Summary
フローサイトメトリーを必要としない固定/凍結保存組織サンプル内で、肝細胞数および核プロイドの変化を測定するための堅牢で費用対効果の高い柔軟な方法を提示します。私たちのアプローチは、肝臓の損傷や病気の進行を追跡するのに理想的な肝臓細胞学の強力なサンプル全体の署名を提供します。
Abstract
肝臓が損傷すると、肝細胞数が減少し、細胞サイズ、核サイズ、策略が増加する。また、コリンギオサイト、筋線維芽細胞、前駆細胞、炎症細胞などの非実質細胞の拡張は、慢性肝障害、組織改変および疾患進行を示す。このプロトコルでは、傷害、慢性疾患および癌に関連する肝臓の細胞組成の変化を計算するための単純なハイスループットアプローチを説明する。我々は、2次元(2D)組織切片から抽出された情報を使用して、サンプル内の肝細胞核策略を定量化および較正し、ユーザーが肝臓内の特定のプロイドサブセットをその場で見つけることができる方法を示す。我々の方法は、固定/凍結された肝臓材料、基本的な免疫細胞化学試薬および任意の標準的な高含有画像化プラットフォームへのアクセスを必要とする。これは、新たに収集された組織の破壊、空間情報の損失および潜在的な崩壊バイアスを必要とする標準的なフローサイトメトリー技術に代わる強力な代替手段として機能します。
Introduction
哺乳類の肝臓の肝細胞は、双核細胞を産生するために失速したサイトカネシスを受け、DNA内在性を有して最大16NのDNA含量を含む多倍核を産生する。出生後の発達、老化、および多様な細胞ストレスへの応答における全体的な細胞および核の策略の増加1.多重化のプロセスは動的かつ可逆的である2、その正確な生物学的機能は不明のままであるが 3.増加したプロイディは、増殖能力の低下に関連付けられている 4 、 遺伝的多様性2、 慢性傷害5および癌保護への適応6.肝細胞の策略変化は、概日リズム7の変化の結果として起こり、8を引き上げ、最も顕著なのは、肝臓のプロイドプロファイルが傷害および疾患9によって変化し、そして説得力のある証拠は、≥8N核の増加または2N肝細胞の喪失などの特定の策略変化が、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)進行3、10、10またはウイルス感染の3差有差影響を追跡するための有用な署名を提供することを示唆している。
一般に、肝損傷および再生は、肝細胞サイズの増加および核領域12に関連しており、肝細胞の全体数が減少すると共に、特に2NDNA含量10、11,11を有するものである。肝臓における実質損傷はまた、多くの場合、間質筋線維芽細胞、炎症性細胞およびバイポテンシー肝前駆細胞を含む非実質細胞(NPC)の拡張を伴う。パンキマル細胞数と核策略の定量的細胞学的プロファイルを提供する高スループット法は、NPCの変化を考慮しながら、傷害および疾患時の肝臓の応答を追跡する研究および臨床ツールとしてかなりの可能性を秘めています。肝細胞癌のヒトサンプルにおけるプロイドスペクトルの最新の説得力のある分析は、核プロイドが腫瘍内で劇的に増加し、TP5313の分化および損失を伴うより積極的な腫瘍サブタイプにおいて特異的に増幅されることを示している。したがって、核策略の定量的評価における方法論的進歩が、肝臓癌の将来の予後プロファイリングに役立つ可能性が高い。
本プロトコルでは、マウス肝組織切片の比較分析のための柔軟なハイスループット方法論が記載されており、これは肝細胞数の詳細な細胞量プロファイリング、NPC応答および核プロイドを推定するための内部的に較正された方法を提供する(図1)。肝細胞は、核サイズおよび核施設の特性評価に先立って、肝細胞核因子4α(HNF4α)免疫標識によってNPCと区別される。平均Hoechst 33342強度(DNA密度のプロキシ)と補間された3次元(3D)核体積を統合することによって、すべての円形核マスクに対して「最小DNA含有量」が推定される。その後、最小DNA含有量を測定し、NPCを使用して評価し、核プロイドプロファイルを生成します。
画像取得、核セグメンテーション、画像解析は高内容イメージングを用いて行われ、数万個の細胞を含む2次元(2D)肝臓切片の広い領域をスクリーニングすることが可能です。カスタム作成プログラムは、すべての円形肝細胞核のサンプル全体のプロイドプロファイルを生成するために、高コンテンツ画像解析データの自動後処理のために提供されます。これは、自由にソフトウェアをダウンロードして、立体画像解析(SIA)10、11、14、15に基づいて核策略10,11,14を15計算するために実行されます。SIAの方法論は、循環核形態と核サイズとDNA含有量の単調な関係を仮定して、肝臓14における肝細胞核策略を推定するための正確で、骨の折れる方法としてフローサイトメトリーによって以前に検証されてきた。この議定書では、両方の核パラメータは、核施設とHoechst 33342ラベリングの評価によって測定される。各核マスクの「最小DNA含有量」の計算に続いて、既知の2-4N DNA含有量を有するNPCを用いた肝細胞核プロイドの較正が行われ、有用な内部制御として機能する。
従来のフローサイトメトリー法16と比較して、説明したアプローチは、肝細胞核プロイドをその際に評価することを可能にし、結果を偏らさせ得る新鮮な組織または分解方法へのアクセスを必要とせず、標準化することが困難である。すべての SIA ベースのアプローチと同様に、核の小数部 >2N は、赤道平面の外側の大きな核の断面化により、2D サンプリングによって過小評価されます。組織全体の策略プロファイルはまた、すべての円形肝細胞核マスクの最小DNA含有量を記述し、同じ策略の2つの離散(「非接触」)核を有する単核肝細胞と双核細胞を直接区別しない。しかし、このプロトコルの単純さは、細胞の策略のより詳細な評価を提供する双核細胞の同定を容易にする核間間隔または細胞周囲分析などの追加パラメータを考慮するように適応するためのかなりの範囲を可能にする。
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Protocol
すべての動物実験は、以前CIPF倫理委員会によって承認されました。マウスはセントロ・デ・インベスティガシオン・プリンシペ・フェリペ(スペイン・バレンシア)の病原体のない施設に収容され、実験動物のブリーダー、ユーザー、供給センターとして登録されました(reg.ES 46 250 0001 002)現在適用されるヨーロッパおよびスペインの動物福祉規則(RD 53/2013)。
