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Medicine

Une méthode in situ à haut débit pour l’estimation de la ploidy nucléaire hépatocyte chez les souris

Published: April 19, 2020 doi: 10.3791/60095
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1,3
1Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)

Summary

Nous présentons une méthode robuste, rentable et flexible pour mesurer les changements dans le nombre d’hépatocytes et le stratagème nucléaire dans des échantillons de tissus fixes/cryoconservés qui ne nécessitent pas de cytométrie d’écoulement. Notre approche fournit une signature puissante à l’échelle de l’échantillon de cytologie hépatique idéale pour suivre la progression des lésions hépatiques et des maladies.

Abstract

Lorsque le foie est blessé, le nombre d’hépatocytes diminue, tandis que la taille des cellules, la taille nucléaire et le stratagème augmentent. L’expansion des cellules non parenchymales telles que les cholangiocytes, les myofibroblastes, les progéniteurs et les cellules inflammatoires indiquent également des lésions hépatiques chroniques, des remodelages tissulaires et la progression de la maladie. Dans ce protocole, nous décrivons une approche simple à haut débit pour calculer les changements dans la composition cellulaire du foie qui sont associés aux dommages, aux maladies chroniques et au cancer. Nous montrons comment les informations extraites des sections tissulaires bidimensionnelles (2D) peuvent être utilisées pour quantifier et calibrer le stratagème nucléaire hépatocyte dans un échantillon et permettre à l’utilisateur de localiser des sous-ensembles de ploidy spécifiques dans le foie in situ. Notre méthode nécessite l’accès à des matériaux hépatiques fixes/congelés, à des réactifs d’immunocytochimie de base et à toute plate-forme d’imagerie à haute teneur de série standard. Il sert d’alternative puissante aux techniques standard de cytométrie de débit, qui exigent la perturbation des tissus fraîchement recueillis, la perte d’information spatiale et le biais potentiel de désagrégation.

Introduction

Les hépatocytes dans le foie de mammifères peuvent subir la cytokinesis au point mort pour produire des cellules binucléaires, et l’endoreplication d’ADN pour produire des noyaux polyploïdes contenant jusqu’à 16N de contenu d’ADN. Augmentation globale du ploidy cellulaire et nucléaire pendant le développement postnatal, le vieillissement et en réponse à divers stress cellulaires1. Le processus de polyploidisation est dynamique et réversible2, bien que sa fonction biologique précise reste floue3. L’augmentation du stratagème est associée à une capacité de prolifération réduite4, à la diversité génétique2,à l’adaptation aux blessures chroniques5 et à la protection contre le cancer6. Les altérations de ploidy d’Hépatocyte se produisent en raison du rythme circadien altéré7, et du sevrage8. Plus particulièrement, le profil de ploidy du foie est modifié par des blessures et la maladie9, et des preuves convaincantes suggèrent que des changements spécifiques de ploidy, tels que l’augmentation des noyaux de 8N ou la perte des hépatocytes de 2N, fournissent des signatures utiles pour le suivi de la maladie du foie gras non-alcoolique (NAFLD) progression3,10, ou l’impact différentiel des infections virales11.

En termes généraux, les lésions hépatiques et la régénération sont associées à une augmentation de la taille des cellules hépatocytes et de la zone nucléaire12, ainsi qu’à une réduction du nombre total d’hépatocytes, en particulier ceux dont la teneur en ADN2N est 10,,11. Les lésions parenchymales dans le foie sont également fréquemment accompagnées par l’expansion des cellules non parenchymales (NPC), y compris les myofibroblastes stromaux, les cellules inflammatoires et les cellules progénitrices bipotentes de foie. Les méthodes à haut débit qui fournissent un profil cytologique quantitatif du nombre de cellules parenchymiques et du stratagème nucléaire, tout en tenant compte des changements dans les PNJ, ont donc un potentiel considérable en tant que recherche et outils cliniques pour suivre la réponse du foie pendant les blessures et les maladies. L’analyse in situ récente convaincante des spectres de ploidy dans des échantillons humains du carcinome hépatocellulaire démontrent également que le ploidy nucléaire est considérablement augmenté dans les tumeurs et est spécifiquement amplifié dans les sous-types de tumeur plus agressifs avec la différenciation et la perte réduites de TP5313. Par conséquent, il y a une forte possibilité que les progrès méthodologiques dans l’évaluation quantitative du stratagème nucléaire aideront dans le profilage pronostique futur du cancer du foie.

Dans ce protocole, une méthodologie flexible à haut débit pour l’analyse comparative des sections des tissus hépatiques de souris est décrite, qui fournit un profilage cytométrique détaillé des nombres d’hépatocytes, la réponse de PNJ et une méthode calibré interne pour estimer le stratagème nucléaire(figure 1). Les hépatocytes se distinguent des PNJ par l’immunolabelling hépatocyte du facteur nucléaire 4 alpha (HNF4MD), avant la caractérisation de la taille nucléaire et de la morphométrie nucléaire. Le « contenu minimal de l’ADN » est estimé pour tous les masques nucléaires circulaires en intégrant l’intensité moyenne hoechst 33342 (un indicateur de la densité d’ADN) avec le volume nucléaire tridimensionnel interpolé (3D). Le contenu minimal d’ADN d’Hépatocyte est alors calibré utilisant des PNJ pour générer un profil de stratagème nucléaire.

L’acquisition d’images, la segmentation nucléaire et l’analyse d’image sont effectuées à l’aide d’images à haute teneur, ce qui permet de dépister de vastes zones de sections hépatiques bidimensionnelles (2D) contenant des dizaines de milliers de cellules. Un programme écrit sur mesure est prévu pour le post-traitement automatisé des données d’analyse d’images à contenu élevé afin de produire un profil de stratagème à l’échelle de l’échantillon pour tous les noyaux hépatocytes circulaires. Ceci est effectué à l’aide d’un logiciel gratuit pour télécharger des logiciels pour calculer le ploidy nucléaire basé sur l’analyse d’image stereologique (SIA)10,11,14,15. La méthodologie SIA a été précédemment validée par cytométrie de flux comme méthode précise, quoique laborieuse, pour estimer le ploidy nucléaire hépatocyte dans le foie14, en supposant la morphologie nucléaire circulaire et une relation monotone entre la taille nucléaire et la teneur en ADN. Dans ce protocole, les deux paramètres nucléaires sont mesurés par l’évaluation de la morphométrie nucléaire et de l’étiquetage Hoechst 33342. Le calcul de la « teneur minimale en ADN » pour chaque masque nucléaire est suivi de l’étalonnage du stratagème nucléaire hépatocyte à l’aide des PNJ, qui ont une teneur connue en ADN de 2 à 4N et servent donc de contrôle interne utile.

Par rapport aux méthodes conventionnelles de cytométrie de débit16, l’approche décrite permet d’évaluer in situ le stratagème nucléaire hépatocyte et ne nécessite pas d’accès à des tissus frais ou à des méthodes de désagrégation qui peuvent biaiser les résultats et être difficiles à normaliser. Comme pour toutes les approches basées sur la SIA, les sous-classes de ploidy nucléaire sont sous-représentées par l’échantillonnage 2D en raison de la section des noyaux plus grands à l’extérieur du plan équatorial. Le profil de ploidy à l’échelle des tissus décrit également le contenu minimal de l’ADN pour tous les masques nucléaires hépatocytes circulaires, et ne fait pas directement de distinction entre les hépatocytes mononucléaires et les cellules binucléaires qui ont deux noyaux discrets (« non touchants ») du même stratagème. Cependant, la simplicité de ce protocole permet d’adapter une marge de manœuvre considérable pour tenir compte de paramètres supplémentaires tels que l’espacement internucléaire ou l’analyse du périmètre cellulaire, ce qui faciliterait l’identification des cellules binucléaires fournissant une évaluation plus détaillée de la ploidy cellulaire.

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Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont déjà été approuvées par le comité d’éthique du CIPF. Des souris ont été logées dans une installation exempte d’agents pathogènes au Centro de Investigacion Proncipe Felipe (Valence, Espagne), enregistrée en tant qu’éleveur d’animaux expérimentaux, utilisateur et centre d’approvisionnement (reg. no. ES 46 250 0001 002) en vertu des réglementations européennes et espagnoles actuelles en matière de bien-être animal (RD 53/2013).

