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Medicine

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

Published: April 19, 2020 doi: 10.3791/60095
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1,3
1Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)

Summary

Wir präsentieren eine robuste, kostengünstige und flexible Methode zur Messung von Veränderungen der Hepatozytenzahl und der Kernploidie in festen/kryokonservierten Gewebeproben, die keine Durchflusszytometrie erfordern. Unser Ansatz bietet eine leistungsstarke probenweite Signatur der Leberzytologie, ideal für die Verfolgung des Fortschreitens von Leberverletzungen und Krankheiten.

Abstract

Wenn die Leber verletzt ist, hepatozyten Zahlen abnehmen, während Zellgröße, Kerngröße und Ploidy zu erhöhen. Die Ausdehnung von nicht-parenchymalen Zellen wie Cholangiozyten, Myofibroblasten, Vorläufern und Entzündungszellen weist auch auf chronische Leberschäden, Gewebeumbau und Krankheitsprogression hin. In diesem Protokoll beschreiben wir einen einfachen Ansatz mit hohem Durchsatz zur Berechnung von Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung der Leber, die mit Verletzungen, chronischen Krankheiten und Krebs verbunden sind. Wir zeigen, wie Informationen aus zweidimensionalen (2D) Gewebeabschnitten verwendet werden können, um hepatozyte Kernploidie innerhalb einer Probe zu quantifizieren und zu kalibrieren und es dem Benutzer zu ermöglichen, bestimmte Ploidie-Teilmengen innerhalb der Leber in situ zu lokalisieren. Unsere Methode erfordert Zugang zu festem/gefrorenem Lebermaterial, grundlegenden immunzytochemischen Reagenzien und jeder Standardplattform für bildende Bildgebungsmittel mit hohem Inhalt. Es dient als leistungsstarke Alternative zu Standard-Flow-Zytometrie-Techniken, die Eine Unterbrechung des frisch gesammelten Gewebes, Verlust räumlicher Informationen und potenzielle Disaggregationsverzerrung erfordern.

Introduction

Hepatozyten in der Säugetierleber können einer stockenden Zytokinese unterzogen werden, um binukleare Zellen zu produzieren, und DNA-Endoreplikation, um polyploide Kerne zu produzieren, die bis zu 16N DNA-Gehalt enthalten. Insgesamt zelluläre und nukleare Ploidie erhöhen während der postnatalen Entwicklung, Alterung und als Reaktion auf verschiedene zelluläre Belastungen1. Der Prozess der Polyploidisierung ist dynamisch und reversibel2, obwohl seine genaue biologische Funktion unklar bleibt3. Erhöhte Ploidie ist verbunden mit reduzierter Proliferativfähigkeit4, genetische Vielfalt2, Anpassung an chronische Verletzungen5 und Krebsschutz6. Hepatozytenploidie Veränderungen treten als Folge von veränderten zirkadianen Rhythmus7, und Entwöhnung8. Vor allem wird das Ploidy-Profil der Leber durch Verletzung und Krankheitverändert 9, und überzeugende Beweise deuten darauf hin, dass spezifische Ploidy-Änderungen, wie erhöhte 8N-Kerne oder Verlust von 2N Hepatozyten, nützliche Signaturen für die Verfolgung der nicht-alkoholischen Fettleber -Progression (NAFLD) Progression3,10oder die differentialen Auswirkungen von Virusinfektionen11.

Im Allgemeinen sind Leberverletzung und Regeneration mit erhöhter Hepatozytenzellgröße und Kernfläche12verbunden, zusammen mit einer reduzierten Gesamtzahl von Hepatozyten, insbesondere solchen mit 2N-DNA-Gehalt10,11. Parenchymale Verletzungen in der Leber gehen häufig auch mit einer Ausdehnung nicht-parenchymaler Zellen (NPCs) einher, einschließlich stromaler Myofibroblasten, Entzünderzellen und bipotenten Lebervorläuferzellen. Hochdurchsatzmethoden, die ein quantitatives zytologisches Profil der parenchymalen Zellzahl und der Kernploidie liefern und gleichzeitig Veränderungen der NPCs berücksichtigen, haben daher ein beträchtliches Potenzial als Forschungs- und klinische Instrumente, um das Reaktionsverhalten der Leber während von Verletzungen und Krankheiten zu verfolgen. Überzeugende jüngste In-situ-Analysen von Ploidy-Spektren in menschlichen Proben des hepatozellulären Karzinoms zeigen auch, dass die Kernploidie innerhalb von Tumoren dramatisch erhöht ist und speziell in aggressiveren Tumorsubtypen mit reduzierter Differenzierung und Verlust von TP5313verstärkt wird. Daher besteht die große Möglichkeit, dass methodische Fortschritte bei der quantitativen Bewertung der Kernploidie bei der zukünftigen prognostischen Profilierung von Leberkrebs helfen werden.

In diesem Protokoll wird eine flexible Hochdurchsatzmethodik für die vergleichende Analyse von Lebergewebeabschnitten von Mäusen beschrieben, die eine detaillierte zytometrische Profilierung von Hepatozytenzahlen, die NPC-Antwort und eine intern kalibrierte Methode zur Schätzung der Kernploidie bietet (Abbildung 1). Hepatozyten unterscheiden sich von NPCs durch Hepatozyten-Atomfaktor 4 alpha (HNF4) Immunlabelling, vor der Charakterisierung der nuklearen Größe und der nuklearen Morphometrie. Der "Minimale DNA-Gehalt" wird für alle kreisförmigen Kernmasken geschätzt, indem die mittlere Hoechst 33342-Intensität (ein Proxy für DNA-Dichte) mit interpoliertem dreidimensionalem (3D) Kernvolumen integriert wird. Hepatozyten minimaler DNA-Gehalt wird dann mit NPCs kalibriert, um ein nukleares Ploidy-Profil zu erzeugen.

Die Bildaufnahme, die nukleare Segmentierung und die Bildanalyse werden mittels hochauflösender Bildgebung durchgeführt, sodass große Bereiche zweidimensionaler (2D) Leberabschnitte mit Zehntausenden von Zellen gescreent werden können. Für die automatisierte Nachbearbeitung von Bildanalysedaten mit hohem Inhalt wird ein kundenspezifisches Programm bereitgestellt, um ein stichprobenweites Ploidy-Profil für alle kreisförmigen Hepatozytenkerne zu erstellen. Dies wird mit kostenlosen Software zum Herunterladen von Software durchgeführt, um kerntechnische Ploidie basierend auf stereologischer Bildanalyse (SIA)10,11,14,15zu berechnen. Die SIA-Methodik wurde zuvor durch Diedurchflusszytometrie als eine genaue, wenn auch mühsame Methode zur Schätzung der Hepatozyten-Kernploidie in der Leber14validiert, wobei die zirkuläre Kernmorphologie und eine monotone Beziehung zwischen nuklearer Größe und DNA-Gehalt vorausgesetzt werden. In diesem Protokoll werden beide nuklearen Parameter durch Diebewertung der nuklearen Morphometrie und der Hoechst 33342-Kennzeichnung gemessen. Auf die Berechnung des "minimalen DNA-Gehalts" für jede Kernmaske folgt die Kalibrierung der Hepatozyten-Kernploidie mit NPCs, die einen bekannten 2-4N-DNA-Gehalt aufweisen und daher als nützliche interne Kontrolle dienen.

Im Vergleich zu herkömmlichen Durchflusszytometriemethoden16 ermöglicht der beschriebene Ansatz die Bewertung der Hepatozyten-Kernploidie vor Ort und erfordert keinen Zugang zu frischem Gewebe oder Disaggregationsmethoden, die die Ergebnisse verzerrt und schwer zu standardisieren sind. Wie bei allen SIA-basierten Ansätzen sind die Kernploidie-Unterklassen >2N durch 2D-Probenahme aufgrund der Schnittung größerer Kerne außerhalb der äquatorialen Ebene unterrepräsentiert. Das gewebeweite Ploidy-Profil beschreibt auch den minimalen DNA-Gehalt für alle kreisförmigen Hepatozyten-Kernmasken und unterscheidet nicht direkt zwischen mononukleären Hepatozyten und binukleären Zellen, die zwei diskrete ("nicht berührende") Kerne derselben Ploidie haben. Die Einfachheit dieses Protokolls lässt jedoch einen beträchtlichen Spielraum für eine Anpassung an zusätzliche Parameter wie den internuklearen Abstand oder die Zellperimeteranalyse, die die Identifizierung binuklearer Zellen erleichtern würde, was eine detailliertere Bewertung der zellulären Ploidie ermöglichen würde.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden zuvor von der CIPF-Ethikkommission genehmigt. Mäuse wurden in einer pathogenfreien Anlage im Centro de Investigacion Principe Felipe (Valencia, Spanien) untergebracht, registriert als Versuchstierzüchter, Anwender und Versorgungszentrum (reg. ES 46 250 0001 002) nach den geltenden europäischen und spanischen Tierschutzvorschriften (FU 53/2013).