1. 組織の収穫とサンプル調製
注:このプロトコルは、事前に固定または凍結保存せずに組織を凍結する方法を記述します。以前に固定/凍結保存されたサンプルについては、セクション 2 に進み、ステップ 3.1 を省略します。すべての分析は、12-16週齢の成体雌C57BL/6マウスを使用して行われました。
- フェンタニル/ペントバルビタール腹腔内注射による動物の犠牲、続いて子宮頸部脱臼。腹側にマウスを向けた状態で、腹腔を開き、ピンセットで皮膚をつかみ、下腹部の基部から胸骨の基部に外科的なはさみを使用して垂直切開を行うことによって肝臓を露出させる。
- 慎重に細かいピンセットを使用して胆嚢を除去し、肝臓を解剖し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たされた10センチペトリ皿皿プレートで選択した肝臓の小葉を洗いすります。
注:この場合、中央値のローブが使用された場合、各動物について同じ肝臓の葉を比較することをお勧めします。 - ラベル付きのクリオマールを室温(RT)で最適な切削温度(OCT)媒体で満たします。OCTバブルを避けてください。表示された場合は、針またはピペットチップを使用して金型の端に押し込みます。
- 充填されたOCTクリオブオールに肝臓の葉を埋め込み、すぐにドライアイスの上に置いて急速な凍結を確実にします。クライオノルドは-80°Cで凍結切断するまで保管してください。
2. クライオセクション
- 乾燥した氷の上に凍結を輸送し、組織の劣化を避けます。クライオスタット内部を20分間-20°Cに平衡化する前に。
- プラスチックのクリオマールの基部に圧力をかけることによってサンプルを取り出す。液体OCTをRTの暖かいサンプルディスクに適用し、クライオスタットの位置に置き、OCT埋め込まれた肝臓サンプルを取り付けます。穏やかな圧力を加え、サンプルがディスクにくっつくように、OCTがフリーズするまで3分待ちます。
注:組織の劣化を回避するために、できるだけ指でサンプルを扱うことは避けてください。 - サンプルをクライオスタットのアームにロックし、サンプルの端がクライオスタットブレードと平行になるように向きを調整します。組織が到達するまでサンプルにカットします。
- サンプルを6μmの厚さに切り離します。ラベル付きポリアミドコーティングスライドをサンプルの上に5 s置き、サンプルをスライドに貼り付けます。RTに3~5分間スライドを置き、最良の結果を得るには、セクション3に直接進みます。
注:複数の新鮮な凍結サンプルの処理のために、すべてのサンプルが処理されるまでドライアイス上のスライドボックスにスライドを一時的に保存することによって再現可能な結果が得られました。この方法を使用すると、セクション 3 に進む前にすべてのスライドを RT に平衡化できます。ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)サンプルを使用できますが、この方法によりバックグラウンド自己蛍光が増加します。FFPEサンプルから進むには、ポリアミド処理スライド上の40°C水浴からセクションをキャッチして4μmの取り付けでセクションを取り付けます。60°Cで1時間加熱し、キシレン(x2)、エタノール100%(x2)、96%(x2)、70%(x1)およびdH2O(x1)を含むコプリン瓶に連続RTの化傷(5分2)で脱パラフィン化する。抗原を露出させるために、RTでPBSでスライドを焼く前に90°Cで20分間クエン酸緩衝液にスライドを置く。
3. 蛍光免疫標識
- RTで10分間PBSに4%パラホルムアルデヒド(PFA)の1mLを塗布することにより、ヒュームフードの組織切片を固定します。
注:今から免疫染色プロセスの終わりまで、サンプルの乾燥を避けてください。 - 各組織セクションの周りの領域を乾燥させ、疎水性ペンを使用して囲みます。0.5%の非イオン性界面活性剤(すなわち、トリトンX-100)をPBSで15分間RTで透過させる。その後、PBSで満たされたコプリン瓶を3分間、穏やかな攪拌(2倍繰り返し)で洗います。
- ブロックは、1%ウシ血清アルブミン(BSA)、5%馬血清、0.2%のノニオン界面活性剤(RTで少なくとも1時間)の濾過溶液を使用した。
- 一次HNF4α抗体を用いて、暗湿染色チャンバーで4°Cで夜間にブロッキングバッファーに希釈したインキュベート(抗体および特異的希釈液については、材料表を参照)。
- スライドをPBSで満たされたコプリン瓶に入れ、穏やかな攪拌を使用して3分間洗浄します(4倍繰り返します)。
- Alexa-488コンジュゲート二次抗体と共役した2次抗体と、フィルターした1%BSAで希釈したHoechstと、暗い湿気の多い染色チャンバーでRTで2時間のPBSで2時間ノンイオン性界面活性剤を希釈したインキュベート(抗体および特異的希釈液の材料表を参照)。
- スライドをPBSで満たされたコプリン瓶に入れ、穏やかな攪拌を使用して3分間洗浄します(4倍繰り返します)。穏やかな攪拌を使用して3分間ddH2Oで洗浄します(2倍繰り返します)。
- カバースリップ(24 x 60 mm)に2滴の蛍光実装メディアを配置し、その上にスライドを敷設することで、穏やかな圧力を加えて泡を除去することで、スライドを取り付けます。長期保管の場合は、透明なマニキュア付きの端にカバースリップをシールし、4°Cで暗闇の中に保管してください。
- 先に進む前に、従来の蛍光顕微鏡を使用してスライドをチェックし、良好な固定と免疫標識を確保してください。
注: 期待される結果については、図 2A,Bを参照してください。
4. 蛍光画像取得
注: このステップでは、蛍光画像の自動取得をサポートする高コンテンツイメージングプラットフォーム(材料表)が必要です。
- イメージングシステムをオンにして、新しい取得プロトコルを開きます。
- 10x の目的を選択し、視野の面積をメモします(この場合は 0.6 mm2)。
- 適切な励起フィルターと発光フィルタを使用して蛍光画像を取得するためのパラメータを設定します(ステップ3.6)。Hoechst と Alexa-488 の場合は、390/18 および 438/24 nm 励起と 432.5/48 および 475/24 nm 放射をそれぞれ持つ「DAPI」および「GFP」チャネルを選択します。