1. Récolte des tissus et préparation de l’échantillon

REMARQUE : Ce protocole décrit comment congeler les tissus sans fixation préalable ou cryoconservation. Pour les échantillons précédemment fixés/cryoconservés, passez à l’article 2 et ometz l’étape 3.1. Toutes les analyses ont été effectuées à l’aide de souris femelles adultes C57BL/6 âgées de 12 à 16 semaines.

  1. Sacrifiez les animaux par injection intraperitonéale de fentanyl/pentobarbital suivie d’une dislocation cervicale. Avec la souris face côté ventral vers le haut, ouvrir la cavité abdominale et exposer le foie en saisissant la peau avec des pincettes et l’exécution d’une incision verticale de la base de l’abdomen inférieur à la base du sternum à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
  2. Retirez soigneusement la vésicule biliaire à l’aide d’une fine pince à épinerie, disséquez le foie et rincez le lobule hépatique sélectionné dans une assiette à vaisselle Petri de 10 cm remplie de saline tamponnée par phosphate (PBS).
    REMARQUE : Il est recommandé de comparer le même lobe de foie pour chaque animal, dans ce cas le lobe médian a été employé.
  3. Remplissez un cryomold étiqueté avec une température de coupe optimale (OCT) moyenne à température ambiante (RT). Évitez les bulles OCT. S’ils apparaissent, poussez-les au bord du moule à l’aide d’une aiguille ou d’une pipette.
  4. Encorps le lobule de foie dans un cryomold rempli d’OCT et placez-le immédiatement sur la glace sèche pour assurer la congélation rapide. Entreposez les cryomolds à -80 oC jusqu’à ce que la cryosection.

2. Cryosection

  1. Transportez des cryomolds sur de la glace sèche pour éviter la dégradation des tissus. Avant d’équilibrer l’équilibre à l’intérieur du cryostat réglé à -20 oC pendant 20 min.
  2. Échantillon d’éjection en appliquant une pression sur la base du cryomold en plastique. Appliquer le liquide OCT pour réchauffer le disque d’échantillon à RT, positionner dans le cryostat et attacher un échantillon de foie incrusté d’OCT. Appliquez une pression douce et attendez 3 min pour que l’OCT gèle en veillant à ce que l’échantillon colle au disque.
    REMARQUE : Évitez de manipuler l’échantillon avec les doigts autant que possible pour éviter la dégradation des tissus.
  3. Verrouillez l’échantillon dans le bras du cryostat et ajustez l’orientation de sorte que le bord de l’échantillon soit parallèle à la lame cryostat. Couper l’échantillon jusqu’à ce que le tissu soit atteint.
  4. Section de l’échantillon à 6 m d’épaisseur. Placer une diapositive étiquetée recouverte de polyamide sur l’échantillon pendant 5 s pour laisser l’échantillon coller sur la glissière. Placez la glissière à RT pendant 3 à 5 min, puis, pour obtenir de meilleurs résultats, passez directement à la section 3.
    REMARQUE : Pour le traitement de plusieurs échantillons congelés frais, des résultats reproductibles ont été obtenus en stockant temporairement des diapositives dans une boîte à glissière sur de la glace sèche jusqu’à ce que tous les échantillons aient été traités. Lorsque vous utilisez cette approche, toutes les diapositives s’équilibrent vers LA RT avant de passer à l’article 3. Des échantillons de paraffine fixe formaline intégrés (FFPE) peuvent être utilisés, bien que l’autofluorescence de fond soit augmentée par cette méthode. Pour passer des échantillons de la FFPE, section à 4 m. Mont en attrapant des sections du bain d’eau de 40 oC sur des toboggans traités en polyamide. Diapositives de chaleur pour 1 h à 60 oC, puis déparaffinize par des lavages RT en série (5 min) dans des bocaux Coplin contenant du xylène (x2), de l’éthanol 100% (x2), 96% (x2), 70% (x1) et dH2O (x1). Pour exposer les antigènes placent des diapositives dans un tampon de citrate pendant 20 min à 90 oC avant de tempérer les diapositives dans PBS à RT. Procédez à l’étape 3.2.

3. Immunolabelling fluorescence

  1. Fixer les sections tissulaires dans un capot de fumée en appliquant 1 ml de paraformaldéhyde (PFA) de 4 % dans PBS pendant 10 min à RT. Transférer les diapositives dans un bocal Coplin rempli par PBS et laver pendant 3 min à l’aide d’agitation douce (répéter 3x).
    REMARQUE : À partir de maintenant jusqu’à la fin du processus d’immunostachation, évitez le séchage de l’échantillon.
  2. Séchez la zone autour de chaque section tissulaire et entourez-vous à l’aide d’un stylo hydrophobe. Perméabilize avec 0,5% surfactant non ionique (c.-à-d., Triton X-100) dans PBS pendant 15 min à RT. Ensuite, laver dans PBS rempli bocal Coplin pendant 3 minutes en utilisant l’agitation douce (répéter 2x).
  3. Bloquer à l’aide d’une solution filtrée de 1% de sérum bovin albumin (BSA), 5% sérum de cheval, 0,2% surfactant non ionique dans PBS (pour au moins 1 h à RT).
  4. Incubate avec l’anticorps primaire HNF4MD dilué dans le tampon de blocage pendant la nuit à 4 oC dans une chambre de coloration humide foncée (voir Tableau des matériaux pour les anticorps et les dilutions spécifiques).
  5. Placer les toboggans dans un bocal Coplin rempli par PBS et laver pendant 3 min à l’aide d’agitation douce (répéter 4x).
  6. Incubate avec Alexa-488 anticorps secondaires conjugués et Hoechst dilué dans filtré 1% BSA et 0,2% surfactant non ionique dans PBS pendant 2 h à RT dans une chambre de teinture humide foncé (voir Tableau des matériaux pour les anticorps et les dilutions spécifiques).
  7. Placer les toboggans dans un bocal Coplin rempli par PBS et laver pendant 3 min à l’aide d’agitation douce (répéter 4x). Laver en ddH2O pendant 3 min en utilisant de l’agitation douce (répéter 2x).
  8. Mount glisse en plaçant deux gouttes de support de montage fluorescent sur un coverlip (24 x 60 mm) et en posant des diapositives dessus, éliminant les bulles en appliquant une légère pression. Pour un stockage à long terme, sceller le housset sur les bords avec du vernis à ongles clair et entreposez-le dans l’obscurité à 4 oC.
  9. Avant de procéder, vérifiez les diapositives à l’aide d’un microscope à fluorescence classique pour assurer une bonne fixation et immuno-lbeling.
    REMARQUE : Voir la figure 2A,B pour les résultats attendus.

4. Acquisition d’images de fluorescence

REMARQUE : Pour cette étape, une plate-forme d’imagerie à haute teneur (Tableau des matériaux) est nécessaire pour prendre en charge l’acquisition automatique d’images de fluorescence.

  1. Allumez le système d’imagerie et ouvrez un nouveau protocole d’acquisition.
  2. Sélectionnez l’objectif 10x, notez la zone du champ de vision (dans ce cas 0,6 mm2).
  3. Définissez des paramètres pour acquérir des images de fluorescence à l’aide des filtres d’excitation et d’émission appropriés (selon l’étape 3.6). Pour Hoechst et Alexa-488, sélectionnez les canaux "DAPI" et "GFP" avec des émissions de 390/18 et 438/24 nm et 432,5/48 et 475/24 nm émission, respectivement.
  4. Concentrez l’échantillon et assurez-vous que l’intensité du signal n’est pas saturante. Assurez-vous que la capture d’image se fait avec le même temps d’exposition pour toutes les images ou utilisez un système où l’intensité de la fluorescence est corrigée pendant le temps d’exposition.
  5. Numériser l’échantillon et acquérir suffisamment d’images pour obtenir une couverture complète de la section tissulaire (environ 20 à 50 champs de vision, selon la taille de l’échantillon).
  6. Examinez la base de données d’images, éliminant manuellement (i) les champs mal concentrés, (ii) ceux aux frontières de chaque section tissulaire (pour éviter les calculs de densité cellulaire biaisés), et (iii) ceux contenant des zones pliées/physiquement endommagées de la section tissulaire si elles sont présentes.