1. Gewebeernte und Probenvorbereitung

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt, wie Gewebe ohne vorherige Fixierung oder Kryokonservierung eingefroren wird. Für zuvor fixierte/kryokonservierte Proben fahren Sie mit Abschnitt 2 fort und lassen Sie Schritt 3.1 weg. Alle Analysen wurden mit erwachsenen weiblichen C57BL/6-Mäusen im Alter von 12 bis 16 Wochen durchgeführt.

  1. Opfern Sie Tiere durch Fentanyl/Pentobarbital intraperitoneale Injektion gefolgt von zervikaler Dislokation. Mit der Maus nach oben gerichtet, öffnen Sie die Bauchhöhle und belichten die Leber, indem Sie die Haut mit einer Pinzette greifen und einen vertikalen Schnitt von der Basis des Unterbauchs bis zur Basis des Brustbeins mit einer chirurgischen Schere durchführen.
  2. Entfernen Sie vorsichtig die Gallenblase mit einer feinen Pinzette, sezieren Sie die Leber aus und spülen Sie die ausgewählte Leberlobule in einem 10 cm Petriteller, gefüllt mit Phosphat-gepufferter Kochsaline (PBS).
    HINWEIS: Es wird empfohlen, den gleichen Leberlappen für jedes Tier zu vergleichen, in diesem Fall wurde der Medianlappen verwendet.
  3. Füllen Sie ein beschriftetes Kryomold mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) Medium bei Raumtemperatur (RT). Vermeiden Sie OCT-Blasen. Wenn sie erscheinen, schieben Sie sie mit einer Nadel oder Pipettespitze an den Rand der Form.
  4. Leberlobule in einen gefüllten OCT-Kryomold einbetten und sofort auf Trockeneis legen, um ein schnelles Einfrieren zu gewährleisten. Kryomolden bei -80 °C bis zum Kryosektionen lagern.

2. Kryosektion

  1. Transportieren Sie Kryomolde auf Trockeneis, um Gewebeabbau zu vermeiden. Vor dem Kryosektionsgleichgewicht im Cryostat auf -20 °C für 20 min eingestellt.
  2. Auswerfen der Probe durch Druck auf die Basis des Kunststoff-Kryomolds. Verwenden Sie flüssiges OCT auf warme Probenscheibe bei RT, Position in Kryostat und befestigen Sie eine OCT eingebettete Leberprobe. Tragen Sie sanften Druck und warten Sie 3 min auf OCT, um einzufrieren, um sicherzustellen, dass die Probe auf der Scheibe klebt.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Probe so weit wie möglich mit den Fingern zu behandeln, um dem Gewebeabbau zu entgehen.
  3. Verriegeln Sie die Probe in den Arm des Kryostats und passen Sie die Ausrichtung so an, dass der Rand der Probe parallel zur Kryostatklinge verläuft. In die Probe schneiden, bis das Gewebe erreicht ist.
  4. Schneiden Sie die Probe mit einer Dicke von 6 m ab. Legen Sie einen beschrifteten polyamidbeschichteten Schlitten für 5 s über die Probe, damit die Probe auf den Schlitten kleben bleibt. Platzieren Sie die Folie bei RT für 3 x 5 min, und fahren Sie dann für beste Ergebnisse direkt zu Abschnitt 3.
    HINWEIS: Für die Verarbeitung mehrerer frisch gefrorener Proben wurden reproduzierbare Ergebnisse erzielt, indem Dias vorübergehend in einer Diabox auf Trockeneis gelagert wurden, bis alle Proben verarbeitet wurden. Bei Verwendung dieses Ansatzes lassen Sie alle Folien mit RT ausdemalibrisieren, bevor Sie mit Abschnitt 3 fortfahren. Formalin fixed paraffin embedded (FFPE) Proben können verwendet werden, obwohl die Hintergrundautofluoreszenz durch diese Methode erhöht wird. Um von FFPE-Proben zu gehen, Abschnitt bei 4 m. Montage durch Fangen von Abschnitten aus 40 °C Wasserbad auf Polyamid-behandelten Dias. Wärmegleitet für 1 h bei 60 °C, dann durch serielle RT-Waschungen (5 min) in Coplin-Gläsern, die Xylol (x2), Ethanol 100% (x2), 96% (x2), 70% (x1) und dH2 O(x1) enthalten. Um Antigene freizulegen, platzieren Sie Dias 20 min bei 90 °C in citratpuffer, bevor Sie Dias in PBS bei RT temperieren. Fahren Sie mit Schritt 3.2 fort.

3. Fluoreszenz-Immunlabelling

  1. Befestigen Sie Gewebeabschnitte in einer Rauchhaube, indem Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 10 min bei RT auftragen. Dias in ein PBS gefülltes Coplin-Glas übertragen und 3 min mit sanfter Rührung waschen (wiederholen Sie 3x).
    HINWEIS: Vermeiden Sie von jetzt an bis zum Ende des Immunstaining-Prozesses das Trocknen der Probe.
  2. Trocknen Sie den Bereich um jeden Gewebeabschnitt und umgeben Sie ihn mit einem hydrophoben Pen. Permeabilisieren Sie mit 0,5% nichtionischem Tensid (d.h. Triton X-100) in PBS für 15 min bei RT. Dann waschen Sie in PBS gefüllt Ecoplin Glas für 3 min mit sanfter Rührung (wiederholen 2x).
  3. Block mit einer gefilterten Lösung von 1% Rinderserumalbumin (BSA), 5% Pferdeserum, 0,2% nichtionischem Tensid in PBS (für mindestens 1 h bei RT).
  4. Inkubieren Sie mit dem primären HNF4-Antikörper, der über Nacht bei 4 °C in einer dunklen feuchten Färbekammer im Sperrpuffer verdünnt wird (siehe Tabelle der Materialien für Antikörper und spezifische Verdünnungen).
  5. Dias in ein PBS gefülltes Coplin-Glas geben und 3 min mit sanfter Rührung waschen (4x wiederholen).
  6. Inkubieren Sie mit Alexa-488 konjugierten Sekundärantikörpern und Hoechst verdünnt in gefilterten 1% BSA und 0,2% nichtionischem Tensid in PBS für 2 h bei RT in einer dunklen feuchten Färbekammer (siehe Tabelle der Materialien für Antikörper und spezifische Verdünnungen).
  7. Dias in ein PBS gefülltes Coplin-Glas geben und 3 min mit sanfter Rührung waschen (4x wiederholen). Waschen Sie in ddH2O für 3 min mit sanfter Rührung (wiederholen 2x).
  8. Montieren Sie Dias, indem Sie zwei Tropfen fluoreszierender Montagemedien auf einen Deckel (24 x 60 mm) legen und Rutschen darüber legen, wodurch Blasen durch sanften Druck vermieden werden. Zur Langzeitlagerung an Kanten mit klarem Nagellack abdichten und bei 4 °C im Dunkeln lagern.
  9. Bevor Sie fortfahren, überprüfen Sie Dias mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop, um eine gute Fixierung und Immunkennzeichnung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Siehe Abbildung 2A,B für erwartete Ergebnisse.

4. Fluoreszenz-Bildaufnahme

HINWEIS: Für diesen Schritt ist eine bildende Plattform mit hohem Inhalt (Materialtabelle) erforderlich, die die automatische Fluoreszenzbildaufnahme unterstützt.

  1. Schalten Sie das Bildgebungssystem ein, und öffnen Sie ein neues Erfassungsprotokoll.
  2. Wählen Sie das 10x Objektiv, beachten Sie den Bereich des Sichtfeldes (in diesem Fall 0,6 mm2).
  3. Legen Sie Parameter fest, um Fluoreszenzbilder mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionsfiltern (gemäß Schritt 3.6) zu erfassen. Wählen Sie für Hoechst und Alexa-488 die Kanäle "DAPI" und "GFP" mit 390/18 und 438/24 nm Anregung und 432,5/48 bzw. 475/24 nm Emission aus.
  4. Konzentrieren Sie die Probe und stellen Sie sicher, dass die Signalintensität nicht sättigend ist. Stellen Sie sicher, dass die Bildaufnahme mit der gleichen Belichtungszeit für alle Bilder erfolgt, oder verwenden Sie ein System, bei dem die Fluoreszenzintensität für die Belichtungszeit korrigiert wird.
  5. Scannen Sie die Probe und erfassen Sie genügend Bilder, um eine vollständige Abdeckung des Gewebeabschnitts zu erhalten (je nach Stichprobengröße ca. 20 bis 50 Sichtfelder).
  6. Überprüfen Sie die Bilddatenbank, indem Sie (i) schlecht fokussierte Felder, (ii) die Felder an den Rändern jedes Gewebeabschnitts (um verzerrungsorientierte Zelldichteberechnungen zu vermeiden) und (iii) diejenigen, die gefaltete/physisch beschädigte Bereiche des Gewebeabschnitts enthalten, wenn vorhanden, manuell eliminieren.

5. Automatisierte Fluoreszenzbildanalyse

ANMERKUNG: Dieser Schritt erfordert eine geeignete Bildanalysesoftware (Materialtabelle), die in der Lage ist: (1) hoechst-markierte Kerne in Bildern mit 405 nm (nukleare Segmentierung), (2) die Bewertung der mittleren Hoechst-Kernintensität und -morphometrie und (3) die Schwellenanalyse zur Bestimmung des +/- Status der Kernfluoreszenz bei 488 nm (HNF4) zu ermitteln. Zur visuellen Bewertung und Anpassung der Segmentierungs- und Schwellenwertparameter innerhalb des Programms ist eine grundlegende Bedienerschulung/-expertise erforderlich, um sicherzustellen, dass die Kerne und der HNF4-Status optimal abgesperrt sind (Abbildung 2).