- サンプルに焦点を当て、信号強度が非飽和であることを確認します。画像の撮影は、すべての画像に対して同じ露光時間で行うか、蛍光の強度が露光時間に補正されるシステムを使用してください。
- サンプルをスキャンし、組織セクションの完全なカバレッジを得るために十分な画像を取得します(サンプルサイズに応じて約20〜50の視野)。
- 画像データベースを見直し、(i)不十分な焦点を当てなかったフィールド、(ii)各組織セクションの境界にあるもの(偏った細胞密度計算を避けるために)、(iii)組織セクションの折り畳まれた/物理的に損傷した領域を含むものを手動で排除する。
5. 自動蛍光画像解析
注:このステップには、適切な画像分析ソフトウェア(材料表)が必要です:(1)405nmの画像内のHoechstラベル付き核を自動的に識別する(核セグメンテーション)、(2)平均ヘーヒトスト核強度とモーホメトリーを評価し、(3)488nm(HNα4)で核蛍光の+/-状態を決定するための閾値分析。プログラム内のセグメンテーションおよび閾値パラメータを視覚的に評価および調整し、核とHNF4α+/-ステータスが最適にゲートされていることを確認するには、基本的なオペレータトレーニング/専門知識が必要です(図2)。
- 画像解析ソフトウェアでは、ステップ 4.5 から Hoechst (405 nm) および HNF4α (488 nm) 画像を含む取得ファイルを開き、新しい解析プロトコルを作成します。
- 核セグメンテーション(Hoechst、405 nm)および肝細胞/NPC閾値解析(HNF4α、488nm)に使用する波長を定義します。
- 核が最適に分離されるように、ソフトウェアの核セグメンテーションパラメータ(「最小核面積」や核検出「感度」など)を調整します。
注: 肝細胞の良いセグメンテーションは、NPCのそれより優先されるべきです。2NPC核は、中弦波内皮のような、平坦化/楕円形または不規則な形状であり、一般的に肝細胞の核細胞のものよりも小さく、より密接に詰まっている(四分位間サイズ範囲:30-43 μm2)。マウス肝臓では、最小核面積≥23 μm2、検出「感度」65%が使用されました(期待される結果については図2C,Dを参照)。感度は、ピクセルクラスタが個々の核として認識される方法をその強度に基づいて決定し、自動画像解析を進める前に、ユーザーが設定した各サンプルについて経験的にテストする必要があります。 - 488 nmの閾値強度を変更して、肝細胞(HNF4α+)および非パレンキマル細胞(HNF4α-)の最適なゲーティングを確保します。
注 : 期待される結果については、図 2C,Dを参照してください。しきい値の強度の値は相対的であり、レーザー強度などの染色効率と取得設定に依存します。したがって、ユーザーによって標準化される必要があります。内皮細胞やペリポータルNPCなどの既知のHNF4-細胞を、内部陰性対照および二核肝細胞核として、染色のための陽性基準として用いる。データセット全体に解析パラメータを適用する前に、少数の画像を使用して解析パラメータをテストし、核セグメンテーションと強度しきい値の分離を確実に行います。 - 定量化する核パラメータを選択:(1)Hoechst染色(μm2)に基づく核面積(μm2)、(2)は、核の角流強度(RU)を意味し、(3)核伸長係数(核の長軸に対する核の短軸の平均比、 中心対称の[細長い]オブジェクトの値が1、(4)Nuc 1/(フォームファクター)は、周囲2/(4π x面積)で計算された核の「丸み」指数を意味します。値は1から無限大、(5)HNF4αステータス(正1または負の0)、(6)「重心」(cg)に基づく核x/y座標は、サブピクセル精度のグレースケール画像からオブジェクトの中心を見つける方法です。
- すべてのサンプル データセットの解析を実行し、ステップ 5.5 の数値データをスプレッドシート ソフトウェアにエクスポートします。
6. データ分析
注: データ分析のステップは、任意の標準的なスプレッドシート ソフトウェアを使用して実行できます。
- 肝細胞細胞および非肝細胞細胞数を計算する。
- 各サンプルについて分析した肝臓セクションの総面積を計算するには、視野の数と視野の面積を掛けます (ステップ 4.2)。
- 各肝セクションに対して生成されたスプレッドシートファイルを操作し、HNF4α+核のみを選択してデータをフィルタリングします。分析したHNF4α+核の総数を計算し、これを分析した全面積で割って各サンプルの平均肝細胞密度を得る(図2F)。
- HNF4α-セルのスプレッドシートをフィルタリングすることで、非数元細胞に対して同じ計算を行う(図2E)。
- 各サンプルについて分析した肝臓セクションの総面積を計算するには、視野の数と視野の面積を掛けます (ステップ 4.2)。
- 肝細胞の核サイズ分布を計算します。
- スプレッドシートソフトウェアを使用して、データをフィルタしてHNF4α+核のみを選択します。
- ヒストグラムにおける核面積のプロット値 (図 2G)。ビン幅を 5 μm2に設定します。
注: 周波数値は、ステップ 6.1.1 に従って面積(nuclei/mm2)を補正できます。
- 肝細胞核策略解析を行う。
注: ステップ 5.6 のスプレッドシート データは、各サンプルの核策略プロファイルを生成するために使用されます。このプロセスは自動化されており、サポート情報とデモデータセットと共に自由にダウンロードできるカスタムの書かれたソフトウェアを使用して実行できます。https://github.com/lukeynoon(を参照してください。補助ファイル).ソースコードは、方法論を適応させたいユーザーのために提供されます。アルゴリズムの説明とインストールと使用の手順を以下に概説します。プログラムは、自動的に2つのグループに肝細胞核を分離するためにスプレッドシートデータを使用しています。(1)「単純な」円形核と(2)2cのプロイドを有する双核細胞を代表する「複雑な」非円形核を有するもの。最小限の核DNA含有量(核領域とDNA密度の機能)は、次にすべての「単純な」核について計算されます。その後のステップでは、HNF4α+肝細胞核プロイドを知られた2−4N内部制御としてHNF4α-核を用いて自動的に校正する。- ソフトウェアをダウンロードしてインストールします。
- パッケージ化されたアプリケーションをダウンロードする方法: https://github.com/lukeynoon
