post-elaborazione automatica di dati di analisi delle immagini ad alto contenuto per produrre un profilo di ploidia a livello di campione per tutti i nuclei circolari di epatociti. Questa operazione viene eseguita utilizzando software gratuito per scaricare per calcolare la ploidia nucleare basata sull'analisi stereologica delle immagini (SIA)10,11,14,15. La metodologia SIA è stata precedentemente convalidata dalla citometria di flusso come un metodo accurato, anche se laborioso, per stimare la ploidia nucleare epatocitica nel fegato14, assumendo una morfologia nucleare circolare e una relazione monotonica tra dimensione nucleare e contenuto di DNA. In questo protocollo, entrambi i parametri nucleari sono misurati mediante valutazione della morfometria nucleare e dell'etichettatura Hoechst 33342. Il calcolo del "contenuto minimo di DNA" per ogni maschera nucleare è seguito dalla calibrazione della ploidia nucleare epatocite utilizzando NPC, che hanno un noto 2-4N contenuto di DNA e quindi servono come un utile controllo interno.

Rispetto ai metodi convenzionali di citometria di flusso16, l'approccio descritto consente di valutare la ploidia nucleare epatocite in situ e non richiede l'accesso a tessuti nuovi o metodi di disaggregazione che possono biasizzare i risultati ed essere difficili da standardizzare. Come per tutti gli approcci basati su SIA, le sottoclassi di ploidia nucleare >2N sono sottorappresentate dal campionamento 2D a causa della sezionamento di nuclei più grandi al di fuori del piano equatoriale. Il profilo ploidiario a livello di tessuto descrive anche il contenuto minimo di DNA per tutte le maschere nucleari circolari degli epatociti e non discrimina direttamente tra epatociti mononucleari e cellule binucleari che hanno due nuclei discreti ("non toccanti") dello stesso ploidio. Tuttavia, la semplicità di questo protocollo consente di adattare in modo considerevole per tenere conto di parametri aggiuntivi come la spaziatura internucleare o l'analisi del perimetro cellulare, che faciliterebbero l'identificazione delle cellule binucleari fornendo una valutazione più dettagliata della ploidia cellulare.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati precedentemente approvati dal comitato etico del CIPF. I topi sono stati alloggiati in una struttura senza agenti patogeni presso il Centro de Investigaciàn Pràncipe Felipe (Valencia, Spagna), registrati come allevatore sperimentale di animali, utente e centro di approvvigionamento (reg n. n. ES 46 250 0001 002) ai sensi dell'attuale normativa europea e spagnola in materia di benessere degli animali (RD 53/2013).

1. Raccolta dei tessuti e preparazione del campione

NOTA: Questo protocollo descrive come congelare il tessuto senza previa fissazione o crioconservazione. Per i campioni precedentemente fissati/crioconservati procedere alla sezione 2 e omettere il passaggio 3.1. Tutte le analisi sono state eseguite utilizzando topi adulti C57BL/6 di età compresa tra 12 e 16 settimane.

  1. Sacrificare gli animali da iniezione intraperitoneale di fentanil/pentobarbitalseguita seguita da lussazione cervicale. Con il topo rivolto verso il lato ventrale verso l'alto, aprire la cavità addominale ed esporre il fegato afferrando la pelle con una pinzetta ed eseguendo un'incisione verticale dalla base dell'addome inferiore alla base dello sterno utilizzando forbici chirurgiche.
  2. Rimuovere con attenzione la cistifellea con una pinzetta fine, sezionare il fegato e sciacquare il lobulo di fegato selezionato in un piatto petri da 10 cm riempito con salina tamponata da fosfato (PBS).
    NOTA: Si consiglia di confrontare lo stesso lobo epatico per ogni animale, in questo caso è stato utilizzato il lobo mediano.
  3. Riempire un criomuffsi etichettato con una temperatura di taglio ottimale (OCT) media a temperatura ambiente (RT). Evitare le bolle dello Strumento di personalizzazione di Office. Se appaiono, spingerli al bordo dello stampo utilizzando una punta ago o pipetta.
  4. Incorporare il lobulo di fegato in un criomold RIEMPIto dello OCT e posizionarlo immediatamente sul ghiaccio secco per garantire un rapido congelamento. Conservare criomuffsi a -80 gradi centigradi fino a criosezione.

2. Criosezione

  1. Trasportare criomuffsi sul ghiaccio secco per evitare la degradazione dei tessuti. Prima della criosezione equilibrata all'interno della criostat impostare a -20 gradi centigradi per 20 minuti.
  2. Espellere il campione applicando pressione alla base del criomuffino di plastica. Applicare lo Strumento di personalizzazione di Office liquido sul disco campione riscaldato in RT, posizionare in criostato e collegare un campione di fegato incorporato dello Strumento di personalizzazione di Office. Applicare una leggera pressione e attendere 3 min per OCT per congelare assicurandosi che il campione si attacchi al disco.
    NOTA: Evitare di maneggiare il campione con le dita il più possibile per eludere la degradazione del tessuto.
  3. Bloccare il campione nel braccio del criostato e regolare l'orientamento in modo che il bordo del campione sia parallelo alla lama del criostato. Tagliare nel campione fino a raggiungere il tessuto.
  4. Sezionare il campione con uno spessore di 6 m. Posizionare un vetrino rivestito in poliammide etichettato sul campione per 5 s per far aderire il campione sul vetrino. Posizionare la diapositiva in corrispondenza di RT per 3-5 min, quindi, per ottenere i migliori risultati, procedere direttamente alla sezione 3.
    NOTA: Per l'elaborazione di più campioni freschi, sono stati ottenuti risultati riproducibili conservando temporaneamente i vetrini in una scatola di diapositive su ghiaccio secco fino a quando tutti i campioni non sono stati elaborati. Quando si utilizza questo approccio, consentire a tutte le diapositive di raggiungere l'acognitazione a RT prima di procedere alla sezione 3. È possibile utilizzare campioni di formalina di paraffina fissa incorporata (FFPE), anche se l'autofluorescenza di sfondo viene aumentata con questo metodo. Per procedere da campioni di FFPE, sezione a 4 m. Monte catturando sezioni dal bagno d'acqua a 40 gradi centigradi su vetrini trattati con poliammide. Scivoli di calore per 1 h a 60 gradi centigradi, quindi deparaffinare da lavamenti CASUAL seriali (5 min) in vasetti Coplin contenenti xilene (x2), etanolo 100% (x2), 96% (x2), 70% (x1) e dH2O (x1). Per esporre gli antigeni, posizionare i vetrini nel tampone di citrati per 20 min a 90 gradi centigradi prima di temperare i vetrini in PBS a RT. Procedere al passaggio 3.2.