5. Analyse automatisée de l’image de fluorescence

REMARQUE : Cette étape nécessite un logiciel appropriéd’analyse d’images (Tableau des matériaux) capable de : (1) d’identifier automatiquement les noyaux étiquetés Hoechst dans les images à 405 nm (segmentation nucléaire), (2) l’évaluation de l’intensité et de la morphométrie nucléaires moyennes de Hoechst, et (3) l’analyse de seuil pour déterminer le statut de fluorescence nucléaire à 488 nm (HNF4MD). Une certaine formation/expertise de base de l’opérateur est nécessaire pour évaluer visuellement et ajuster les paramètres de segmentation et de seuil au sein du programme afin de s’assurer que les noyaux et le statut HNF4MD/- sont parfaitement fermés(figure 2).

  1. Dans le logiciel d’analyse d’images, ouvrez le fichier d’acquisition contenant des images Hoechst (405 nm) et HNF4MD (488 nm) de l’étape 4.5, et créez un nouveau protocole d’analyse.
  2. Définir les longueurs d’onde à utiliser pour la segmentation nucléaire (Hoechst, 405 nm) et pour l’analyse des seuils hépatocyte/NPC (HNF4MD, 488 nm).
  3. Ajuster les paramètres de segmentation nucléaire du logiciel (tels que la « zone nucléaire minimale » et la « sensibilité » de détection nucléaire) pour s’assurer que les noyaux sont parfaitement séparés.
    REMARQUE : Une bonne segmentation des hépatocytes devrait être priorisée par rapport à celle des PNJ. Les noyaux d’hépatocyte sont typiquement arrondis (gamme de taille interquartile : 40 à 64 m2). Les noyaux de PNJ, tels que ceux de l’endothélie sinusoïdale, sont de forme aplatie/elliptique ou irrégulière et généralement plus petites et plus étroitement emballées que celles des hépatocytes (gamme de taille interquartile : 30 à 43 m2). Pour le foie de souris, une superficie minimale de 23 m2 et une « sensibilité » de détection de 65 % ont été utilisées (voir la figure 2C,D pour les résultats attendus). La sensibilité détermine comment les grappes de pixels sont reconnues comme des noyaux individuels en fonction de leur intensité et doivent être testées empiriquement pour chaque échantillon défini par l’utilisateur avant de procéder à l’analyse automatisée de l’image.
  4. Modifier l’intensité du seuil à 488 nm pour assurer une gating optimale des hépatocytes (HNF4MD) et des cellules non parenchymales (HNF4MD-).
    REMARQUE : Voir la figure 2C,D pour les résultats attendus. La valeur de l’intensité du seuil est relative et dépendra de l’efficacité de coloration et des paramètres d’acquisition tels que l’intensité laser. Il doit donc être standardisé par l’utilisateur. Utilisez les cellules HNF4- connues comme les cellules endothéliales et les PNJ périportaires comme un contrôle négatif interne et des noyaux binucléaires hépatocytes comme référence positive pour la coloration. Testez les paramètres d’analyse à l’aide d’un petit nombre d’images pour assurer une bonne segmentation nucléaire et une ségrégation des seuils d’intensité avant d’appliquer les paramètres d’analyse à l’ensemble du jeu de données.
  5. Sélectionnez les paramètres nucléaires suivants à quantifier : (1) zone nucléaire basée sur la coloration Hoechst (m2), (2) le facteur d’élongation nucléaire (RU), (3) le facteur d’élongation nucléaire (rapport moyen de l’axe court du noyau à l’axe long du noyau, lorsqu’un objet centré symétrique [non allongé] a une valeur de 1, (4) Nuc 1/(facteur de forme), signifie l’indice de « rondeur » nucléaire calculé par périmètre 2/(4 x zone). Les valeurs vont de 1 à l’infini, où 1 est un cercle parfait, (5) le statut HNF4 (positif-1 ou négatif-0), et (6) les coordonnées nucléaires x/y basées sur le « centre de gravité » (cg), une méthode pour localiser le centre de l’objet à partir d’images à l’échelle grise avec une précision sous-pixel.
  6. Exécutez l’analyse pour tous les ensembles de données d’échantillons et exportez les données numériques de l’étape 5.5 au logiciel de tableur.

6. Analyse des données

REMARQUE : L’étape d’analyse des données peut être effectuée à l’aide de n’importe quel logiciel de tablement standard.

