Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

תפוקה גבוהה בשיטת באתרו להערכת הפטציט הגרעיני בעכברים

Published: April 19, 2020 doi: 10.3791/60095
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1,3
1Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)

Summary

אנו מציגים שיטה חזקה, חסכונית, וגמיש למדידת שינויים במספר hepatocyte ובכלי הנשק הגרעיני בתוך קבוע/הקפאה דגימות רקמות שאינו דורש זרימה cy, try. הגישה שלנו מספקת חתימה רבת עוצמה לדוגמה של ציטולוגיה בכבד עבור מעקב אחר ההתקדמות של פגיעה בכבד ומחלות.

Abstract

כאשר הכבד נפצע, מספרי הפטוציט מפחיתים, בעוד שגודל התאים, גודל הגרעין והעלייה בפלויידי. התרחבות של תאים שאינם מסוג מדומה, כגון המרה, מיופיברוציטים, ושלתי ותאים דלקתיים גם מצביעים על נזק כבד כרוני, שיפוץ רקמות והתקדמות המחלה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים גישה פשוטה תפוקה גבוהה לחישוב שינויים בהרכב הסלולר של הכבד הקשורים לפציעה, מחלה כרונית וסרטן. אנו מראים כיצד מידע שהופק מסעיפים דו ממדיים (2D) רקמות ניתן להשתמש כדי לכמת ולכייל hepatocyte הגרעין הגרעיני בתוך מדגם ולאפשר למשתמש לאתר תת ערכות מסוימות פלואידיות בתוך הכבד באתרו. השיטה שלנו דורשת גישה לחומר כבד קבוע/קפוא, ריאגנטים חיסונית בסיסי וכלי כל פלטפורמת הדמיה גבוהה. היא משמשת חלופה רבת עוצמה לטכניקות הזרימה הסטנדרטיות של cy, אשר דורשות הפרעה של רקמה שנאספה לפני כן, אובדן מידע מרחבי והטיה פוטנציאלית לפירוק.

Introduction

הפטציטים בכבד היונקים יכולים לעבור נתקע ציטוקינזה כדי לייצר תאים binuclear, ו-DNA endoreplication לייצר גרעיני פוליפואיד המכילים עד 16N ה-DNA תוכן. הגדלת הפלואידיות התאית והגרעינית במהלך פיתוח הפוסט-לידה, הזדקנות ותגובה ללחצים סלולריים מגוונים1. תהליך הפוליפולואידיזציה הוא דינמי והפיך2, למרות שתפקידה הביולוגי המדויק אינו ברור3. מוגברת פלויידי הוא קשור עם קיבולת ההתרבות מופחתת4, מגוון גנטי2, הסתגלות לפציעה כרונית5 הגנה מפני סרטן6. השינוי הפטוציט הפלואידי מתרחש כתוצאה מקצב מעגלי משתנה7, והגמילהמשמונה. בעיקר, הפרופיל הפלואידי של הכבד משתנה על ידי פציעה ומחלה9, וראיות משכנעות מציע כי שינויים מסוימים פלואידיות, כגון הגדלת ≥ 8n גרעינים או אובדן של 2n hepatocytes, לספק חתימות שימושיות עבור מעקב אחר מחלת כבד שומני לא אלכוהוליים (nafld11) התקדמות3,10, או ה

במונחים כלליים, פגיעה בכבד והתחדשות קשורים עם גודל תא hepatocyte מוגבר שטח גרעיני12, יחד עם מספר כולל מופחת של hepatocyte, במיוחד אלה עם 2n תוכן DNA10,11. הפציעה בכבד מלווה גם לעתים קרובות על ידי התרחבות של תאים שאינם מתוך הכתוניים (NPCs), כולל סטרומה מיוסטרותקיעות, תאים דלקתיים ותאים מחולל בכבד biפוטנטי. שיטות תפוקה גבוהה המספקות פרופיל ציטולוגי כמותי של מספר תא מדומה ופלויידי גרעיני, ואילו גם חשבונאות לשינויים NPCs, ולכן יש פוטנציאל ניכר כמו מחקר כלים קליניים כדי לעקוב אחר תגובת הכבד במהלך הפציעה והמחלה. משכנעת לאחרונה בניתוח באתרו של הפלויידי ספקטרום בדגימות האדם של קרצינומה hepatocellular גם להדגים כי הפיידי הגרעינית הוא גדל באופן דרמטי בתוך גידולים והוא מוגבר במיוחד תת הגידול אגרסיבי יותר עם בידול מופחת ואובדן של TP5313. מכאן, קיימת אפשרות חזקה שהתקדמות מתודולוגיים בהערכה כמותית של הפלואידיות הגרעינית תסייע ביצירת פרופיל התחזיות העתידיות של סרטן הכבד.

בפרוטוקול זה, מתודולוגיה גמישה בתפוקה גבוהה עבור ניתוח השוואתי של מקטעי רקמת הכבד של העכבר מתוארים, אשר מספק פרופיל cy, מפורט של מספרי hepatocyte, התגובה NPC ושיטה מכויל פנימי להערכת הגרעין פלויידי (איור 1). הפטציטים נבדלים מ NPCs על ידי הגורם הגרעיני hepatocytes 4 אלפא (HNF4α) אימונויניום, לפני אפיון של גודל גרעיני וממורמטריה גרעינית. "תוכן ה-DNA מינימלי" מוערך עבור כל מסכות גרעיניות מעגלית על ידי שילוב ממוצע Hoechst 33342 עוצמה (proxy עבור צפיפות DNA) עם הנפח תלת מימדי (3D) הגרעיני. הפטציט תוכן די-אן-איי מינימלי מכויל לאחר מכן באמצעות NPCs כדי ליצור פרופיל של פלויידי גרעיני.

רכישת תמונה, פילוח גרעיני וניתוח תמונה מבוצעים באמצעות הדמיה בעלת תוכן גבוה, המאפשר אזורים גדולים של דו מימדי (2D) מקטעי כבד המכילים עשרות אלפי תאים להיות מוקרן. תוכנית מותאמת אישית מסופקת לצורך עיבוד אוטומטי של נתוני ניתוח תמונה באיכות גבוהה כדי להפיק פרופיל פלואידי רחב לדגימה לכל גרעין הפטוציט המעגלי. פעולה זו מבוצעת באמצעות חינם כדי להוריד את התוכנה כדי לחשב את הנשק הגרעיני מבוסס על ניתוח התמונה סטריאוולוגית (SIA)10,11,14,15. מתודולוגיית ה-SIA אומתה בעבר על ידי הזרמת cy, כשיטה מדויקת, אם כי מפרך, שיטה להערכת הפרופציט גרעינית בכבד14, בהנחה מורפולוגיה גרעינית מעגלית מערכת יחסים בין הגודל הגרעיני ותוכן ה-DNA. בפרוטוקול זה, שני הפרמטרים הגרעיניים נמדדים על ידי הערכה של מורמטריה גרעינית ו הופסט תוויות 33342. החישוב של "תוכן ה-DNA מינימלי" עבור כל מסכה גרעינית מלווה בכיול של hepatocyte הגרעין הגרעיני באמצעות NPCs, אשר יש הידוע 2 על התוכן DNA ולכן לשמש שליטה פנימית שימושי.

לעומת הזרם הקונבנציונלי cy, שיטות שירות16 הגישה המתוארת מאפשרת hepatocyte הגרעין הגרעיני כדי להיות מוערך באתרו ואינו דורש גישה לרקמה טרייה או שיטות מצבור שיכולים הטיה תוצאות ולהיות קשה לתקנן. כמו בכל הגישות המבוססות על SIA, מחלקות ההגנה הגרעינית > 2N מיוצגים באמצעות דגימת 2N בשל החשיפה של גרעין גדול מחוץ למישור המשוונית. הפרופיל ברקמות הפלואידיות מתאר גם את תוכן ה-DNA המינימלי לכל מסכות הגרעין העגולות, ואינו מפלה ישירות בין תאי הפטציטים והתאים הבינאוריים בעלי שני הגרעינים הנפרדים ("לא נוגעים") של אותו פלויידי. עם זאת, את הפשטות של פרוטוקול זה מאפשר היקף ניכר עבור אותו להיות מותאם לחשבון עבור פרמטרים נוספים כגון מרווח בין גרעיני או ניתוח היקפי התא, זה יקל על זיהוי של תאים binuclear מתן הערכה מפורטת יותר של הסלולר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ניסויי החיות אושרו בעבר על ידי ועדת האתיקה של האו. עכברים שוכנו במתקן נטול הפתוגן במרכז החקירה של פרינסיפה פליפה (ולנסיה, ספרד), רשום בתור בעל חיים ניסיוני מגדל, משתמש, ואספקה (reg. no. ES 46 250 0001 002) תחת התנאים הנוכחיים של הרווחה האירופית והספרדית בעלי חיים (RD 53/2013).