3. Immunolabelling con fluorescenza

  1. Fissare le sezioni del tessuto in un cappuccio fumatore applicando 1 mL del 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS per 10 min a RT. Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin riempito di PBS e lavare per 3 min utilizzando agitazione delicata (ripetere 3x).
    NOTA: Da ora fino alla fine del processo di immunostaining, evitare l'essiccazione del campione.
  2. Asciugare l'area intorno a ogni sezione di tessuto e circondare utilizzando una penna idrofobica. Permeabilizza con 0,5% di surfactant nonionico (cioè Triton X-100) in PBS per 15 min a RT. Quindi lavare in PBS riempito barattolo Coplin per 3 min utilizzando agitazione delicata (ripetere 2x).
  3. Bloccare utilizzando una soluzione filtrata di albumina di siero bovino (BSA), 5% siero di cavallo, 0,2% surfactant nonionico in PBS (per almeno 1 h a RT).
  4. Incubare con l'anticorpo primario HNF4, diluito nel buffer di blocco durante la notte a 4 gradi centigradi in una camera di colorazione umida scura (vedi Tabella dei materiali per anticorpi e diluizioni specifiche).
  5. Mettere i vetrini in un barattolo Coplin riempito con PBS e lavare per 3 min utilizzando agitazione delicata (ripetere 4x).
  6. Incubazione con Alexa-488 anticorpo secondario coniugato e Hoechst diluito in filtrato 1% BSA e 0.2% surfactant nonionico in PBS per 2 h a RT in una camera di colorazione umida scura (vedi Tabella dei materiali per anticorpi e diluizioni specifiche).
  7. Mettere i vetrini in un barattolo Coplin riempito con PBS e lavare per 3 min utilizzando agitazione delicata (ripetere 4x). Lavare in ddH2O per 3 min con agitazione delicata (ripetere 2x).
  8. Montare i vetrini posizionando due gocce di supporto di montaggio fluorescente su un coperchio (24 x 60 mm) e posando i vetrini su di esso, eliminando le bolle applicando una leggera pressione. Per la conservazione a lungo termine, sigillare coverslip ai bordi con smalto trasparente e conservare al buio a 4 gradi centigradi.
  9. Prima di procedere, controllare i vetrini utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale per garantire una buona fissazione e immunolabeling.
    NOTA: Vedere la figura 2A,B per i risultati previsti.

4. Acquisizione dell'immagine di fluorescenza

NOTA: per questo passaggio, è necessaria una piattaforma di imaging ad alto contenuto (Table of Materials) che supporti l'acquisizione automatica di immagini a fluorescenza.

  1. Accendere il sistema di imaging e aprire un nuovo protocollo di acquisizione.
  2. Selezionare l'obiettivo 10x, notare l'area del campo visivo (in questo caso 0,6 mm2).
  3. Impostare i parametri per acquisire immagini a fluorescenza utilizzando i filtri di eccitazione ed emissione appropriati (secondo il passaggio 3.6). Per Hoechst e Alexa-488, selezionare i canali "DAPI" e "GFP" rispettivamente con eccitazione 390/18 e 438/24 nm e 432,5/48 e 475/24 nm emission.
  4. Mettere a fuoco il campione e assicurarsi che l'intensità del segnale non sia saturante. Assicurarsi che l'acquisizione dell'immagine venga eseguita con lo stesso tempo di esposizione per tutte le immagini o utilizzare un sistema in cui l'intensità della fluorescenza viene corretta per il tempo di esposizione.
  5. Scansiona il campione e acquisisci immagini sufficienti per ottenere una copertura completa della sezione tissutale (circa 20-50 campi di vista, a seconda delle dimensioni del campione).
  6. Esaminare il database delle immagini, eliminando manualmente (i) i campi poco focalizzati, (ii) quelli ai bordi di ogni sezione tissutale (per evitare di inclinare i calcoli della densità delle cellule) e (iii) quelli che contengono aree piegate/fisicamente danneggiate della sezione dei tessuti, se presenti.

5. Analisi automatizzata delle immagini a fluorescenza

NOTA: questo passaggio richiede un adeguato software di analisi delle immagini (Tabella dei materiali) in grado di: (1) identificare automaticamente I nuclei etichettati da Hoechst all'interno di immagini a 405 nm (segmentazione nucleare), (2) valutare l'intensità e la morfometria nucleare di Hoechst e (3) per determinare lo stato di fluorescenza nucleare a 488 nm (HNF4). Per valutare e regolare visivamente i parametri di segmentazione e di soglia all'interno del programma, è necessaria una formazione/competenza dell'operatore di base per valutare e regolare visivamente i parametri di segmentazione e di soglia all'interno del programma, in modo da garantire che i nuclei e lo stato di HNF4//- siano perfettamente recintati (Figura 2).

  1. Nel software di analisi delle immagini aprire il file di acquisizione contenente le immagini di Hoechst (405 nm) e HNF4 (488 nm) del passaggio 4.5 e creare un nuovo protocollo di analisi.
  2. Definire le lunghezze d'onda da utilizzare per la segmentazione nucleare (Hoechst, 405 nm) e per l'analisi delle soglie di epatocite/NPC (HNF4, 488 nm).
  3. Regolare i parametri di segmentazione nucleare del software (come "area nucleare minima" e "sensibilità" di rilevamento nucleare) per garantire che i nuclei siano segregati in modo ottimale.
    NOTA: Una buona segmentazione degli epatociti dovrebbe essere prioritaria rispetto a quella dei PNG.2 I nuclei NPC, come quelli degli endotili sinusoidali, sono appiattiti/ellittici o di forma irregolare e generalmente più piccoli e più imballati rispetto a quelli degli epatociti (gamma di dimensioni interquartile: 30-43m- 2). Per il fegato di topo, sono stati utilizzati un'area nucleare minima di 23 m2 e un rilevamento di "sensibilità" del 65% (vedere la Figura 2C,D per i risultati attesi). La sensibilità determina il modo in cui i cluster di pixel vengono riconosciuti come singoli nuclei in base alla loro intensità e deve essere testata empiricamente per ogni campione impostato dall'utente prima di procedere con l'analisi automatica delle immagini.
  4. Modificare l'intensità della soglia a 488 nm per garantire un'analisi ottimale degli epatociti (HNF4) e delle celle non parenchymale (HNF4-).
    NOTA: Vedere la figura 2C,D per i risultati attesi. Il valore dell'intensità di soglia è relativo e dipenderà dall'efficienza di colorazione e dalle impostazioni di acquisizione come l'intensità laser. Dovrebbe quindi essere standardizzato dall'utente. Utilizzare cellule note di HNF4, come cellule endoteliali e PNG periportali come controllo negativo interno e nuclei di epatocite binucleari come riferimento positivo per la colorazione. Testare i parametri di analisi utilizzando un numero ridotto di immagini per garantire una buona segmentazione nucleare e una buona segregazione della soglia di intensità prima di applicare i parametri di analisi all'intero set di dati.
  5. Selezionare i seguenti parametri nucleari da quantificare: (1) area nucleare in base alla colorazione di Hoechst (z2),(2) intensità media di Hoechst nucleare (RU), (3) fattore di allungamento nucleare (rapporto medio tra l'asse corto del nucleo e l'asse lungo del nucleo, dove un oggetto centrato simmetrico [non allungato] ha un valore di 1, (4) Nuc 1/(fattore di forma), indice medio di "rotondità" nucleare calcolato dal perimetro 2/(4x x area). I valori vanno da 1 all'infinito, dove 1 è un cerchio perfetto, (5) stato HNF4, ovvero lo stato (positivo 1 o negativo-0) e (6) le coordinate x/y nucleari in base al "centro di gravità" (cg), un metodo per individuare il centro dell'oggetto da immagini in scala di grigi con precisione sub-pixel.
  6. Eseguire l'analisi per tutti i set di dati di esempio ed esportare i dati numerici dal passaggio 5.5 al software per fogli di calcolo.

6. Analisi dei dati

NOTA: la fase di analisi dei dati può essere eseguita utilizzando qualsiasi software di foglio di calcolo standard.