  1. Calculez les nombres de cellules hépatocytes et non hépatocytes.
    1. Calculer la superficie totale de la section hépatique analysée pour chaque échantillon en multipliant le nombre de champs de vue par la zone de vision (étape 4.2).
    2. En travaillant avec des fichiers de feuilles de calcul générés pour chaque section hépatique, filtrez les données en ne sélectionnant que les noyaux HNF4MD. Calculez le nombre total de noyaux HNF4MD analysés et divisez-le par la superficie totale analysée pour obtenir la densité moyenne des hépatocytes pour chaque échantillon(figure 2F).
    3. Effectuez le même calcul pour les cellules non parenchymales en filtrant la feuille de calcul des cellules HNF4MD(figure 2E).
  2. Calculer la distribution de la taille nucléaire hépatocyte.
    1. À l’aide d’un logiciel de feuille de calcul, filtrez les données pour sélectionner uniquement les noyaux HNF4MD.
    2. Valeurs de parcelle de zone nucléaire dans un histogramme (figure 2G). Réglez la largeur du bac à 5 m2.
      REMARQUE : Les valeurs de fréquence peuvent être corrigées pour la zone (noyau/mm2) par étape 6.1.1.
  3. Effectuez l’analyse du stratagème nucléaire hépatocyte.
    REMARQUE : Les données de la feuille de calcul de l’étape 5.6 sont utilisées pour générer un profil de stratagème nucléaire pour chaque échantillon. Ce processus a été automatisé et peut être exécuté à l’aide d’un logiciel écrit personnalisé qui est librement disponible pour télécharger avec des informations à l’appui et des jeux de données de démonstration àhttps://github.com/lukeynoon(voirFichiers supplémentaires). Le code source est fourni aux utilisateurs qui souhaitent adapter la méthodologie. Une description de l’algorithme, ainsi que des instructions d’installation et d’utilisation sont décrites ci-dessous. Le programme utilise les données des feuilles de calcul pour séparer automatiquement les noyaux d’hépatocytes en deux groupes; (1) ceux avec des noyaux circulaires "simples" et (2) des noyaux non circulaires "complexes" représentatifs des cellules binucléaires avec un ploidy de 2c. La teneur minimale en ADN nucléaire (fonction de la zone nucléaire et de la densité de l’ADN) est ensuite calculée pour tous les noyaux « simples ». Une étape ultérieure calibre alors automatiquement le ploidy nucléaire hépatocyte HNF4MD en utilisant les noyaux HNF4MD comme un contrôle interne connu de 2 à 4N.
    1. Téléchargez et installez un logiciel.
      1. Téléchargez l’application emballée à partir de: https://github.com/lukeynoon
      2. Lancement MATLAB. Naviguez vers l’onglet APP de la piste d’outils, cliquez sur Installer App et ouvrez l’application téléchargée appelée "Ploidy_Application.mlappinstall ". Un message apparaîtra pour confirmer l’installation réussie.
        REMARQUE : L’application est maintenant prête à l’emploi et restera dans l’onglet APP de la recherche d’outils.
    2. Formatez les données d’entrée.
      REMARQUE : Avant l’analyse automatisée du stratagème nucléaire, tous les fichiers de feuilles de calcul contenant des données d’imagerie à contenu élevé (étape 5.6) doivent être stockés et formatés selon les instructions suivantes.
      1. Dans chaque fichier de données exporté (. XLS 97-2004 cahier de travail) de l’étape 5.6, comprennent une feuille appelée "Mesures cellulaires" contenant toutes les données requises pour l’analyse de stratagème énoncée dans les colonnes(figure 3A). Assurez-vous que la disposition de la feuille de calcul, y compris les noms d’en-tête de colonne, reste inchangée par rapport à celle de la figure 3A, car la méthode d’analyse trouve les données correctes de la colonne en recherchant ces noms (voir les jeux de données de démonstration dans les fichiers supplémentaires pour référence). Si, par exemple, le logiciel d’analyse d’images à contenu élevé ne produit pas de colonne « Flux lumineux »(figure 3A), insérez manuellement une colonne « Flux lumineux » au même endroit, c’est-à-dire colonne K et remplissez-la de zéros.
      2. Pour chaque condition expérimentale (p. ex., « Injured-d14 »), fournir un ensemble de données de contrôle, qui sera utilisé pour calculer le contrôle interne pour l’étalonnage du stratagème nucléaire de 2 à 4N (étape 6.3.4.3). Ici, sélectionnez des échantillons de foie de litières adultes non traitées (« Contrôle-d0 »; Figure 3B-D).
      3. Pour les répliques biologiques (par condition), conservez chaque feuille de calcul dans son propre dossier (comme dans la figure 3B). Nommez le dossier préfixe progressivement, par exemple, « Sample1, Sample2, Sample3... SampleN ", selon les noms de fichiers contenus à l’intérieur. Par conséquent, chaque dossier de jeu de données (p. ex., « Contrôle-d0 ») doit contenir une série de sous-plis (« Échantillon1 », « Échantillon2 », etc.) contenant chacun un fichier de feuille de calcul du même nom correspondant.
    3. Exécutez l’application.
      1. Au sein de MATLAB, lancez le « Ploidy_Application » en cliquant sur l’icône dans l’onglet MY APPS de la sortie d’outils(figure 3C). L’interface utilisateur graphique Ploidy_Application (GUI) apparaîtra(figure 3C).
      2. Cliquez sur le bouton Path to control data pour naviguer vers le dossier dans lequel les données de contrôle se réplique résident (par exemple, "Control-d0"). Ce chemin de données apparaîtra ensuite dans l’interface (p. ex., /Utilisateurs/Desktop/Control-d0).
      3. Ensuite, dans le type « préfixe de dossier », le nom à donner aux fichiers de sortie (p. ex., « Échantillon »).
        REMARQUE : Ce préfixe peut être modifié à n’importe quel texte, à condition que les dossiers et les noms de fichiers restent progressivement nommés.
      4. Cliquez sur le bouton Chemin vers d’autres données et naviguez vers le dossier dans lequel les données comparatives se reproduise résident (par exemple, «Injured-d14»). Ce chemin de données apparaîtra ensuite dans l’interface (p. ex., /Utilisateurs/Desktop/Injured-d14).
      5. Cliquez sur Run!. Lorsque l’analyse est terminée, la barre d’état se lit comme suit : « Analyse complète !.. ».
        REMARQUE : La demande fera état, pour chaque échantillon, de la stratification des noyaux « simples » en 2n, 2n-4n, 4n-8n et 8n ' en termes de dénombrement absolu et en pourcentage du total(figure 3D). Ces fichiers seront automatiquement enregistrés dans chaque dossier d’échantillon comme: "Count_2n.txt", "Count_2n_to_4n.txt ", "Count_4n_to_8n.txt", "Count_8n_and_higher.txt", "Percentage_2n.txt", "Percentage_2nto4n.txt", "Percentage_4nto8n.txt", "Percentage_8n_and_higher.txt". Le Ploidy_Application enregistrera automatiquement une liste pour chaque échantillon, de toutes les estimations de stratagèmes individuelles pour les noyaux « simples » hépatocytes et non-hépatocytes dans « Ploidy_All_Hepatocytes.txt » et « Ploidy_NonHepatocytes.txt ». Pour l’ensemble de données de contrôle, la méthode enregistre également les seuils minimaux de contenu d’ADN calculés pour la stratification du stratagème (voir l’étape 6.3.4.3.7) dans un fichier nommé "Normalised_Thresholds_Control". Enfin, l’application produira un dossier pour le contrôle et les données de l’état comparatif sélectionnée appelées « Résumé ». Ce dossier contient deux sous-plieurs, "Ploidy" et "Stratification" qui contiennent les moyennes de tous les échantillons fournis(figure 3D).
    4. Description de la méthodologie.
      REMARQUE : La section suivante décrit en détail la méthodologie utilisée par le logiciel d’analyse du ploidy nucléaire. Si l’utilisateur choisit de ne pas utiliser l’application, ces étapes peuvent être suivies à l’aide d’un logiciel de feuille de calcul pour calculer manuellement le profil de stratagème nucléaire.
      1. Séparer les noyaux en «simple» ou «complexe» selon la morphométrie nucléaire.
        1. Calculez un « indice de circularité » pour tous les noyaux, défini comme le « facteur d’allongement » nucléaire divisé par le « Nuc 1/(facteur de forme) », où une valeur de 1,0 indique un cercle parfait.
          REMARQUE : « L’allongement nucléaire » et le « Nuc 1/(facteur de forme) » sont deux mesures distinctes de la « circularité » d’un objet qui évaluent des critères morphométriques complémentaires et non chevauchants. Le premier mesure les axes longs et courts d’un objet, tandis que le second compare la longueur du périmètre d’un objet à celle de sa zone. Pour renforcer la définition de la circularité nucléaire utilisée dans ce protocole, ces deux mesures ont été combinées en un seul « indice de circularité ». Une approche antérieure pour estimer la ploidie nucléaire à l’aide de la méthodologie décrite n’utilisait que l’allongement nucléaire17. Bien que des résultats acceptables aient été obtenus à l’aide de cette approche, les auteurs ont observé qu’un « indice de circularité » composite améliore la discrimination des noyaux choisis manuellement par des hépatocytes mononucléaires et binucléaires (données non montrées).
        2. Classer les noyaux avec un indice de circularité de 0,8 comme «complexe» et ceux -gt; 0.8 comme «simple».
      2. Estimer le contenu « minimal » de l’ADN (m) pour tous les noyaux « simples ».
        1. Calculer le rayon nucléaire (r) à l’aide de la formule :
        2. Calculer le volume nucléaire (v) à l’aide du volume d’une formule de sphère :
        3. Générer une valeur relative pour le contenu minimal de l’ADN (m) à l’aide de la formule :
      3. Calibrer l’ensemble de données à l’aide des noyaux NPC (HNF4MD) comme un contrôle interne de 2 à 4N.
        REMARQUE : Les PNJ ont un contenu d’ADN de 2 à 4N selon l’état du cycle cellulaire. Par conséquent, la valeur moyenne du contenu génétique « minimal » de PNJ (PNJm)augmente avec les blessures(figure 4A). L’erreur d’étalonnage est minimisée en établissant une limite supérieure de PNJm représentant un seuil de 4c(figure 4B).
        1. Dans la feuille de calcul, sélectionnez uniquement les noyaux de PNJ avec des valeurs pour "m" qui se trouvent dans 1 déviation standard (SD) du mode (ce filtre le bruit d’une éventuelle erreur de segmentation).
        2. Dans cette plage filtrée, examinez les zones nucléaires et leurs intensités moyennes correspondantes Hoechst(figure 4C).
        3. Estimez la plus petite zone nucléaire dans cette plage filtrée avec l’intensité maximale de Hoechst nucléaire (c.-à-d., le point où la ligne de la courbe change de direction dans le jeu de données filtré comme illustré par le cercle rouge de la figure 4C). Cette valeur représente un état de transition (t) de 2N à 4N au-dessus duquel l’échantillonnage des noyaux de 4c prédomine plus de 2c noyaux, ce qui entraîne une maxima d’intensité moyenne hoechst.
          REMARQUE : Cette valeur est automatiquement déterminée par le logiciel ; toutefois, les utilisateurs de feuilles de calcul peuvent sélectionner manuellement ce point comme la taille transitoire.
        4. Calculez le contenu minimal de l’ADN représenté par cette taille transitoire (tm) en suivant l’étape 6.3.4.2.
        5. Pour estimer l’épaule 4N du jeu de données NPCm, ajoutez 1 SD à la valeur de tm. Le nombre qui en résulte (figure 4B) décrit la limite supérieure de la teneur minimale en ADN de PNJ à utiliser pour la stratification du ploidy nucléaire (S4c).
        6. Étapes répétées 6.3.4.3.1-6.3.4.3.5 pour tous les échantillons de "contrôle".
          REMARQUE : Par exemple, dans la figure 3,les foies témoins non blessés (« Contrôle-d0 ») sont utilisés comme condition de contrôle.
        7. Calculer un seuil moyen de stratification de 4c (S4c) pour les échantillons de « contrôle » et l’utiliser pour extrapoler les limites 2c (S2c) et 8c (S8c) pour un contenu minimal d’ADN (m). Les seuils de stratification sont automatiquement générés et stockés par le logiciel (étape 6.3.3.3).
          REMARQUE : Selon la conception de l’étude, les valeurs moyennes de seuil de stratification peuvent être calculées pour chaque condition ou pour des conditions spécifiques (p. ex., foie de contrôle sain). Cependant, le logiciel d’analyse du ploidy nucléaire exige que l’un des 2 fichiers soit désigné comme « contrôle » aux fins du calcul des valeurs relatives du stratagème.
        8. Calculez une valeur de stratagème pour tous les noyaux en utilisant la valeur S2c générée à l’étape 6.3.4.3.7 selon :
        9. Stratifier les noyaux d’hépatocyte « simple » (HNF4MD) en tranches de 2c/4c/8c/8c selon les critères suivants : « 2c » HNF4MD "4c" HNF4MD à 2 lt; p 4; "8c" HNF4MD à 4 lt; p 8; HNF4md de 8 ans et 8 h 00
        10. Pour reconstruire le modelage spatial des sous-groupes de ploidy, séparer les données nucléaires dans chaque feuille de calcul de l’échantillon en fonction des champs correspondants dans lesquels ils ont été acquis. Ensuite, utilisez les coordonnées nucléaires x/y associées (de l’étape 5.5) aux sous-groupes de ploidy de parcelle en 2D(figure 5C).