- MATLAB を起動します。ツールトリップの [APP] タブに移動し、[アプリのインストール] をクリックして、ダウンロードしたアプリケーションを "Ploidy_Application.mlappinstall" と呼んで開きます。インストールが成功したことを確認するメッセージが表示されます。
注:アプリケーションは現在使用する準備ができて、ツールトリップのAPPタブに残ります。
- 入力データをフォーマットします。
注: 核計画の自動解析を行う前に、高コンテンツイメージング データを含むすべてのスプレッドシート ファイルを保存し、次の手順に従ってフォーマットする必要があります。- エクスポートされた各データ ファイル (.XLS 97-2004ワークブック)ステップ5.6から、列に示された策略分析に必要なすべてのデータを含む「セル測定」と呼ぶシートが含まれる(図3A)。分析方法では、これらの名前を検索して正しい列データを検出するため、列ヘッダー名を含むスプレッドシートのレイアウトが図 3Aのレイアウトと変わらないようにしてください (参照については、「補足ファイル」のデモ データセットを参照)。たとえば、高コンテンツ画像解析ソフトウェアが「光束」カラムを生成しない場合(図3A)、同じ位置に「光束」列を手動で挿入し、列Kをゼロで埋めます。
- 実験条件(例えば、「傷-d14」)ごとに、2-4N核策略校正の内部制御を計算するために使用される制御データセットを提供する(ステップ6.3.4.3)。ここでは、未処理の成人のゴミ捨て人(「Control-d0」)から肝臓サンプルを選択します。図 3B-D)。
- 生物学的複製 (条件ごと) の場合は、各スプレッドシートを専用のフォルダに保存します (図 3B)。フォルダーのプレフィックスにインクリメンタルで名前を付けます。例: "Sample1、Sample2、Sample3..SampleN" (含まれているファイル名に従って)。したがって、すべてのデータセットフォルダ(例えば、「Control-d0」)には、同じ名前のスプレッドシートファイルを含む一連のサブフォルダ(「Sample1」、「Sample2」など)を含める必要があります。
- アプリケーションを実行します。
- MATLAB 内で、ツールトリップの [マイ アプリ] タブ内のアイコンをクリックして 「Ploidy_Application」を起動します (図 3C)。グラフィカル・ユーザー・インターフェース (GUI) Ploidy_Applicationが表示されます (図 3C)。
- [コントロール データへのパス] ボタンをクリックして、コントロール データがレプリケートされるフォルダーに移動します (たとえば、"Control-d0")。このデータ パスはインターフェイスに表示されます (たとえば、/ユーザー/デスクトップ/コントロール d0)。
- 次に、「フォルダプレフィックス」に、出力ファイルに付ける名前(例えば「Sample」)を入力します。
注: このプレフィックスは、フォルダとファイル名が増分名前のままである場合、任意のテキストに変更できます。 - [他のデータへのパス] ボタンをクリックし、比較データがレプリケートされるフォルダーに移動します (たとえば、"負傷-d14")。このデータ パスはインターフェイスに表示されます (たとえば、/ユーザー/デスクトップ/負傷した d14)。
- [実行] をクリックします。分析が完了すると、ステータス バーに 「分析完了!..」と表示されます。
注:アプリケーションは、各サンプルについて、絶対数の観点から、および合計のパーセンテージとして、≤2n、2n-4n、4n-8nおよび8n+に「単純な」核の階層化を報告します(図3D)。これらのファイルは、各サンプル フォルダに自動的に保存されます:"Count_2n.txt"" "" """" "" "Count_2n_to_4n" "" "Count_4n_to_8n.txt"" "Count_8n_and_higher.txt" " "Percentage_2n.txt" " "Percentage_2nto4n.txt", "Percentage_4nto8n.txt" "Percentage_2n.txt" Percentage_8n_and_higher.txt"として保存されます。Ploidy_Applicationは、各サンプルのリストを自動的に保存し、"Ploidy_All_Hepatocytes.txt"および"Ploidy_NonHepatocytes.txt"の "単純な" 肝細胞および非肝細胞核に対するすべての個々の策略推定値を保存します。制御データセットの場合、このメソッドは、ploidy の階層化のために計算された最小の DNA コンテンツ閾値 (ステップ 6.3.4.3.7 を参照) を"Normalised_Thresholds_Control"という名前のファイルに保存します。最後に、アプリケーションは、コントロールと「概要」と呼ばれる選択した比較条件データの両方のフォルダを生成します。このフォルダには、提供されたすべてのサンプルの平均を含む"Ploidy"と"階層化"という 2 つのサブフォルダが含まれています (図 3D)。
- 方法論の説明。
注: 以下のセクションでは、核計画解析ソフトウェアで使用される方法について詳しく説明します。ユーザーがアプリケーションを使用しないことを選択した場合、これらの手順は、手動で核策略プロファイルを計算するスプレッドシートソフトウェアを使用して従うことができます。- 核穿動法に従って、核を「単純」または「複雑」に分離する。
- 核の「伸び率」を「Nuc 1/(フォームファクター)」で割った「円形度指数」を計算し、値が1.0の場合は完全な円を示します。
注:「核伸び」と「Nuc 1/(フォームファクター)」は、相補的で非重なり合う形態学的基準を評価するオブジェクトの「円形性」の2つの個別の尺度です。前者はオブジェクトの長軸と短軸を測定し、後者はオブジェクトの周長をその領域の長さと比較します。このプロトコルで使用される核循環の定義を強化するために、これら2つの測定は単一の「循環性指数」に結合された。記述された方法論を用いて核の策略を推定する以前のアプローチは、核伸長のみを用いた17.このアプローチを用いて許容可能な結果が得られたが、複合的な「循環指数」は、単核および双核肝細胞から手動で選択された核の識別を改善することを観察した(データは示していない)。 - 円形度指数 ≤ 0.8 の核を「複雑」、その核を「単純」と分類する。.