  1. Calcolare i numeri di cella epatociti e non epatociti.
    1. Calcolare l'area totale della sezione epatica analizzata per ogni campione moltiplicando il numero di campi di visualizzazione per l'area del campo visivo (passaggio 4.2).
    2. Lavorando con i file di fogli di calcolo generati per ogni sezione epatica, filtra i dati selezionando solo i nuclei HNF4. Calcolare il numero totale di nuclei HNF4 e dividerlo per l'area totale analizzata per ottenere densità media di epatociti per ogni campione (Figura 2F).
    3. Eseguire lo stesso calcolo per le celle non parenchymal filtrando il foglio di calcolo per le celle HNF4 -(Figura 2E).
  2. Calcolare la distribuzione delle dimensioni nucleari degli epatociti.
    1. Utilizzando il software per fogli di calcolo, filtrare i dati per selezionare solo i nuclei HNF4.
    2. Tracciare i valori dell'area nucleare in un istogramma (Figura 2G). Impostare la larghezza del contenitore su 5 m2.
      NOTA: i valori di frequenza possono essere corretti per l'area (nuclei/mm2) secondo il punto 6.1.1.
  3. Eseguire l'analisi ploidia nucleare epatocite.
    NOTA: i dati del foglio di calcolo del passaggio 5.6 vengono utilizzati per generare un profilo di ploidia nucleare per ogni campione. Questo processo è stato automatizzato e può essere eseguito utilizzando un software scritto personalizzato che è liberamente disponibile per il download con informazioni di supporto e set di dati dimostrativihttps://github.com/lukeynoon(vedereFile supplementari). Il codice sorgente è fornito per gli utenti che desiderano adattare la metodologia. Di seguito sono riportate una descrizione dell'algoritmo, insieme alle istruzioni per l'installazione e l'utilizzo. Il programma utilizza i dati del foglio di calcolo per separare automaticamente i nuclei di epatociti in due gruppi; (1) quelli con nuclei circolari "semplici" e (2) nuclei "complessi" non circolari rappresentativi di cellule binucleari con "2c ploidia. Il contenuto minimo di DNA nucleare (funzione dell'area nucleare e della densità del DNA) viene calcolato successivamente per tutti i nuclei "semplici". Un passo successivo poi calibra automaticamente la ploidia nucleare di HNF4 o l'epatocito usando l'HNF4- nuclei come un noto controllo interno di 2'4N.
    1. Scaricare e installare il software.
      1. Scaricare l'applicazione in pacchetto da: https://github.com/lukeynoon
      2. Avviare MATLAB. Passare alla scheda APP della barra degli strumenti, fare clic su Installa app e aprire l'applicazione scaricata definita "Ploidy_Application.mlappinstall". Verrà visualizzato un messaggio per confermare la corretta installazione.
        NOTA: L'applicazione è ora pronta per l'uso e rimarrà nella scheda APP della barra degli strumenti.
    2. Formattare i dati di input.
      NOTA: prima dell'analisi automatizzata della ploidia nucleare, tutti i file di fogli di calcolo contenenti dati di imaging ad alto contenuto (passaggio 5.6) devono essere memorizzati e formattati in base alle seguenti istruzioni.
      1. In ogni file di dati esportato (. La cartella di lavoro XLS 97-2004) del passaggio 5.6, includere un foglio chiamato "Misure di cella" contenente tutti i dati necessari per l'analisi ploidia di ploidia di tipo nelle colonne (Figura 3A). Assicurarsi che il layout del foglio di calcolo, inclusi i nomi delle intestazioni di colonna, rimanga invariato rispetto a quello della figura 3A, poiché il metodo di analisi trova i dati di colonna corretti cercando questi nomi (vedere i set di dati dimostrativi in File supplementari per riferimento). Se, ad esempio, un software di analisi delle immagini ad alto contenuto non produce una colonna "Flusso di luce"(Figura 3A), inserire manualmente una colonna "Flusso di luce" nella stessa posizione, ovvero la colonna K e riempirla con zeri.
      2. Per ogni condizione sperimentale (ad esempio, "Injured-d14"), fornire un set di dati di controllo, che verrà utilizzato per calcolare il controllo interno per la calibrazione della ploidia nucleare 2.4N (passaggio 6.3.4.3). Qui, selezionare i campioni di fegato da cucciolate adulte non trattate ("Control-d0"; Figura 3B-D).
      3. Per le repliche biologiche (per condizione), memorizzare ogni foglio di calcolo nella propria cartella (come illustrato nella figura 3B). Assegnare un nome incrementale ai prefissi delle cartelle, ad esempio "Sample1, Sample2, Sample3... SampleN", in base ai nomi di file contenuti all'interno. Di conseguenza, ogni cartella del set di dati (ad esempio, "Control-d0") deve contenere una serie di sottocartelle ("Sample1", "Sample2" e così via) ognuna contenente un file di foglio di calcolo con lo stesso nome corrispondente.
    3. Eseguire l'applicazione.
      1. All'interno di MATLAB, avviare il "Ploidy_Application" facendo clic sull'icona all'interno della scheda MY APPS della barra degli strumenti (Figura 3C). Verrà visualizzata l'interfaccia utente grafica (GUI) Ploidy_Application(Figura 3C).
      2. Fare clic sul pulsante Percorso dati controllo per passare alla cartella in cui si trovano i dati del controllo (ad esempio, "Control-d0"). Questo percorso dati verrà quindi visualizzato nell'interfaccia (ad esempio, /Users/Desktop/Control-d0).
      3. Successivamente, in "prefisso cartella" digitare il nome da assegnare ai file di output (ad esempio, "Esempio").
        NOTA: questo prefisso può essere modificato in qualsiasi testo, a condizione che le cartelle e i nomi dei file rimangano denominati in modo incrementale.
      4. Fare clic sul pulsante Percorso di altri dati e passare alla cartella in cui si trovano i dati comparativi (ad esempio, "Injured-d14"). Questo percorso dati verrà quindi visualizzato nell'interfaccia (ad esempio, /Users/Desktop/Injured-d14).
      5. Fare clic su Esegui!. Al termine dell'analisi, nella barra di stato verrà eseguito il messaggio "Analisi completata!..".
        NOTA: l'applicazione segnalerà, per ogni campione, la stratificazione dei nuclei "semplici" in "2n", 2n-4n, 4n-8n e 8n in termini di conteggi assoluti e come percentuale del totale (Figura 3D). Questi file verranno salvati automaticamente in ogni cartella di esempio come: "Count_2n.txt", "Count_2n_to_4n.txt", "Count_4n_to_8n.txt", "Count_8n_and_higher.txt", "Percentage_2n.txt", "Percentage_2nto4n.txt", "Percentage_4nto8n.txt", "Percentage_8n_and_higher.txt". Il Ploidy_Application salverà automaticamente un elenco per ogni campione, di tutte le singole stime ploidiche per nuclei "semplici" epatitociti e non epatociti in "Ploidy_All_Hepatocytes.txt" e "Ploidy_NonHepatocytes.txt". Per il set di dati del controllo, il metodo salva anche le soglie minime del contenuto del DNA calcolate per la stratificazione della ploidy (vedere il passaggio 6.3.4.3.7) in un file denominato "Normalised_Thresholds_Control". Infine, l'applicazione produrrà una cartella sia per il controllo che per i dati delle condizioni comparative selezionati con il nome "Riepilogo". Questa cartella contiene due sottocartelle, "Ploidy" e "Stratification" che contengono le medie di tutti i campioni forniti (Figura 3D).
    4. Descrizione della metodologia.
      NOTA: nella sezione seguente viene descritta in dettaglio la metodologia utilizzata dal software Nuclear Ploidy Analysis. Se l'utente sceglie di non utilizzare l'applicazione, questi passaggi possono essere seguiti utilizzando il software foglio di calcolo per calcolare manualmente il profilo di ploidia nucleare.
      1. Separare i nuclei in "semplici" o "complessi" in base alla morfometria nucleare.
        1. Calcolare un "indice di circolarità" per tutti i nuclei, definito come il "fattore di allungamento" nucleare diviso per il "Nuc 1/(fattore di forma)", dove un valore di 1,0 indica un cerchio perfetto.
          NOTA: "Allungamento nucleare" e "Nuc 1/(fattore di forma)" sono due misure discrete della "circolarità" di un oggetto che valutano criteri morfometrici complementari e non sovrapposti. Il primo misura gli assi lunghi e corti di un oggetto, mentre il secondo confronta la lunghezza del perimetro di un oggetto con quella della sua area. Per rafforzare la definizione di circolarità nucleare utilizzata in questo protocollo, queste due misurazioni sono state combinate in un unico "indice di circolarità". Un approccio precedente per stimare la ploidia nucleare utilizzando la metodologia descritta utilizzava solo l'allungamento nucleare17. Sebbene siano stati ottenuti risultati accettabili utilizzando questo approccio, gli autori hanno osservato che un "indice di circolarità" composito migliora la discriminazione dei nuclei selezionati manualmente da epatociti mononucleari ed binucleari (dati non mostrati).
        2. Classificare i nuclei con un indice di circolarità 0,8 come "complessi" e quelli > 0,8 come "semplici".
      2. Stimare il contenuto di DNA "minimo" (m) per tutti i nuclei "semplici".
        1. Calcolare il raggio nucleare (r) utilizzando la formula:
        2. Calcolare il volume nucleare (v) utilizzando il volume di una formula sfera:
        3. Generare un valore relativo per il contenuto minimo di DNA (m) utilizzando la formula:
      3. Calibrare il set di dati utilizzando i nuclei NPC (HNF4-) come controllo interno di 2-4N.
        NOTA: i PNG hanno un contenuto di DNA di 2-4N a seconda dello stato del ciclo cellulare. Di conseguenza, il valore medio del contenuto di DNA "minimo" NPC (NPCm) aumenta con lesioni (Figura 4A). L'errore di calibrazione viene ridotto al minimo stabilendo un limite superiore di NPCm che rappresenta una soglia di 4c (Figura 4B).
        1. All'interno del foglio di calcolo, selezionare solo i nuclei NPC con valori per "m" che si trovano all'interno di 1 deviazione standard (SD) della modalità (questo filtra il rumore da possibile errore di segmentazione).
        2. All'interno di questo intervallo filtrato, esaminare le aree nucleari e le corrispondenti intensità media di Hoechst (Figura 4C).
        3. Stimare l'area nucleare più piccola all'interno di questo intervallo filtrato con l'intensità massima nucleare di Hoechst (cioè il punto in cui la linea della curva cambia direzione nel set di dati filtrato come illustrato dal cerchio rosso nella Figura 4C). Questo valore rappresenta uno stato transitorio (t) al di sopra del quale il campionamento di nuclei 4c predomina su nuclei 2c, con conseguente massima di intensità media di Hoechst.
          NOTA: questo valore viene determinato automaticamente dal software; tuttavia, gli utenti del foglio di calcolo possono selezionare manualmente questo punto come dimensione di transizione.
        4. Calcolare il contenuto minimo del DNA rappresentato da questa dimensione transitoria (tm)seguendo il passaggio 6.3.4.2.
        5. Per stimare la spalla 4N del set di dati NPCm, aggiungere 1 SD al valore di tm. Il numero risultante (Figura 4B) descrive il limite superiore del contenuto minimo di DNA NPC da utilizzare per la stratificazione della ploidia nucleare (S4c).
        6. Ripetere i passaggi seguenti 6.3.4.3.1-6.3.4.3.5 per tutti i campioni di "controllo".
          NOTA: Ad esempio, nella Figura 3,i fegati di controllo non danneggiati ("Control-d0") vengono utilizzati come condizione di controllo.
        7. Calcolare una soglia media di stratificazione 4c (S4c) per i campioni di "controllo" e utilizzarla per estrapolare i limiti 2c (S2c)e 8c (S8c)per il contenuto minimo di DNA (m). Le soglie di stratificazione vengono generate e memorizzate automaticamente dal software (passaggio 6.3.3.3).
          NOTA: a seconda del progetto dello studio, i valori medi della soglia di stratificazione possono essere calcolati per ogni condizione o per condizioni specifiche (ad esempio, fegato di controllo sano). Tuttavia, il software Nuclear Ploidy Analysis richiede che uno di un set di 2 file è designato come "controllo" ai fini del calcolo dei valori di ploidia relativa.
        8. Calcolare un valore ploidio per tutti i nuclei utilizzando il valore S2c generato al punto 6.3.4.3.7 come da:
        9. Stratificare nuclei "semplici" epatociti (HNF4) in 2c/4c/8c/>8c staffe secondo i seguenti criteri: "2c" HNF4 ' "4c" HNF4 s.l.m. "8c" HNF4 s.l.m. ">8c" HNF4 s.l.m.
        10. Per ricostruire il patterning spaziale dei sottogruppi ploidi, separare i dati nucleari all'interno di ogni foglio di calcolo campione in base ai campi corrispondenti in cui sono stati acquisiti. Utilizzare quindi le coordinate x/y nucleari associate (dal passaggio 5.5) ai sottogruppi ploidi in 2D (Figura 5C).