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Representative Results

Cette méthode a été utilisée pour mesurer l’impact des lésions cholestatiques sur le foie de souris adulte en nourrissant les animaux pendant 0-21 jours avec un régime hépatoxique contenant 0,1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC)17. L’alimentation chronique de DDC a comme conséquence des dommages hépatocellulaires ont augmenté le stratagème et l’expansion périportaire des PNJ. L’utilisateur doit être conscient que la souche de souris et les différences dépendantes de l’âge peuvent exister dans le stratagème nucléaire et que toutes les analyses ont été effectuées à l’aide de souris femelles adultes C57BL/6 âgés de 12 à 16 semaines.

Après l’immunolabelling HNF4MD (article 3 du protocole), il est important de vérifier toutes les diapositives à l’aide de la microscopie à fluorescence conventionnelle, afin d’assurer une fixation et une coloration de bonne qualité(figure 2A). Le frottis ou le flou de Hoechst peut indiquer une fixation inadéquate ou une dégradation de l’échantillon avant la fixation(figure 2B), auquel cas revenir à l’article 2 du protocole et raccourcir le temps entre la section et la fixation (étape 3.1). L’immunoétique réussie avec l’anticorps HNF4MD peut facilement être évaluée à ce stade par une discrimination claire des noyaux d’hépatocytes étiquetés positivement, généralement plus grands et plus arrondis que ceux des PNJ(figure 2A). Les noyaux endothéliaux aplatis/elliptiques dans le parenchyme, ou des taches denses de cellules qui se développent dans les zones périportales suivant les dommages de DDC peuvent servir de référence visuelle utile pour identifier HNF4- NPC lors de l’évaluation du succès/échec de l’immunostaining.

La ségrégation nucléaire et les paramètres de seuil HNF4MD (étapes 5.2-5.4) devraient être soigneusement optimisés avant l’analyse automatique de l’image (étape 5.6) pour refléter largement le modèle visuel de l’immunostaining observé par la microscopie à fluorescence conventionnelle à la fin de la section du protocole 3(figure 2C). Des exemples de segmentation nucléaire optimale par rapport à la segmentation sous-optimale et de protocoles de seuil HNF4MD sont résumés dans la figure 2D. Suite à l’analyse d’image (étape 6.1.3), les données devraient refléter un nombre croissant de PNJ dans le foie avec des dommages de DDC(figure 2E), de 52 % à 2,0 % des noyaux dans les foies témoins à 72,8 % - 1,4 % après 21 jours de traitement par DDC. Les hépatocytes représentent 48,0 % et 2,0 % des noyaux totaux dans les foies témoins, en accord avec les analyses antérieures de l’histologie du foie montrant que les hépatocytes occupent 70 à 85 % du volume tissulaire, mais seulement 45 à 50 % du total des cellules hépatiques18,,19. Une réduction faible mais significative du nombre de noyaux HNF4MD est observée au cours des 14 premiers jours d’alimentation DDC(figure 2F). Une parcelle de distribution de fréquences de la zone nucléaire hépatocyte (étape 6.2) montre une zone nucléaire HNF4MD de pointe dans les foies témoins dans la plage de taille de 40 à 50 m2, et un changement clair de la taille du nucléaire après une blessure au DDC(figure 2G); compatible avec l’augmentation du ploidy et de l’hypertrophie hépatocellulaire12.

Dans les foies témoins sains (jour 0), 63,4 % et 1,7 % des noyaux HNF4MD ont une morphométrie circulaire « simple »(figure 5A). Ce chiffre diminue à 46,8 % à 5,7 % (P - 0,042) après 21 jours de dommage à la DDC, ce qui reflète une complexité accrue de la morphométrie nucléaire vraisemblablement associée au déplacement entre les états de ploidy pendant la polyploidisation (voir « Interprétation de la morphométrie nucléaire » ci-dessous). Des exemples représentatifs de distributions de ploidy nucléaire obtenus à l’aide de cette méthode dans les sections de foie de contrôle sont montrés dans la figure 5A, qui décrit comment l’interpolation du contenu de l’ADN permet la stratification des cellules individuelles dans un seul échantillon. Des valeurs moyennes pour les sous-ensembles de cellules « complexes » et « simples » HNF4MD sont également affichées(figure 5A). Les données sont compatibles avec les estimations précédentes de la polyploidie dans 80 à 90% des hépatocytes murins adultes2. La fréquence des noyaux complexes (36,6 % et 1,7 %) dans les foies de contrôle se rapproche également de celui des cellules binucléaires (35%)20, bien que les données devraient être strictement considérées comme une mesure du stratagème nucléaire plutôt que cellulaire (voir "Interprétation de la morphométrie nucléaire" ci-dessous). La comparaison du stratagème relatif entre les groupes traités au moment du contrôle (jour 0) et du DDC devrait refléter une perte importante de noyaux hépatocytes de 2c et 4c avec des blessures ainsi qu’un nombre accru de cellules de8c (figure 5B). Les informations de position relatives pour chaque sous-groupe de ploidy peuvent être interrogées par parcelle de diffusion de coordonnées x-y associées à chaque noyau dans le jeu de données ou en récupérant l’emplacement 2D de sous-ensembles hépatocytes particuliers dans le logiciel d’analyse d’images à contenu élevé(figure 5C).

Étalonnage
Pour évaluer la validité de la méthode d’étalonnage des PNJ utilisée, la double immunobeling des sections hépatiques a été effectuée à l’aide d’anticorps à HNF4MD et marqueur de prolifération Ki-67(figure 6A,B). Ces données ont montré l’enrichissement pour Ki-67, qui étiquette les cellules dans toutes les phases actives du cycle cellulaire, sur le côté droit de la courbe minimale de distribution d’ADN NPC (entre S2c et S4c) - où on s’attendrait à ce que les PNJ reproduisent l’ADN et ont donc le ploidy de 2c(figure 6A). Après l’étalonnage interne de tous les échantillons de foie de contrôle et de s’enorcles étudiés, le Ki-67, a été considérablement enrichi (P’lt; 0,0001) dans des noyaux «simples» de PNJ avec une ploidy estimée à 17,2c (82,5 % - 6,6 % SD, n - 12) par rapport à ceux avec le ploidy de 2c (17,5 % - 6,6 % SD, n - 12) (figure 6B), indiquant l’étalonnage ploidy. Ces données confirment la validité de la méthode utilisée. En outre, en supposant un seuil précis de Ki67, ils fournissent un aperçu quantitatif de la mesure dans laquelle les masques nucléaires subéquatoires des groupes de ploidy plus élevés "contaminer" les groupes ci-dessous.