- 核の「伸び率」を「Nuc 1/(フォームファクター)」で割った「円形度指数」を計算し、値が1.0の場合は完全な円を示します。
- すべての「単純な」核について「最小」DNA含有量(m)を推定する。
- 次の式を使用して、核半径 (r) を計算します。
- 球体式の体積を使用して、核体積(v)を計算します。
- 次の数式を使用して、最小 DNA コンテンツ (m) の相対値を生成します。
- 次の式を使用して、核半径 (r) を計算します。
- 内部 2-4N コントロールとして NPC (HNF4α-) 核を使用して、データセットを調整します。
注:NPCは細胞周期の状態に応じて2-4N DNA含有量を有します。したがって、NPCの「最小」DNA含有量(NPCm)の平均値は、傷害とともに増加する(図4A)。校正誤差は、4c閾値を表すNPCmの上限を設定することによって最小化される(図4B)。- スプレッドシート内で、モードの標準偏差(SD)内にある「m」の値を持つNPC核のみを選択します(これは、可能なセグメンテーションエラーからのノイズを除外します)。
- このフィルタリングされた範囲内で、核領域とそれに対応する平均のHoechst強度を調べる(図4C)。
- このフィルタリングされた範囲内の最小の核面積を最大核のHoechst強度で推定する(すなわち、図4Cの赤い円で示されるように、曲線の線がフィルタリングされたデータセットの方向を変化する点)。この値は、4c核のサンプリングが2c核を上回る2N-4N遷移状態(t)を表し、その結果、平均Hoechst強度の最大値になります。
注: この値は、ソフトウェアによって自動的に決定されます。ただし、スプレッドシートユーザーは、このポイントを移行サイズとして手動で選択できます。 - この過渡的なサイズ(tm)で表される最小のDNA含有量を、ステップ6.3.4.2に従って計算します。
- NPCmデータセットの 4N 肩を推定するには、1 SD を tmの値に追加します。結果の数(図4B)は、核策略層に用いられる最小DNA含有量のNPCの上限を記載する(S4c)。
- すべての「制御」サンプルについて、手順 6.3.4.3.1~6.3.4.3.5 を繰り返します。
注: たとえば、図 3では、コントロールの状態として、損傷していないコントロール肝臓 (「Control-d0」) が使用されています。 - 「制御」サンプルの平均4c層化閾値(S4c)を計算し、これを使用して最小DNA含有量(m)のために2c(S2c)および8c(S8c)境界を推定する。2c8c階層化のしきい値は、ソフトウェアによって自動的に生成され、保存されます(ステップ 6.3.3.3)。
注:研究の設計に応じて、平均階層化閾値は、各条件または特定の条件(例えば、健康なコントロール肝臓)について計算することができます。しかし、核プロイド解析ソフトウェアは、2つのファイルのセットのうちの1つが、相対的なプロイド値を計算する目的で「制御」として指定されることを要求する。 - ステップ 6.3.4.3.7 で生成された S2c値を使用して、すべての核のプロイド値を計算します。
- 次の基準に従って、2c /4c/8c/>8cブラケットに「単純な」肝細胞(HNF4α+)核を層状化する: "2c" HNF4α+ = p ≤ 2;"4c" HNF4α+ = 2 < p ≤ 4;"8c" HNF4α+ = 4 < p ≤ 8;">8c" HNF4α+ = 8 < p.
- 策略サブグループの空間パターン化を再構築するには、各サンプルスプレッドシート内の核データを、取得した対応するフィールドに従って分離します。次に、関連する核X/y座標(ステップ5.5から)を使用して、2Dでプロイドサブグループをプロットします(図5C)。
- 核穿動法に従って、核を「単純」または「複雑」に分離する。
- ソフトウェアをダウンロードしてインストールします。
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Representative Results
この方法は、0.1%3,5-ジエトキシカルボニル-1,4-ジヒドロコリジン(DDC)17を含む肝毒性食を有する動物に0−21日間供給することにより、成人マウス肝臓に対する胆閉障害の17影響を測定するために使用されてきた。慢性DDCの摂食は、肝細胞損傷の結果、NPCのプロイディおよびポータル間の拡大を増加させた。ユーザーは、マウス株と年齢依存性の違いが核策略に存在する可能性があり、すべての分析は12〜16週齢の成体雌C57BL/6マウスを使用して行われていることに注意する必要があります。
HNF4α免疫標識後(プロトコルセクション3)、従来の蛍光顕微鏡を用いてすべてのスライドをチェックし、良好な品質の固定と染色を確保することが重要である(図2A)。Hoechstの塗り傷またはぼかしは、固定前の不十分な固定またはサンプル劣化を示す可能性があります(図2B)、その場合はプロトコルセクション2に戻り、断面と固定の間の時間を短縮します(ステップ3.1)。HNF4α抗体による免疫標識の成功は、この段階で、正に標識された肝細胞核の明確な識別によって容易に判断することができるが、典型的にはNPCのそれらよりも大きく、より丸みを帯びている(図2A)。パンキマ内の平坦化/楕円性内皮核、またはDDC損傷後にポータル内領域に拡大する細胞の密なパッチは、免疫染色の成功/失敗を評価する際にHNF4α-NPCを同定するための有用な視覚的参照として役立つ可能性があります。
核偏析およびHNF4α閾値パラメータ(ステップ5.2−5.4)は、プロトコルセクション3の最後に従来の蛍光顕微鏡で観察された免疫染色の視覚パターンを広く反映するように、自動画像分析(ステップ5.6)の前に慎重に最適化する必要があります(図2C)。最適対最適でない核セグメンテーションおよびHNF4α閾値プロトコルの例を図2Dに要約する。画像分析(ステップ6.1.3)の後、データは、DDC治療の21日後に対照肝臓の核Figure 2Eの52%±2.0%から72.8%±1.4%まで、DDC損傷を伴う肝臓のNPCの増加を反映する必要があります。肝細胞は、対照肝における全核の48.0%±2.0%を占め、肝細胞が組織容積の70~85%を占めていることを示す肝臓組織学の以前の分析と一致するが、肝細胞全体の45~50%に過ぎない18,19,19である。DDC送出の最初の14日間にHNF4α+核の数が小さいが有意な減少が観察される(図2F)。肝細胞核面積の周波数分布プロット(ステップ6.2)は、40-50 μm2サイズの範囲の制御肝臓におけるピークHNF4α+核面積と、DDC損傷後の核サイズの明確な右シフトを示す(図2G)。増加したプロイディおよび肝細胞肥大12と一致する。