1. קצירת רקמות והכנת דגימות

הערה: פרוטוקול זה מתאר כיצד להקפיא רקמות ללא קיבעון מוקדם או הקפאה מוקדמת. עבור דגימות שתוקנו/הקפאה בעבר, המשך לסעיף 2 והשמט את השלב 3.1. כל הניתוחים בוצעו באמצעות נקבה מבוגרת C57BL/6 עכברים בגילאי 12 עד 16 שבועות.

  1. הקרבת בעלי חיים על ידי הזרקת פנטניל/פנטוברביטל הצפק ואחריו פריקה צוואר הרחם. עם העכבר מול הצד הגחוני למעלה, לפתוח את חלל הבטן לחשוף את הכבד על ידי אוחז את העור עם מלקחיים וביצוע חתך אנכי מהבסיס של הבטן התחתונה לבסיס עצם החזה באמצעות מספריים כירורגי.
  2. בזהירות להסיר את כיס המרה באמצעות פינצטה עדין, לנתח את הכבד ולשטוף את הכבד הנבחר כדורית בצלחת 10 ס"מ צלחת פטרי ממולא מלוחים מואגור פוספט (PBS).
    הערה: מומלץ להשוות את אותה אונה הכבד עבור כל חיה, במקרה זה האונה החציוני שימש.
  3. מילוי קריומתויג עם טמפרטורת חיתוך (OCT) מיטבית בטמפרטורת החדר (RT). להימנע בועות OCT. אם הם מופיעים, לדחוף אותם לקצה של העובש באמצעות מחט או טיפ פיפטה.
  4. הטמע כדורית הכבד לתוך ממולא OCT הישן ומיד מניחים אותו על קרח יבש כדי להבטיח הקפאה מהירה. ב80 מעלות צלזיוס עד להקפאה.

2. קריוסיס1

  1. מובילים בקרח יבש על מנת. למנוע השפלה ברקמות לפני ההקפאה בתוך ההקפאה הגדר עד 20 ° c עבור 20 דקות.
  2. להוציא לדוגמה על ידי הפעלת לחץ על הבסיס של הקריומית פלסטיק. החל את OCT הנוזלי כדי לחמם את הדיסק לדוגמה ב-RT, מיקום בהקפאה וחבר דגימת כבד מוטבעת של OCT. החל לחץ עדין והמתן 3 דקות עבור OCT כדי להקפיא להבטיח את המדגם מקלות לדיסק.
    הערה: הימנע מטיפול במדגם עם האצבעות ככל האפשר כדי להתחמק השפלה רקמות.
  3. נעל את המדגם בזרועו של הקריוסטט וכוונן את הכיוון כך שקצה המדגם יהיה מקביל ללהב הקריוסטט. חותכים את הדגימה עד שהרקמה מגיעה.
  4. מקטע את המדגם בעובי של 6 יקרומטר. מניחים שקופית מצופה פוליאמיד המסומנת על המדגם עבור 5 s כדי לאפשר לדוגמה להיצמד לשקופית. מקם את השקופית ב-RT עבור 3-5 דקות, לאחר מכן, לקבלת תוצאות מיטביות, המשך ישירות לסעיף 3.
    הערה: לעיבוד של מספר דוגמאות טריות מוקפאות מתקבלות על-ידי אחסון זמני של שקופיות בתיבת שקופיות בקרח יבש עד לעיבוד כל הדגימות. בעת שימוש בגישה זו, מאפשרים לכל השקופיות להגיע למצב של RT לפני שתמשיך בסעיף 3. Formalin קבוע פרפין מוטבע (FFPE) דגימות ניתן להשתמש, למרות הרקע autoפלואורסצנטית הוא גדל על ידי שיטה זו. כדי להמשיך מתוך דגימות FFPE, מקטע ב 4 μm. הר על ידי לכידת סעיפים מ 40 המים ° c בג על מגלשות מטופלים פוליאמיד. חום שקופיות עבור 1 h ב 60 ° c, לאחר מכן לאחר מכן על ידי שטיפת RT טורי (5 דקות) בצנצנות coplin המכילים קסילן (x2), אתנול 100% (x2), 96% (x2), 70% (x1) ו-dH2O (x1). כדי לחשוף שקופיות של מקום אנטיגנים במאגר ציטראט עבור 20 דקות ב-90 ° צ' לפני שקופיות הרפיה ב-PBS at RT. המשך לשלב 3.2.

3. אימונויניום

  1. תקן את מקטעי הרקמה בתוך מכסה המנוע על ידי החלת 1 מ ל 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב-PBS עבור 10 דקות ב-RT. העבר שקופיות לצנצנת PBS מילא ושטוף 3 דקות בעצבנות עדינה (חזור על 3x).
    הערה: מעתה ועד סוף תהליך החיסוני, הימנע מייבוש המדגם.
  2. יבש את האזור סביב כל חתך הרקמה ולהקיף באמצעות עט הידרופובי. החדירות עם 0.5% nonionic סורסטנט (כלומר, טריטון X-100) ב-PBS עבור 15 דקות ב-RT. לאחר מכן רוחצים ב-PBS בצנצנת Coplin במשך 3 דקות בעצבנות עדינה (חזור על 2x).
  3. בלוק שימוש בתמיסה מסוננת של 1% בסרום של שור (BSA), 5% סרום סוסים, 0.2% nonionic מבקר ב-PBS (לפחות 1 h ב RT).
  4. מודלת עם נוגדן HNF4α העיקרי מדולל במאגר חסימת בלילה ב 4 ° c בחדר כהה כתמים לחים (ראה טבלת חומרים עבור נוגדנים ומדלל ספציפי).
  5. הניחו שקופיות בצנצנת של מילוי הPBS ושטפו במשך 3 דקות בעצבנות עדינה (חזור על 4x).
  6. דגירה עם אלקסה-488 נוגדן משני מצוחים ו Hoechst מדולל מסונן 1% BSA ו 0.2% nonionic סורסטנט ב-PBS עבור 2 h ב RT ב לחות כהה תא כתמים (ראה טבלת חומרים עבור נוגדנים ומדלל ספציפי).
  7. הניחו שקופיות בצנצנת של מילוי הPBS ושטפו במשך 3 דקות בעצבנות עדינה (חזור על 4x). התרחץ ב-ddH2O עבור 3 דקות בעצבנות עדינה (חזור על 2x).
  8. הר שקופיות על ידי הצבת שתי טיפות של מדיה הרכבה פלורסנט על coverslip (24 x 60 מ"מ) והנחת שקופיות על זה, חיסול בועות על ידי הפעלת לחץ עדין. לאחסון לטווח ארוך, חותם שמיכות בקצוות עם לק ציפורניים ברור לאחסן בחושך ב 4 ° c.
  9. לפני שתמשיך, בדוק שקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית קונבנציונאלי כדי להבטיח קיבעון טוב immunolabeling.
    הערה: ראה איור 2א, ב לקבלת תוצאות צפויות.

4. רכישת תמונה פלואורסצנטית

הערה: עבור שלב זה, פלטפורמת דימות בעלת תוכן גבוה (טבלת חומרים) נדרשת ותומכת ברכישת תמונות פלואורסצנטית אוטומטית.

  1. הפעל את מערכת ההדמיה ופתח פרוטוקול רכישה חדש.
  2. בחר את המטרה 10x, לשים לב לאזור של שדה התצוגה (במקרה זה 0.6 mm2).
  3. הגדר פרמטרים כדי לרכוש תמונות פלואורסצנטית באמצעות עירור המתאים ומסנני פליטה (כמו לכל שלב 3.6). עבור Hoechst ו אלקסה-488, בחר "DAPI" ו "GFP" ערוצים עם 390/18 ו 438/24 ננומטר ו 432.5/48 ו 475/24 פליטת ננומטר, בהתאמה.
  4. התמקד במדגם וודא שעוצמת האות אינה מרוויה. ודא כי לכידת תמונה נעשית עם אותו זמן חשיפה עבור כל התמונות או להשתמש במערכת שבה האינטנסיביות של הזריחה תוקנה לזמן חשיפה.
  5. לסרוק את המדגם ולרכוש תמונות מספיקות כדי לקבל כיסוי מלא של מקטע הרקמה (כ 20-50 שדות תצוגה, בהתאם לגודל המדגם).
  6. סקור את מסד הנתונים של התמונה, ביטול ידני (i) שדות ממוקדים היטב, (ii) אלה בגבולות של כל מקטע רקמות (כדי למנוע חישובים בצפיפות תאים ממתח), ו-(iii) אלה המכילים אזורים מקופלים/פיזית ניזוק של סעיף הרקמה אם קיים.

5. ניתוח אוטומטי של תמונה פלואורסצנטית

הערה: שלב זה דורש תוכנת ניתוח תמונהמתאימה (טבלת חומרים) המסוגלת: (1) זיהוי אוטומטי של הופסט גרעיני בתוך תמונות ב 405 ננומטר (מקטעי גרעין), (2) הערכה משמעות העוצמה הגרעינית hoechst, ו (3) בניתוח הסף כדי לקבוע את +/-מצב של זריחה גרעינית ב 488 ננומטר (HNF4α) כמה הכשרה מפעילה בסיסית/מומחיות נדרשת כדי להעריך ולהתאים את פילוח ופרמטרים סף בתוך התוכנית כדי להבטיח כי גרעיני ו HNF4α +/-מצב הם מגודרת בצורה אופטימלית (איור 2).