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Representative Results

Questo metodo è stato utilizzato per misurare l'impatto della lesione colestatica sul fegato adulto del topo alimentando gli animali per 0-21 giorni con una dieta epatossica contenente lo 0,1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dicollididene (DDC)17. L'alimentazione cronica della DDC provoca lesioni epatocellulari aumento dell'espansione ploidia e periportalia dei PNG. L'utente deve essere consapevole che la tensione del topo e le differenze dipendenti dall'età possono esistere nella ploidia nucleare e che tutte le analisi sono state eseguite utilizzando topi adulti C57BL/6 di età compresa tra 12 e 16 settimane.

Dopo l'immunoetichettaling di HNF4 (sezione 3 del protocollo), è importante controllare tutti i vetrini utilizzando la microscopia a fluorescenza convenzionale, per garantire una fissazione e una colorazione di buona qualità (Figura 2A). La sbisciazione o la sfocatura di Hoechst può indicare una fissazione inadeguata o una degradazione del campione prima della fissazione (Figura 2B), nel qual caso tornare alla sezione 2 del protocollo e ridurre il tempo tra sezionamento e fissazione (passaggio 3.1). L'immunoetichettaling di successo con l'anticorpo HNF4 può essere facilmente giudicato in questa fase dalla chiara discriminazione dei nuclei di epatocite etichettati positivamente, in genere più grandi e più arrotondati rispetto a quelli dei PNG (Figura 2A). I nuclei endoteliali appiattiti/ellittici all'interno del parenchyma, o dense cerotti di cellule che si espandono nelle aree periportali a seguito di lesioni da DDC possono servire come utile riferimento visivo per identificare HNF4 - NPC quando si valuta il successo / fallimento dell'immunostaining.