  1. Öffnen Sie in der Bildanalyse-Software die Erfassungsdatei mit Hochst-Bildern (405 nm) und HNF4 (488 nm) aus Schritt 4.5, und erstellen Sie ein neues Analyseprotokoll.
  2. Definieren Sie Wellenlängen, die für die kernnukleare Segmentierung (Hoechst, 405 nm) und für die Hepatozyten-/NPC-Schwellenanalyse (HNF4, 488 nm) verwendet werden sollen.
  3. Passen Sie die nuklearen Segmentierungsparameter der Software (z. B. "Mindestkernfläche" und Kernerkennung "Empfindlichkeit") an, um sicherzustellen, dass die Kerne optimal getrennt sind.
    HINWEIS: Eine gute Segmentierung von Hepatozyten sollte Vorrang vor der von NPCs haben. Hepatozytenkerne sind charakteristisch abgerundet (interquartiler Größenbereich: 40 x 64 m2). NPC-Kerne, wie die der sinusförmigen Endothelie, sind abgeflacht/elliptisch oder unregelmäßig in der Form und im Allgemeinen kleiner und dichter verpackt als die von Hepatozyten (interquartiler Größenbereich: 30 x 43 m2). Für die Mausleber wurden eine minimale Kernfläche von 23 m2 und eine "Empfindlichkeit" von 65 % verwendet (siehe Abbildung 2C,D für erwartete Ergebnisse). Die Sensitivität bestimmt, wie Pixelcluster basierend auf ihrer Intensität als einzelne Kerne erkannt werden und sollte empirisch für jede vom Benutzer festgelegte Probe getestet werden, bevor die automatisierte Bildanalyse fortgesetzt wird.
  4. Ändern Sie die Schwellenintensität bei 488 nm, um eine optimale Gatingung von Hepatozyten (HNF4+) und nicht parenchymalen Zellen (HNF4-) zu gewährleisten.
    HINWEIS: Siehe Abbildung 2C,D für erwartete Ergebnisse. Der Wert der Schwellenintensität ist relativ und hängt von der Färbeeffizienz und Erfassungseinstellungen wie Laserintensität ab. Es sollte daher vom Benutzer standardisiert werden. Verwenden Sie bekannte HNF4-Zellen wie Endothelzellen und Periportal-NPCs als interne Negativkontrolle und binukleare Hepatozytenkerne als positive Referenz für die Färbung. Testen Sie die Analyseparameter mit einer kleinen Anzahl von Bildern, um eine gute kernnukleare Segmentierung und DieIntensitätsschwellentrennung sicherzustellen, bevor Sie Analyseparameter auf den gesamten Datensatz anwenden.
  5. Wählen Sie die folgenden zu quantifizierenden Kernparameter aus: (1) Kernfläche auf der Grundlage der Hoechst-Färbung (m2), (2) mittlerekerne Hoechst-Intensität (RU), (3) kernischer Dehnungsfaktor (mittleres Verhältnis der kurzen Achse des Kerns zur langen Achse des Kerns; wenn ein zentrumssymmetrisches [nicht-lästiges] Objekt den Wert 1, (4) Nuc 1/(Formfaktor) hat, bedeutet der kerntechnische "Rundungsindex", der nach Umkreis 2/(4x x Fläche) berechnet wird. Die Werte reichen von 1 bis unendlich, wobei 1 ein perfekter Kreis ist, (5) HNF4-Status (positiv-1 oder negativ-0) und (6) nukleare x/y-Koordinaten basierend auf "Schwerpunkt" (cg), einer Methode zum Einstellen des Objektmittelpunkts aus Graustufenbildern mit Subpixelgenauigkeit.
  6. Führen Sie die Analyse für alle Beispiel-Datasets aus, und exportieren Sie numerische Daten aus Schritt 5.5 in Tabellenkalkulationssoftware.

6. Datenanalyse

HINWEIS: Der Datenanalyseschritt kann mit jeder Standard-Tabellenkalkulationssoftware durchgeführt werden.