  1. בתוכנה לניתוח תמונות, פתח את קובץ הרכישה המכיל את התמונה (405 nm) ו HNF4α (488 nm) תמונות משלב 4.5, וליצור פרוטוקול ניתוח חדש.
  2. הגדר אורכי גל לשימוש עבור פילוח גרעיני (Hoechst, 405 nm) ועבור ניתוח הסף של hepatocyte/NPC (HNF4α, 488 nm).
  3. להתאים את הפרמטרים של התוכנה מפילוח גרעיני (כגון "שטח גרעיני מינימלי" וזיהוי גרעיני "רגישות") כדי להבטיח גרעינים הם הפרדה אופטימלית.
    הערה: יש לקבל עדיפות גבוהה יותר מפילוח של הפטוציטים בגלל זה של npcs. גרעיני הפטציט מעוגל בדרך אופיינית (טווח בין רבעוני: 40-64 יקרומטר2). גרעיני NPC, כגון אלה של sinusoidal אנדותאליה, הם משוטחים/אליפטי או לא סדיר בצורה בדרך כלל קטן יותר וצפוף יותר מאשר אלה של hepatocytes (טווח הרביעון גודל: 30-43 יקרומטר2). עבור כבד העכבר, שטח גרעיני מינימלי ≥ 23 יקרומטר2 וזיהוי "רגישות" של 65% שימשו (ראה איור 2ג, D לקבלת תוצאות צפויות). רגישות קובעת כיצד אשכולות הפיקסלים מזוהים כגרעינים בודדים המבוססים על עוצמתם וצריכים להיבדק באופן אמפירי עבור כל דוגמה שנקבעה על-ידי המשתמש לפני שתמשיך בניתוח תמונה אוטומטי.
  4. שינוי עוצמת הסף ב 488 ננומטר כדי להבטיח המשך הHNF4α של הפציטים (+) ותאים שאינם מתוך מכוניים (HNF4α-).
    הערה: ראה איור 2ג, D לקבלת תוצאות צפויות. הערך של עוצמת הסף הוא יחסי ויהיה תלוי בצביעת יעילות והגדרות רכישה כגון עוצמת לייזר. לכן צריך להיות מתוקננת על ידי המשתמש. השתמש HNF4α-תאים מוכרים כגון תאים אנדותל ו-NPCs הperiportal כפקד פנימי שלילי ובין גרעיני hepatocyte כהתייחסות חיובית לצביעת. בדוק את פרמטרי הניתוח באמצעות מספר קטן של תמונות כדי להבטיח פילוח גרעיני טוב והפרדה בין הסף לפני החלת פרמטרי ניתוח על קבוצת הנתונים כולה.
  5. בחרו את הפרמטרים הגרעיניים הבאים כדי לכמת: (1) אזור גרעיני המבוסס על כתמים הוקוסט (μm2), (2) פירושו חוזק גרעיני הופסט (RU), (3) גורם התארכות גרעינית (יחס ממוצע של הציר הקצר של הגרעין לציר הארוך של הגרעין, שבו לאובייקט מרכז סימטרי [לא מוארך] יש ערך של 1, (4) nuc 1/(מארז הטופס), משמעות גרעינית "מעוגלות" מדד מחושב על ידי היקפית 2/(4π x אזור). הערכים נעים בין 1 לאינסוף, כאשר 1 הוא מעגל מושלם, (5) HNF4α סטטוס (חיובי-1 או שלילי-0), ו (6) קואורדינטות x/y מבוסס על "מרכז הכבידה" (cg), שיטה לאיתור מרכז האובייקט מתמונות בקנה מידה אפור עם דיוק תת פיקסל.
  6. הפעל את הניתוח עבור כל ערכות הנתונים לדוגמה ויצא נתונים מספריים משלב 5.5 לתוכנת גיליון אלקטרוני.

6. ניתוח נתונים

הערה: ניתן לבצע את שלב ניתוח הנתונים באמצעות כל תוכנת גיליון אלקטרוני סטנדרטית.