I parametri di soglia della segregazione nucleare e dell'HNF4 (passaggi 5,2-5,4) devono essere attentamente ottimizzati prima dell'analisi automatica delle immagini (passaggio 5.6) per riflettere ampiamente il modello visivo di immunostaining osservato dalla microscopia a fluorescenza convenzionale alla fine della sezione 3 del protocollo (Figura 2C). Esempi di segmentazione nucleare ottimale rispetto a non ottimale e protocolli di soglia HNF4 sono riepilogati nella Figura 2D. Dopo l'analisi dell'immagine (passaggio 6.1.3), i dati dovrebbero riflettere un numero crescente di PNG nel fegato con lesioni DDC (Figura 2E), dal 52% - 2,0% dei nuclei nei fegati di controllo al 72,8% 1,4% dopo 21 giorni di trattamento DDC. Gli epatociti rappresentano il 48,0% - 2,0% del totale dei nuclei nei fegati di controllo, concordante con precedenti analisi dell'istologia epatica che mostrano che gli epatociti occupano il 70-85% del volume dei tessuti, ma solo il 45-50% delle cellule epatiche totali18,19. Durante i primi 14 giorni di alimentazione DDC (Figura 2Fsi osserva una piccola ma significativa riduzione del numero di nuclei HNF4). Un grafico di distribuzione di frequenza dell'area nucleare di epatocite (passaggio 6.2) mostra un picco dell'HNF4, un'area nucleare nei fegati di controllo nell'intervallo di dimensioni di 40-50 m2, e un chiaro spostamento a destra delle dimensioni nucleari dopo l'infortunio del DDC (Figura 2G); compatibile con l'aumento della ploidia e dell'ipertrofia epatocellulare12.

Nei fegati sani (giorno 0) di controllo, il 63,4% - 1,7% dei nuclei HNF4, ha una morfometria circolare "semplice"(Figura 5A). Questa cifra scende al 46,8% , 5,7% (P - 0,042) dopo 21 giorni di lesioni da DDC, riflettendo l'aumento della complessità nella morfometria nucleare presumibilmente associata allo spostamento tra gli stati di ploidy durante la poliploidizzazione (vedere "Interpretazione della morfometria nucleare" di seguito). Esempi rappresentativi di distribuzioni di ploidia nucleare ottenute utilizzando questo metodo nelle sezioni epatiche di controllo sono mostrati nella Figura 5A, che descrive come l'interpolazione del contenuto del DNA consente la stratificazione di singole cellule all'interno di un singolo campione. Vengono inoltre visualizzati i valori medi per sottoinsiemi di celle "complesse" e "semplici" di HNF4 (Figura 5A). I dati sono coerenti con le stime precedenti della poliploidia nell'80-90% degli epatociti murini adulti2 . La frequenza dei nuclei complessi (36,6% x 1,7%) nei fegati di controllo si avvicina anche a quello delle cellule binucleari (35%)20, anche se i dati dovrebbero essere strettamente considerati come una misura di ploidia nucleare piuttosto che cellulare (vedi "Interpretazione della morfometria nucleare" di seguito). Il confronto tra la ploidia relativa tra i gruppi trattati tra il controllo (giorno 0) e i gruppi trattati con DDC dovrebbe riflettere una perdita significativa di nuclei di epatociti 2c e 4c con lesioni insieme a un aumento del numero di cellule >8c(Figura 5B). Le informazioni di posizione relative per ogni sottogruppo ploidia possono essere interrogate mediante il grafico a dispersione delle coordinate x-y associate a ciascun nucleo all'interno del set di dati o recuperando la posizione 2D di particolari sottoinsiemi di epatociti all'interno del software di analisi delle immagini ad alto contenuto (Figura 5C).

Calibrazione
Per valutare la validità del metodo di calibrazione NPC utilizzato, è stata eseguita la doppia immunotura delle sezioni epatiche utilizzando anticorpi contro l'HNF4 e il marcatore proliferante Ki-67(Figura 6A,B). Questi dati hanno mostrato l'arricchimento per Ki-67, che etichetta le cellule in tutte le fasi attive del ciclo cellulare, sul lato destro della curva minima di distribuzione del DNA NPC (tra S2c e S4c) - dove i PNG dovrebbero replicare il DNA e quindi avere >2c ploidia (Figura 6A). Dopo la calibrazione interna di tutti i campioni di controllo e fegato feriti studiati, Ki-67, è stato notevolmente arricchito (P < 0.0001) in nuclei NPC "semplici" con una ploidy stimata di >2c (82,5% - 6,6% SD, n - 12) rispetto a quelli con ploidy di successo (17,5% - 6,6% SD, n - 12) (Figura 6B). Questi dati supportano la validità del metodo utilizzato. Inoltre, assumendo una sogliola accurata di Ki67, forniscono alcune informazioni quantitative sulla misura in cui le maschere nucleari subequatoriali dei gruppi ploidici più alti "contaminano" di seguito.

Per verificare ulteriormente la validità del metodo di calibrazione NPC, è stato introdotto un calibratore esterno basato sul volume nucleare precedentemente riportato del topo 2N epatociti (155,8 m3)14. Quando questa cifra è stata utilizzata in combinazione con un valore medio di intensità Dizisti per HNF4a- nuclei la stima risultante per la ploidia media epatocite nei fegati di controllo era indistinguibile da quella interna (S2c) calibratore (Figura 6C). Inoltre, le stime della ploidia media epatocito nei topi del ceppo c57BL/6 dei topi di età comparabile sono state simili, confermando che non è necessaria una precedente conoscenza empirica della dimensione nucleare degli epatociti 2N, rendendo questa metodologia controllata internamente per stimare completamente la ploidia nucleare.

Interpretazione della morfometria nucleare
Il metodo descritto fornisce una lettura ploidia per i nuclei di epatociti con morfometria circolare "semplice". L'esclusione dei nuclei "complessi" si basa sull'ipotesi che rappresentino una proporzione di epatociti binucleari con maschere nucleari sovrapposte/toccanti, rendendo più impegnativa la determinazione ploidia di questo sottoinsieme (Figura 7A). È importante sottolineare che la segregazione dei nuclei secondo la circolarità non consente all'utente di distinguere tra i nuclei degli epatociti mononucleari e quelli delle cellule binucleari, in cui due nuclei di ploidia simile sono chiaramente separati all'interno della cellula. Questo è stato testato empiricamente selezionando manualmente le cellule binucleari e mononucleari dai set di dati di immagine e valutando ne la segregazione mediante l'algoritmo (Figura 7B). Nuclei di epatociti binucleari che erano fisicamente vicini (Figura 7C) ma "non toccanti" sono stati classificati dall'algoritmo come "semplici", mentre quelli che erano "toccanti" sono stati chiaramente discriminati come "complessi". Quindi, questo saggio non fornisce una lettura della ploidia cellulare nel fegato, dato che i nuclei di cellule binucleari sono suddivisi tra le sottoclassi "semplici" e "complesse" (vedi Discussione). Tuttavia, alcune informazioni sul passaggio tra gli stati di ploidia cellulare e nucleare possono essere ottenute da questi dati semplicemente tracciando istogrammi di morfometria nucleare e dimensioni nucleari e applicando un modello di come gli stati "complessi" e "semplici" sono transiti tra durante la poliploidizzazione (Figura 7D). Nei fegati di controllo si osservano chiaramente tre fasi (I-III) di morfometria nucleare (Figura 7E). Essi rappresentano il raggruppamento di maschere nucleari circolari 2N (I), 4N (II) e 8N (III) rispettivamente (come illustrato nella figura 7D). Gli epatociti 16N mononucleari sono estremamente rari nei fegati di topo adulti16,18,21, da qui il gruppo di ploidiatura cellulare 16N è composto quasi interamente da cellule binucleari con 8N nuclei, situati all'interno, e a destra, della fase III ( Figura7E), spiegando la goccia di circolarità a destra della fase III. È interessante notare che, dopo un infortunio (giorno 14 del DDC), uno spostamento quantitativo verso una maggiore complessità ("binuclearità") inizia nelle fasi I (che riflettono da 2n a 2x2n) e nelle fasi III (che riflettono da 8n a 2x8n), prima che si consolidi in tutte e tre le fasi (I-III). Gli autori ipotizzano che questo spostamento verso una maggiore complessità è dovuto ad un aumento della ploidia cellulare derivante da citochina bloccata, mentre a destra della fase III si osserva la tendenza opposta, a causa della maggiore rappresentazione delle cellule mononucleari circolari 16N nel fegato ferito a causa dell'endoreplicaria. Queste osservazioni dovranno ovviamente essere testate adattando il metodo per tenere correttamente conto della ploidia cellulare (vedi Discussione).