  1. Berechnen Sie Hepatozyten- und Nicht-Hepatozyten-Zellzahlen.
    1. Berechnen Sie die Gesamtfläche des für jede Stichprobe analysierten Leberabschnitts, indem Sie die Anzahl der Ansichtsfelder mit dem Bereich des Ansichtsfeldes multiplizieren (Schritt 4.2).
    2. Wenn Sie mit Tabellenkalkulationsdateien arbeiten, die für jeden Leberabschnitt generiert werden, filtern Sie die Daten, indem Sie nur HNF4+-Kerne auswählen. Berechnen Sie die Gesamtzahl der analysierten HNF4+-Kerne und dividieren Sie diese durch die Gesamtfläche, die analysiert wurde, um eine mittlere Hepatozytendichte für jede Probe zu erhalten (Abbildung 2F).
    3. Führen Sie die gleiche Berechnung für nicht-parenchymale Zellen durch, indem Sie die Kalkulationstabelle nach HNF4-Zellen filtern (Abbildung 2E).
  2. Berechnen Sie die Verteilung der nuklearen Größe von Hepatozyten.
    1. Filtern Sie daten mit Tabellenkalkulationssoftware, um nur HNF4+-Kerne auszuwählen.
    2. Plotwerte des Kernbereichs in einem Histogramm (Abbildung 2G). Stellen Sie die Behälterbreite auf 5 m2ein.
      HINWEIS: Frequenzwerte können für Fläche (Kerne/mm2) gemäß Schritt 6.1.1 korrigiert werden.
  3. Führen Sie hepatozyte Kernploidie-Analyse.
    HINWEIS: Die Tabellendaten aus Schritt 5.6 werden verwendet, um für jede Probe ein kerntechnisches Ploidy-Profil zu generieren. Dieser Prozess wurde automatisiert und kann mit einer benutzerdefinierten geschriebenen Software durchgeführt werden, die frei zum Download mit unterstützenden Informationen und Demonstrations-Datasets unterhttps://github.com/lukeynoon(sieheErgänzende Dateien). Der Quellcode wird für Benutzer bereitgestellt, die die Methodik anpassen möchten. Eine Beschreibung des Algorithmus sowie Installations- und Gebrauchsanweisungen sind unten aufgeführt. Das Programm verwendet Tabellenkalkulationsdaten, um Hepatozytenkerne automatisch in zwei Gruppen zu trennen; (1) solche mit "einfachen" kreisförmigen Kernen und (2) "komplexen" nichtkreisförmigen Kernen, die für binukleare Zellen mit >2c Ploidie repräsentativ sind. Der minimale Kern-DNA-Gehalt (eine Funktion des Kernbereichs und der DNA-Dichte) wird als nächstes für alle "einfachen" Kerne berechnet. Ein nachfolgender Schritt kalibriert dann automatisch die KERNploidie HNF4+ Hepatozyten mit HNF4-Kernen als bekannte 2-4N-interne Kontrolle.
    1. Herunterladen und Installieren von Software.
      1. Laden Sie die verpackte Anwendung herunter von: https://github.com/lukeynoon
      2. Starten Sie MATLAB. Navigieren Sie zur REGISTERKARTE APP des Toolstrips, klicken Sie auf App installieren und öffnen Sie die heruntergeladene Anwendung mit dem Begriff"Ploidy_Application.mlappinstall". Es wird eine Meldung angezeigt, um die erfolgreiche Installation zu bestätigen.
        HINWEIS: Die Anwendung ist jetzt einsatzbereit und verbleibt in der APP-Registerkarte des Toolstrips.
    2. Formatieren Sie Eingabedaten.
      HINWEIS: Vor der automatisierten Kernploidie-Analyse sollten alle Tabellenkalkulationsdateien mit bildhafter Daten mit hohem Inhalt (Schritt 5.6) gemäß den folgenden Anweisungen gespeichert und formatiert werden.
      1. In jeder exportierten Datendatei (. XLS 97-2004 Arbeitsmappe) aus Schritt 5.6, enthalten ein Blatt mit dem Begriff "Zellmaße" mit allen Daten, die für die ploidy-Analyse erforderlich sind, die in Spalten aufgeführt sind (Abbildung 3A). Stellen Sie sicher, dass das Tabellenkalkulationslayout einschließlich der Spaltenkopfnamen gegenüber dem von Abbildung 3Aunverändert bleibt, da die Analysemethode die richtigen Spaltendaten findet, indem sie nach diesen Namen sucht (siehe Demo-Datasets in Ergänzenden Dateien als Referenz). Wenn z. B. die Bildanalysesoftware mit hohem Inhalt keine Spalte "Lichtfluss" erzeugt (Abbildung 3A), fügen Sie manuell eine Spalte "Lichtfluss" an derselben Stelle ein, d. h. Spalte K, und füllen Sie sie mit Nullen.
      2. Für jede Versuchsbedingung (z. B. "Verletzte-d14") stellen Sie einen Kontrolldatensatz bereit, der zur Berechnung der internen Kontrolle für die Kernploidienkalibrierung verwendet wird (Schritt 6.3.4.3). Wählen Sie hier Leberproben von unbehandelten erwachsenen Littermaten ("Control-d0"; Abbildung 3B-D).
      3. Speichern Sie für biologische Replikationen (pro Bedingung) jede Kalkulationstabelle in einem eigenen Ordner (wie in Abbildung 3B). Benennen Sie die Ordnerpräfixe inkrementell, z. B. "Sample1, Sample2, Sample3... SampleN", wie es die darin enthaltenen Dateinamen beziffern. Daher sollte jeder Datensatzordner (z. B. "Control-d0") eine Reihe von Unterordnern ("Sample1", "Sample2", etc.) enthalten, die jeweils eine Tabellenkalkulationsdatei mit demselben entsprechenden Namen enthalten.
    3. Führen Sie die Anwendung aus.
      1. Starten Sie in MATLAB die "Ploidy_Application", indem Sie auf das Symbol in der Registerkarte MY APPS des Toolstrips klicken (Abbildung 3C). Die Ploidy_Application grafische Benutzeroberfläche (GUI) wird angezeigt (Abbildung 3C).
      2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Pfad, um Daten zu steuern, um zu dem Ordner zu navigieren, in dem sich die Steuerelementdaten replizieren (z. B. "Control-d0"). Dieser Datenpfad wird dann in der Schnittstelle angezeigt (z. B. /Users/Desktop/Control-d0).
      3. Geben Sie im "Ordnerpräfix" den Namen ein, der den Ausgabedateien gegeben werden soll (z. B. "Beispiel").
        HINWEIS: Dieses Präfix kann in einen beliebigen Text geändert werden, vorausgesetzt, dass die Ordner und Dateinamen inkrementell benannt bleiben.
      4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Pfad zu anderen Daten, und navigieren Sie zu dem Ordner, in dem sich die Vergleichsdaten replizieren (z. B. "Verletzte-d14"). Dieser Datenpfad wird dann in der Schnittstelle angezeigt (z. B. /Users/Desktop/Injured-d14).
      5. Klicken Sie auf Ausführen!. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, lautet die Statusleiste "Analysis Complete!..".
        ANMERKUNG: Der Antrag meldet für jede Probe die Schichtung der "einfachen" Kerne in 2n, 2n, 4n, 4n 8n und 8n+ in Absoluten Zahlen und als Prozentsatz der Gesamtanzahl(Abbildung 3D). Diese Dateien werden automatisch in jedem Beispielordner gespeichert als: "Count_2n.txt", "Count_2n_to_4n.txt", "Count_4n_to_8n.txt", "Count_8n_and_higher.txt", "Percentage_2n.txt", "Percentage_2nto4n.txt", "Percentage_4nto8n.txt", "Percentage_8n_and_higher.txt". Die Ploidy_Application speichert automatisch eine Liste für jede Probe, aller individuellen Ploidy-Schätzungen für "einfache" Hepatozyten- und Nicht-Hepatozytenkerne in "Ploidy_All_Hepatocytes.txt" und "Ploidy_NonHepatocytes.txt". Für das Kontroll-Dataset speichert die Methode auch die minimalen DNA-Gehalt-Schwellenwerte, die für die Schichtung der Ploidie berechnet wurden (siehe Schritt 6.3.4.3.7) in einer Datei mit dem Namen "Normalised_Thresholds_Control". Schließlich erstellt die Anwendung einen Ordner für das Steuerelement und die ausgewählten vergleichenbedingungenDaten mit dem Namen "Zusammenfassung". Dieser Ordner enthält zwei Unterordner, "Ploidy" und "Stratification", die die Durchschnittswerte aller bereitgestellten Stichproben enthalten (Abbildung 3D).
    4. Beschreibung der Methodik.
      HINWEIS: Im folgenden Abschnitt wird die von der Software "Nukleare Ploidie-Analyse" verwendete Methodik ausführlich beschrieben. Wenn der Benutzer sich entscheidet, die Anwendung nicht zu verwenden, können diese Schritte mit Tabellenkalkulationssoftware befolgt werden, um das Kernploidy-Profil manuell zu berechnen.
      1. Trennen Sie Kerne in "einfach" oder "komplex" nach nuklearer Morphometrie.
        1. Berechnen Sie einen "Zirkularitätsindex" für alle Kerne, definiert als der nukleare "Dehnungsfaktor" dividiert durch den "Nuc 1/(Formfaktor)", wobei ein Wert von 1,0 einen perfekten Kreis angibt.
          ANMERKUNG: "Nukleare Dehnung" und "Nuc 1/(Formfaktor)" sind zwei diskrete Kennzahlen der "Zirkularität" eines Objekts, die ergänzende, nicht überlappende morphometrische Kriterien bewerten. Erstere misst die Lang- und Kurzachsen eines Objekts, während letztere die Länge des Umfangs eines Objekts mit der seines Bereichs vergleicht. Um die in diesem Protokoll verwendete Definition der nuklearen Zirkularität zu stärken, wurden diese beiden Messungen zu einem einzigen "Zirkularitätsindex" zusammengefasst. Ein früherer Ansatz zur Schätzung der Kernkraftploidie unter Verwendung der beschriebenen Methode, die nur die nukleare Dehnung verwendethat 17. Während mit diesem Ansatz akzeptable Ergebnisse erzielt wurden, haben die Autoren beobachtet, dass ein zusammengesetzter "Zirkularitätsindex" die Diskriminierung manuell ausgewählter Kerne von mononuklearen und binukleären Hepatozyten verbessert (Daten werden nicht angezeigt).
        2. Klassifizieren Sie Kerne mit einem Zirkularitätsindex von 0,8 als "komplex" und die von > 0,8 als "einfach".
      2. Schätzen Sie den "minimalen" DNA-Gehalt (m) für alle "einfachen" Kerne.
        1. Berechnen Sie den Kernradius (r) mit der Formel:
        2. Berechnen Sie das Kernvolumen (v) mit dem Volumen einer Kugelformel:
        3. Generieren Sie einen relativen Wert für minimalen DNA-Gehalt (m) mit der Formel:
      3. Kalibrieren Sie den Datensatz mit den NPC-Kernen (HNF4-) als interne 2-4N-Steuerung.
        HINWEIS: NPCs haben je nach Zellzyklusstatus einen DNA-Gehalt von 2 bis 4 N. Daher steigt der Mittelwert des "minimalen" DNA-Gehalts von NPC (NPCm) mit der Verletzung (Abbildung 4A). Der Kalibrierungsfehler wird minimiert, indem eine Obergrenze von NPCm festgelegt wird, die einen Schwellenwert von 4c darstellt (Abbildung 4B).
        1. Wählen Sie in der Kalkulationstabelle nur NPC-Kerne mit Werten für "m" aus, die innerhalb von 1 Standardabweichung (SD) des Modus liegen (dies filtert Rauschen aus einem möglichen Segmentierungsfehler heraus).
        2. Untersuchen Sie innerhalb dieses gefilterten Bereichs Kerngebiete und deren entsprechende mittlere Hoechst-Intensitäten (Abbildung 4C).
        3. Schätzen Sie den kleinsten Kernbereich innerhalb dieses gefilterten Bereichs mit maximaler kernkrafter Hoechst-Intensität (d. h. dem Punkt, an dem die Linie der Kurve die Richtung im gefilterten Datensatz ändert, wie durch den roten Kreis in Abbildung 4Cdargestellt). Dieser Wert stellt einen 2N-4N-Übergangszustand (t) dar, über dem die Probenahme von 4c-Kernen über 2c-Kernen überwiegt, was zu einer Maxima der mittleren Hoechst-Intensität führt.
          HINWEIS: Dieser Wert wird automatisch von der Software bestimmt; Tabellenkalkulationsbenutzer können diesen Punkt jedoch manuell als Übergangsgröße auswählen.
        4. Berechnen Sie den minimalen DNA-Gehalt, der durch diese Übergangsgröße (tm) dargestellt wird, indem Sie Schritt 6.3.4.2 folgen.
        5. Um die 4N-Schulter des NPCm-Datasets zu schätzen, fügen Sie dem Wert von tm1 SD hinzu. Die resultierende Zahl (Abbildung 4B) beschreibt die obere Grenze des minimalen DNA-Gehalts von NPC, die für die Kernploidienschichtung verwendet werden soll (S4c).
        6. Wiederholen Sie die Schritte 6.3.4.3.1 bis 6.3.4.3.5 für alle "Kontroll"-Proben.
          HINWEIS: In Abbildung 3werden beispielsweise unverletzte Kontrolllebern ("Control-d0") als Kontrollbedingung verwendet.
        7. Berechnen Sie einen durchschnittlichen 4c-Schichtungsschwellenwert (S4c) für "Kontroll"-Proben und verwenden Sie diese, um die Grenzen 2c (S2c) und 8c (S8c) für minimalen DNA-Gehalt (m) zu extrapolieren. Schichtungsschwellen werden automatisch von der Software generiert und gespeichert (Schritt 6.3.3.3).
          HINWEIS: Je nach Studienentwurf können die durchschnittlichen Schichtungsschwellenwerte für jede Bedingung oder für bestimmte Bedingungen (z. B. gesunde Kontrollleber) berechnet werden. Die Software Zur Analyse der Nuklearen Ploidie erfordert jedoch, dass eine von 2 Dateien als "Kontrolle" für die Berechnung relativer Ploidy-Werte bezeichnet wird.
        8. Berechnen Sie einen Ploidy-Wert für alle Kerne unter Verwendung des in Schritt 6.3.4.3.7 erzeugten S2c-Werts gemäß:
        9. "einfache" Hepatozyten (HNF4+) Kerne nach folgenden Kriterien in 2c/4c/8c/>8c-Klammern stifizieren: "2c" HNF4+ = p 2; "4c" HNF4-+ = 2 < p 4; "8c" HNF4-+ = 4 < p - 8; ">8c" HNF4- + = 8 < p.
        10. Um die räumliche Strukturierung von Ploidy-Untergruppen zu rekonstruieren, trennen Sie die Kerndaten in jeder Stichprobentabelle nach den entsprechenden Feldern, in denen sie erworben wurden. Verwenden Sie dann die zugehörigen kernnuklearen x/y-Koordinaten (ab Schritt 5.5), um Ploidy-Untergruppen in 2D zu zeichnen (Abbildung 5C).