健康な(0日目)対照肝臓では、HNF4α+核の63.4%±1.7%が「単純な」円形の穿動を有する(図5A)。この数値は、21日間のDDC損傷後に46.8%±5.7%(P= 0.042)に減少し、二重化中の策略状態間のシフトに関連すると考えられる核塞動量の複雑さの増加を反映している(以下の「核施設の解釈」を参照)。この方法を用いて得られた核プロイド分布の代表的な例を、コントロール肝切片に示すAを図5に示し、DNA含量の補間が単一サンプル内の個々の細胞の階層化を可能にする方法を説明している。「複雑」および「単純」HNF4α+セルのサブセットの平均値も示されている(図5A)。データは、成人マウス肝細胞2の80-90%における多倍数の以前の推定値と一致している。複素核の周波数(36.6%±1.7%)対照肝臓では、20の双核細胞(35%)に近いが、データは細胞策略ではなく核の尺度とみなされるべきである(以下の「核施設の解釈」を参照)。対照(0日目)とDDC処置群の間の相対的なプロイドの比較は、>8c細胞の増加数と共に傷害を伴う2cおよび4c肝細胞核の有意な損失を反映すべきである(図5B)。各プロイドサブグループの相対位置情報は、データセット内の各核に関連付けられたx-y座標の散布図によって、または高コンテンツ画像解析ソフトウェア内の特定の肝細胞サブセットの2D位置を取得することによって問い合わせることができる(図5C)。
校正
使用するNPC較正方法の妥当性を評価するために、HNF4αおよび増殖マーカーKi-67に対する抗体を用いて肝切片の二重免疫標識を行った(図6A,B)。これらのデータは、NPC最小DNA分布曲線の右側(S2cとS4cの間)のNPC最小DNA分布曲線の右側に細胞をラベル付けするKi-67の濃縮を示した。Aすべてのコントロールと負傷した肝臓サンプルの内部較正研究の後、 Ki-67は、≤2cプロイド(17.5%±6.6%SD、n =12)と比較して、有意に濃縮された(単純な」NPC核で;2c(82.5%±6.6%SD、n=12)を有するものと比較して、B.適合性を示す図6)これらのデータは、使用するメソッドの有効性をサポートします。また、Ki67の正確な閾値を仮定すると、より高い策略群のサブ赤道核マスクがどの程度以下のグループを「汚染」しているかについての定量的な洞察を提供する。
さらにNPCキャリブレーション法の有効性をテストするために、マウス2N肝細胞の以前に報告された核体積(155.8 μm3)14に基づいて外部キャリブレータ3を導入した。この図をHNF4a-核に対するヘヒトスト強度の平均値と組み合わせて使用した場合、対照肝臓における平均肝細胞プロイドの推定値は、内部(S2c)キャリブレーターの推定値と区別がつかない(図6C)。また、同年代のC57BL/6マウス株における平均肝細胞プロイドの推定値も同様であり、2N型肝細胞核サイズの経験的知識が必要ないことを確認し、核策略を完全に自律的に推定するための内部制御方法論を作った。
核施設の解釈
記載された方法は、「単純な」円形の穿動を伴う肝細胞核に対する策略的読み出しを提供する。「複雑な」核の排除は、それらが重なり合う/接触する核マスクを有する二核肝細胞の割合を表すという仮説に基づいており、このサブセットに対する正確な策略決定はより困難である(図7A)。重要なことに、円形に従う核の分離は、ユーザーが単核肝細胞の核と同様のプロイドの2つの核が細胞内で明確に分離されている双核細胞の核とを区別することを可能にしないことである。これは、画像データセットから手動で双核細胞と単核細胞を選択し、アルゴリズムによる偏析を評価することによって実証的にテストされた(図7B)。物理的に近いが「触Figure 7れていない」という二核肝細胞の核は、アルゴリズムによって「単純」に分類されたのに対し、「触れる」核は明らかに「複雑」と判別された。したがって、このアッセイは、双核細胞の核が「単純」および「複雑な」サブクラスの間で細分されていることを考えると、肝臓における細胞策略の読み出しを提供しない(議論参照)。しかし、細胞と核の策略の状態の切り替えに関するいくつかの洞察は、単に核のモルホームトリーと核サイズのヒストグラムをプロットし、単に「複雑な」状態と「単純な」状態がどのように倍率化されるのかのモデルを適用することによって得られるかもしれない(図7D)。コントロール肝臓では、核穿動の3段階(I−III)が明確に観察される(図7E)。これらは、それぞれ円形2N(I)、4N(II)および8N(III)核マスクのクラスタリングを表す(図7DDに示すように)。単核16N肝細胞は、成体マウス肝臓16、18、2118,21では非常にまれであり、したがって、16N細胞プロイド群は、第III相(図7E)の中に位置し、右側に位置する8N核を有するほぼ完全に核細胞で構成され、第III相の右に円形度の低下を説明する。16興味深いことに、傷害(DDC 14日目)の場合、複雑性の増加(「双核性」)に向けた定量的なシフトは、フェーズI(2n〜2x2nを反映)およびフェーズIII(8nから2x8nを反映)から始まり、最終的にすべての3つのフェーズ(I-III)に統合される。著者らは、この複雑性の増加へのシフトは、失速したサイトカネシスに起因する細胞突起の増加によるものと考えているが、第III相の右側には、内複製による負傷した肝臓の円形16N単核細胞の表現の増加により、反対の傾向が観察される。これらの観察は、当然のことながら、細胞の策略を適切に説明するように方法を適応させることによってテストする必要があります(議論を参照)。
図1:ワークフローの概要肝臓組織が収穫される(1),凍結切除(2)、HNF4α抗体で固定および免疫標識を行い、ファラニマルおよび非ファラニ細胞(NPC)を判別することを可能にする(3)。2処理後、自動画像キャプチャ(4)と解析(5)を使用して、高コンテンツイメージングプラットフォームを使用してサンプルをデジタル化します。細胞は、Hoechst核蛍光およびHNF4α免疫蛍光閾値によってセグメント化される。次に、Hoechst核面積(「A」)と円形度(「C」)が計算されます。最後に、データが分析されます (6);HNF4α-NPCは、(i)およびHNF4α+肝細胞核を、核の円形度(ii)に従って2つのサブセット(「単純」および「複合体」)に分ける。次に、すべての「単純な」核に対して、核半径(r)および平均蛍光強度(核DNA密度の代理として)の補間が行われる(iii)。次に、サンプルの要約(v)をコンパイルする前に、データを内部2Nキャリブレータ(iv)としてNPCを使用して階層化されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:慢性DDC給餌中のマウス肝臓の高内容画像分析および細胞測定プロファイリング(A) 0.1% DDCを含む食事を摂食した後の21日後の成人マウス肝臓のHNF4α/Hoechst免疫蛍光染色の代表的な共焦点像。画像は、丸みを帯びたHNF4α+肝細胞核(「H」)および門脈周囲の領域におけるHNF4α-NPCの拡張(「PV」)を示しています。(B)最適(「正しい」)および最適でない(「誤った」)核ホークスト染色の例は、不十分な固定を示す。(C)ハイスループット画像解析プラットフォームを用いて、核ヘヒト染色とHNF4α免疫標識による肝細胞とNPCを分離する。ソフトウェアマスク(赤/緑線)は、ヘーヒスト蛍光に従って核がどのように正しくセグメント化され、HNF4αステータスに従って肝細胞(+)またはNPC(-)に分類されているかを示します。(D) セグメンテーション/閾値分析のセットアップを最適化するためのガイド。ソフトウェアによって認識される重ね合わせ核マスクは、核セグメンテーション用の緑/青線(HNF4α+)またはレッド/ブルー(HNF4α-)で閾値解析(H =肝細胞)で示されます。トラブルシューティング: 核検出感度が低すぎる(i)、または高すぎる(ii)HNF4αの閾値が低すぎる(iii)、または高すぎる(iv)設定。