Figure 1
Figura 1: Riepilogo del flusso di lavoro. Il tessuto elicoidale (1), criosezione (2), fisso e immunoetichettato con un anticorpo HNF4, che consente di discriminare le cellule parenchymal e non parenchymal (NPC) (3). Una volta elaborati, i campioni vengono digitalizzati utilizzando una piattaforma di imaging ad alto contenuto utilizzando l'acquisizione automatica di immagini (4) e l'analisi (5). Le cellule sono segmentate dalla fluorescenza nucleare di Hoechst e dalla soglia dell'immunofluorescenza dell'HNF4. Successivamente, vengono calcolate l'area nucleare di Hoechst ("A") e la circolarità ("C"). Infine, i dati vengono analizzati (6); I PNG HNF4- sono quantificati (i) e i nuclei di HNF4 epaticiti sono separati in due sottoinsiemi ("semplice" e "complesso") secondo la circolare nucleare (ii). L'interpolazione della ploidia nucleare dell'epatocite viene quindi eseguita per tutti i nuclei "semplici" in funzione del raggio nucleare (r) e dell'intensità media della fluorescenza di Hoechst (come proxy per la densità del DNA nucleare) (iii). I dati vengono quindi stratificati utilizzando I PNG come calibratore 2N interno (iv) prima di compilare un riepilogo di esempio (v). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Analisi delle immagini ad alto contenuto e profilazione citometrica del fegato del topo durante l'alimentazione cronica della DDC. (A) Un'immagine confocale rappresentativa dell'HNF4/Hoechst immunofluorescenza macchiata del fegato adulto di topo dopo 21 giorni di alimentazione con una dieta contenente lo 0,1% dDC; l'immagine mostra i nuclei arrotondati di HNF4 e gli epatociti ("H") e l'espansione di HNF4- NPC nelle aree che circondano la vena del portale ("PV"). (B) Esempi di colorazione nucleare Hoechst ottimale ("corretta") e non ottimale ("errata") che indica nodi vedenti che indicano una scarsa fissazione. (C) Uso di una piattaforma di analisi delle immagini ad alto consumo per separare gli epatociti e i PNG in base alla colorazione nucleare di Hoechst e all'immunoetichettatura HNF4. Le maschere software (linee rosse/verdi) mostrano come i nuclei sono segmentati correttamente in base alla fluorescenza di Hoechst e ordinati in epatociti (-) o PNG (-) secondo lo stato di HNF4. (D) Una guida all'ottimizzazione dell'impostazione per l'analisi segmentazione/soglia. Le maschere nucleari sovrapposte riconosciute dal software sono indicate da linee verdi/blu per la segmentazione nucleare e da verde/blu (HNF4) o rosso/blu (HNF4-) per l'analisi delle soglie (H - epatocito). Risoluzione dei problemi: sensibilità al rilevamento nucleare impostata su un valore troppo basso (i) o troppo alto (ii). Soglia per HNF4, impostata su un valore troppo basso (iii) o troppo alto (iv). (E, F) Analisi quantitativa dei nuclei NPC ed epatociti durante l'alimentazione del DDC: (E) HNF4- e (F) le densità nucleari vengono confrontate con il tempo del trattamento DDC (giorni). È stato analizzato un totale di 5,7 x 105 cellule, da 4-6 animali per timepoint. I dati vengono presentati come media : SEM. Unidirezionale ANOVA è stato utilizzato per confrontare i mezzi. I valori di Rilevanza P sono stati calcolati utilizzando il test della differenza meno significativa (LSD) di Fisher. (G) Distribuzione di frequenza dell'area nucleare HNF4 durante il trattamento DDC. I dati mostrano uno spostamento a destra nell'area nucleare epatocita durante lesioni coerenti con l'ipertrofia cellulare e la poliploidizzazione. È stato analizzato un totale di 2,5 x 105nuclei HNF4, da 4/6 animali per timepoint. Questa cifra è stata modificata da Manzano-Naez etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Analisi automatizzata della ploidia nucleare epatocite utilizzando software scritto personalizzato. (A) Schermata che mostra la corretta formattazione dei dati del foglio di calcolo per l'immissione nel software di analisi ploidia nucleare. Le colonne contenenti dati essenziali (passaggio 5.5 del protocollo) sono evidenziate in giallo. Tutti i titoli di colonna devono corrispondere esattamente a quelli indicati. (B) Screenshot che mostra come i singoli file di foglio di calcolo contenenti dati provenienti da repliche biologiche ("Sample1", "Sample2", ecc.) devono essere denominati e organizzati in sottocartelle per ogni condizione (in questo esempio "Control-d0" e "Injured-d14"). (C) Screenshot dopo la corretta installazione dell'applicazione ploidia (cerchio rosso). Quando l'applicazione viene avviata (facendo clic su "Ploidy_Appl..") nella scheda MY APPS della barra degli strumenti viene visualizzata la "Ploidy_GUI" (pannello inferiore). Il nome dell'esperimento ("Sample") e i percorsi del controllo (ad esempio, "Control-d0") e i test (ad esempio, "Injured-d14") vengono immessi prima di fare clic su Esegui. Il software calcola, calibra e stratifica la ploidia nucleare per tutti i campioni utilizzando il set di dati "Control-d0" per generare soglie per un contenuto minimo di DNA. (D) L'output dei dati da Ploidy_Application mostra singoli file di dati salvati automaticamente in ogni cartella campione (i) contenente numeri assoluti e percentuali di nuclei "semplici" in ogni gruppo ploidia. Per ogni condizione (in questo caso sia "Control-d0" che "Injured-d14"), viene generata automaticamente una cartella riassuntiva contenente automaticamente stime di ploidia nucleare medie per tutti i nuclei "semplici" e non epatociti (ii) e una ripartizione di come la ploidia nucleare è stratificata per ogni campione (iii). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: L'uso di Png come calibratore interno per ploidi. (A) Grafico che mostra l'impatto della lesione da DDC sui nuclei di DNA minimo medio (m) di nuclei di epatociti (HNF4) e NPC (HNF4-). Tutti i dati sono normalizzati al giorno 0 NPC (n - 4 animali per punto temporale). (B) Istogramma che descrive la distribuzione deivalori MPC in un unico campione di fegato rappresentativo (giorno 0, totale di 7.180 nuclei). Lo schema (sopra) mostra come le maschere NPC circolari possono derivare da cellule con un contenuto di DNA di 2-4c. Lo scopo del metodo di calibrazione è quello di definire la soglia di stratificazione che rappresenta 4c (S4c)al limite superiore della distribuzione NPCm (linea tratteggiata), riducendo al minimo il rumore dovuto a errori di segmentazione agli estremi della curva di distribuzione. (C) Vengono tracciate le variazioni dell'intensità media di Hoechst e dell'area nucleare per i nuclei nPC (HNF4-). Per evitare errori di segmentazione, solo i nuclei con un corrispondente valore MPCm compreso tra 1 SD del modo in cui il valoreMPC viene esaminato (casella gialla). All'interno di questo intervallo la dimensione della transizione di 2c-4c (t) viene calcolata e utilizzata come punto di ancoraggio all'interno dei dati per stimare il S4c. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Analisi ad alto throughput in situ della ploidy nucleare nel fegato del topo durante l'alimentazione cronica dDC. (A) Analisi del controllo del fegato adulto utilizzando la metodologia descritta. I nuclei di epatociti di HNF4 e delle sezioni epatiche 2D sono suddivisi in base alla circolarità nucleare di Hoechst in due gruppi: "semplice" e "complesso". (In alto) Sono mostrate le immagini di Fluorescenza rappresentativa Hoechst di cellule appartenenti a questi due gruppi. (Sinistra) Grafico a dispersione che mostra la stratificazione di semplici nuclei HNF4 o da un campione (giorno 0) in base al valore di ploidia interpolata, all'area nucleare e all'intensità media di Hoechst nucleare. (A destra) Grafico a torta che descrive in dettaglio la tipica ripartizione delle cellule HNF4 nel fegato di controllo (giorno 0) che indica le proporzioni di ogni sottoclasse di ploidia nucleare. È stato analizzato un totale di 6,7 x 104 nuclei HNF4 di 4 animali. (B) Impatto della lesione epatica DDC sulla ploidia nucleare epatocite mediante analisi situ ad alto throughput. I grafici dimostrano la relativa diminuzione della proporzione di nuclei di epatociti 2c e 4c entro i primi 14 giorni di alimentazione DDC, mentre i nuclei poliploidi >8c aumentano drasticamente di numero. È stato analizzato un totale di 1,5 x 105 nuclei HNF4 ( 4 animali per punto temporale). I dati vengono presentati come media : SEM. Unidirezionale ANOVA è stato utilizzato per confrontare i mezzi. I valori di Significance P sono stati calcolati utilizzando il test di confronto multiplo di Tukey. (C) Esempio per mostrare come le sottoclassi di ploidia nucleare possono essere tracciate spazialmente all'interno del parenchyma utilizzando questo metodo, interrogando dati di imaging ad alto contenuto con gli stessi criteri quantitativi utilizzati per la stratificazione ploidia (circolarità, dimensione nucleare e intensità media di Hoechst). Le immagini della fluorescenza di Hoechst sono mostrate con maschere software (punti rossi) che contrassegnano 2 nuclei nel fegato in due momenti durante l'alimentazione cronica dDC (giorno 14 e 21). Veina del portale (linea tratteggiata blu) e aree periportali che si espandono (linea gialla). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Valutazione critica del metodo di calibrazione NPC. (A,B) I PNG che proliferano sono categorizzati con successo con un punteggio di ploidia >2c. (A) Istogramma del DNA minimo di NPC da fegati di controllo immunoetichettati con anticorpi all'HNF4 e al marcatore proliferare Ki-67 (n - 4, i dati sono presentati come media : SEM). Sono indicate soglie di stratificazione per 2c (S2c) e 4c (S4c). (B) La stratificazione dei PNG secondo la metodologia descritta si traduce in un significativo arricchimento dell'immunoetichettalizzazione Ki-67 nei nuclei a cui è stato assegnato un punteggio > 2c ploidy (n ) . I dati sono presentati come media : SEM. Non accoppiato t test è stato utilizzato per confrontare le medie . (C) Convalida esterna del metodo di calibrazione NPC. Le stime della ploidia nucleare media dell'epatocito ottenute utilizzando il metodo interno del calibratore NPC sono state confrontate con quelle ottenute mediante la calibrazione degli stessi campioni (Controllo C57BL/6 fegato del topo 3, n . 4) con un volume nucleare noto per 2N epatociti14. I dati sono presentati anche da due analisi indipendenti21,22 che descrivono la ploidia nucleare epatocite da topi dello stesso ceppo all'età di 2-6 mesi (mostrata a destra della linea tratteggiata). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: La morfometria nucleare epatocite ha una relazione "complessa" con la ploidia cellulare. (A) La sintesi di come la ploidia cellulare epatocite (2N, 4N, 8N e 16N) sia parzialmente segregata dall'analisi 2D della morfometria nucleare. Le cellule binucleari (rosse) sono suddivise tra morfometri "semplici" ("S") e "complesse" ("C") a seconda che i nuclei sembrino toccare o meno. (B, C) Gli epatociti individuali sono stati selezionati e analizzati manualmente per la morfometria nucleare e la spaziatura internucleare. (B) Gli epatociti binucleari con nuclei "toccanti" erano "complessi" (100% -0,8), mentre le cellule mononucleari (nero) e gli epotociti binucleari con maschere nucleari non toccanti erano "semplici" (94% >0,8). (C) I nuclei "semplici" degli epatociti binucleari potrebbero essere distinti da quelli delle cellule mononucleari a causa della notevole riduzione della spaziatura internucleare (n - 3, totale di 94 nuclei analizzati). (D) Modello che approssima il modo in cui gli stati di ploidia cellulare del pannello A potrebbero essere distribuiti in termini di morfometria nucleare 2D e area nucleare con conseguente raggruppamento di semplici forme circolari in quattro fasi (I-IV). (E) Confronto tra morfometria/dimensioni nucleari di HNF4 nei fegati di controllo (giorno 0) e dopo 14 giorni (a sinistra) e 21 giorni (a destra) di lesioni da DDC. Le fasi morfometriche sono indicate sopra (I -V). Le frecce indicano spostamenti nella morfometria nucleare derivanti da lesioni che sono coerenti con la binuclearizzazione dei nuclei 2c ("a"), 4c ("b") e 8c ("c"), insieme a una maggiore mononuclearizzazione della classe di ploidia cellulare 16N (d). Totale di 29 x 30 x 103 nuclei analizzati per condizione (n x 2). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementari: dimostrazione dei set di dati. Fare clic qui per visualizzare questi file.