  1. חשב את הפטציט ואת מספרי התאים הלא-מפאציט.
    1. חשב את האזור הכולל של מקטע הכבד שנותח עבור כל מדגם על-ידי הכפלת מספר שדות התצוגה על-ידי האזור של שדה התצוגה (שלב 4.2).
    2. עבודה עם קבצי גיליון אלקטרוני שנוצר עבור כל מקטע כבד, לסנן את הנתונים על ידי בחירת רק HNF4α + גרעיני. חשב את המספר הכולל של HNF4α + גרעיני מנותח וחילוק זה על-ידי האזור הכולל שנותח כדי להשיג דחיסות hepatocyte ממוצע עבור כל מדגם (איור 2F).
    3. בצע את החישוב זהה עבור תאים שאינם מופיעים על-ידי סינון הגיליון האלקטרוני עבור HNF4α-תאים (איור 2E).
  2. חשב את התפלגות הגודל הגרעיני של hepatocyte.
    1. באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני, סנן נתונים כדי לבחור רק HNF4α + גרעינים.
    2. התוויית ערכים של אזור גרעיני בהיסטוגרמה (איור 2G). הגדר את רוחב הסל עד 5 יקרומטר2.
      הערה: ניתן לתקן ערכי תדירות עבור שטח (גרעינים/mm2) לפי שלב 6.1.1.
  3. בצעו ניתוח גרעיני. לחיפטציט
    הערה: נתוני הגיליון האלקטרוני משלב 5.6 משמשים להפקת פרופיל משתמש גרעיני עבור כל דוגמה. תהליך זה היה אוטומטי וניתן לבצעה באמצעות תוכנה כתובה מותאמת אישית הזמינה באופן חופשי להורדה עם מידע תמיכה וערכות נתונים הדגמה בhttps://github.com/lukeynoon(ראה הוראותקבצים משלימים). קוד מקור מסופק עבור משתמשים המעוניינים להתאים את המתודולוגיה. תיאור של האלגוריתם, יחד עם הוראות התקנה ושימוש מתוארים להלן. התוכנית משתמשת בנתוני גיליון אלקטרוני כדי להפריד באופן אוטומטי גרעינים hepatocyte לשתי קבוצות; (1) אלה עם גרעיני "פשוט" מעגלי ו (2) "מורכב" הנציג של הגרעין הלא עגול של תאים binuclear עם > 2c פלויידי. התוכן המינימלי הגרעיני DNA (פונקציה של שטח גרעיני וצפיפות DNA) מחושב הבא עבור כל "פשוט" גרעיני. הצעד הבא מכייל באופן אוטומטי HNF4α + hepatocyte הגרעין הגרעיני באמצעות HNF4α-גרעיני כפקד פנימי 2-4N מוכר.
    1. הורד והתקן תוכנה.
      1. הורד את היישום הארוז מ: https://github.com/lukeynoon
      2. . הפעל את MATLAB נווט אל הכרטיסייה APP של רצועת הכלים, לחץ על התקן app ופתח את היישום שהורדת כינה "Ploidy_Application. mlappinstall". תופיע הודעה שתאשר את ההתקנה המוצלחת.
        הערה: היישום מוכן כעת לשימוש ויישאר בכרטיסייה APP של רצועת הכלים.
    2. עיצוב נתוני קלט.
      הערה: לפני ניתוח מיידי של הגרעין הגרעיני, כל קבצי הגיליון האלקטרוני המכילים נתוני הדמיה של תוכן גבוה (שלב 5.6) צריכים להיות מאוחסנים ומעוצבים בהתאם להנחיות הבאות.
      1. בכל קובץ נתונים מיוצא (. XLS 97-2004 חוברת עבודה) משלב 5.6, כלול גיליון הנקרא "מדדי תאים" המכיל את כל הנתונים הדרושים לניתוח הפלויידי שנקבעו בעמודות (איור 3א). ודא שפריסת הגיליון האלקטרוני כולל שמות של כותרות עמודה נותרת ללא שינוי מתוך הספרה 3A, מכיוון ששיטת הניתוח מאתרת את נתוני העמודה הנכונים על-ידי חיפוש שמות אלה (ראה ערכות נתונים של הדגמה בקבצים משלימים עבור הפניה). אם לדוגמה, תוכנה לניתוח תמונות באיכות גבוהה אינה מפיקה עמודת "שטף אור" (איור 3א), הכנס באופן ידני עמודת "שטף אור" באותו מיקום, כלומר, עמודה K ומלאו אותה באפסים.
      2. עבור כל מצב ניסיוני (למשל, "פצועים-d14"), מספקים ערכת נתונים של בקרה, שישמשו לחישוב השליטה הפנימית עבור 2 כיול גרעיני (שלב 6.3.4.3). כאן, בחר דגימות כבד מתוך כנות למבוגרים לא מטופלות ("בקרת-d0"; איור 3ב-ד).
      3. לשכפל ביולוגי (לכל תנאי), אחסן כל גיליון אלקטרוני בתיקיה משלה (כמו באיור 3ב). ציין את שם קידומות התיקיות בהפרשים קבועים, לדוגמה, "Sample1, Sample2, Sample3... SampleN ", לפי שמות הקבצים הכלולים בתוך. מכאן, כל תיקיית ערכת נתונים (למשל, "Control-d0") צריך להכיל סדרה של תיקיות משנה ("Sample1", "Sample2", וכו ') כל המכיל קובץ גיליון אלקטרוני של אותו שם מקביל.
    3. . תריץ את הבקשה
      1. בתוך MATLAB, הפעל את "Ploidy_Application" על ידי לחיצה על הסמל בתוך הכרטיסייה APPS שלי של רצועת הכלים (איור 3ג). ממשק המשתמש הגרפי Ploidy_Application (GUI) יופיע (איור 3ג).
      2. לחץ על הנתיב כדי לשלוט בלחצן נתונים כדי לנווט אל התיקיה שבה משכפל נתוני הפקד (לדוגמה, "control-d0"). נתיב נתונים זה יופיע לאחר מכן בממשק (לדוגמה, /Ds/deskpuerusuderul).
      3. לאחר מכן, ב "קידומת תיקיה" הקלד את השם שיינתן לקבצי הפלט (לדוגמה, "לדוגמה").
        הערה: ניתן לשנות קידומת זו לכל טקסט, בתנאי שהתיקיות ושמות הקבצים יישארו מצטבר בשם.
      4. לחץ על לחצן נתיב לנתונים אחרים ונווט אל התיקיה שבה משכפל הנתונים השוואתיים (לדוגמה, "פצועים-d14"). נתיב נתונים זה יופיע לאחר מכן בממשק (לדוגמה,/ Users/deskpsogoged-a).
      5. לחץ על הפעל!. לאחר השלמת הניתוח, שורת המצב תיקרא "ניתוח!.. השלמה".
        הערה: היישום ידווח, עבור כל דוגמה, ריבוד של גרעין "פשוטים" לתוך ≤ 2n, 2n-4n, 4n-8n ו-8n + במונחים של ספירות מוחלטות וכאחוזים מכלל (איור 3ד). קבצים אלה יישמרו באופן אוטומטי בכל תיקיה לדוגמה כמו: "Count_2n. txt", "Count_2n_to_4n. txt", "Count_4n_to_8n. txt", "Count_8n_and_higher. txt", "Percentage_2n. txt", "Percentage_2nto4n. txt", "Percentage_4nto8n.txt", "Percentage_8n_and_higher.txt". הPloidy_Application תשמור באופן אוטומטי רשימה עבור כל דוגמה, של כל האומדנים הבודדים פלואידי עבור "פשוט" hepatocyte ו גרעיני לא-hepatocyte ב "Ploidy_All_Hepatocytes. txt" ו- "Ploidy_NonHepatocytes. txt". עבור ערכת הנתונים של הפקד, השיטה שומרת גם את ספי התוכן המינימלי של ה-DNA שחושבו לריבוד של פלויידי (ראה שלב 6.3.4.3.7) בקובץ בשם "Normalised_Thresholds_Control". לבסוף, היישום יפיק תיקיה עבור הפקד הן ונתוני התנאי השוואתי שנבחרו מכונים "תקציר". תיקיה זו מכילה שתי תיקיות ממשנה, "פלויידי" ו-"ריבוד" המכילות את הממוצעים של כל הדגימות שסופקו (איור 3ד).
    4. תיאור המתודולוגיה.
      הערה: הסעיף הבא מתאר בפרוטרוט את המתודולוגיה המשמשת את תוכנת ניתוח הפלואידיות הגרעינית. אם המשתמש בוחר שלא להשתמש ביישום, ניתן לעקוב אחר שלבים אלה באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני כדי לחשב את פרופיל הפלואידי הגרעיני באופן ידני.
      1. להפריד את הגרעינים לתוך "פשוט" או "מורכב" על פי מורמטריה גרעינית.
        1. חישוב "אינדקס מעגלי" עבור כל הגרעינים, המוגדרים כגורם גרעיני "פקטור התארכות" מחולק על-ידי "Nuc 1/(מארז טופס)", כאשר ערך של 1.0 מציין מעגל מושלם.
          הערה: "התארכות גרעיניות" ו-"Nuc 1/(מארז הטופס") הם שני מדדים נפרדים של "מעגליות" של האובייקט, ההערכת קריטריונים משלימים, שאינם חופפים. הראשון מודד את הציר הארוך והקצר של העצם, בעוד האחרון משווה את אורך ההיקף של האובייקט לאזור. כדי לחזק את ההגדרה של מעגליות גרעיניות המשמשות בפרוטוקול זה, שתי מדידות אלה שולבו לתוך "אינדקס מעגלי" אחד. הגישה הקודמת להערכת הגרעין הגרעיני באמצעות המתודולוגיה המתוארת השתמשו רק התארכות גרעינית17. בעוד שתוצאות מקובלות התקבלו באמצעות גישה זו, המחברים ראו כי "מדד מעגלי" המורכב משפר את האפליה של גרעינים שנבחרו באופן ידני מתוך מוננוציטים ובין-בהיר (נתונים לא מוצגים).
        2. סווג גרעינים עם מדד מעגלי ≤ 0.8 כ "מורכב" ואלה > 0.8 כמו "פשוט".
      2. הערכת "מינימלי" תוכן ה-DNA (m) עבור כל "פשוט" גרעיני.
        1. חשב את הרדיוס הגרעיני (r) באמצעות הנוסחה:
        2. חשב נפח גרעיני (v) באמצעות אמצעי האחסון של נוסחת הספירה:
        3. צור ערך יחסי עבור תוכן DNA מינימלי (m) באמצעות הנוסחה:
      3. כיול ערכת הנתונים באמצעות גרעין NPC (HNF4α) כפקד פנימי של 2-4N.
        הערה: NPCs יש 2 התוכן DNA-4N בהתאם למצב מחזור התא. מכאן, ערך ממוצע של NPC "מינימלי" תוכן ה-DNA (npc) גדלעם פציעה (איור 4א). שגיאת הכיול ממוזערת על-ידי יצירת מגבלה עליונה של NPCm המייצגת סף 4c (איור 4ב).
        1. בתוך הגיליון האלקטרוני, בחר רק גרעיני NPC עם ערכים עבור "m" זה לשקר בתוך 1 סטיית תקן (SD) של המצב (זה מסנן את הרעש מתוך שגיאת פילוח אפשרי).
        2. בתוך טווח מסונן זה, בחנו את האזורים הגרעיניים ואת עוצמות הכוונות המקבילות שלהם (איור 4ג).
        3. העריכו את השטח הגרעיני הקטן ביותר בתוך טווח מסונן זה בעוצמה הגרעינית המקסימלית האטומית (כלומר, הנקודה שבה קו העקומה משנה כיוון בערכת הנתונים המסוננת כפי שמודגם על-ידי העיגול האדום באיור 4ג). ערך זה מייצג מצב המעבר של 2N-4N (t) שמעליו מדגימה של גרעיני 4n בעיקר על פני גרעינים מדגם 2n, והתוצאה היא מקסימה של עוצמת ההואכסט.
          הערה: ערך זה נקבע באופן אוטומטי על-ידי התוכנה; עם זאת, משתמשי גיליון אלקטרוני יכולים לבחור באופן ידני נקודה זו כגודל המעבר.
        4. חשב את תוכן ה-DNA המינימלי המיוצג על-ידי גודל מעבר זה (tm) בעקבות שלב 6.3.4.2.
        5. כדי להעריך את הכתף 4N של ערכתהנתונים NPC , להוסיף 1 SD לערך של tm. המספר שהתקבל (איור 4ב) מתאר את הגבול העליון של התוכן NPC מינימלי DNA לשמש ריבוד הגרעינית (S4c).
        6. חזור על שלבים 6.3.4.3.1-6.3.4.3.5 עבור כל "שליטה" דגימות.
          הערה: לדוגמה, באיור 3, כבדי שליטה שלא נפגעו ("control-d0") משמשים כתנאי בקרה.
        7. לחשב את הממוצע 4c ריבוד סף (s4c) עבור "שליטה" דגימות ולהשתמש בזה כדי להסיק את 2 ג (s2 ג) ו 8c (s8c) גבולות עבור תוכן DNA מינימלי (m). ספי הריבוד נוצרים באופן אוטומטי ומאוחסנים על-ידי התוכנה (שלב 6.3.3.3).
          הערה: בהתאם לעיצוב הלמידה, ניתן לחשב את ערכי הסף הריבוד הממוצעים עבור כל תנאי או עבור תנאים ספציפיים (לדוגמה, כבד בקרה בריא). עם זאת, תוכנת ניתוח התוכנה הגרעינית מחייבת שאחת מסדרה של 2 קבצים מוגדרת כ"שליטה" לצורך חישוב ערכים מדועתיים יחסיים.
        8. חישוב ערך פלויידי עבור כל הגרעינים באמצעות ערך2 ג S שנוצר בשלב 6.3.4.3.7 לפי:
        9. בסוגריים מרובעים "פשוט" הפטציט (HNF4α +) הגרעיני לתוך 2c/4c/8c/> 8c, בהתאם לקריטריונים הבאים: "2c" HNF4α + = p ≤ 2; "4c" HNF4α + = 2 < p ≤ 4; "8c" HNF4α + = 4 < p ≤ 8; "> 8c" HNF4α + = 8 < p.
        10. כדי לשחזר את הדגימה המרחבית של תת-קבוצות הפלואידיות, הפרידו את הנתונים הגרעיניים בתוך כל גיליון אלקטרוני לדוגמה בהתאם לתחומים המתאימים שבהם הם הוכנסו. לאחר מכן השתמש בקואורדינטות x/y גרעיניות (משלב 5.5) כדי להתוות קבוצות מתים של פלואידיות ב-2D (איור 5ג).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטה זו שימש כדי למדוד את ההשפעה של פציעה בכיס התינוק על הכבד של העכבר המבוגר על ידי האכלה בעלי חיים עבור 0-21 ימים עם דיאטה hepatotoxic המכיל 0.1% 3, 5-diethoxycarbonyl-1, 4-דיהידרוטסטוסטרון (DDC)17. תוצאות כרוניות DDC האכלה בפציעה hepatocellular גדל פלויידי והרחבת הפורטל של NPCs. המשתמש צריך להיות מודע כי מאמץ העכבר ואת ההבדלים תלויי הגיל עשוי להתקיים בפלויידי גרעינית וכי כל הניתוחים בוצעו באמצעות נקבה מבוגרת C57BL/6 עכברים בגילאי 12 עד 16 שבועות.