Pour tester davantage la validité de la méthode d’étalonnage du PNJ, un étalonnage externe a été introduit sur la base du volume nucléaire précédemment rapporté des hépatocytes 2N de souris (155,8 m3)14. Lorsque ce chiffre a été utilisé en combinaison avec une valeur moyenne de l’intensité Hoechst pour HNF4a- noyaux l’estimation résultante pour le ploidy d’hépatocyte moyen dans les foies témoins était indiscernable de celle de l’étalontor interne (S2c) (figure 6C). En outre, les estimations de la ploidie hépatocyte moyenne chez la souris de la souche de souris C57BL/6 d’âge comparable, étaient également similaires, confirmant que les connaissances empiriques antérieures de la taille nucléaire d'2N d’hepatocyte ne sont pas exigées, rendant cette méthodologie commandée à l’interne pour estimer la ploidy nucléaire entièrement autonome.

Interprétation de la morphométrie nucléaire
La méthode décrite fournit une lecture de stratagème pour les noyaux hépatocytes avec la morphométrie circulaire « simple ». L’exclusion des noyaux « complexes » est fondée sur l’hypothèse qu’elles représentent une proportion d’hépatocytes binucléaires avec des masques nucléaires qui se chevauchent ou qui touchent, ce qui rend la détermination précise du ploidy pour ce sous-ensemble plus difficile(figure 7A). Fait important, la ségrégation des noyaux selon la circularité ne permet pas à l’utilisateur de distinguer entre les noyaux d’hépatocytes mononucléaires et ceux des cellules binucléaires, dans lesquels deux noyaux de stratagème similaire sont clairement séparés à l’intérieur de la cellule. Ceci a été testé empiriquement en sélectionnant manuellement les cellules binucléaires et mononucléaires à partir des jeux de données d’image et en évaluant leur ségrégation par l’algorithme(figure 7B). Les noyaux d’hépatocytes binucléaires qui étaient physiquement proches(figure 7C)mais « ne touchant pas » ont été classés par l’algorithme comme « simples », tandis que ceux qui étaient « touchants » étaient clairement discriminés comme étant « complexes ». Par conséquent, cet essai ne fournit pas une lecture du stratagème cellulaire dans le foie, étant donné que les noyaux des cellules binucléaires sont subdivisés entre les sous-classes « simples » et « complexes » (voir Discussion). Cependant, un aperçu de la commutation entre les états de ploidy cellulaire et nucléaire peut être acquise à partir de ces données simplement en traçant des histogrammes de morphométrie nucléaire et de taille nucléaire et en appliquant un modèle de la façon dont les états « complexes » et « simples » sont passés en transition pendant la polyploidisation(figure 7D). Dans les foies de contrôle, trois phases (I-III) de morphométrie nucléaire sont clairement observées(figure 7E). Ils représentent respectivement le regroupement de masques nucléaires circulaires 2N (I), 4N (II) et 8N (III) (comme l’illustre la figure 7D). Les hépatocytes mononucléaires 16N sont extrêmement rares dans les foies de souris adultes16,18,21, d’où la 16N groupe de ploidy cellulaire est composé presque entièrement de cellules binucléaires avec des noyaux 8N, situés à l’intérieur, et à droite, de la phase III(figure 7E), expliquant la baisse de la circularité à droite de la phase III. Fait intéressant, sur blessure (jour DDC 14), un changement quantitatif vers une complexité accrue ("binuclearity") commence dans les phases I (reflétant 2n à 2x2n) et les phases III (reflétant 8n à 2x8n), avant qu’il ne soit finalement consolidé dans les trois phases (I III). Les auteurs spéculent que ce changement vers la complexité accrue est dû à un ploidy cellulaire accru résultant de la cytokinésie au point mort, tandis que à droite de la phase III la tendance opposée est observée, due à la représentation accrue des cellules mononucléaires circulaires 16N dans le foie blessé due à l’enplidorecation. Ces observations devront bien sûr être testées en adaptant la méthode pour tenir dûment compte de la ploidie cellulaire (voir Discussion).