(E, F)DDC送電中のNPCおよび肝細胞核の定量的分析:(E)HNF4α-およびE(F)HNF4α+核密度をDDC処理の時間(日数)と比較する。F合計5.7 x 105細胞を、タイムポイントあたり4-6匹から分析した。データは平均 + SEM. **P < 0.01 および ***P < 0.001 として表示されます。一方向の分散分析は、平均を比較するために使用されました。有意性P値は、フィッシャーの最も有意差(LSD)検定を用いて計算した。(G)DDC処理時のHNF4α+核領域の周波数分布このデータは、細胞肥大および多重化と一致する傷害中の肝細胞核領域の右シフトを示している。合計2.5 x 105HNF4α+核を、タイムポイントあたり4-6匹から分析した。この図は、マンザノ・ヌニェスら17.から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:カスタム書き込みソフトウェアを用いた肝細胞核プロイドの自動分析(A) 核策略分析ソフトウェアへの入力のためのスプレッドシートデータの正しいフォーマットを示すスクリーンショット。必須データを含む列 (プロトコルのステップ 5.5) は黄色で強調表示されます。すべての列タイトルは、指定されたタイトルと正確に一致する必要があります。(B) 生物学的複製のデータを含む個々のスプレッドシートファイル(「Sample1」、「Sample2」など)を、各条件(この例では「Control-d0」と「負傷-d14」と題して)のサブフォルダに名前を付けて整理する方法を示すスクリーンショット。(C) 策略アプリケーションのインストール成功後のスクリーンショット (赤い円).ツールトリップの[マイアプリ]タブでアプリケーションを起動すると(Ploidy_Appl..)、下のパネルに「Ploidy_GUI」が表示されます。実験名 (「サンプル」) とコントロールへのパス ("Control-d0"など) とテスト (例: "負傷-d14") のデータセットは、実行をクリックする前に入力されます。その後、ソフトウェアは「Control-d0」データセットを使用してすべてのサンプルの核プロイドを計算、較正、階層化し、最小限のDNA含有量のしきい値を生成します。(D) Ploidy_Applicationからのデータ出力は、各サンプル・フォルダー (i) に各サンプル・フォルダー (i) に自動的に保存される個々のデータ・ファイルを示し、各プロイド・グループ内の「単純な」核の絶対数とパーセント数を含む。各条件(この場合は「Control-d0」と「負傷-d14」の両方)について、すべての「単純な」肝細胞および非肝細胞核(ii)の平均核策略推定値と、各サンプル(iii)に対する核プロイドが層化される方法の内訳を含む要約フォルダも自動的に生成される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:内部プロイドキャリブレータとしてのNPCの使用(A)肝細胞(HNF4α+)およびNPC(HNF4α-)核の平均最小DNA含有量(m)に及ぼすDDC損傷の影響を示すグラフ。すべてのデータは、0 日の NPC (n = タイムポイントあたり 4 匹の動物) に正規化されます。(B) 1つの代表的な肝臓サンプルにおけるNPCm値の分布を記述するヒストグラム(0日目、合計7,180核)。上記の回路図は、2-4c DNAコンテンツを持つセルから、円形の NPC マスクがどのように派生するかを示しています。キャリブレーション法の目的は、NPCm分布(点線)の上限で4c(S4c)を表す層化閾値を定義し、分布曲線の極端でのセグメンテーション誤差によるノイズを最小限に抑える。(C)NPC(HNF4α-)核の平均ヘヒト強度および核面積の変化がプロットされる。Cセグメンテーションエラーを回避するために、モードNPCm値の1SD内の対応するNPCm値を有する核のみが精査される(黄色のボックス)。この範囲内で、2c-4c 遷移サイズ (t) が計算され、データ内のアンカー ポイントとして S4cを推定します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5 慢性DDC給餌中のマウス肝臓における核プロイドの場でのハイスループット(A) 記載された方法論を用いた成人肝臓の制御解析2D肝切片からのHNF4α+肝細胞核は、Hoechst核循環度に従って「単純」と「複雑」の2つのグループに細分化される。(トップ)これら2群に属する細胞の代表的な蛍光ホーヒスト画像が示されている。(左)補間されたプロイド値、核面積および平均核ヘヒト強度に従って1つのサンプル(0日目)からの単純なHNF4α+核の層を示す散布図。(右)コントロール肝臓におけるHNF4α+細胞の典型的な内訳(0日目)を詳述した円グラフは、各核突起サブクラスの割合を示す。4匹の動物から合計6.7 x 104 HNF4α+核を分析した。(B) Situ分析におけるハイスループットによる肝細胞核策略に対するDDC肝損傷の影響グラフは、DDC送達の最初の14日以内に2cおよび4c肝細胞核の割合の相対的な減少を示し、一方で、>8cの多倍数核は劇的に数を増加させる。合計1.5 x 105 HNF4α+核を分析した(n=時間単位で4匹動物)。データは平均 + SEM. **P < 0.01 および ***P < 0.001 として表示されます。一方向の分散分析は、平均を比較するために使用されました。有意性P値は、Tukeyの多重比較検定を用いて計算した。(C) この方法を用いて、核層内で核精細サブクラスを空間的に追跡する方法を示す例を示す。Hoechst蛍光画像は、慢性DDC送電中の2つの時点で肝臓の2c核を示すソフトウェアマスク(赤い点)で示されている(14日目および21日目)。NPC が拡大するポータル静脈 (青い点線) とポータルの領域 (黄色の線) が示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:NPCキャリブレーション法の重要な評価(A,B)増殖する NPC は、>2c のプロイドスコアで分類されます。(A)HNF4αおよび増殖マーカーKi-67に対する抗体で免疫標識されたコントロール肝臓からのNPC最小DNA含有量のヒストグラム(n=4、データは平均+SEMとして提示される)。A2c(S2c)および4c(S4c)の層化4c閾値が示される。(B) 記載された方法論に従ったNPCの階層化により、>2cプロイドスコア(n = 12)が割り当てられた核におけるKi-67免疫標識の有意な濃縮が生じる。データは平均 + SEM として提示されます。(C) NPCキャリブレーション方法の外部検証。内部NPC較正装置法を用いて得られた平均肝細胞核プロイドの推定値を、同じサンプルの較正(対照C57BL/6マウス肝臓3−4ヶ月、n=4)と比較し、2N肝細胞14に対する既知の核体積を有する。また、2~6ヶ月の同じ株のマウスからの肝細胞核プロイドを記述する21,2222の独立した分析からデータが提示されます(点線の右側に示されています)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:肝細胞核施設は細胞策略と「複雑」な関係にある。(A) 肝細胞プロイド(2N,4N,8N,16N)の概要を核施設の2D解析により部分的に分離する。