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Discussion

Viene descritto un approccio ad alto contenuto e ad alto contenuto per l'analisi del rimodellamento dei tessuti e la stima della ploidia nucleare epatocite nel fegato murino. Una volta che ha familiarità con la procedura, un utente può elaborare, immagini e analizzare più campioni in un periodo di 3-5 giorni, generando set di dati testati di grandi dimensioni che forniscono una firma dettagliata dello stato di salute del fegato. Data la semplicità del metodo di preparazione del campione, insieme al gran numero di cellule e aree tissutali analizzate (in media 14 mm2/campione), i risultati sono robusti e altamente riproducibili. L'automazione dell'acquisizione e dell'analisi delle immagini rimuove anche gli errori dell'utente e la potenziale distorsione da questi importanti passaggi. Un'importante innovazione è l'uso dei PNG come calibratore interno di ploidia che consente una valutazione relativa del contenuto di DNA nucleare epatocite sia all'interno che tra i campioni. L'incorporazione di un'azione di etichettatura HNF4 è quindi fondamentale per fornire a questo protocollo un vantaggio tecnico unico rispetto ai metodi 2Dpubblicatiin precedenza 3,12,22. Al contrario, la semplicità relativa della metodologia rispetto ai flussi di lavoro di ricostruzione 3D18 lo rende tecnicamente meno laborioso e potenzialmente più flessibile.