לאחר HNF4α אימונויניום (פרוטוקול סעיף 3), חשוב לבדוק את כל השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית קונבנציונאלי, כדי להבטיח קיבעון באיכות טובה וכתמים (איור 2א). מריחת או טשטוש של Hoechst יכול להצביע על קיבעון מתאים או השפלה לדוגמה לפני קיבעון (איור 2B), ובמקרה זה לחזור לסעיף הפרוטוקול 2 ולקצר את הזמן בין הפחתת הקיבעון (שלב 3.1). החיסונית מוצלחת עם הנוגדן HNF4α ניתן בקלות להישפט בשלב זה על ידי אפליה ברורה של גרעינים באופן חיובי מתויג גרעיני, בדרך כלל גדול יותר מעוגל יותר מאשר אלה של NPCs (איור 2א). גרעיני משוטח/אליפטי בתוך העטיף, או כתמים צפופים של תאים המוחלקים באזורים הפריפאליים לאחר פגיעת DDC יכולים לשמש כהפניה חזותית שימושית לזיהוי HNF4α-NPCs בעת הערכת ההצלחה/כישלון של כתמי חיסוני.

הפרדה גרעינית ופרמטרי הסף HNF4α (שלבים 5.2-5.4) צריך להיות ממוטב בקפידה לפני ניתוח תמונה אוטומטית (שלב 5.6) כדי לשקף באופן כללי את הדפוס החזותי של מכתים חיסוני שנצפתה על ידי מיקרוסקופ הזריחה המקובלת בסוף פרוטוקול סעיף 3 (איור 2ג). דוגמאות לפילוח גרעיני תת-אופטימלי לעומת מספר מיטבי ופרוטוקולי סף HNF4α מסוכמים באיור 2ד. בעקבות ניתוח תמונה (שלב 6.1.3), הנתונים צריכים לשקף מספר גדל והולך של NPCs בכבד עם פציעה DDC (איור 2E), מ 52% ± 2.0% של גרעינים בכבד שליטה כדי 72.8% ± 1.4% לאחר 21 ימים של טיפול DDC. הפטציטים מייצגים 48.0% ± 2.0% של גרעינים מוחלטים בכבד שליטה, concordant עם ניתוחים קודמים של היסטולוגיה בכבד מראה כי hepatocytes לכבוש 70 ל 85% של נפח הרקמה, אבל רק 45-50% של תאי הכבד הכולל18,19. ירידה קטנה אך משמעותית במספרים של HNF4α + גרעיני הוא נצפתה במהלך 14 הימים הראשונים של האכלה DDC (איור 2F). מגרש הפצה בתדר של האזור הגרעיני hepatocyte (שלב 6.2) מראה שיא HNF4α + האזור הגרעיני בכבד בקרת ב 40-50 יקרומטר2 טווח גודל, ו משמרת ימנית ברורה בגודל הגרעיני לאחר פציעה DDC (איור 2G); בעקביות עם מעלה פלויידי ו hepatocellular היפרפרס12.

ב בריא (יום 0) שליטה בכבדים, 63.4% ± 1.7% של HNF4α + גרעיני יש "פשוט" מעגלי מעגלית (איור 5א). איור זה יורד ל 46.8% ± 5.7% (P = 0.042) לאחר 21 ימים של פגיעה DDC, המשקף מורכבות מוגברת של מודוריקה גרעינית כנראה הקשורים הסטה בין מדינות במהלך פוליפולוטיזציה (ראה "פרשנות של מורמטריה גרעינית" להלן). דוגמאות מייצגות של הפצות גרעינית המתקבלים באמצעות שיטה זו באמצעות מקטעי כבד שליטה מוצגים באיור 5A, אשר מתאר כיצד אינטרפולציה של תוכן ה-DNA מאפשר ריבוד של תאים בודדים בתוך מדגם אחד. ערכי ממוצע עבור קבוצות ממשנה של "מורכבות" ו-"HNF4α + תאים" פשוטים מוצגים גם (איור 5א). הנתונים עקביים עם הערכות קודמות של פוליפולודיה ב-80-90% מהמבוגרים בעלי הפטציטים2. תדירות של גרעינים מורכבים (36.6% ± 1.7%) בכבד שליטה גם קירוב זה של תאים binuclear (35%)20, אם כי הנתונים צריכים להיחשב בקפדנות כמדד של הגרעין ולא הסלולר (ראה "פרשנות של מורמטריה גרעינית" להלן). השוואה בין שליטה (יום 0) לבין קבוצות הטיפול ב-DDC צריכה לשקף אובדן משמעותי של גרעינים בעלי שני c ו-4c, עם פציעה בכמות מוגברת של תאי > 8c (איור 5ב'). מידע על מיקום יחסי עבור כל תת קבוצה של פלויידי ניתן לחקור באמצעות מזימת פיזור של קואורדינטות x-y המשויכות לכל גרעין בתוך ערכת הנתונים או על-ידי אחזור המיקום הדו-ממדי של תת-ערכות מסוימות של hepatocyte בתוך תוכנת ניתוח התמונה הגבוהה (איור 5ג).

כיול
כדי להעריך את תוקפו של שיטת כיול NPC בשימוש, אימונויניום כפול של מקטעי הכבד בוצעה באמצעות נוגדנים כדי HNF4α ומתרבים סמן קי-67 (איור 6A, B). נתונים אלה הראו העשרה עבור קי-67, אשר מתייג תאים בכל השלבים הפעילים של מחזור התא, בצד הימני של העקומה NPC מינימלי dna התפלגות (בין s2 ג ו-s4c)-שבו npcs צפוי להיות משכפל DNA ולכן יש > 2 ג פלויידי (איור 6א). לאחר כיול פנימי של כל השליטה, ודגימות הכבד הפצועות שנחקרו Ki-67, היה מועשר באופן משמעותי (P < 0.0001) ב "פשוט" גרעיני NPC עם מוערך פלויידי של > 2c (82.5% ± 6.6% SD, n = 12) בהשוואה לאלה עם ≤ 2c פלויידי (17.5% ± 6.6% SD, n = 12) (איור 6ב), המציין כיול פלויידי מוצלח. נתונים אלה תומכים בחוקיות השיטה שבשימוש. כמו כן, בהנחה שסף מדויקת של Ki67, הן מספקות תובנה כמותית מסוימת לגבי מידת הsubequatorial של מסכות גרעיניות מקבוצות הפלואידיות הגבוהות יותר "לזהם" קבוצות מתחת.

כדי לבדוק עוד את תוקפו של שיטת כיול NPC, מכייל חיצוני הוצג בהתבסס על הנפח הגרעיני שדווח בעבר של העכבר 2n hepatocytes (155.8 יקרומטר3)14. כאשר הדמות הזאת שימש בשילוב עם ערך ממוצע של חוזק הופסט עבור HNF4a-גרעינים ההערכה המתקבלת עבור מתכוון hepatocyte פלויידי בכבד השליטה לא היה זהה מזה של הפנימי (S2 ג) כמאכור (איור 6ג). יתר על כן, האומדנים של מתכוון hepatocyte פלויידי בעכברים של C57BL/6 העכבר מאמץ של גיל דומה, היו גם דומים, מאשרת כי ידע אמפירי מראש של 2N hepatocyte גודל גרעיני אינו נדרש, הפיכת מתודולוגיה זו מבוקרת פנימית להערכת אוטונומית הגרעינית באופן עצמאי.