双核細胞(赤)は、核が触れているように見えるかどうかに応じて、「単純」(「S」)と「複雑」(「C」)の間で細分化されます。(B,C)個々の肝細胞を手動で選択し、核施設と核間間隔について分析した。(B)「触れる」核を持つ双核肝細胞は「複雑」(100%≤0.8)であったのに対し、非接触核マスクを有する単核細胞(黒)および双核肝細胞は「単純」(94%>0.8)であった。(C)二核肝細胞の「単純な」核は、核間間隔が有意に減少した(n = 3、合計94核分析)を考慮して、単核細胞の核核と区別することができる。(D) パネルAの細胞突起状態が2D核施設と核面積の観点からどのように分布するかを近似したモデルは、単純な円形の形態を4つの段階(I−IV)にクラスタリングする。(E)コントロール肝臓(0日目)とDDC損傷の14日後(左)および21日後(右)におけるHNF4α+核モルホトリー/サイズプロットの比較。モルファメトリー相は上記(I-V)で示されています。矢印は、2c(「a」)、4c(「b」)および8c(「c」)核の二核化と一致する傷害に起因する核塞動量の変化と、16N細胞プロイドクラス(d)の単核化の増加を示す。条件ごとに解析された 29-30 x 103核の合計 (n = 2)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補助ファイル: デモ データセット。これらのファイルを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マウス肝臓における肝細胞核プロイドの組織改修および推定の解析のための高含有、ハイスループットアプローチが記載されている。この手順に慣れると、ユーザーは3〜5日間で複数のサンプルを処理、画像化、分析し、肝臓の健康の詳細な署名を提供する大規模なテスト可能なデータセットを生成できます。サンプル調製方法のシンプルさを考えると、多数の細胞と組織領域が分析され(平均14mm2/sample)、結果2は堅牢で再現性が高い。画像のキャプチャと分析の自動化は、これらの重要なステップからユーザーのエラーと潜在的なバイアスを取り除きます。重要な技術革新は、サンプル内およびサンプル間の肝細胞核DNA含有量の相対的な評価を可能にする内部プロイドキャリブレーターとしてのNPCの使用です。したがって、HNF4αラベリングステップの組み込みは、以前に公開された2Dメソッド33、12、2212,22と比較して、このプロトコルに独自の技術的優位性を提供する鍵となります。対照的に、3D再構成ワークフロー18と比較して方法論の相対的な単純性は、技術的に手間が低く、潜在的により柔軟になる。
フローサイトメトリーの精密法と比較して、2D組織の切片から核DNA含有量を外挿する上で重要な注意点は、策略状態に関する個々の核の分類に起因する可能性のある限られた信頼である。これに加えて、SIA ベースのアプローチ内の固有のバイアスは、サブ赤道サンプリングによる小さな小さな小さなサブグループを過剰に表現することです。ただし、データを内部標準に正規化し、大規模な母集団ベースのアプローチを取ることによって、これらの効果によるエラーは軽減され、サンプル間で比較可能になります。肝細胞は、高度に丸みを帯びた核形態を特徴とし、例えばNPCと比較して、核断面面積単独10、11、14、15、2311,14に基10づくDNA含有量の正確な推定に特に適していることを意味する。,15,23SIAベースのアプローチは、個々の核の推定「最小DNA含有量」記述子をもたらすモーホメトリーと平均ヘーヒト蛍光強度の尺度を統合することによって、核の円形性とDNA密度の両方を説明するために、このプロトコルで洗練されています。重要なことに、NPCを2-4Nの策略対照として使用することは、最小限の核DNA含有量の客観的較正および階層化のための重要な内部基準を提供し、HNF4α(または同様の肝細胞核マーカー)に対する適切な抗体を供給できることを考えると、記述された方法論はあらゆる種のサンプルまたは形式に適用可能である。
核プロイドの評価は、肝疾患進行のための有用な署名を提供することが示されているが、肝臓,13内の策略変化の多様性を完全に確認するためには、肝細胞周囲およびしたがって細胞プロイドを考慮するように記載された方法論を適応させることが望ましいし、必要であろう。細胞プロイドのマッピングは、ヒトおよびマウスの肝臓サンプルにおけるβカテニン10、13、24、13,アクチン1012、22および22サイトケラチン10、11,11などのマーカーを使用して肝細胞周囲の標識によって以前に達成された。24しかし、これがDDC傷害後に試験された場合、劇的な上皮改修は、ファロイジン(データは示さない)またはβカテニン17に対する抗体による肝細胞周囲の信頼性の高い評価を妨げた。したがって、このアプローチは実現可能であるが、それはすべての傷害モデルに適用できるわけではないかもしれないが、達成されれば、細胞策略のマッピングを進めるだけでなく、肝細胞のサイズと数のより正確な推定を行うであろう。また、核間間隔(図7C)などの追加の核パラメータを考慮することで、単核細胞を「単純な」双核肝細胞から区別することができ、2Dマスクに含まれる核の放射状測定によって「複雑な」双核細胞のさらなる分離を達成できることももっともらしい。
検証されたヒトHNF4α抗体がFFPE組織25に存在し、内部較正が種特異的な制限のこの方法論を解放することを考えると、プロトコルはヒトサンプルにほぼ即座に適用可能である。したがって、ヒト疾患における肝細胞核策略および肝臓損傷のハイスループット分析のベンチマークを提供するかなりの可能性を有する。また、他の抗体と多重化することにより、この方法は、特定の肝細胞サブセットの新しい役割と、肝障害および疾患に対するそれらの反応を明らかにすることができる。この目的のために、我々は、増殖核マーカーKi-67(図6)の免疫染色と方法論を組み合わせることに成功し、これは、プロイドの内部較正を改善するためのNPCの不拡散2N集団の同定を含む有用な情報を収集することを可能にする(Noon、未発表データ2019)。したがって、この方法が提供する位置および定量的データと柔軟性を結合させることで、その将来の応用は肝臓における多プロイドの役割の理解を深めることが示唆される。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作業は、スペインのMINECO政府がBFU2014-58686-P(LAN)とSAF-2017-84708-R(DJB)を付与することによって資金提供されました。LANは、全国のミネコ・ラモン・イ・カハル・フェローシップRYC-2012-11700とプランGenT賞(コンニタット・バレンシアナ、CDEI-05/20-C)、およびバレンシア・ジェネラリタットACIF/2016/020の地域ValI +D学生シップによってFMNによって支えられました。RPは、エワ・K・パルチ教授の資金調達を認めたいと考えています。INセルアナライザプラットフォームの支援を受けたアリシア・マルティネス・ロメロ博士(CIPFサイトメトリー・サービス)に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
References
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