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Representative Results

Diese Methode wurde verwendet, um die Auswirkungen von cholestatischen Verletzungen auf die erwachsene Mausleber zu messen, indem Tiere für 0-21 Tage mit einer hepatotoxischen Diät gefüttert wurden, die 0,1% 3,5-Diethoxycarbonyl-1,4-Dihydrocollidin (DDC)17enthält. Chronische DDC-Fütterung führt zu hepatozellulären Verletzungen erhöhte Ploidie und Periportal Expansion von NPCs. Der Benutzer sollte sich bewusst sein, dass Mausstamm und altersabhängige Unterschiede in der Kernploidie bestehen können und dass alle Analysen mit erwachsenen weiblichen C57BL/6-Mäusen im Alter von 12 bis 16 Wochen durchgeführt wurden.

Nach der HNF4-Immunkennzeichnung (Protokollabschnitt 3) ist es wichtig, alle Dias mit konventioneller Fluoreszenzmikroskopie zu überprüfen, um eine gute Fixierung und Färbung in guter Qualität zu gewährleisten (Abbildung 2A). Das Verschmieren oder Verwischen von Hoechst kann auf eine unzureichende Fixierung oder Probendegradation vor der Fixierung hinweisen (Abbildung 2B), in diesem Fall kehren Sie zu Protokollabschnitt 2 zurück und verkürzen Sie die Zeit zwischen Schnitt und Fixierung (Schritt 3.1). Eine erfolgreiche Immunetikettierung mit dem HNF4-Antikörper lässt sich in diesem Stadium leicht an einer eindeutigen Diskriminierung positiv gekennzeichneter Hepatozytenkerne messen, die typischerweise größer und abgerundeter sind als die von NPCs (Abbildung 2A). Abgeflachte/elliptische endotheliale Kerne innerhalb des Parenchyms oder dichte Flecken von Zellen, die sich in Periportalbereichen nach DDC-Verletzungen ausdehnen, können als nützliche visuelle Referenz für die Identifizierung von HNF4-NPCs bei der Beurteilung des Erfolgs/Versagens der Immunfärbung dienen.

Die nukleare Segregation und die HNF4-Schwellenwertparameter (Schritte 5.2-5.4) sollten vor der automatischen Bildanalyse (Schritt 5.6) sorgfältig optimiert werden, um das visuelle Muster der Immunfärbung, das bei der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie am Ende des Protokollabschnitts 3 (Abbildung 2C) beobachtet wird, weitgehend widerzuspiegeln. Beispiele für eine optimale vs. suboptimale Kernsegmentierung und HNF4-Schwellenwertprotokolle sind in Abbildung 2Dzusammengefasst. Nach der Bildanalyse (Schritt 6.1.3) sollten die Daten eine steigende Anzahl von NPCs in der Leber mit DDC-Verletzung (Abbildung 2E) widerspiegeln, von 52 % bis 2,0 % der Kerne in Kontrolllebern auf 72,8 % bis 1,4 % nach 21 Tagen DDC-Behandlung. Hepatozyten machen 48,0 % bis 2,0 % der Gesamtkerne in Kontrolllebern aus, übereinstimmend mit früheren Analysen der Leberhistologie, die zeigen, dass Hepatozyten 70 bis 85 % des Gewebevolumens einnehmen, aber nur 45 bis 50 % der gesamten Leberzellen18,19. Während der ersten 14 Tage der DDC-Fütterung wird eine kleine, aber signifikante Verringerung der Anzahl der HNF4+-Kerne beobachtet (Abbildung 2F). Ein Frequenzverteilungsdiagramm des Hepatozyten-Kerngebiets (Schritt 6.2) zeigt einen Spitzenraum des HNF4+-Kerngebiets in Kontrolllebern im Größenbereich von 40 bis 50 m2 und eine klare Rechtsverschiebung der Kerngröße nach dDC-Verletzung(Abbildung 2G); mit erhöhter Ploidie und hepatozellulärer Hypertrophie12.

In gesunden (Tag 0) Kontrolllebern haben 63,4 % bis 1,7 % der HNF4+-Kerne eine "einfache" kreisförmige Morphometrie (Abbildung 5A). Diese Zahl sinkt nach 21 Tagen DDC-Verletzung auf 46,8 % bis 5,7 % (P = 0,042), was auf eine erhöhte Komplexität der nuklearen Morphometrie hindeutet, die vermutlich mit dem Wechsel zwischen den Ploidy-Zuständen während der Polyploidisierung verbunden ist (siehe "Interpretation der nuklearen Morphometrie" unten). Repräsentative Beispiele für Kernploidie-Verteilungen, die mit dieser Methode in Kontrollleberabschnitten gewonnen wurden, sind in Abbildung 5Adargestellt, in der beschrieben wird, wie die Interpolation des DNA-Gehalts die Schichtung einzelner Zellen innerhalb einer einzigen Probe ermöglicht. Mittelwerte für Teilmengen von "komplexen" und "einfachen" HNF4+-Zellen werden ebenfalls angezeigt (Abbildung 5A). Die Daten stimmen mit früheren Schätzungen der Polyploidie bei 80 bis 90% der erwachsenen murinen Hepatozyten2überein. Die Häufigkeit komplexer Kerne (36,6 % bei 1,7 %) Lebern, die unter Kontrolle sind, nähern sich ebenfalls denen von binukleären Zellen (35%)20, obwohl die Daten streng als Maß für die kerntechnische und nicht als zelluläre Ploidie betrachtet werden sollten (siehe "Interpretation der nuklearen Morphometrie" weiter unten). Der Vergleich der relativen Ploidie zwischen kontrollierten (Tag 0) und DDC-behandelten Gruppen sollte einen signifikanten Verlust von 2c- und 4c-Hepatozytenkernen mit Verletzung zusammen mit einer erhöhten Anzahl von >8c-Zellen widerspiegeln (Abbildung 5B). Relative Positionsinformationen für jede Ploidy-Untergruppe können durch Streudiagramm von x-y-Koordinaten, die jedem Kern innerhalb des Datasets zugeordnet sind, oder durch Abrufen der 2D-Position bestimmter Hepatozyten-Teilmengen innerhalb der Bildanalysesoftware mit hohem Inhalt(Abbildung 5C) abgefragt werden.

Kalibrierung
Um die Gültigkeit der verwendeten NPC-Kalibrierungsmethode zu beurteilen, wurde eine duale Immunkennzeichnung von Leberabschnitten mit Antikörpern gegen HNF4 und den proliferativen Marker Ki-67 (Abbildung 6A,B) durchgeführt. Diese Daten zeigten eine Anreicherung für Ki-67, das Zellen in allen aktiven Phasen des Zellzyklus auf der rechten Seite der minimalen DNA-Verteilungskurve des NPC (zwischen S2c und S4c)kennzeichnet - wobei NPCs voraussichtlich DNA replizieren und daher >2c Ploidie haben (Abbildung 6A). Nach interner Kalibrierung aller untersuchten Kontroll- und verletzten Leberproben Ki-67 wurde signifikant angereichert (P < 0,0001) in "einfachen" NPC-Kernen mit einer geschätzten Ploidie von >2c (82,5% bei 6,6% SD, n = 12) im Vergleich zu denen mit 2c Ploidie (17,5% bei 6,6% SD, n = 12) (Abbildung 6B), was auf eine erfolgreiche Ploidy-Kalibrierung hindeutet. Diese Daten unterstützen die Gültigkeit der verwendeten Methode. Unter der Annahme einer genauen Schwellenwertierung von Ki67 geben sie auch einen quantitativen Einblick in das Ausmaß, in dem subäquatoriale Kernmasken aus höheren Ploidy-Gruppen unten "kontaminieren".

Um die Gültigkeit des NPC-Kalibrierverfahrens weiter zu testen, wurde ein externer Kalibrator auf der Grundlage des zuvor gemeldeten Kernvolumens der Maus 2N Hepatozyten (155,8 m3)14eingeführt. Wenn diese Zahl in Kombination mit einem Durchschnittswert der Hoechst-Intensität für HNF4a- Kerne verwendet wurde, war die resultierende Schätzung für die mittlere Hepatozytenploidie in den Kontrolllebern nicht von der des internen (S2c) Kalibrators zu unterscheiden (Abbildung 6C). Darüber hinaus waren die Schätzungen der mittleren Hepatozytenploidie bei Mäusen des C57BL/6-Mausstamms vergleichbaren Alters ebenfalls ähnlich, was bestätigt, dass frühere empirische Kenntnisse der 2N Hepatozytenkerngröße nicht erforderlich sind, was diese intern kontrollierte Methode zur Schätzung der Kernploidie vollständig autonom macht.

Interpretation der nuklearen Morphometrie
Die beschriebene Methode bietet eine ploidy Auslesung für Hepatozytenkerne mit "einfacher" kreisförmiger Morphometrie. Der Ausschluss "komplexer" Kerne beruht auf der Hypothese, dass sie einen Anteil binuklearer Hepatozyten mit überlappenden/berührenden Kernmasken darstellen, was eine genaue Ploidy-Bestimmung für diese Teilmenge schwieriger macht (Abbildung 7A). Wichtig ist, dass die Trennung von Kernen nach Zirkularität es dem Benutzer nicht ermöglicht, zwischen den Kernen mononuklearer Hepatozyten und denen von binukleären Zellen zu unterscheiden, in denen zwei Kerne ähnlicher Ploidie innerhalb der Zelle klar voneinander getrennt sind. Dies wurde empirisch getestet, indem binukleäre und mononukleare Zellen manuell aus den Bild-Datasets ausgewählt und ihre Segregation durch den Algorithmus bewertet wurden (Abbildung 7B). Kerne binuklearer Hepatozyten, die physisch nahe waren(Abbildung 7C), aber "nicht berührend", wurden vom Algorithmus als "einfach" eingestuft, während diejenigen, die "berührend" waren, eindeutig als "komplex" diskriminiert wurden. Daher bietet dieser Test keine Auslesung der zellulären Ploidie in der Leber, da Die Kerne binuklearer Zellen zwischen den "einfachen" und "komplexen" Unterklassen unterteilt sind (siehe Diskussion). Einige Einblicke in den Wechsel zwischen Zell- und Kernploidie können jedoch aus diesen Daten gewonnen werden, indem man einfach Histogramme der nuklearen Morphometrie und kernnuklearen Größe zeichnet und ein Modell anwendet, wie "komplexe" und "einfache" Zustände während der Polyploidisierung zwischen "komplexen" und "einfachen" Zuständen übergangen werden (Abbildung 7D). Bei der Kontrolle der Leber werden drei Phasen der kerntechnischen Morphometrie(Abbildung 7E ) deutlich beobachtet ( Abbildung 7E). Sie stellen die Clusterbildung von kreisförmigen Kernmasken 2N (I), 4N (II) und 8N (III) dar (siehe Abbildung 7D). Mononukleäre 16N Hepatozyten sind extrem selten in erwachsenen Mauslebern16,18,21, daher besteht die 16N zelluläre Ploidiegruppe fast ausschließlich aus binukleären Zellen mit 8N Kernen, die sich innerhalb und rechts in Phase III befinden ( Abbildung7E), was den Rückgang der Zirkularität rechts von Phase III erklärt. Interessanterweise beginnt bei einer Verletzung (DDC-Tag 14) eine quantitative Verschiebung hin zu erhöhter Komplexität ("Binuklearität") in den Phasen I (die 2n bis 2x2n) und die Phasen III (reflektiert 8n bis 2x8n) vor, bevor sie schließlich in allen drei Phasen konsolidiert wird (I-III). Die Autoren spekulieren, dass diese Verschiebung hin zu erhöhter Komplexität auf eine erhöhte zelluläre Ploidie infolge einer ins Stocken geratenen Zytokinese zurückzuführen ist, während rechts von Phase III der gegenteilige Trend beobachtet wird, aufgrund der erhöhten Darstellung von kreisförmigen 16N mononukleären Zellen in der verletzten Leber aufgrund der Endoreplikation. Diese Beobachtungen müssen natürlich durch Anpassung der Methode an die zelluläre Ploidie getestet werden (siehe Diskussion).

Figure 1
Abbildung 1: Zusammenfassung des Workflows. Lebergewebe wird geerntet (1), kryosectioniert (2), fixiert und immungekennzeichnet mit einem HNF4-Antikörper, der es ermöglicht, parenchymale und nicht-parenchymale Zellen (NPCs) zu diskriminieren (3). Nach der Verarbeitung werden die Proben mithilfe einer high-content Imaging-Plattform mithilfe der automatisierten Bildaufnahme (4) und der Analyse (5) digitalisiert. Die Zellen werden durch die Hoechst-Kernfluoreszenz und die HNF4-Immunfluoreszenzschwelle segmentiert. Als nächstes werden das Kerngebiet Hoechst ("A") und die Zirkularität ("C") berechnet. Schließlich werden die Daten analysiert (6); HNF4-NPCs sind quantifiziert (i) und HNF4+Hepatozytenkerne werden gemäß der nuklearen Zirkularität (ii) in zwei Teilmengen ("einfach" und "komplex") getrennt. Die Interpolation der Hepatozyten-Kernploidie wird dann für alle "einfachen" Kerne als Funktion des nuklearen Radius (r) und der mittleren Hoechst-Fluoreszenzintensität (als Proxy für die kernnukleare DNA-Dichte) (iii) durchgeführt. Die Daten werden dann mit NPCs als internem 2N-Kalibrator (iv) geschichtet, bevor eine Probenzusammenfassung (v) erstellt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Bildanalyse mit hohem Inhalt und zytometrische Profilierung der Mausleber während der chronischen DDC-Fütterung. (A) Ein repräsentatives konfokales Bild der Immunfluoreszenzfärbung der erwachsenen Mausleber nach 21 Tagen Fütterung mit einer Diät mit 0,1 % DDC; Das Bild zeigt abgerundete HNF4-+ Hepatozytenkerne ("H") und die Erweiterung von HNF4-NPCs in Bereichen, die die Portalader umgeben ("PV"). (B) Beispiele für eine optimale ("richtige") und suboptimale ("falsche") kerntechnische Hoechst-Färbung, die auf eine schlechte Fixierung hinweist. (C) Einsatz einer Plattform für die Bildanalyse mit hohem Durchsatz zur Trennung von Hepatozyten und NPCs nach kernnuklearer Hoechst-Färbung und HNF4-Immunkennzeichnung. Softwaremasken (rot/grüne Linien) zeigen, wie Kerne nach Hoechst-Fluoreszenz korrekt segmentiert und nach HNF4-Status in Hepatozyten (+) oder NPCs (-) sortiert werden. (D) Ein Leitfaden zur Optimierung der Einstellungen für die Segmentierung/Schwellenwertanalyse. Überlagerte Kernmasken, die von der Software erkannt werden, sind durch grüne/blaue Linien für die nukleare Segmentierung und grün/blau (HNF4+) oder rot/blau (HNF4-)) für die Schwellenanalyse (H = Hepatozyten) gekennzeichnet. Fehlerbehebung: Die Empfindlichkeit der Kernerkennung ist zu niedrig (i) oder zu hoch (ii). Schwellenwert für HNF4-Wert zu niedrig (iii) oder zu hoch (iv). (E,F) Quantitative Analyse von NPC- und Hepatozytenkernen während der DDC-Fütterung: (E) HNF4- und (F) HNF4+ Kerndichten werden mit der Zeit der DDC-Behandlung (Tage) verglichen. Insgesamt wurden 5,7 x 105 Zellen analysiert, von 4 bis 6 Tieren pro Zeitpunkt. Die Daten werden als Mittelwert + SEM dargestellt. **P < 0.01 und ***P < 0.001. Einweg-ANOVA wurde verwendet, um Mittelzuweise zu vergleichen. Signifikanz-P-Werte wurden mit Fishers am wenigsten signifikanten Differenztest (LSD) berechnet. (G) Frequenzverteilung des KERNbereichs HNF4+ während der DDC-Behandlung. Die Daten zeigen eine Rechtsverschiebung im Hepatozyten-Kernbereich während der Verletzung im Einklang mit zellulärer Hypertrophie und Polyploidierung. Insgesamt wurden 2,5 x 105HNF4+-Kerne von 4 bis 6 Tieren pro Zeitpunkt analysiert. Diese Zahl wurde von Manzano-Néez et al.17geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Automatisierte Analyse der Hepatozyten-Atomploidie mit individueller schriftlicher Software. (A) Screenshot mit korrekter Formatierung von Tabellenkalkulationsdaten für die Eingabe in die Kernploidie-Analysesoftware. Spalten, die wesentliche Daten enthalten (Schritt 5.5 des Protokolls), sind gelb hervorgehoben. Alle Spaltentitel sollten genau mit den angegebenen übereinstimmen. (B) Screenshot zeigt, wie einzelne Tabellenkalkulationsdateien, die Daten aus biologischen Replikaten enthalten ("Sample1", "Sample2", etc.), für jede Bedingung benannt und in Unterordnern organisiert werden sollten (in diesem Beispiel mit den Titeln "Control-d0" und "Injured-d14"). (C) Screenshot nach erfolgreicher Installation der ploidy Anwendung (roter Kreis). Wenn die Anwendung gestartet wird (durch Klicken auf "Ploidy_Appl..") in der Registerkarte MY APPS des Toolstrip erscheint das "Ploidy_GUI" (unterer Bereich). Der Versuchsname ("Sample") und Pfade zu den Datensätzen "Control-d0") und test (z. B. "Verletzte-d14") werden eingegeben, bevor sie auf Ausführenklicken. Die Software berechnet, kalibriert und stratifiziert dann die Kernploidie für alle Proben mit dem Datensatz "Control-d0", um Schwellenwerte für minimalen DNA-Gehalt zu generieren. (D) Die Datenausgabe von Ploidy_Application zeigt einzelne Datendateien, die automatisch in jedem Beispielordner gespeichert werden (i) und absolute und prozentuale Zahlen von "einfachen" Kernen in jeder Ploidy-Gruppe enthalten. Für jede Bedingung (in diesem Fall sowohl "Control-d0" als auch "Injured-d14") wird automatisch ein Sammelordner generiert, der die durchschnittlichen nuklearen Ploidie-Schätzungen für alle "einfachen" Hepatozyten- und Nicht-Hepatozyten-Kerne (ii) und eine Aufschlüsselung der Geschichte der Kernploidie für jede Probe enthält (iii). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Die Verwendung von NPCs als interner Ploidy-Kalibrator. (A) Schaubild, das die Auswirkungen der DDC-Verletzung auf den mittleren minimalen DNA-Gehalt (m) von Hepatozyten (HNF4+) und NPC-Kernen (HNF4-) zeigt. Alle Daten werden auf Tag 0 NPCs normalisiert (n = 4 Tiere pro Zeitpunkt). (B) Histogramm, das die Verteilung der NPCm-Werte in einer einzigen repräsentativen Leberprobe beschreibt (Tag 0, insgesamt 7.180 Kerne). Das Schema (oben) zeigt, wie kreisförmige NPC-Masken aus Zellen mit einem DNA-Gehalt von 2 x 4 c stammen können. Ziel des Kalibrierverfahrens ist es, den Schichtungsschwellenwert für 4c (S4c) an der oberen Grenze der NPCm-Verteilung (gepunktete Linie) zu definieren und gleichzeitig Rauschen aufgrund von Segmentierungsfehlern an den Extremen der Verteilungskurve zu minimieren. (C) Veränderungen der mittleren Hoechst-Intensität und des Kernbereichs für NPC-Kerne (HNF4-) werden dargestellt. Um Segmentierungsfehler zu vermeiden, werden nur die Kerne mit einem entsprechenden NPCm-Wert innerhalb von 1 SD des Modus NPCm-Wert überprüft (gelbes Feld). Innerhalb dieses Bereichs wird die 2c-4c-Übergangsgröße (t) berechnet und als Ankerpunkt innerhalb der Daten verwendet, um die S4czu schätzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Hochdurchsatz-In-situ-Analyse der Kernploidie in der Mausleber während der chronischen DDC-Fütterung. (A) Analyse der Kontrolle der erwachsenen Leber mit der beschriebenen Methodik. DIE Hepatozytenkerne von HNF4+ aus 2D-Leberabschnitten sind nach Hoechst-Kernzirkularität in zwei Gruppen unterteilt: "einfach" und "komplex". (Oben) Repräsentative Fluoreszenz Hoechst Bilder von Zellen, die zu diesen beiden Gruppen gehören, werden gezeigt. (Links) Streudiagramm mit Schichtung einfacher HNF4-+-Kerne aus einer Probe (Tag 0) nach interpoliertem Ploidy-Wert, Kernfläche und mittlerer kernatischer Hoechst-Intensität. (Rechts) Kreisdiagramm mit dem typischen Abbau von HNF4+-Zellen in der Kontrollleber (Tag 0), der die Anteile der einzelnen Kernploidien-Unterklasse angibt. Insgesamt wurden 6,7 x 104 HNF4+-Kerne von 4 Tieren analysiert. (B) Auswirkungen der DDC-Leberverletzung auf die Hepatozyten-Kernploidie durch Hochdurchsatz-In-situ-Analyse. Graphen zeigen den relativen Rückgang des Anteils von 2c und 4c Hepatozytenkernen innerhalb der ersten 14 Tage der DDC-Fütterung, während >8c polyploide Kerne dramatisch an Zahl zunehmen. Insgesamt wurden 1,5 x 105 HNF4+-Kerne analysiert (n = 4 Tiere pro Zeitpunkt). Die Daten werden als Mittelwert + SEM dargestellt. **P < 0.01 und ***P < 0.001. Einweg-ANOVA wurde verwendet, um Mittelzuweise zu vergleichen. Signifikanz-P-Werte wurden mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey berechnet. (C) Beispiel, um zu zeigen, wie Unterklassen der Kernploidie innerhalb des Parenchyms mit dieser Methode räumlich verfolgt werden können, indem hochauflösende Bildgebungsdaten mit den gleichen quantitativen Kriterien für die Ploidy-Schichtung (Zirkularität, Kerngröße und mittlere Hoechst-Intensität) abfragt werden. Hoechst Fluoreszenzbilder werden mit Softwaremasken (rote Punkte) gezeigt, die 2c-Kerne in der Leber an zwei Zeitpunkten während der chronischen DDC-Fütterung markieren (Tag 14 und 21). Portalader (blaue gepunktete Linie) und Periportalbereiche, in denen sich NPCs ausdehnen (gelbe Linie), werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Kritische Bewertung der NPC-Kalibrierungsmethode. (A,B) Proliferierende NPCs werden erfolgreich mit einem >2c-Ploidy-Score kategorisiert. (A) Histogramm des Minimal-DNA-Gehalts von NPC aus Kontrolllebern, die mit Antikörpern gegen HNF4 und proliferativen Marker Ki-67 immunoaktiv sind (n = 4, Daten werden als Mittelwert + SEM dargestellt). Die Schichtungsschwellen für 2c (S2c) und 4c (S4c) sind angegeben. (B) Die Schichtung von NPCs nach der beschriebenen Methodik führt zu einer signifikanten Anreicherung der Ki-67-Immunkennzeichnung in Kernen, denen ein >2c-Ploidy-Score (n = 12) zugewiesen ist. Die Daten werden als Mittelwert + SEM dargestellt. Ungepaarter t-Test wurde verwendet, um die Mittelwerte ****P < 0.0001 zu vergleichen. (C) Externe Validierung der NPC-Kalibrierungsmethode. Schätzungen der mittleren Hepatozyten-Kernploidie, die mit der internen NPC-Kalibratormethode gewonnen wurde, wurden mit denen verglichen, die durch Kalibrierung der gleichen Proben (Control C57BL/6 Mouse Leber 3-4 Monate, n = 4) mit einem bekannten Kernvolumen für 2N Hepatozyten14erhalten wurden. Die Daten werden auch aus zwei unabhängigen Analysen21,22 zur Beschreibung der Hepatozyten-Atomploidie von Mäusen desselben Stammes im Alter von 2 bis 6 Monaten (rechts neben der gepunkteten Linie) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Die Kernmorphometrie hepatozytär hat eine "komplexe" Beziehung zur zellulären Ploidie. (A) Zusammenfassung, wie die Hepatozytenzellploidie (2N, 4N, 8N und 16N) teilweise durch 2D-Analyse der kernaatischen Morphometrie getrennt wird. Binukleare Zellen (rot) werden zwischen "einfachen" ("S") und "komplexen" ("C") Morphometrien unterteilt, je nachdem, ob Kerne berührend zu sein scheinen oder nicht. (B,C) Einzelne Hepatozyten wurden manuell ausgewählt und auf nukleare Morphometrie und internukleare Abstände analysiert. (B) Binukleare Hepatozyten mit "berührenden" Kernen waren "komplex" (100 % 0,8), während mononukleäre Zellen (schwarz) und binukleare Hepatozyten mit nicht berührenden Kernmasken "einfach" waren (94% >0,8). (C) "Einfache" Kerne binuklearer Hepatozyten könnten aufgrund deutlich reduzierter internuklearer Abstände von denen mononuklearer Zellen unterschieden werden (n = 3, insgesamt 94 analysierte Kerne). (D) Modell, das ankiert, wie zelluläre Ploidiezustände von Panel A in Bezug auf 2D-Atommorphometrie und Kernbereich verteilt werden könnten, was zu einer Bündelung einfacher kreisförmiger Formen in vier Phasen führt (I-IV). (E) Vergleich der HNF4+-Kernmorphometrie/Größe von Diagrammen in Kontrolllebern (Tag 0) und nach 14 Tagen (links) und 21 Tagen (rechts) der DDC-Verletzung. Morphometriephasen sind oben angegeben (I-V). Pfeile zeigen Verschiebungen in der nuklearen Morphometrie infolge von Verletzungen, die mit der Binuklearisierung von 2c ("a"), 4c ("b") und 8c ("c") Kernen übereinstimmen, zusammen mit einer erhöhten Mononuklearisierung der 16N-Zellploidieklasse (d). Insgesamt wurden pro Zustand 29 x 30 x 103 Kerne analysiert (n = 2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Dateien: Demonstrations-Datasets. Bitte klicken Sie hier, um diese Dateien anzuzeigen.

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Discussion

Ein hochgehaltiger, hochdurchsatzhoher Ansatz für die Analyse der Gewebeumgestaltung und Schätzung der Hepatozyten-Atomploidie in der murinen Leber wird beschrieben. Sobald ein Benutzer mit dem Verfahren vertraut ist, kann er mehrere Proben in einem Zeitraum von 3 bis 5 Tagen verarbeiten, abbilden und analysieren, wodurch große testbare Datasets generiert werden, die eine detaillierte Signatur des Leberzustands bereitstellen. Angesichts der Einfachheit der Probenvorbereitungsmethode, zusammen mit der großen Anzahl der analysierten Zellen und Gewebeflächen (im Durchschnitt 14 mm2/Probe), sind die Ergebnisse robust und sehr reproduzierbar. Die Automatisierung der Bildaufnahme und -analyse beseitigt auch Benutzerfehler und potenzielle Verzerrungen aus diesen wichtigen Schritten. Eine wichtige Neuerung ist die Verwendung von NPCs als interner Ploidy-Kalibrator, der eine relative Bewertung des Hepatozyten-Kern-DNA-Gehalts sowohl innerhalb als auch zwischen Proben ermöglicht. Die Einbeziehung eines HNF4-Kennzeichnungsschritts ist daher der Schlüssel, um diesem Protokoll einen einzigartigen technischen Vorteil gegenüber den zuvor veröffentlichten 2D-Methoden3,12,22zu verschaffen. Im Gegensatz dazu macht die relative Einfachheit der Methodik im Vergleich zu 3D-Rekonstruktionsworkflows18 sie technisch weniger mühsam und potenziell flexibler.

Im Vergleich zur Präzisionsmethode der Durchflusszytometrie, einem wichtigen Vorbehalt zur Extrapolation des Kern-DNA-Gehalts aus 2D-Gewebeabschnitten, ist das begrenzte Vertrauen, das auf die Kategorisierung einzelner Kerne in Bezug auf den Ploidy-Status zurückzuführen ist. Hinzu kommt die inhärente Verzerrung innerhalb von SIA-basierten Ansätzen zur Überdarstellung kleinerer Ploidy-Untergruppen aufgrund subäquatorialer Stichproben. Durch die Normalisierung der Daten auf einen internen Standard und einen großen, auf Grund gesamtheitenbasierten Ansatz wird der durch diese Effekte verursachte Fehler jedoch abgemildert und in allen Stichproben vergleichbar. Hepatozyten zeichnen sich durch eine stark abgerundete Kernmorphologie aus, verglichen mit z.B. NPCs, was bedeutet, dass sie besonders für eine genaue Abschätzung des DNA-Gehalts auf der Grundlage des kerntechnischen Querschnittsbereichs allein10,11,14,15,23zugänglich sind. Der SIA-basierte Ansatz wurde in diesem Protokoll verfeinert, um sowohl die nukleare Zirkularität als auch die DNA-Dichte zu berücksichtigen, indem Messungen der Morphometrie und die mittlere Hoechst-Fluoreszenzintensität integriert wurden, was zu einem geschätzten "minimalen DNA-Gehalt"-Deskriptor für einzelne Kerne führt. Wichtig ist, dass die Verwendung von NPCs als 2-4N-Ploidy-Kontrolle einen wichtigen internen Standard für die objektive Kalibrierung und Schichtung des minimalen Kern-DNA-Gehalts bietet, so dass die beschriebene Methodik auf Proben jeder Art oder das Format anwendbar ist, da ein geeigneter Antikörper für HNF4 (oder ähnliche Hepatozyten-Kernmarker) herbestimmt werden kann.

Obwohl sich gezeigt hat, dass die Bewertung der Kernploidie nützliche Signaturen für das Fortschreiten der Lebererkrankung10,13liefert, um die Vielfalt der Ploidie-Veränderungen in der Leber vollständig zu ermitteln, wäre es wünschenswert und notwendig, die beschriebene Methodik anzupassen, um die Hepato-Perimeter- und damit zelluläre Ploidie zu berücksichtigen. Die Kartierung der zellulären Ploidie wurde zuvor durch Die Kennzeichnung des Hepatozytenumfangs mit Markern wie Beta-Catenin10,13,24, Actin12,22 und Cytokeratin10,11 in menschlichen und Mausleberproben erreicht. Als dies jedoch nach einer DDC-Verletzung getestet wurde, verhinderte die dramatische epitheliale Umgestaltung eine zuverlässige Beurteilung des hepatozellulären Umfangs sowohl durch Phalloidin (Daten nicht gezeigt) als auch Antikörper gegen Beta-Catenin17. Obwohl dieser Ansatz zwar machbar ist, ist er jedoch möglicherweise nicht auf alle Verletzungsmodelle anwendbar, aber wenn er erreicht wird, würde die Kartierung der zellulären Ploidie vorangebracht und Schätzungen der Größe und Zahl von Hepatozyten genauer gemacht. Es bleibt auch plausibel, dass durch die Berücksichtigung zusätzlicher kernnuklearer Parameter, wie z. B. internukleare Abstände (Abbildung 7C), mononukleare Zellen von "einfachen" binuklearen Hepatozyten diskriminiert werden könnten und dass eine weitere Segregation "komplexer" binuklearer Zellen durch radiale Messungen der Kerne erreicht werden könnte, die ihre 2D-Masken enthalten.

Da validierte humane HNF4-Antikörper für FFPE-Gewebe25 vorhanden sind und die interne Kalibrierung diese Methode von allen artspezifischen Einschränkungen befreit, ist das Protokoll fast sofort auf menschliche Proben anwendbar. Somit hat es ein beträchtliches Potenzial, einen Maßstab für die Analyse von Hepatozytenkernploidie und Leberschäden bei menschlichen Krankheiten zu liefern. Auch durch Multiplexing mit anderen Antikörpern, Diese Methode kann neue Rollen für bestimmte Hepatozyten-Teilmengen und ihre Reaktion auf Leberschäden und Krankheiten offenbaren. Zu diesem Zweck haben wir erfolgreich die Methodik mit der Immunfärbung für den proliferativen Kernmarker Ki-67 (Abbildung 6) kombiniert, wodurch nützliche Informationen gewonnen werden können - einschließlich der Identifizierung nicht-proliferierender 2N-Populationen von NPCs zur verbesserten internen Kalibrierung der Ploidie (Noon, unveröffentlichte Daten 2019). Daher schlagen wir vor, dass durch die Kopplung der Flexibilität mit den Positions- und quantitativen Daten, die die Methode liefert, ihre zukünftigen Anwendungen das Verständnis der Rolle der Polyploidie in der Leber verbessern werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der spanischen MINECO Regierung Zuschüsse BFU2014-58686-P (LAN) und SAF-2017-84708-R (DJB) finanziert. LAN wurde unterstützt durch ein nationales MINECO Ramon y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 und Plan GenT Award (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) und FMN von einem regionalen ValI+D Studentenschaft der Valencianischen Generalitat ACIF/2016/020. Das RP würdigt Prof. Ewa K. Paluch für die Finanzierung. Wir danken Dr. Alicia Martinez-Romero (CIPF Cytometry Service) für die Hilfe bei der IN Cell Analyzer Plattform.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) TestDiet 1810704 Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) Invitrogen A11055 Dilution 1:500
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cryostat Leica CM1850 UV Leica biosystems CM1850 UV Tissue sectioning
Fluorescent Mounting medium Dako S3023
GraphPad Prism GraphPad Software Prism 8 Statistical software for graphing data
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Final concentration 5 µg/mL
IN Cell Analyzer 1000 GE Healthcare Bio-Sciences Corp High-Content Cellular Imaging and Analysis System
MATLAB MathWorks R2019a Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy
Microscope coverslides VWR International 630-2864 Size of 24 x 60 mm
Microsoft Office Excel Microsoft Speadsheet software
OCT Tissue Tek Pascual y Furió 4583
Paraformaldehyde Panreac AppliChem 141451.121
Pen for immunostaining Sigma-Aldrich Z377821-1EA 5mm tip width
Polysine Microscope Slides VWR International 631-0107
Rabbit polyclonal Anti-HNF4α Thermo Fisher Scientific PA5-79380 Dilution 1:250 (alternative)
Rabit polyclonal Anti-HNF4α Santa Cruz Biotechnology sc-6556 Dilution 1:200 (antibody used in the study)
Tween 20 Sigma-Aldrich P5927

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References

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Medizin Ausgabe 158 Leber Polyploidie Hepatozyten hochgehaltige Bildgebung Hepatologie Hepatozytenkernfaktor 4 alpha (HNF4)
A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice
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Manzano-Núñez, F., Peters, R., Burks, D. J., Noon, L. A. A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice. J. Vis. Exp. (158), e60095, doi:10.3791/60095 (2020).

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