Figure 1
Figure 1 : Résumé du flux de travail. Le tissu hépatique est récolté (1), cryosectionné (2), fixe et immuno-étiqueté avec un anticorps HNF4MD permettant de discriminer les cellules parenchymales et non parenchymales (NPC) (3). Une fois traités, les échantillons sont numérisés à l’aide d’une plate-forme d’imagerie à haute teneur en images à l’aide de capture d’images automatisée (4) et d’analyse (5). Les cellules sont segmentées par la fluorescence nucléaire Hoechst et le seuil d’immunofluorescence HNF4MD. Ensuite, la zone nucléaire de Hoechst (« A ») et la circularité (« C ») sont calculées. Enfin, les données sont analysées (6); Les noyaux hNF4MD- PNJ sont quantifiés (i) et les noyaux hépatocytes HNF4MD sont séparés en deux sous-ensembles (« simples » et « complexes ») selon la circularité nucléaire (ii). L’interpolation du stratagème nucléaire hépatocyte est ensuite effectuée pour tous les noyaux « simples » en fonction du rayon nucléaire (r) et signifie l’intensité de fluorescence Hoechst (en tant que proxy pour la densité d’ADN nucléaire) (iii). Les données sont ensuite stratifiées à l’aide des PNJ comme un calibrateur 2N interne (iv) avant de compiler un résumé d’échantillon (v). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Analyse d’image à contenu élevé et profilage cytométrique du foie de souris pendant l’alimentation chronique de DDC. (A) Une image confocale représentative de la coloration d’immunofluorescence HNF4MD/Hoechst du foie de souris adulte après 21 jours d’alimentation avec un régime contenant 0,1 % de DDC ; l’image montre des noyaux d’hépatocytes arrondis HNF4MD (« H ») et l’expansion des PNNF HNF4MD dans les zones entourant la veine du portail (« PV »). (B) Exemples de colorations optimales (« correctes ») et sous-optimales (« incorrectes ») de Hoechst nucléaires indiquant une mauvaise fixation. (C) Utilisation de la plate-forme d’analyse d’images à haut débit pour séparer les hépatocytes et les PNJ selon la coloration nucléaire Hoechst et l’immunolabelling HNF4. Les masques logiciels (lignes rouges/vertes) montrent comment les noyaux sont correctement segmentés en fonction de la fluorescence hoechst et triés en hépatocytes (MD) ou PNJ (-) selon le statut HNF4MD. (D) Un guide pour optimiser la configuration pour l’analyse segmentation/seuil. Les masques nucléaires superposés reconnus par le logiciel sont indiqués par les lignes vertes/bleues pour la segmentation nucléaire et le vert/bleu (HNF4MD) ou le rouge/bleu (HNF4MD-) pour l’analyse des seuils (H et hépatocyte). Dépannage : Sensibilité à la détection nucléaire trop faible (i), ou trop élevée (ii). Seuil pour HNF4md réglé trop bas (iii), ou trop élevé (iv). (E,F) L’analyse quantitative des noyaux de NPC et d’hépatocyte pendant l’alimentation de DDC : (E) HNF4 et (F) les densités nucléaires de HNF4MD sont comparées à la période de traitement de DDC (jours). Au total, 5,7 x 105 cellules ont été analysées, à partir de 4 à 6 animaux par point de temps. Les données sont présentées comme moyennes ' SEM. 'P 'lt; 0.01 et 'P 'lt; 0.001. ANOVA à sens unique a été utilisé pour comparer les moyens. Les valeurs de signification P ont été calculées à l’aide du test de différence (LSD) le moins important de Fisher. (G) Distribution de fréquences de la zone nucléaire HNF4MD pendant le traitement de DDC. Les données montrent un changement droit dans la zone nucléaire hépatocyte pendant les dommages compatibles avec l’hypertrophie cellulaire et la polyploidisation. Au total, 2,5 x 105noyaux HNF4MD ont été analysés, à partir de 4 à 6 animaux par point de temps. Ce chiffre a été modifié à partir de Manzano-Nàez et al.17. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Analyse automatisée du stratagème nucléaire hépatocyte à l’aide de logiciels écrits personnalisés. (A) Capture d’écran montrant le formatage correct des données de feuilles de calcul pour l’entrée dans le logiciel d’analyse de stratagème nucléaire. Les colonnes contenant des données essentielles (étape 5.5 du protocole) sont mises en évidence jaune. Tous les titres de colonne doivent correspondre avec précision à ceux indiqués. (B) Capture d’écran montrant comment les fichiers de feuilles de calcul individuels contenant des données provenant de répliques biologiques («Échantillon1», «Échantillon2», etc.) doivent être nommés et organisés en sous-dossiers pour chaque condition (intitulé « Contrôle-d0 » et « Blessé-d14 » dans cet exemple). (C) Capture d’écran après l’installation réussie de l’application ploidy (cercle rouge). Lorsque l’application est lancée (en cliquant sur "Ploidy_Appl..") dans l’onglet MY APPS de la sortie d’outils, le "Ploidy_GUI" apparaît (panneau inférieur). Le nom de l’expérience (« Échantillon ») et les chemins vers le contrôle (p. ex., « Contrôle-d0 ») et les ensembles de données de test (p. ex., « Blessés-d14 ») sont entrés avant de cliquer sur Run. Le logiciel calcule, calibre et stratifie le stratagème nucléaire pour tous les échantillons utilisant le jeu de données « Control-d0 » pour générer des seuils pour un contenu minimal d’ADN. (D) La sortie de données de Ploidy_Application indique les fichiers de données individuels automatiquement enregistrés dans chaque dossier d’échantillon (i) contenant des nombres absolus et en pourcentage de noyaux « simples » dans chaque groupe de ploidy. Pour chaque condition (dans ce cas,« Contrôle-d0 » et « Blessé-d14 »), un dossier sommaire est également généré automatiquement contenant des estimations moyennes de stratagème nucléaire pour tous les noyaux « simples » et non hépatocytes (ii) et une ventilation de la façon dont la ploidy nucléaire est stratifiée pour chaque échantillon (iii). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : L’utilisation des PNJ comme étalonnage interne de stratagème. (A) Graphique montrant l’impact des dommages de DDC sur le contenu minimal moyen d’ADN (m) des noyaux d’hépatocyte (HNF4MD) et de PNJ (HNF4MD-). Toutes les données sont normalisées au jour 0 PNJ (n - 4 animaux par point de temps). (B) Histogramme décrivant la distribution des valeurs de PNJm dans un seul échantillon représentatif de foie (jour 0, total de 7 180 noyaux). Le schéma (ci-dessus) montre comment les masques circulaires de PNJ peuvent dériver des cellules avec un contenu d’ADN de 2 à 4c. L’objectif de la méthode d’étalonnage est de définir le seuil de stratification représentant 4c (S4c) à la limite supérieure de la distribution NPCm (ligne pointillée), tout en minimisant le bruit dû aux erreurs de segmentation à l’extrême de la courbe de distribution. (C) Des changements dans l’intensité moyenne de Hoechst et la zone nucléaire pour les noyaux de PNJ (HNF4-) sont tracés. Pour éviter l’erreur de segmentation, seuls les noyaux dont la valeur NPCm correspondante est de moins de 1 SD de la valeur du mode NPCm sont scrutés (boîte jaune). Dans cette plage, la taille de transition de 2c à 4c (t) est calculée et utilisée comme point d’ancrage dans les données pour estimer le S4c. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Analyse in situ à haut débit du ploidy nucléaire dans le foie de souris pendant l’alimentation chronique de DDC. (A) Analyse du foie adulte témoin à l’aide de la méthodologie décrite. Les noyaux hépatocytes HNF4MD provenant de sections hépatiques 2D sont subdivisés selon la circularité nucléaire de Hoechst en deux groupes : « simple » et « complexe ». (En haut) Des images représentatives de fluorescence Hoechst des cellules appartenant à ces deux groupes sont montrées. (Gauche) Scatterplot montrant la stratification des noyaux HNF4MD simples à partir d’un échantillon (jour 0) selon la valeur du ploidy interpolé, la zone nucléaire et l’intensité nucléaire moyenne Hoechst. (Droite) Graphique à tarte détaillant la dégradation typique des cellules HNF4MD dans le foie de contrôle (jour 0) indiquant les proportions de chaque sous-classe de ploidy nucléaire. Au total, 6,7 x 104 noyaux HNF4MD de 4 animaux ont été analysés. (B) Impact des dommages au foie de DDC sur le ploidy nucléaire hépatocyte par analyse in situ de haut débit. Les graphiques démontrent la diminution relative de la proportion de noyaux hépatocytes de 2c et 4c dans les 14 premiers jours de l’alimentation de DDC tandis que les noyaux polyploïdes de 8c augmentent considérablement en nombre. Au total, 1,5 x 105 noyaux HNF4MD ont été analysés (n - 4 animaux par point de temps). Les données sont présentées comme moyennes ' SEM. 'P 'lt; 0.01 et 'P 'lt; 0.001. ANOVA à sens unique a été utilisé pour comparer les moyens. Les valeurs de signification P ont été calculées à l’aide du test de comparaison multiple de Tukey. (C) Exemple pour montrer comment les sous-classes de ploidy nucléaire peuvent être suivis spatialement dans le parenchyme en utilisant cette méthode, en interrogeant des données d’imagerie à haute teneur avec les mêmes critères quantitatifs utilisés pour la stratification ploidy (circularité, taille nucléaire et intensité moyenne Hoechst). Les images de fluorescence Hoechst sont montrées avec des masques logiciels (points rouges) marquant 2c noyaux dans le foie à deux points de temps pendant l’alimentation chronique de DDC (jour 14 et 21). La veine du portail (ligne pointillée bleue) et les zones périportaires dans lesquelles les PNJ se développent (ligne jaune) sont indiquées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Évaluation critique de la méthode d’étalonnage du PNJ. (A,B) Proliférant PNJ sont classés avec succès avec un score de ploidy de 2c. ( A )Histogrammede contenu minimal d’ADN de PNP des foies témoins immunolacés avec des anticorps à HNF4 et marqueur de prolifération Ki-67 (n - 4, les données sont présentées comme moyenne - SEM). Des seuils de stratification pour 2c (S2c) et 4c (S4c) sont indiqués. (B) La stratification des PNJ selon la méthodologie décrite entraîne un enrichissement significatif de l’immunolabelling Ki-67 dans les noyaux attribué un score de ploidy de 2c (n - 12). Les données sont présentées comme moyennes - SEM. Unpaired t test a été utilisé pour comparer les moyens de 'P 'lt; 0.0001. (C) Validation externe de la méthode d’étalonnage de PNJ. Les estimations de la ploidy nucléaire hépatocyte moyenne obtenue à l’aide de la méthode interne de calibrier de PN ont été comparées à celles obtenues par étalonnage des mêmes échantillons (Cpateur C57BL/6 foie de souris 3 à 4 mois, n - 4) avec un volume nucléaire connu pour les hépatocytes 2N14. Les données sont également présentées à partir de deux analyses indépendantes21,22 décrivant le stratagème nucléaire hépatocyte de souris de la même souche à l’âge de 2-6 mois (montré à droite de la ligne pointillée). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : La morphométrie nucléaire hépatocyte entretient une relation « complexe » avec le stratagème cellulaire. (A) Résumé de la façon dont le ploidy cellulaire hépatocyte (2N, 4N, 8N et 16N) est partiellement séparé par l’analyse 2D de la morphométrie nucléaire. Les cellules binucléaires (rouges) sont subdivises entre les morphometries « simples » (« S ») et « complexes » (« C ») selon que les noyaux semblent toucher ou non. (B,C) Des hépatocytes individuels ont été sélectionnés et analysés manuellement pour la morphométrie nucléaire et l’espacement internucléaire. (B) Les hépatocytes binucléaires avec des noyaux « touchants » étaient « complexes » (100 % à 0,8), tandis que les cellules mononucléaires (noir) et les hépatocytes binucléaires avec des masques nucléaires non touchants étaient « simples » (94 % et 0,8). (C) les noyaux « simples » des hépatocytes binucléaires pouvaient être distingués de ceux des cellules mononucléaires en raison de l’espacement internucléaire considérablement réduit (n - 3, total de 94 noyaux analysés). (D) Modèle approximant comment les états de ploidy cellulaire du panneau A pourraient être distribués en termes de morphométrie nucléaire 2D et de zone nucléaire, ce qui entraînerait un regroupement de formes circulaires simples en quatre phases (I-IV). (E) Comparaison des parcelles de morphométrie/taille nucléaire HNF4MD dans les foies témoins (jour 0) et après 14 jours (à gauche) et 21 jours (à droite) de blessures au DDC. Les phases de morphométrie sont indiquées ci-dessus (I-V). Les flèches indiquent des changements dans la morphométrie nucléaire résultant de blessures qui sont compatibles avec la binucléarisation de 2c ("a"), 4c ("b") et 8c ("c") noyaux, ainsi que la mononucléarisation accrue de la classe de ploidy cellulaire 16N (d). Total de 29 à 30 x 103 noyaux analysés par état (n - 2). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Fichiers supplémentaires : jeux de données de démonstration. S’il vous plaît cliquez ici pour afficher ces fichiers.