פרשנות של מורמטריה גרעינית
השיטה המתוארת מספקת מגוון פלויידי לגרעינים הפטוציט עם "פשוט" מעגלי. הדרה של "מורכבים" גרעינים מבוסס על ההשערה כי הם מייצגים חלק של החרופציטים ברור עם חופפים/נגיעה מסכות גרעיניות, מה שהופך את הנחישות מדויקת פלויידי עבור מערכת זו מאתגרת יותר (איור 7א). וחשוב מכך, הפרדה בין גרעינים על פי מעגליות אינה מאפשרת למשתמש להבחין בין הגרעינים של הפטציטים המנונקות ואלה של תאים ברורים, בהם שני גרעינים של פלואידיות דומים מופרדים בבירור בתוך התא. זה נבדק באופן אמפירי על ידי בחירה ידנית של תאים ברורים וברורים מפני הנתונים התמונה והערכת ההפרדה שלהם על ידי האלגוריתם (איור 7ב). גרעינים של הפטוציטים שהיו קרובים פיזית (איור 7ג) אבל "לא נוגעים" היו מסווגים על ידי האלגוריתם כ "פשוט", בעוד אלה שהיו "נוגעים" היו בבירור מפלים כמו "מורכב". לפיכך, שיטת הבדיקה אינה מספקת מגוון של התאים הסלולריים בכבד, בהתחשב בעובדה שגרעינים של תאי ברור מחולקת בין מחלקות "פשוטות" ו-"מורכבות" (ראה דיון). עם זאת, תובנה מסוימת לעבר המעבר בין מדינות של הסלולר והפלואידיות יכול להיות מושגת מתוך נתונים אלה פשוט על ידי התוויית היסטגרמות של מורמטריה גרעינית וגודל גרעיני והחלת מודל של איך "מורכב" ו "פשוט" מדינות מעבר בין במהלך פוליפולוטיזציה (איור 7ד). בכבד שליטה שלושה שלבים (I-III) של המורמטריה הגרעינית נצפו בבירור (איור 7E). הם מייצגים את קיבוץ האשכולות של מסיכות גרעיניות מעגלית 2N (I), 4N (II) ו-8N (III) בהתאמה (כפי שמודגם באיור 7ד). מונמונומנט 16n hepatocytes נדירים מאוד בכבד העכבר המבוגר16,18,21, ולכן הקבוצה הסלולרית הסלולר 16n מורכב כמעט לחלוטין של תאים binuclear עם גרעיני 8n, ממוקם בתוך, ומימין, של שלב iii (איור 7E), המסבירה את הירידה במעגל לימין של שלב iii מעניין, בעת פציעה (DDC יום 14), שינוי כמותי לקראת מורכבות מוגברת ("בינקלאז") מתחיל בשלבים I (המשקף 2n ל-2x2n) ושלבים III (המשקף 8n ל-2x8n), לפני שהוא מאוחד לבסוף בכל שלושת השלבים (I-III המחברים משערים כי משמרת זו לקראת מורכבות מוגברת היא בשל מוגבר הסלולר מוגברת כתוצאה מציטוקינזה נתקע, ואילו לימין של שלב III את המגמה הפוכה היא נצפתה, בשל ייצוג מוגבר של תאים 16N מעגלית מעוגל בכבד הפצוע בשל endoreplication. תצפיות אלה כמובן צריך להיבדק על ידי התאמת השיטה לחשבון כראוי עבור הסלולר (ראה דיון).