Rispetto al metodo di precisione della citometria di flusso, un importante avvertimento all'estrapolazione del contenuto di DNA nucleare da sezioni di tessuto 2D, è la fiducia limitata che può essere attribuita alla categorizzazione dei singoli nuclei per quanto riguarda lo stato di ploidia. A questo si aggiunge la distorsione intrinseca all'interno degli approcci basati su SIA per sovrarappresentare i sottogruppi di ploidia più piccoli a causa del campionamento subequatoriale. Tuttavia, normalizzando i dati a uno standard interno e adottando un approccio basato sulla popolazione di grandi dimensioni, l'errore dovuto a questi effetti è mitigato e confrontato tra i campioni. Gli epatociti sono caratterizzati da una morfologia nucleare altamente arrotondata, rispetto ad esempio ai PNG, il che significa che sono particolarmente suscettibili di stima accurata del contenuto di DNA basato sull'area trasversale nucleare da sola10,11,14,15,23. L'approccio basato su SIA è stato perfezionato in questo protocollo per tenere conto sia della circolarità nucleare che della densità del DNA integrando misure di morfometria e intensità media di fluorescenza di Hoechst, determinando un descrittore stimato di "contenuto minimo di DNA" per i singoli nuclei. È importante sottolineare che l'uso dei PNG come controllo della ploidia di 2-4N fornisce un importante standard interno per la calibrazione oggettiva e la stratificazione del contenuto minimo di DNA nucleare, rendendo la metodologia descritta applicabile a campioni di qualsiasi specie, o formato, dato che può essere procurato un anticorpo appropriato per l'HNF4 (o un marcatore nucleare epatocito simile).

Anche se la valutazione della ploidia nucleare ha dimostrato di fornire firme utili per la progressione della malattia epatica10,13, al fine di accertare pienamente la diversità dei cambiamenti ploidici all'interno del fegato sarebbe auspicabile e necessario adattare la metodologia descritta per tenere conto del perimetro epatocellulare e quindi della ploidia cellulare. La mappatura della ploidia cellulare è stata precedentemente ottenuta etichettando il perimetro dell'epatocito utilizzando marcatori come beta catenin10,13,24, actin12,22 e citokeratin10,11 in campioni di fegato umano e topo. Tuttavia, quando questo è stato testato dopo un infortunio alla DDC, il rimodellamento epiteliale drammatico precludeva una valutazione affidabile del perimetro epatocellulare sia da phalloidin (dati non mostrati) che da anticorpi alla beta catenin17. Quindi, sebbene questo approccio sia fattibile, potrebbe non essere applicabile a tutti i modelli di lesioni, ma se ottenuto avanzerebbe la mappatura della ploidia cellulare, oltre a rendere più accurate le stime delle dimensioni e del numero di epatociti. Resta inoltre plausibile che, tenendo conto di parametri nucleari aggiuntivi, come la spaziatura internucleare (Figura 7C), le cellule mononucleari possano essere discriminate dagli epatociti binucleari "semplici" e che un'ulteriore segregazione delle cellule binucleari "complesse" possa essere ottenuta mediante misurazioni radiali dei nuclei che le loro maschere 2D contengono.

Dato che esistono anticorpi umani convalidati da HNF4 per il tessuto FFPE25 e che la calibrazione interna libera questa metodologia di eventuali limitazioni specifiche delle specie, il protocollo è quasi immediatamente applicabile ai campioni umani. Pertanto, ha un notevole potenziale per fornire un punto di riferimento per l'analisi ad alto rendimento della ploidia nucleare epatocite e lesioni epatiche nella malattia umana. Inoltre, con il multiplexing con altri anticorpi, questo metodo può rivelare nuovi ruoli per particolari sottoinsiemi di epatociti e la loro risposta alle lesioni e maissi. A tal fine, abbiamo combinato con successo la metodologia con l'immunostaining per il marcatore nucleare proliferante Ki-67(Figura 6), che consente di raccogliere informazioni utili - tra cui l'identificazione di 2N popolazioni non proliferanti di PNG per una migliore calibrazione interna della ploidy (Noon, dati inediti 2019). Quindi, accolando la flessibilità con i dati posizionali e quantitativi forniti dal metodo, suggeriamo che le sue applicazioni future miglioreranno la comprensione del ruolo della poliploidia nel fegato.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione spagnola del governo MINECO BFU2014-58686-P (LAN) e SAF-2017-84708-R (DJB). LAN è stata sostenuta da un premio nazionale DI MineCO Ramàn y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 e Plan GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) e FMN da una studentessa regionale della Generalitat Valencian ACIF/2016/020. RP vorrebbe riconoscere il professor Ewa K. Paluch per il finanziamento. Ringraziamo la Dott.ssa Alicia Martanez-Romero (servizio CIPF Cytometry) per l'aiuto con la piattaforma IN Cell Analyzer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) TestDiet 1810704 Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) Invitrogen A11055 Dilution 1:500
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cryostat Leica CM1850 UV Leica biosystems CM1850 UV Tissue sectioning
Fluorescent Mounting medium Dako S3023
GraphPad Prism GraphPad Software Prism 8 Statistical software for graphing data
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Final concentration 5 µg/mL
IN Cell Analyzer 1000 GE Healthcare Bio-Sciences Corp High-Content Cellular Imaging and Analysis System
MATLAB MathWorks R2019a Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy
Microscope coverslides VWR International 630-2864 Size of 24 x 60 mm
Microsoft Office Excel Microsoft Speadsheet software
OCT Tissue Tek Pascual y Furió 4583
Paraformaldehyde Panreac AppliChem 141451.121
Pen for immunostaining Sigma-Aldrich Z377821-1EA 5mm tip width
Polysine Microscope Slides VWR International 631-0107
Rabbit polyclonal Anti-HNF4α Thermo Fisher Scientific PA5-79380 Dilution 1:250 (alternative)
Rabit polyclonal Anti-HNF4α Santa Cruz Biotechnology sc-6556 Dilution 1:200 (antibody used in the study)
Tween 20 Sigma-Aldrich P5927

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References

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Medicina Numero 158 fegato poliploidia epatocite imaging ad alto contenuto epatologia fattore nucleare epatite 4 alfa (HNF4)Hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4
Un metodo ad alto throughput in Situ per la stima della ploidia nucleare epatica nei topi
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Manzano-Núñez, F., Peters, R., Burks, D. J., Noon, L. A. A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice. J. Vis. Exp. (158), e60095, doi:10.3791/60095 (2020).

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