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Discussion

Une approche à haut contenu et à haut débit pour l’analyse du remodelage et de l’estimation des tissus du ploidy nucléaire hépatocyte dans le foie murin est décrite. Une fois familier avec la procédure, un utilisateur peut traiter, imager et analyser plusieurs échantillons dans une période de 3 à 5 jours, générant de grands jeux de données testables qui fournissent une signature détaillée de la santé hépatique. Compte tenu de la simplicité de la méthode de préparation de l’échantillon, ainsi que le grand nombre de cellules et de tissus analysés (en moyenne 14 mm2/échantillon), les résultats sont robustes et hautement reproductibles. L’automatisation de la capture et de l’analyse d’images élimine également les erreurs de l’utilisateur et les biais potentiels de ces étapes importantes. Une innovation importante est l’utilisation des PNJ comme un étalonnage interne de stratagème qui permet l’évaluation relative de la teneur en ADN nucléaire hépatocyte à la fois à l’intérieur et entre les échantillons. L’incorporation d’une étape d’étiquetage HNF4md est donc essentielle pour fournir à ce protocole un avantage technique unique par rapport aux méthodes 2D publiées précédemment3,12,22. En revanche, la relative simplicité de la méthodologie par rapport aux flux de travail de reconstruction 3D18 la rend techniquement moins laborieuse et potentiellement plus flexible.

Par rapport à la méthode de précision de la cytométrie de débit, une mise en garde importante à l’extrapolation de la teneur en ADN nucléaire des sections de tissu 2D, est la confiance limitée qui peut être attribuée à la catégorisation des noyaux individuels en ce qui concerne le statut de ploidy. À cela s’ajoute le biais inhérent dans les approches basées sur la SIA pour surreprésenter les petits sous-groupes de ploidy en raison de l’échantillonnage subéquataire. Toutefois, en normalisant les données à une norme interne et en adoptant une approche importante fondée sur la population, l’erreur due à ces effets est atténuée et comparable d’un échantillon à l’autre. Les hépatocytes sont caractérisés par une morphologie nucléaire très arrondie, par rapport à par exemple les PNJ, ce qui signifie qu’ils sont particulièrement favorables à l’estimation précise du contenu de l’ADN basé sur la seule zone transversale nucléaire10,11,14,15,23. L’approche basée sur le SIA a été affinée dans ce protocole pour tenir compte à la fois de la circularité nucléaire et de la densité de l’ADN en intégrant des mesures de morphométrie et une intensité de fluorescence Hoechst, ce qui donne lieu à un descripteur estimé de « contenu minimal d’ADN » pour les noyaux individuels. Il est important de noter que l’utilisation des PNJ comme contrôle du ploidy de 2 à 4N fournit une norme interne importante pour l’étalonnage et la stratification objectifs de la teneur minimale en ADN nucléaire, ce qui rend la méthodologie décrite applicable aux échantillons de n’importe quelle espèce, ou format, étant donné qu’un anticorps approprié pour HNF4MD (ou marqueur nucléaire hépatocyte similaire) peut être source.

Bien que l’évaluation de la ploidy nucléaire ait été montrée pour fournir des signatures utiles pour la progression de la maladie du foie10,13, afin de vérifier pleinement la diversité des changements de ploidy dans le foie, il serait à la fois souhaitable et nécessaire d’adapter la méthodologie décrite pour tenir compte du périmètre hépatocellulaire et donc de la ploidy cellulaire. La cartographie du stratagème cellulaire a déjà été réalisée par l’étiquetage du périmètre hépatocyte à l’aide de marqueurs tels que la catenine bêta10,13,24, actin12,22 et cytokeratine10,11 dans les échantillons de foie humain et de souris. Cependant, quand ceci a été examiné après la blessure de DDC, le remodelage épithélial dramatique a empêché l’évaluation fiable du périmètre hépatocellulaire à la fois par phalloidin (données non montrées) ou anticorps à la catenine bêta17. Par conséquent, bien que cette approche soit réalisable, elle peut ne pas s’appliquer à tous les modèles de blessures, mais si elle est réalisée permettrait de faire progresser la cartographie de la ploidy cellulaire ainsi que de rendre les estimations de la taille et du nombre d’hépatocytes plus précises. Il demeure également plausible qu’en tenant compte de paramètres nucléaires supplémentaires, tels que l’espacement internucléaire(figure 7C), les cellules mononucléaires puissent être discriminées à partir d’hépatocytes binucléaires « simples » et que la ségrégation des cellules binucléaires « complexes » pourrait être réalisée par des mesures radiales des noyaux que leurs masques 2D contiennent.

Étant donné que des anticorps humains validés HNF4MD existent pour le tissuFFPE 25 et que l’étalonnage interne libère cette méthodologie de toutes les limitations spécifiques à l’espèce, le protocole s’applique presque immédiatement aux échantillons humains. Ainsi, il a un potentiel considérable pour fournir une référence pour l’analyse à haut débit du stratagème nucléaire hépatocyte et des lésions hépatiques dans les maladies humaines. En outre, en multiplexe avec d’autres anticorps, cette méthode peut révéler de nouveaux rôles pour des sous-ensembles d’hépatocytes particuliers et leur réponse aux lésions hépatiques et aux maladies. À cette fin, nous avons combiné avec succès la méthodologie avec l’immunostaining pour le marqueur nucléaire proliférant Ki-67(figure 6), qui permet de glaner des informations utiles - y compris l’identification des populations non proliférantes de 2N des PN pour améliorer l’étalonnage interne du stratagème (midi, données inédites 2019). Par conséquent, en couplant la flexibilité avec les données de position et quantitatives que la méthode fournit, nous suggérons que ses applications futures amélioreront la compréhension du rôle de la polyploïde dans le foie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés par le gouvernement espagnol MINECO subventions BFU2014-58686-P (LAN) et SAF-2017-84708-R (DJB). LAN a été soutenu par une bourse nationale MINECO Ramon y Cajal RYC-2012-11700 et plan GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), et FMN par un étudiant régional ValI-D de la Generalitat ACIF de Valence/2016/020. RP tient à remercier le professeur Ewa K. Paluch pour son financement. Nous remercions la Dre Alicia Martinez-Romero (service de cytométrie CIPF) pour l’aide de la plate-forme IN Cell Analyzer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) TestDiet 1810704 Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) Invitrogen A11055 Dilution 1:500
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cryostat Leica CM1850 UV Leica biosystems CM1850 UV Tissue sectioning
Fluorescent Mounting medium Dako S3023
GraphPad Prism GraphPad Software Prism 8 Statistical software for graphing data
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Final concentration 5 µg/mL
IN Cell Analyzer 1000 GE Healthcare Bio-Sciences Corp High-Content Cellular Imaging and Analysis System
MATLAB MathWorks R2019a Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy
Microscope coverslides VWR International 630-2864 Size of 24 x 60 mm
Microsoft Office Excel Microsoft Speadsheet software
OCT Tissue Tek Pascual y Furió 4583
Paraformaldehyde Panreac AppliChem 141451.121
Pen for immunostaining Sigma-Aldrich Z377821-1EA 5mm tip width
Polysine Microscope Slides VWR International 631-0107
Rabbit polyclonal Anti-HNF4α Thermo Fisher Scientific PA5-79380 Dilution 1:250 (alternative)
Rabit polyclonal Anti-HNF4α Santa Cruz Biotechnology sc-6556 Dilution 1:200 (antibody used in the study)
Tween 20 Sigma-Aldrich P5927

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References

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Médecine Numéro 158 foie polyploïde hépatocyte imagerie à haute teneur hépatologie hépatocyte facteur nucléaire 4 alpha (HNF4MD)
Une méthode in situ à haut débit pour l’estimation de la ploidy nucléaire hépatocyte chez les souris
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Manzano-Núñez, F., Peters, … More

Manzano-Núñez, F., Peters, R., Burks, D. J., Noon, L. A. A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice. J. Vis. Exp. (158), e60095, doi:10.3791/60095 (2020).

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