Figure 1
איור 1: סיכום זרימת העבודה. רקמת הכבד נקצרו (1), קריוסינות (2), קבוע ואימונויניום עם נוגדן HNF4α המאפשר התאים שאינם מרקצ ו (npcs) להיות הפלים (3). לאחר עיבוד, דגימות הם סרוקים באמצעות פלטפורמת הדמיה בעלת תוכן גבוה באמצעות לכידת תמונה אוטומטית (4) וניתוח (5). התאים מחולקים על ידי הופסט של קרינה גרעינית וHNF4α immunofluorescence סף. לאחר מכן, האזור הגרעיני הופסט ("A") ומעגליות ("C") מחושבים. לבסוף, הנתונים נותחו (6); HNF4α-NPCs הם כימות (i) ו HNF4α + גרעיני הגרעינים מופרדים לשתי קבוצות מחשבים ("פשוט" ו "מורכב") על פי מעגליות גרעינית (ii). אינטרפולציה של hepatocyte הגרעין הגרעיני הוא מבוצע לאחר מכן עבור כל "פשוט" גרעיני כפונקציה של רדיוס גרעיני (r) ומתכוון הופסט עוצמה פלואורסצנטית (כפרוקסי עבור צפיפות DNA גרעינית) (iii). לאחר מכן, הנתונים מרולים באמצעות NPCs כ-2N מכייל פנימי (iv) לפני הידור סיכום לדוגמה (v). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח תמונה באיכות גבוהה ופרופיל ציטומטלי של הכבד של העכבר במהלך האכלה DDC כרונית. (א) דמות מייצגת הנציגה של HNF4α/הופסט אימונוofor, כתמים של הכבד העכבר המבוגר לאחר 21 ימים של האכלה עם דיאטה המכילה 0.1% DDC; התמונה מציגה HNF4α מעוגל + הפטציט גרעינים (H) והתרחבות של HNF4α-NPCs באזורים המקיפים את וריד הפורטל ("PV"). (ב) דוגמאות לאופטימלי ("נכון") ולתת האופטימלי ("שגוי") כתמים גרעיניים המציינים את הקיבעון המסכן. (ג) השימוש בפלטפורמת ניתוח תמונה בתפוקה גבוהה לבין הפסולציטים וnpcs בהתאם להכתמים גרעיניים וHNF4α אימונויניום. מסכות תוכנה (אדום/ירוק קווים) להראות כיצד גרעיני מקוטע כראוי על פי הופסט פלואורסצנטית ומיון לתוך hepatocytes (+) או NPCs (-) על פי מצב HNF4α. (ד) מדריך למיטוב ההתקנה לניתוח פילוח/סף. על מסכות גרעיניות המזוהות על ידי התוכנה מצוינים על ידי קווים ירוקים/כחולים לפילוח גרעיני וירוק/כחול (HNF4α +) או אדום/כחול (HNF4α-) עבור ניתוח הסף (H = hepatocyte). פתרון בעיות: רגישות לגילוי גרעיני להגדיר נמוך מדי (i), או גבוה מדי (ii). הסף עבור HNF4α הוגדר נמוך מדי (iii), או גבוה מדי (iv). (E, F) ניתוח כמותי של NPC וגרעין hepatocyte במהלך האכלה DDC: (E) HNF4α-ו (F) HNF4α + צפיפויות גרעיניות מושווים נגד הזמן של טיפול DDC (ימים). סך של 5.7 x 105 תאים נותחו, מ 4-6 בעלי חיים לנקודת זמן. נתונים מוצגים כממוצע + SEM. * * P < 0.01 ו * * * P < 0.001. בכיוון אחד של ANOVA שימש להשוואת אמצעי. ערכי P מובהקות חושבו באמצעות בדיקת ההפרש הפחות משמעותי של פישר (LSD). (ז) התפלגות תדר של HNF4α + האזור הגרעיני במהלך טיפול DDC. הנתונים מראים משמרת ימנית באזור הגרעיני hepatocyte במהלך הפציעה בעקביות עם יפרטרופיה היפר-היפראפיקציה תאית ופוליפולוטיזציה. סך של 2.5 x 105HNF4α + גרעיני נותחו, מ 4-6 בעלי חיים לנקודת זמן. דמות זו השתנתה ממנאנו-Núñez ואח '17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח אוטומטי של הפציט הגרעין הגרעיני באמצעות תוכנה כתובה אישית. (A) צילום מסך המציג עיצוב נכון של נתוני גיליון אלקטרוני עבור קלט לתוך התוכנה הגרעינית ניתוח הפלויידי. עמודות המכילות נתונים חיוניים (שלב 5.5 של הפרוטוקול) מסומנות בצהוב. כל כותרות העמודות אמורות להתאים בדיוק לאלה שצוינו. (ב) צילום מסך מראה כיצד קבצי גיליון אלקטרוני בודדים המכילים נתונים מתוך משכפל ביולוגי ("Sample1", "Sample2", וכו ') צריך להיות שם ומאורגן תיקיות מידע עבור כל תנאי (שכותרתו "Control-d0" ו "נפגע-d14" בדוגמה זו). (ג) צילום מסך לאחר התקנה מוצלחת של היישום פלויידי (העיגול האדום). כאשר היישום מופעל (על-ידי לחיצה על "Ploidy_Appl..") בכרטיסייה היישומים שלי של רצועת הכלים "Ploidy_GUI" מופיע (הפאנל התחתון). שם הניסוי ("לדוגמה") ונתיבים לפקד (לדוגמה, "Control-d0") ובדיקה (לדוגמה, "פצועים-d14") מוזנים ערכות נתונים לפני הלחיצה על הפעלה. לאחר מכן, התוכנה מחשבת, מכייל ומפעיל את הפלואידיות הגרעינית עבור כל הדגימות באמצעות ערכת הנתונים "Control-d0" כדי ליצור ספי עבור תוכן ה-DNA מינימלי. (ד) פלט נתונים מ-Ploidy_Application מציג קבצי נתונים בודדים שנשמרו באופן אוטומטי בכל אחת מתיקיות המדגם (i) המכילה מספרים מוחלטים ואחוזי גרעין "פשוטים" בכל קבוצה של פלויידי. עבור כל תנאי (במקרה זה הן "Control-d0" ו-"פצועים-d14"), תיקיית סיכום מופק באופן אוטומטי המכיל הערכות משמעות הגרעין הגרעינית עבור כל "פשוט" hepatocyte ו-hepatocyte גרעיני (ii) והתמוטטות של כיצד הפלויידי הגרעינית היא מסובדת עבור כל מדגם (iii). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: השימוש ב-NPCs ככייל פנימי. (א) גרף המציג את ההשפעה של פציעת DDC על תוכן DNA מינימלי (m) של hepatocyte (HNF4α +) ו-NPC (HNF4α-) גרעינים. כל הנתונים מנורמלות ליום 0 NPCs (n = 4 בעלי חיים לכל נקודת זמן). (ב) היסטוגרמה המתארת את התפלגות ערכי NPCm בדגימת כבד ייצוגית (יום 0, סך של 7,180 גרעינים). התרשים (מעל) מראה כיצד מסכות NPC מעגלית יכול לנבוע מתאים עם תוכן DNA 2-4c. מטרת שיטת הכיול היא להגדיר את הסף ריבוד המייצג 4c (S4c) בגבול העליון שלהתפלגות NPC (קו מנוקד), תוך מזעור רעש עקב שגיאות פילוח בקיצוניות של עקומת ההתפלגות. (ג) שינויים משמעות הופסט עוצמה ואזור גרעיני עבור NPC (HNF4α-) גרעינים מותווים. כדי למנוע שגיאה פילוח רק אלה גרעיניםעם ערך npc המתאים של בתוך 1 SD של המצב npcm ערך מיבדקו (התיבה הצהובה). בטווח זה, גודל המעבר של 2c-4c (t) מחושב ומשמש כנקודת עיגון בתוך הנתונים כדי להעריך את ה-S4c. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תפוקה גבוהה בניתוח באתרו של הפלואידיות גרעינית בכבד העכבר במהלך האכלה DDC כרונית. (א) ניתוח של כבד מבוגר בשליטה במתודולוגיה המתוארת. HNF4α + גרעיני הגרעין ממקטעי הכבד הדו מחולק על פי מעגלי הגרעין של הואכסט לשתי קבוצות: "פשוט" ו"קומפלקס". עליון מייצגים הנציגה של התאים האחרים השייכים לשתי קבוצות אלה מוצגים. שמאל מגרש מראה ריבוד של HNF4α + גרעינים פשוטים ממדגם אחד (יום 0) על פי הערך פלואידיות באינטרפולציה, השטח הגרעיני מתכוון הכוח הגרעיני הופסט. נכון תרשים עוגה המפרט את הפירוט האופייני של תאי HNF4α + בכבד בקרה (יום 0) המציין את הפרופורציות של כל מחלקת ממדים גרעינית. סך של 6.7 x 104 HNF4α + גרעינים מ 4 בעלי חיים נותחו. (ב) השפעת פגיעה בכבד של DDC על הפטציט הגרעיני באמצעות תפוקה גבוהה בניתוח באתרו. גרפים מדגימים את הירידה היחסית בפרופורציה של גרעיני 2 ג ו-4c hepatocyte בתוך 14 הימים הראשונים של האכלה DDC בעוד > 8c גרעיני פוליפואיד להגדיל באופן דרמטי מספר. סך של 1.5 x 105 HNF4α + גרעיני נותחו (n = 4 בעלי חיים לנקודת זמן). נתונים מוצגים כממוצע + SEM. * * P < 0.01 ו * * * P < 0.001. בכיוון אחד של ANOVA שימש להשוואת אמצעי. משמעות ערכי P חושבו באמצעות מבחן השוואה מרובה של Tukey. (ג) דוגמה כדי להראות כיצד מחלקות משנה האטום יכול להיות מסומנים בתוך האתר באמצעות שיטה זו, על ידי חקירת נתוני הדמיה של תוכן גבוה עם אותם קריטריונים כמותיים המשמשים לפלויידי ריבוד (מעגליות, גודל גרעיני ומתכוון הואכסט עוצמה). תמונות הקרינה הפלואורסצנטית מוצגים עם מסיכות תוכנה (נקודות אדומות) סימון גרעיני 2 ג בכבד בשתי נקודות זמן במהלך האכלה DDC כרונית (יום 14 ו -21). וריד שער (קו מנוקד כחול) ואזורים פרישער בהם הרחבה NPCs (שורה צהובה) מסומנת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הערכה קריטית של שיטת הכיול NPC. (א, ב) NPCs מתרבים מסווגים בהצלחה עם ניקוד > 2c. (א) היסטוגרמה של NPC תוכן ה-DNA מינימלי שליטה בכבד אימונויניום עם נוגדנים HNF4α ומתרבים סמן קי-67 (n = 4, נתונים מוצגים כממוצע + SEM). ריבוד ספי עבור 2 ג (s2 c) ו-4c (s4c) מצוינים. (ב) ריבוד של npcs לפי תוצאות מתודולוגיה המתוארת בהעשרה משמעותית של קי-67 אימונויניום בגרעינים שהוקצו הציון השני של ה> 2c (n = 12). נתונים מוצגים כממוצע + SEM. מבחן Unpaired t שימש כדי להשוות את האמצעים * * * * P < 0.0001. (ג) אימות חיצוני של שיטת הכיול NPC. האומדנים של מתכוון הגרעין הגרעיני ה, המתקבל באמצעות שיטת NPC הפנימי השיטה הושוו לאלה שהושגו על ידי כיול של דגימות זהה (שליטה C57BL/6 כבד העכבר 3 על 4 חודשים, n = 4) עם נפח גרעיני ידוע 2N hepatocyte14. הנתונים מוצגים גם משני ניתוחים עצמאיים21,22 המתארת הפטציט הגרעין הגרעיני מעכברים של אותו זן בגילאים 2-6 חודשים (מוצג מימין לקו מנוקד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: הפטציט הגרעין הגרעיני הוא בעל מערכת יחסים "מורכבת" עם פלויידי תאית. (א) סיכום הדרך התאית הסלולר (2N, 4N, 8n ו-16n) הוא הפרדה חלקית על ידי ניתוח דו-ממדי של מורמטריה גרעינית. תאים בינצלולים (אדום) מחולקת בין "פשוט" ("S") לבין "מורכב" ("C"), ובהתאם לשאלה האם הגרעינים נראים כנגיעה או לא. (ב, ג) המופיציטים בודדים נבחרו באופן ידני ונותחו לצורך מפרידי נשק גרעיני ומרווח בין-גרעיני. (ב) בינת הפטציטים עם גרעיני "נגיעה" היו "מורכבים" (100% ≤ 0.8), ואילו תאים מוניורורים (שחור) ובין הפטציטים עם מסכות גרעיניות שאינם נוגעים ללב היו "פשוטים" (94% > 0.8). (ג) "פשוט" גרעינים של הפטוציטים בינניקוי יכול להיות מכובד מאלה של תאים מונוליתית בגלל מופחת באופן משמעותי מרווח בין גרעיני (n = 3, סך של 94 גרעין מנותח). (ד) דגם היוצר את האופן שבו התאים הסלולאריים הסלולריים מפאנל A עשויים להיות מופצים במונחים של האזור הגרעיני הגרעיני הדו והגרעין וכתוצאה מכך באשכולות של צורות מעגליות פשוטות לארבעה שלבים (I-IV). (ה) השוואה של HNF4α + מגרשים גרעיניים מורמטריה/גודל בכבד שליטה (יום 0) ואחרי 14 ימים (משמאל) ו 21 ימים (מימין) של פציעה DDC. למעלה (I-V). חיצים מציינים שינויים במורמטריה גרעינית כתוצאה מפציעה שעקבית עם binuclearization של 2 ג ("a"), 4c ("b") ו-8c ("c") גרעינים, יחד עם המונונוקלאוריזציה מוגברת של הכיתה 16n הסלולר מחלקה (ד). סך של 29-30 x 103 גרעיני מנותח לכל תנאי (n = 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קבצים משלימים: מערכות נתונים הדגמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בקבצים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מתואר בגישה גבוהה ובתפוקה גבוהה לניתוח שיפוץ רקמות והערכת הערכה גרעינית של הפטוציט בכבד מורטין. ברגע שהוא מכיר את הנוהל, משתמש יכול לעבד, לצלם ולנתח דגימות מרובות ב-3-5 ימים של תקופה, יצירת ערכות נתונים של ברת גדול המספקים חתימה מפורטת של בריאות הכבד. בהינתן הפשטות של שיטת ההכנה לדוגמה, יחד עם מספר גדול של תאים ואזור רקמות שנותחו (בממוצע 14 מ"מ2/דגם), התוצאות הן חזקות ומאוד מוספרות. אוטומציה של לכידת תמונה וניתוח גם מסירה את שגיאת המשתמש ואת ההטיה הפוטנציאלית משלבים חשובים אלה. חדשנות חשובה היא שימוש ב-NPCs ככייל פנימי, המאפשר הערכה יחסית של תוכן ה-DNA הגרעיני של hepatocyte הן בתוך ובין דגימות. שילוב של צעד HNF4α תיוג הוא אפוא מפתח לספק את הפרוטוקול הזה עם יתרון טכני ייחודי לעומת שיטות 2d שפורסמו בעבר3,12,22. לעומת זאת, הפשטות היחסית של המתודולוגיה בהשוואה לזרימות עבודה של שחזור תלת-ממד18 הופכת אותו לפחות מפרך ובעל פוטנציאל גמיש יותר.

לעומת שיטת הדיוק של הזרימה cy, מנסה חשוב כדי לפרט את תוכן ה-DNA הגרעיני סעיפים 2D רקמות, הוא ביטחון מוגבל כי ניתן לייחס לסיווג של גרעינים בודדים ביחס למעמד הפלויידי. נוסף לכך הוא הטיה הטבועה בתוך הגישות מבוססות SIA כדי לייצג את קבוצות הקטנות יותר פלואידיות בשל הדגימה subequatorial. עם זאת, על-ידי נרמול נתונים לתקן פנימי ולקיחת גישה מבוססת אוכלוסיה גדולה, השגיאה עקב אפקטים אלה משפיעה ודומה באמצעות דגימות. הפטציטים מאופיינים במבנה גרעיני מעוגל מאוד, לעומת npcs למשל, כלומר הם קלה במיוחד להערכה מדויקת של תוכן ה-DNA המבוסס על שטח גרעיני באזור החוצה לבד10,11,14,15,23. הגישה מבוססת SIA כבר מעודן בפרוטוקול זה כדי לחשבון הן עבור מעגליות גרעינית וצפיפות ה-DNA על ידי שילוב של מדדים של מוטמטריה ומרושע הופסט עוצמה פלואורסצנטית וכתוצאה מכך מוערך "תוכן DNA מינימלי" מתאר עבור גרעינים בודדים. חשוב מכך, השימוש NPCs כמו 2 בקרת פלויידי למעלה-4N מספק תקן פנימי חשוב עבור כיול אובייקטיבי וריבוד של תוכן מינימלי של דנ א גרעינית, מה שהופך את המתודולוגיה המתוארת ישים על דגימות של כל מין, או פורמט, בהתחשב כי הנוגדן המתאים HNF4α (או מסמן גרעיני הhepatocyte) ניתן להגיע.

למרות הערכה של פלויידי גרעינית הוכח לספק חתימות שימושיות עבור התקדמות מחלת הכבד10,13, על מנת לוודא באופן מלא את הגיוון של שינויים פלויידי בתוך הכבד זה יהיה גם רצוי והכרחי כדי להתאים את המתודולוגיה המתוארת לחשבון עבור hepatocellular היקפית ובכך הסלולר פלויידי. מיפוי של הסלולר פלויידי הושגה בעבר על ידי התוויות של המערכת hepatocyte באמצעות סמנים כגון beta catenin10,13,24, אקטין12,22 ו ציטוקרטין10,11 בדגימות כבד של אדם ועכבר. עם זאת, כאשר זה נבדק לאחר פציעה DDC, שיפוץ דרמטי האפיתל מנעה הערכה אמינה של hepatocellular היקפית הן על ידי phalloidin (נתונים לא מוצגים) או נוגדנים לבטא catenin17. מכאן, בעוד גישה זו אפשרית, זה לא יכול להיות ישים על כל מודלים הפציעה, אבל אם מושגת היה מקדם מיפוי של הסלולר, כמו גם ביצוע הערכות של hepatocyte גודל ומספר מדויק יותר. זה גם נשאר סביר כי על ידי ראיית החשבון עבור פרמטרים גרעיניים נוספים, כגון מרווח בין גרעיני (איור 7ג), תאים mon, ברור יכול להיות מופלים "פשוט" הhepatocytes, וכי הפרדה נוספת של "קומפלקס" תאים binuclear יכול להיות מושגת על ידי מדידות רדיאליות של גרעיני כי מסכות דו-ממדיות שלהם להכיל.

בהינתן כי נוגדנים HNF4α אנושיים מאומת קיימים עבור רקמת FFPE25 וכי כיול פנימי משחרר מתודולוגיה זו של כל מיני מגבלות ספציפיות, הפרוטוקול הוא כמעט מיידית החלים על דגימות אנושיות. לפיכך, יש לו פוטנציאל ניכר לספק בחינת ביצועים עבור ניתוח תפוקה גבוהה של הפציט הגרעינית ופגיעה בכבד במחלה אנושית. כמו כן, על ידי ריבוב עם נוגדנים אחרים, שיטה זו יכולה לחשוף תפקידים חדשים לקבוצות משנה hepatocyte מסוים והתגובה שלהם לפגיעה בכבד ומחלות. לשם כך, יש לנו בהצלחה לשלב את המתודולוגיה עם כתמים חיסוני עבור סמן גרעיני מתרבים קי-67 (איור 6), אשר מאפשר מידע שימושי להיות שניתן לגלות-כולל זיהוי של אוכלוסיות 2n שאינם מתרבים של npcs עבור כיול פנימי משופר של פלויידי (בצהרי, נתונים שלא פורסמו 2019). מכאן, על ידי הזיווגים גמישות עם נתונים כמותיים ומעבר כי השיטה מספקת, אנו מציעים כי היישומים העתידיים שלה ישפר את ההבנה של התפקיד של פוליפולודיה בכבד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו ממומנת על ידי הממשלה הספרדית MINECO מענקים BFU2014-58686-P (LAN) ו-2017-84708-R (DJB). LAN נתמך על ידי האגודה הלאומית מינאקו רמון את החבר RYC-2012-11700 ומתכננת פרס (Comunitat ולנסיה, CDEI-05/20-C), ו-FMN על ידי האזור ValI ו-D שמאל של ולנסיה/2016/020. RP מעוניין להכיר בפרופ ' Ewa ק. פלך למימון. אנו מודים לדוקטור אלישיה מרטיז-רומרו (שירות השירות הסיילאנסה) לקבלת עזרה בפלטפורמת מנתח התאים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) TestDiet 1810704 Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) Invitrogen A11055 Dilution 1:500
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cryostat Leica CM1850 UV Leica biosystems CM1850 UV Tissue sectioning
Fluorescent Mounting medium Dako S3023
GraphPad Prism GraphPad Software Prism 8 Statistical software for graphing data
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Final concentration 5 µg/mL
IN Cell Analyzer 1000 GE Healthcare Bio-Sciences Corp High-Content Cellular Imaging and Analysis System
MATLAB MathWorks R2019a Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy
Microscope coverslides VWR International 630-2864 Size of 24 x 60 mm
Microsoft Office Excel Microsoft Speadsheet software
OCT Tissue Tek Pascual y Furió 4583
Paraformaldehyde Panreac AppliChem 141451.121
Pen for immunostaining Sigma-Aldrich Z377821-1EA 5mm tip width
Polysine Microscope Slides VWR International 631-0107
Rabbit polyclonal Anti-HNF4α Thermo Fisher Scientific PA5-79380 Dilution 1:250 (alternative)
Rabit polyclonal Anti-HNF4α Santa Cruz Biotechnology sc-6556 Dilution 1:200 (antibody used in the study)
Tween 20 Sigma-Aldrich P5927

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
  2. Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
  3. Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide? Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
  4. Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
  5. Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
  6. Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
  7. Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
  8. Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
  9. Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
  10. Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
  11. Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
  12. Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
  13. Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
  14. Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
  15. Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  16. Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
  17. Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
  18. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
  19. Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
  20. Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
  21. Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
  22. Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
  23. Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
  24. Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
  25. Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).

Tags

רפואה סוגיה 158 כבד פוליפולודיה hepatocyte הדמיה בעלת תוכן גבוה hepatocyte הפטציט גורם גרעיני 4 אלפא (HNF4α)
תפוקה גבוהה בשיטת באתרו להערכת הפטציט הגרעיני בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manzano-Núñez, F., Peters, … More

Manzano-Núñez, F., Peters, R., Burks, D. J., Noon, L. A. A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice. J. Vis. Exp. (158), e60095, doi:10.3791/60095 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter