Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En høy-gjennomstrømning i Situ metode for estimering av hepatocytt kjernefysisk ploidy i mus

Published: April 19, 2020 doi: 10.3791/60095
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1,3
1Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)

Summary

Vi presenterer en robust, kostnadseffektiv og fleksibel metode for måling av endringer i hepatocyttall og kjernefysisk plafode innenfor faste/kryobevarte vevsprøver som ikke krever flytcytometri. Vår tilnærming gir en kraftig prøve-wide signatur av leveren cytologi ideell for å spore utviklingen av leverskade og sykdom.

Abstract

Når leveren er skadet, reduseres hepatocyttallet, mens cellestørrelse, kjernefysisk størrelse og ploidy øker. Utvidelsen av ikke-parenchymale celler som cholangiocytter, myofibroblaster, stamfar er og inflammatoriske celler indikerer også kronisk leverskade, vevsremodellering og sykdomsprogresjon. I denne protokollen beskriver vi en enkel høygjennomstrømningstilnærming for beregning av endringer i leverens cellulære sammensetning som er forbundet med skade, kronisk sykdom og kreft. Vi viser hvordan informasjon hentet fra todimensjonale (2D) vevseksjoner kan brukes til å kvantifisere og kalibrere hepatocytkjerne kjernefysisk ploidy i en prøve og gjøre det mulig for brukeren å finne spesifikke ploidy undergrupper i leveren in situ. Vår metode krever tilgang til fast/frosset levermateriale, grunnleggende immuncytokjemireagenser og en hvilken som helst standard høyinnholdsbildeplattform. Det fungerer som et kraftig alternativ til standard flow cytometri teknikker, som krever forstyrrelse av nysamlet vev, tap av romlig informasjon og potensiell disaggregasjon bias.

Introduction

Hepatocytter i pattedyrleveren kan gjennomgå stoppet cytokinese for å produsere tonukleære celler, og DNA-endoreplikasjon for å produsere polyploidkjerner som inneholder opptil 16N DNA-innhold. Samlet cellulær og kjernefysisk ploidy økning under postnatal utvikling, aldring og som svar på ulike cellulære påkjenninger1. Prosessen med polyplaitoisering er dynamisk og reversibel2, selv om den nøyaktige biologiske funksjonen forblir uklar3. Økt plaoidi er forbundet med redusert proliferativ kapasitet4, genetisk mangfold2, tilpasning til kronisk skade5 og kreftbeskyttelse6. Hepatocytt ploidy endringer oppstår som følge av endret døgnrytme7, og avvenning8. Spesielt er den ploidy profilen til leveren endret av skade og sykdom9, og overbevisende bevis tyder på at spesifikke ploidy endringer, for eksempel økt ≥ 8N kjerner eller tap av 2N hepatocytter, gir nyttige signaturer for sporing av ikke-alkoholholdigfettleversykdom (NAFLD) progresjon3,10, eller differensialvirkningen av virusinfeksjoner11.

Generelt er leverskade og regenerering forbundet med økt hepatocytcellestørrelse og kjernefysisk område12, sammen med redusert antall hepatocytter, spesielt de med 2N DNA-innhold10,11. Parenchymal skade i leveren er også ofte ledsaget av utvidelse av ikke-parenchymal celler (NPCer), inkludert stromal myofibroblaster, inflammatoriske celler og bipotente leverstamceller. Høy gjennomstrømningsmetoder som gir en kvantitativ cytologisk profil av parenchymal cellenummer og kjernefysisk plaoidi, samtidig som de tar hensyn til endringer i NPCer, har derfor betydelig potensial som forskning og kliniske verktøy for å spore leverens respons under skade og sykdom. Overbevisende nylig in situ analyse av ploidy spectra i menneskelige prøver av hepatocellulært karsinom viser også at kjernefysisk ploidy er dramatisk økt i svulster og er spesielt forsterket i mer aggressive tumor undertyper med redusert differensiering og tap av TP5313. Derfor er det en sterk mulighet for at metodiske fremskritt i kvantitativ vurdering av kjernefysisk ploidi vil bidra til fremtidig prognostisk profilering av leverkreft.

I denne protokollen er en fleksibel høygjennomstrømningsmetodikk for komparativ analyse av muselevervevseksjoner beskrevet, som gir detaljert cytometrisk profilering av hepatocytttall, NPC-responsen og en internt kalibrert metode for å estimere nukleær ploidi (Figur 1). Hepatocytter skiller seg fra NPCer ved hepatocytt kjernefaktor 4 alfa (HNF4α) immunmerking, før karakterisering av kjernefysisk størrelse og kjernefysisk morfotri. "Minimalt DNA-innhold" er estimert for alle sirkulære kjernefysiske masker ved å integrere gjennomsnittlig Hoechst 33342 intensitet (en proxy for DNA-tetthet) med interpolert tredimensjonalt (3D) kjernefysisk volum. Hepatocytt minimalt DNA-innhold kalibreres deretter ved hjelp av NPCer for å generere en kjernefysisk ploidy profil.

Bildeinnhenting, kjernefysisk segmentering og bildeanalyse utføres ved hjelp av bildebehandling med høyt innhold, slik at store områder av todimensjonale (2D) leverseksjoner som inneholder titusenvis av celler, kan screenes. Et spesialskrevet program er gitt for automatisert etterbehandling av høyinnholdsbildeanalysedata for å produsere en prøveomfattende ploidy profil for alle sirkulære hepatocytkjerner. Dette utføres ved hjelp av gratis å laste ned programvare for å beregne kjernefysisk ploidy basert på stereologisk bildeanalyse (SIA)10,11,14,15. SIA-metoden har tidligere blitt validert av flow cytometri som en nøyaktig, om enn arbeidskrevende metode for å estimere hepatocytkjerne kjernefysisk ploidi i leveren14, forutsatt sirkulær kjernefysisk morfologi og et monotont forhold mellom kjernefysisk størrelse og DNA-innhold. I denne protokollen måles begge kjernefysiske parametere ved vurdering av kjernefysisk morfotri og Hoechst 33342-merking. Beregning av "minimalt DNA-innhold" for hver kjernefysiskmaske etterfølges av kalibrering av hepatocytt kjernefysisk ploidi ved hjelp av NPCer, som har et kjent 2-4N DNA-innhold og derfor tjener som en nyttig internkontroll.

Sammenlignet med konvensjonelle flyt cytometri metoder16 tilnærmingen beskrevet gjør hepatocytt kjernefysisk ploidy å bli vurdert in situ og krever ikke tilgang til friskt vev eller disaggregering metoder som kan skjevhet utfall og være vanskelig å standardisere. Som med alle SIA-baserte tilnærminger, er kjernefysiske ploidy underklasser > 2N underrepresentert av 2D-prøvetaking på grunn av snitting av større kjerner utenfor ekvatorialplanet. Den vevsbrede ploidy profilen beskriver også minimum DNA-innhold for alle sirkulære hepatocytt kjernefysiske masker, og diskriminerer ikke direkte mellom mononukleære hepatocytter og to ukukleære celler som har to diskrete ("ikke-rørende") kjerner av samme ploidi. Imidlertid gir enkelheten i denne protokollen betydelig rom for at den kan tilpasses for å ta hensyn til flere parametere som internukleær avstand eller celleperimeteranalyse, som ville lette identifisering av tonukleære celler som gir en mer detaljert vurdering av cellulær ploidi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble tidligere godkjent av CIPFs etikkkomité. Mus ble plassert i et patogenfritt anlegg ved Centro de Investigación Príncipe Felipe (Valencia, Spania), registrert som en eksperimentell dyreoppdretter, bruker og forsyningssenter (reg. nr. ES 46 250 0001 002) i henhold til gjeldende europeiske og spanske dyrevelferdsforskrifter (RD 53/2013).

1. Vevhøsting og prøvepreparat

MERK: Denne protokollen beskriver hvordan du fryser vev uten tidligere fiksering eller kryopreservation. For tidligere faste/kryobevarte prøver går du videre til avsnitt 2 og utelater trinn 3.1. Alle analyser er utført ved bruk av voksne kvinnelige C57BL/6 mus i alderen 12–16 uker.

  1. Ofre dyr ved fentanyl/pentobarbital intraperitoneal injeksjon etterfulgt av livmorhalsforvridning. Med musen vendt ventral side opp, åpne bukhulen og utsette leveren ved å gripe huden med pinsett og utføre en vertikal snitt fra bunnen av underlivet til bunnen av brystbenet ved hjelp av kirurgisk saks.
  2. Fjern forsiktig galleblæren ved hjelp av fine pinsett, dissekerut leveren og skyll den valgte leverlobulen i en 10 cm Petri-tallerken fylt med fosfatbufret saltvann (PBS).
    MERK: Det anbefales å sammenligne samme leverflike for hvert dyr, i dette tilfellet ble medianlappen brukt.
  3. Fyll en merket kryomold med optimal skjæretemperatur (OCT) medium ved romtemperatur (RT). Unngå OCT bobler. Hvis de ser ut, skyv dem til kanten av formen ved hjelp av en nål eller pipettespiss.
  4. Bygg leverlobule inn i en fylt OCT kryomold og plasser den umiddelbart på tørris for å sikre rask frysing. Oppbevar kryomfolder ved -80 °C til kryoseksjon.

2. Kryoseksjon

  1. Transport cryomolds på tørris for å unngå vev nedbrytning. Før kryoseksjon likevekt inne kryostat satt til -20 °C i 20 min.
  2. Løs ut prøven ved å bruke trykk på bunnen av plastkryomolden. Påfør flytende OCT til varm prøvedisk på RT, posisjon i kryostat og fest en OCT innebygd leverprøve. Påfør mildt trykk og vent 3 min til OCT for å fryse for å sikre at prøven holder seg til disken.
    MERK: Unngå å håndtere prøven med fingrene så mye som mulig for å unngå vevsnedbrytning.
  3. Lås prøven inn i armen på kryostatog juster retningen slik at kanten av prøven er parallelt med kryostatbladet. Skjær inn i prøven til vevet er nådd.
  4. Del prøven med 6 μm tykkelse. Plasser et merket polyamidbelagt lysbilde over prøven i 5 s for å la prøven holde seg på lysbildet. Plasser lysbildet ved RT i 3–5 min, og fortsett deretter direkte til del 3 for best resultat.
    MERK: For behandling av flere ferske fryste prøver er det oppnådd reproduserbare resultater ved å midlertidig lagre lysbilder i en skyveboks på tørris til alle prøvene er behandlet. Når du bruker denne tilnærmingen, kan du la alle lysbilder likevekte til RT før du går videre til del 3. Formalin faste parafin innebygde (FFPE) prøver kan brukes, selv om bakgrunnen autofluorescens er økt ved denne metoden. For å gå videre fra FFPE-prøver, avsnitt ved 4 μm. Monter ved å fange seksjoner fra 40 °C vannbad på polyamidbehandlede lysbilder. Varmesklier i 1 t ved 60 °C, deretter deparaffinisere ved seriell RT vasker (5 min) i Coplin krukker som inneholder xylen (x2), etanol 100% (x2), 96% (x2), 70% (x1) og dH2O (x1). For å eksponere antigens plassere lysbilder i sitratbuffer en 20 min ved 90 °C før herdet lysbilder i PBS ved RT. Fortsett til trinn 3.2.

3. Fluorescens immunmerking

  1. Fest vevsseksjoner i en røykhette ved å påføre 1 ml 4 % paraformaldehyd (PFA) i PBS i 10 min ved RT. Overfør lysbilder til en PBS fylt Coplin-krukke og vask i 3 min ved hjelp av mild agitasjon (gjenta 3x).
    MERK: Fra nå til slutten av immunfargingsprosessen, unngå tørking av prøven.
  2. Tørk området rundt hver vevsseksjon og omgir ved hjelp av en hydrofobe penn. Permeabilize med 0,5% nonionic overflatefactant (dvs. Triton X-100) i PBS for 15 min på RT. Vask deretter i PBS fylt Coplin krukke i 3 min ved hjelp av mild agitasjon (gjenta 2x).
  3. Blokker ved hjelp av en filtrert løsning på 1% storfe serum albumin (BSA), 5% hest serum, 0,2% nonionic overflateaktivt middel i PBS (for minst 1 h ved RT).
  4. Inkuber med primær HNF4α antistoff fortynnet i blokkering sbuffer over natten ved 4 °C i et mørkt fuktig befarelseskammer (se materialtegnerfor antistoffer og spesifikke fortynninger).
  5. Plasser lysbildene i en PBS fylt Coplin krukke og vask i 3 min ved hjelp av mild agitasjon (gjenta 4x).
  6. Inkuber med Alexa-488 konjugert sekundærantistoff og Hoechst fortynnet i filtrert 1 % BSA og 0,2 % ikke-ionnisk overflateaktivt middel i PBS i 2 timer ved RT i et mørkt fuktig flekkkammer (se materialtegnerforantistoffer og spesifikke fortynninger).
  7. Plasser lysbildene i en PBS fylt Coplin krukke og vask i 3 min ved hjelp av mild agitasjon (gjenta 4x). Vask i ddH2O i 3 min med lett opphisselse (gjenta 2x).
  8. Monter lysbildene ved å plassere to dråper fluorescerende monteringsmedium på en dekselslip (24 x 60 mm) og legge lysbilder over den, eliminere bobler ved å bruke mildt trykk. For langtidslagring, tetningsdekselslip på kantene med klar neglelakk og oppbevar i mørket ved 4 °C.
  9. Før du fortsetter, sjekk lysbilder ved hjelp av et konvensjonelt fluorescensmikroskop for å sikre god fiksering og immunmerking.
    MERK: Se figur 2A,B for forventede resultater.

4. Fluorescens bilde oppkjøp

MERK: For dette trinnet kreves en bildeplattform med høy innhold (Table of Materials) som støtter automatisk fluorescensbildeanskaffelse.

  1. Slå på bildesystemet og åpne en ny anskaffelsesprotokoll.
  2. Velg målsettingen på 10 x, noter området i synsfeltet (i dette tilfellet 0,6 mm2).
  3. Angi parametere for å skaffe fluorescensbilder ved hjelp av de riktige eksitasjons- og utslippsfiltrene (i henhold til trinn 3.6). For Hoechst og Alexa-488 velger du "DAPI" og "GFP" kanaler med henholdsvis 390/18 og 438/24 nm eksitasjon og 432,5/48 og 475/24 nm utslipp.
  4. Fokuser prøven og sørg for at signalintensiteten ikke er mettende. Sørg for at bildeopptak er gjort med samme eksponeringstid for alle bildene eller bruk et system der intensiteten av fluorescens er korrigert for eksponeringstiden.
  5. Skann prøve og skaffe tilstrekkelige bilder for å få fullstendig dekning av vevdelen (ca. 20-50 synsfelt, avhengig av prøvestørrelsen).
  6. Se gjennom bildedatabasen, manuelt eliminere (i) dårlig fokuserte felt, (ii) de ved grensene til hver vevseksjon (for å unngå skjevhet celletetthetberegninger), og (iii) de som inneholder brettede / fysisk skadede områder av vevsdelen hvis det finnes.

5. Automatisert fluorescens bildeanalyse

MERK: Dette trinnet krever passende bildeanalyseprogramvare (Table of Materials) som er i stand til: (1) som automatisk identifiserer Hoechst-merkede kjerner i bilder ved 405 nm (kjernefysisk segmentering), (2) vurderer gjennomsnittlig hoechst kjernefysisk intensitet og morfoometry, og (3) terskelanalyse for å bestemme +/- status for kjernefysisk fluorescens ved 488 nm (HNF4α). Noen grunnleggende operatøropplæring/kompetanse er nødvendig for å visuelt vurdere og justere segmenterings- og tersjonsparametere i programmet for å sikre at kjerner og HNF4α+/-status er optimalt inngjerdet (figur 2).

  1. I bildeanalyseprogramvaren åpner du oppkjøpsfilen som inneholder Hoechst (405 nm) og HNF4α (488 nm) bilder fra trinn 4.5, og opprett en ny analyseprotokoll.
  2. Definer bølgelengder som skal brukes til kjernefysisk segmentering (Hoechst, 405 nm) og for hepatocyt/NPC terskelanalyse (HNF4α, 488 nm).
  3. Juster programvarens kjernefysiske segmenteringsparametere (for eksempel "minimum kjernefysisk område" og kjernefysisk deteksjon "følsomhet") for å sikre at kjerner er optimalt segregert.
    MERK: God segmentering av hepatocytter bør prioriteres over npcenes. Hepatocyttkjerner er karakteristisk avrundet (interkvartil størrelsesområde: 40–64 μm2). NPC-kjerner, slik som de av sinusoidal endothelia, er flatet / elliptisk eller uregelmessig i form og generelt mindre og tettere pakket enn de av hepatocytter (interkvartil størrelsesområde: 30-43 μm2). For muselever ble det brukt minimalt kjernefysisk areal ≥23 μm2 og deteksjonsfølsomhet på 65 % (se figur 2C, D for forventede resultater). Følsomhet bestemmer hvordan pikselklynger gjenkjennes som individuelle kjerner basert på intensiteten og bør testes empirisk for hvert eksempel sett av brukeren før du fortsetter med automatisert bildeanalyse.
  4. Endre terskelintensiteten ved 488 nm for å sikre optimal knecytter (HNF4α+) og ikke-parenchymale celler (HNF4α-).
    MERK: Se figur 2C, D for forventede resultater. Verdien av terskelintensiteten er relativ og vil avhenge av fargeeffektivitet og oppkjøpsinnstillinger som laserintensitet. Det bør derfor standardiseres av brukeren. Bruk kjente HNF4α-celler som endotelceller og periportal NPCer som en intern negativ kontroll og biukleukleære hepatocyttkjerner som en positiv referanse for farging. Test analyseparametrene ved hjelp av et lite antall bilder for å sikre god kjernefysisk segmentering og intensitetsterskelsegregering før du bruker analyseparametere til hele datasettet.
  5. Velg følgende kjernefysiske parametere som skal kvantifiseres: (1) kjernefysisk område basert på Hoechst farging (μm2), (2) gjennomsnittlig kjernefysisk hoechst intensitet (RU), (3) kjernefysisk forlengelsefaktor (gjennomsnittlig forhold mellom den korte aksen av kjernen til den lange aksen av kjernen, der et sentersymmetrisk [ikke-langstrakt] objekt har en verdi på 1, (4) Nuc 1/(formfaktor), gjennomsnittlig kjernefysisk "rundhet" indeks beregnet av omkrets 2/(4π x-område). Verdiene varierer fra 1 til uendelig, hvor 1 er en perfekt sirkel, (5) HNF4α status (positiv-1 eller negativ-0), og (6) kjernefysiske x / y koordinater basert på "tyngdepunkt" (cg), en metode for å finne midten av objektet fra gråtonebilder med underpikselpresisjon.
  6. Kjør analysen for alle eksempeldatasett og eksporter numeriske data fra trinn 5.5 til regnearkprogramvare.

6. Dataanalyse

MERK: Dataanalysetrinnet kan utføres ved hjelp av en hvilken som helst standard regnearkprogramvare.

  1. Beregn hepatocytt og ikke-hepatocyttcelletall.
    1. Beregn det totale arealet av leverdelen som er analysert for hvert utvalg, ved å multiplisere antall synsfelt med området for synsfeltet (trinn 4.2).
    2. Filtrere dataene ved å velge bare HNF4α+-kjerner ved å arbeide med regnearkfiler som genereres for hver leverdel. Beregn det totale antallet HNF4α+ kjerner som analyseres og deler dette med det totale arealet som er analysert for å oppnå gjennomsnittlig hepatocyttetthet for hver prøve (figur 2F).
    3. Utfør samme beregning for ikke-parenchymale celler ved å filtrere regnearket for HNF4α-celler (Figur 2E).
  2. Beregn hepatocytt kjernestørrelse distribusjon.
    1. Bruk regnearkprogramvare til å filtrere data for å velge bare HNF4α+-kjerner.
    2. Plottverdier av kjernefysisk område i et histogrammet (Figur 2G). Sett hyllebredden til 5 μm2.
      MERK: Frekvensverdier kan korrigeres for område (kjerner/mm2) i henhold til trinn 6.1.1.
  3. Utfør hepatocytt kjernefysisk ploidy analyse.
    MERK: Regnearkdataene fra trinn 5.6 brukes til å generere en kjernefysisk ploidy profil for hver prøve. Denne prosessen er automatisert og kan utføres ved hjelp av en tilpasset skriftlig programvare som er fritt tilgjengelig for nedlasting med støtteinformasjon og demonstrasjonsdatasett påhttps://github.com/lukeynoon(seTilleggsfiler). Kildekode ndkoms er gitt for brukere som ønsker å tilpasse metodikken. En beskrivelse av algoritmen, sammen med instruksjoner for installasjon og bruk er skissert nedenfor. Programmet bruker regnearkdata til automatisk å skille hepatocyttkjerner i to grupper; (1) de med "enkle" sirkulære kjerner og (2) "komplekse" ikke-sirkulære kjerner representant for tonukleære celler med "2c ploidy. Det minimale kjernefysiske DNA-innholdet (en funksjon av kjernefysisk område og DNA-tetthet) beregnes neste gang for alle "enkle" kjerner. Et påfølgende trinn kalibrerer deretter automatisk HNF4α+ hepatocytt nukleær ploidi ved hjelp av HNF4α- kjerner som en kjent 2-4N intern kontroll.
    1. Last ned og installer programvare.
      1. Last ned det pakkede programmet fra: https://github.com/lukeynoon
      2. Start MATLAB. Naviger til APP-fanen på verktøyturen, klikk installer app og åpne det nedlastede programmet kalt"Ploidy_Application.mlappinstall". Det vises en melding for å bekrefte vellykket installasjon.
        MERK: Programmet er nå klart til bruk og vil forbli i APP-fanen på verktøyturen.
    2. Formater inndata.
      MERK: Før automatisert kjernefysisk ploidy analyse, bør alle regnearkfiler som inneholder høyinnholdbildedata (trinn 5.6) lagres og formateres i henhold til følgende instruksjoner.
      1. I hver eksporterte datafil (. XLS 97-2004 arbeidsbok) fra trinn 5.6, inkluderer et ark betegnet "Cell mål" som inneholder alle dataene som kreves for ploidy analyse angitt i kolonner (Figur 3A). Kontroller at regnearkoppsettet, inkludert kolonneoverskriftsnavn, forblir uendret fra figur 3A, fordi analysemetoden finner de riktige kolonnedataene ved å søke etter disse navnene (se demonstrasjonsdatasett i tilleggsfiler for referanse). Hvis for eksempel bildeanalyseprogramvare med høyt innhold ikke produserer en "Lysflyt"-kolonne (Figur 3A),setter du manuelt inn en "Lysflyt"-kolonne på samme sted, det vil si kolonne K og fyll den med nuller.
      2. For hver eksperimentelle tilstand (f.eks. "Skadet-d14"), gi et kontrolldatasett, som vil bli brukt til å beregne internkontrollen for 2-4N kjernefysisk ploidy kalibrering (trinn 6.3.4.3). Her velger du leverprøver fra ubehandlede voksne kullkamerater ("Control-d0"; figur 3B-D).
      3. For biologiske replikater (per tilstand) lagrer du hvert regneark i sin egen mappe (som i figur 3B). Gi mappen navnet prefikser trinnvis, for eksempel "Sample1, Sample2, Sample3... SampleN", i henhold til filnavnene som finnes i. Derfor bør hver datasettmappe (f.eks. "Kontroll-d0") inneholde en rekke undermapper ("Sample1", "Sample2", etc.) som hver inneholder en regnearkfil med samme tilsvarende navn.
    3. Kjør programmet.
      1. I MATLAB starter du "Ploidy_Application" ved å klikke på ikonet i MINE APPER-fanen i verktøyturen (figur 3C). Det Ploidy_Application grafiske brukergrensesnittet (GUI) vises (Figur 3C).
      2. Klikk Bane for å kontrollere data-knappen for å navigere til mappen der kontrolldataene replikeres, ligger (f.eks. "Kontroll-d0"). Denne databanen vises da i grensesnittet (f.eks. /Users/Desktop/Control-d0).
      3. Deretter skriver du inn navnet som skal gis til utdataene i "mappeprefiks".
        MERK: Dette prefikset kan endres til tekst, forutsatt at mappene og filnavnene forblir trinnvis navngitt.
      4. Klikk knappen Bane til andre data, og naviger til mappen der komparative data replikerer, ligger (f.eks. "Skadet-d14"). Denne databanen vises da i grensesnittet (f.eks. /Users/Desktop/Injured-d14).
      5. Klikk Kjør!. Når analysen er fullført, vil statuslinjen lese "Analyse fullført!..".
        MERK: Søknaden vil rapportere, for hvert utvalg, stratifisering av "enkle" kjerner i ≤ 2n, 2n-4n, 4n-8n og 8n+ i form av absolutte tellinger og som en prosentandel av totalt (figur 3D). Disse filene lagres automatisk i hver eksempelmappe som: "Count_2n.txt", "Count_2n_to_4n.txt", "Count_4n_to_8n.txt", "Count_8n_and_higher.txt", "Percentage_2n.txt", "Percentage_2nto4n.txt", "Percentage_4nto8n.txt", "Percentage_8n_and_higher.txt". Ploidy_Application vil automatisk lagre en liste for hver prøve, av alle de enkelte ploidy estimater for "enkel" hepatocytt og ikke-hepatocytt kjerner i "Ploidy_All_Hepatocytes.txt" og "Ploidy_NonHepatocytes.txt". For kontrolldatasettet lagrer metoden også de minimale DNA-innholdsterskler beregnet for stratifisering av ploidy (se trinn 6.3.4.3.7) i en fil med navnet "Normalised_Thresholds_Control". Til slutt vil programmet produsere en mappe for både kontrollen og de valgte komparative tilstandsdataene kalt "Sammendrag". Denne mappen inneholder to undermapper, "Ploidy" og "Stratifisering" som inneholder gjennomsnittene i alle utvalg som følger med (Figur 3D).
    4. Beskrivelse av metodikken.
      MERK: Følgende avsnitt beskriver i detalj metodikken som brukes av Nuclear Ploidy Analysis-programvaren. Hvis brukeren velger å ikke bruke programmet, kan disse trinnene følges ved hjelp av regnearkprogramvare for å beregne den kjernefysiske ploidyprofilen manuelt.
      1. Skill kjerner til "enkle" eller "komplekse" i henhold til kjernefysisk morfotri.
        1. Beregn en "sirkularitetsindeks" for alle kjerner, definert som kjernefysisk "forlengelsesfaktor" delt på "Nuc 1 / (formfaktor)", hvor en verdi på 1,0 indikerer en perfekt sirkel.
          MERK: "Kjernefysisk forlengelse" og "Nuc 1/(formfaktor)" er to diskrete tiltak av et objekts "sirkularitet" som vurderer komplementære, ikke-overlappende morfoometriske kriterier. Førstnevnte måler de lange og korte aksene til et objekt, mens sistnevnte sammenligner lengden på omkretsen av et objekt med det området. For å styrke definisjonen av kjernefysisk sirkularitet som brukes i denne protokollen, har disse to målingene blitt kombinert til en enkelt "sirkulæritetsindeks". En tidligere tilnærming til å estimere kjernefysisk ploidy ved hjelp av den beskrevne metodikken som bare brukes kjernefysisk forlengelse17. Mens akseptable resultater ble oppnådd ved hjelp av denne tilnærmingen, har forfatterne observert at en sammensatt "sirkularitetsindeks" forbedrer diskriminering av manuelt utvalgte kjerner fra mononukleære og biukleære hepatocytter (data som ikke vises).
        2. Klassifisere kjerner med en sirkularitetsindeks ≤ 0,8 som "kompleks" og de > 0,8 som "enkel".
      2. Anslå "minimalt" DNA-innhold (m) for alle "enkle" kjerner.
        1. Beregn kjernefysisk radius (r) ved hjelp av formelen:
        2. Beregn kjernefysisk volum (v) ved hjelp av volumet av en sfæreformel:
        3. Generer en relativ verdi for minimalt DNA-innhold (m) ved hjelp av formelen:
      3. Kalibrer datasettet ved hjelp av NPC (HNF4α-) kjerner som en intern 2-4N-kontroll.
        MERK: NpCer har et 2-4N DNA-innhold avhengig av cellesyklusstatus. Derfor øker den gjennomsnittlige verdien av NPC "minimalt" DNA-innhold (NPCm) med skade (figur 4A). Kalibreringsfeil minimeres ved å opprette en øvre grense på NPCm som representerer en 4c-terskel (figur 4B).
        1. I regnearket velger du bare NPC-kjerner med verdier for "m" som ligger innenfor 1 standardavvik (SD) i modusen (dette filtrerer ut støy fra mulig segmenteringsfeil).
        2. Innenfor dette filtrerte området, undersøke kjernefysiske områder og deres tilsvarende gjennomsnittlige Hoechst intensiteter (Figur 4C).
        3. Estimer det minste kjernefysiske området innenfor dette filtrerte området med maksimal kjernefysisk Hoechst intensitet (dvs. punktet der linjen i kurven endrer retning i det filtrerte datasettet som illustrert av den røde sirkelen i figur 4C). Denne verdien representerer en 2N-4N overgangstilstand (t) over hvilken prøvetaking av 4c-kjerner dominerer over 2c-kjerner, noe som resulterer i en maksimal gjennomsnittlig hoechst intensitet.
          MERK: Denne verdien bestemmes automatisk av programvaren; Regnearkbrukere kan imidlertid manuelt velge dette punktet som overgangsstørrelse.
        4. Beregn det minimale DNA-innholdet som representeres av denne overgangsstørrelsen (tm)ved å følge trinn 6.3.4.2.
        5. Hvis du vil anslå 4N-skulderen på NPC m-datasettet, legger du til 1 SD til verdien av tm.m Det resulterende tallet (Figur 4B) beskriver den øvre grensen for NPC minimalt DNA-innhold som skal brukes til kjernefysisk ploidy stratifisering (S4c).
        6. Gjenta trinn 6.3.4.3.1−6.3.4.3.5 for alle "kontroll"-prøver.
          MERK: For eksempel, i figur 3,brukes uskadet kontrolllever ("Kontroll-d0") som kontrolltilstand.
        7. Beregn en gjennomsnittlig 4c stratifiseringsterskel (S4c) for "kontroll"-prøver og bruk dette til å ekstrapolere 2c (S2c) og 8c (S8c)grenser for minimalt DNA-innhold (m). Tilfredsstillelsesterskler genereres og lagres automatisk av programvaren (trinn 6.3.3.3).
          MERK: Avhengig av studiedesignen kan gjennomsnittlige terskelverdier for stratifisering beregnes for hver betingelse eller for bestemte forhold (f.eks. sunn kontrolllever). Imidlertid krever Nuclear Ploidy Analysis programvare at en av et sett med 2 filer er utpekt som "kontroll" med det formål å beregne relative ploidy verdier.
        8. Beregn en ploidy verdi for alle kjerner ved hjelp av S2c-verdien som genereres i trinn 6.3.4.3.7 per:
        9. Stratifiser "enkle" hepatocyt (HNF4α+) kjerner i 2c/4c/8c/>8c braketter i henhold til følgende kriterier: "2c" HNF4α + = p ≤ 2; "4c" HNF4α+ = 2 < p ≤ 4; "8c" HNF4α+ = 4 < p ≤ 8; ">8c" HNF4α+ = 8 < s.
        10. For å rekonstruere den romlige mønsteret av ploidy undergrupper, skille kjernefysiske data i hvert utvalgregneark i henhold til de tilsvarende feltene der de ble anskaffet. Bruk deretter tilhørende kjernefysiske x/y-koordinater (fra trinn 5.5) til å plotte ploidy undergrupper i 2D (figur 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metoden har blitt brukt til å måle virkningen av kolestatisk skade på den voksne museleveren ved å mate dyr i 0-21 dager med et hepatotoksisk kosthold som inneholder 0,1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidin (DDC)17. Kronisk DDC fôring resulterer i hepatocellulær skade økt ploidi og periportal utvidelse av NPCer. Brukeren bør være oppmerksom på at musbelastning og aldersavhengige forskjeller kan eksistere i kjernefysisk sokkel og at alle analyser er utført ved hjelp av voksne kvinnelige C57BL/6 mus i alderen 12–16 uker.

Etter HNF4α immunmerking (protokoll seksjon 3), er det viktig å sjekke alle lysbilder ved hjelp av konvensjonell fluorescensmikroskopi, for å sikre god kvalitet fiksering og farging (Figur 2A). Smøring eller uskarphet av Hoechst kan indikere utilstrekkelig fiksering eller prøvenedbrytning før fiksering (figur 2B), i så fall gå tilbake til protokoll seksjon 2 og forkorte tiden mellom snitting og fiksering (trinn 3.1). Vellykket immunmerking med HNF4α antistoff kan lett bedømmes på dette stadiet ved klar diskriminering av positivt merkede hepatocytkjerner, vanligvis større og mer avrundet enn npCer (figur 2A). Flatet/elliptisk endotelkjerner innenfor parenchyma, eller tette flekker av celler som ekspanderer i periportalområder etter DDC-skade, kan tjene som en nyttig visuell referanse for å identifisere HNF4α- NPCer ved vurdering av suksess/svikt i immunfarging.

Kjernesegregering og HNF4α terskelparametere (trinn 5.2-5.4) bør optimaliseres nøye før automatisk bildeanalyse (trinn 5.6) for å reflektere det visuelle mønsteret av immunfarging observert ved konvensjonell fluorescensmikroskopi på slutten av protokollseksjon 3 (figur 2C). Eksempler på optimal vs suboptimal kjernefysisk segmentering og HNF4α terskelprotokoller er oppsummert i figur 2D. Etter bildeanalyse (trinn 6.1.3) bør dataene gjenspeile et økende antall NPCer i leveren med DDC-skade (figur 2E), fra 52 % ± 2,0 % av kjerner i kontrolllever til 72,8 % ± 1,4 % etter 21 dager med DDC-behandling. Hepatocytter representerer 48,0 % ± 2,0 % av de totale kjernene i kontrolllever, konkordans med tidligere analyser av leverhistologi som viser at hepatocytter opptar 70–85 % av vevsvolumet, men bare 45–50 % av totale leverceller18,19. En liten, men signifikant reduksjon i antall HNF4α+ kjerner observeres i løpet av de første 14 dagene av DDC-fôring (figur 2F). En frekvensfordelingsplott av hepatocytt kjernefysisk område (trinn 6.2) viser en topp HNF4α + kjernefysisk område i kontrolllever i 40-50 μm2 størrelsesområde, og et klart høyreskifte i kjernefysisk størrelse etter DDC-skade (Figur 2G); konsistent med økt ploidy og hepatocellulær hypertrofi12.

Hos friske (dag 0) kontrolllever har 63,4 % ± 1,7 % av HNF4α+-kjernene et "enkelt" sirkulært morfotri (figur 5A). Dette tallet reduseres til 46,8 % ± 5,7 % (P = 0,042) etter 21 dager med DDC-skade, noe som reflekterer økt kompleksitet i nukleær tneutri antagelig forbundet med skiftende mellom ploiditolle tilstander under polyplaitoisering (se "Tolkning av nukleær tneumoometri" nedenfor). Representative eksempler på kjernefysiske ploidy distribusjoner oppnådd ved hjelp av denne metoden i kontroll leverseksjoner er vist i figur 5A, som beskriver hvordan interpolering av DNA-innhold tillater stratifisering av individuelle celler i en enkelt prøve. Gjennomsnittlige verdier for undersett av "komplekse" og "enkle" HNF4α + celler vises også (Figur 5A). Dataene er i samsvar med tidligere estimater av polyploidi i 80-90% av voksne murine hepatocytter2. Frekvensen av komplekse kjerner (36,6 % ± 1,7 %) i kontroll lever også omtrentlig til at av toukleære celler (35%)20, selv om data bør strengt betraktes som et mål på kjernefysisk snarere enn cellulær ploidi (se "Tolkning av kjernefysisk morfotri" nedenfor). Sammenligning av relative plafode mellom kontroll (dag 0) og DDC-behandlede grupper bør gjenspeile betydelig tap av 2c og 4c hepatocyttkjerner med skade sammen med økt antall > 8c celler (figur 5B). Relativ posisjonsinformasjon for hver ploidy undergruppe kan avhøres ved scatter-plott av x-y koordinater knyttet til hver kjerne i datasettet eller ved å hente 2D-plasseringen av bestemte hepatocyttundergrupper i høyinnholdsbildeanalyseprogramvaren (figur 5C).

Kalibrering
For å vurdere gyldigheten av NPC-kalibreringsmetoden som ble brukt, ble dobbelt immunmerking av leverseksjoner utført ved hjelp av antistoffer mot HNF4α og proliferativ markør Ki-67 (Figur 6A,B). Disse dataene viste berikelse for Ki-67, som merker celler i alle aktive faser av cellesyklusen, på høyre side av NPC minimal DNA-fordelingskurve (mellom S2c og S4c) - hvor NpC-er forventes å replikere DNA og derfor ha > 2c ploidy (Figur 6A). Etter intern kalibrering av alle kontroll- og skadde leverprøver som er studert, Ki-67, ble betydelig beriket (P < 0,0001) i "enkle" NPC-kjerner med en estimert ploidy på > 2c (82,5% ± 6,6% SD, n = 12) sammenlignet med de med ≤ 2c ploidy (17,5% ± 6,6% SD, n = 12) (Figur 6B), noe som indikerer vellykket ploidikalibrering. Disse dataene støtter gyldigheten av metoden som brukes. Også, forutsatt nøyaktig tersing av Ki67, gir de noen kvantitativ innsikt i i hvilken grad subekvatorialkjernefysiske masker fra høyere ploidy grupper "forurenser" grupper nedenfor.

For ytterligere å teste gyldigheten av NPC-kalibreringsmetoden, ble en ekstern kalibrator introdusert basert på det tidligere rapporterte kjernefysiske volumet av mus 2N hepatocytter (155,8 μm3)14. Når dette tallet ble brukt i kombinasjon med en gjennomsnittlig verdi av Hoechst intensitet for HNF4a- kjerner det resulterende estimatet for gjennomsnittlig hepatocytplatolog i kontroll leveren var umulig å skille fra den interne (S2c) kalibrator (Figur 6C). Videre var estimater av gjennomsnittlig hepatocytt ploidy hos mus i C57BL/6-musestammen av sammenlignbar alder, også like, noe som bekrefter at tidligere empirisk kunnskap om 2N hepatocytkjerne kjernekraftstørrelse ikke er nødvendig, noe som gjør denne internt kontrollerte metodikken for å estimere kjernefysisk ploidy fullt autonom.

Tolkning av kjernefysisk morfotri
Metoden som er beskrevet gir en ploidy avlesning for hepatocyttkjerner med "enkel" sirkulær morfotri. Utelukkelse av "komplekse" kjerner er basert på hypotesen om at de representerer en andel av toukleære hepatocytter med overlappende / rørende kjernefysiske masker, noe som gjør nøyaktig ploidy bestemmelse for denne undergruppen mer utfordrende (Figur 7A). Viktigere, segregering av kjerner i henhold til sirkularitet gjør det ikke mulig for brukeren å skille mellom kjernene i mononukleære hepatocytter og de av tonukleære celler, der to kjerner av lignende ploidi er tydelig atskilt i cellen. Dette ble empirisk testet ved å manuelt velge toukleære og mononukleære celler fra bildedatasettene og vurdere deres segregering av algoritmen (Figur 7B). Kjerner av biukleære hepatocytter som var fysisk nær (Figur 7C) men "ikke berøre" ble kategorisert av algoritmen som "enkel", mens de som var "rørende" ble tydelig diskriminert som "komplekse". Derfor gir denne analysen ikke en avlesning av cellulær ploidi i leveren, gitt at kjerner av tonukleære celler er delt mellom de "enkle" og "komplekse" underklassene (se Diskusjon). Imidlertid kan noen innsikt i overgangen mellom tilstander av cellulær og kjernefysisk ploidy oppnås fra disse dataene bare ved å plotte histograms av kjernefysisk morfoferi og kjernefysisk størrelse og bruke en modell av hvordan "komplekse" og "enkle" stater er overgangen mellom under polyploidisering (Figur 7D). I kontroll lever tre faser (I-III) av kjernefysisk morfotri er tydelig observert (Figur 7E). De representerer klynger av sirkulære 2N (I), 4N (II) og 8N (III) kjernefysiske masker henholdsvis (som vist i figur 7D). Mononukleære 16N hepatocytter er ekstremt sjeldne i voksne muselever16,18,21, derav 16N cellulær ploidy gruppen består nesten utelukkende av tonukleære celler med 8N kjerner, som ligger innenfor, og til høyre, av fase III ( Figur7E), forklarer fallet i sirkularitet til høyre for fase III. Interessant, på skade (DDC dag 14), en kvantitativ endring mot økt kompleksitet ("biukleæritet") begynner i faser I (reflekterer 2n til 2x2n) og faser III (reflekterer 8n til 2x8n), før det er endelig konsolidert i alle tre faser (I-III). Forfatterne spekulerer i at dette skiftet mot økt kompleksitet skyldes økt cellulær ploidy som følge av stoppet cytokinese, mens til høyre for fase III observeres den motsatte trenden, på grunn av økt representasjon av sirkulære 16N mononukleære celler i den skadede leveren på grunn av endoreplikasjon. Disse observasjonene må selvfølgelig testes ved å tilpasse metoden for å ta hensyn til cellulær sokkel (se Diskusjon).

Figure 1
Figur 1: Sammendrag av arbeidsflyten. Levervev høstes (1), kryoseksjon (2), fast og immunmerket med et HNF4α antistoff som gjør det mulig for parenchymale og ikke-parenchymale celler (NpCer) å bli diskriminert (3). Når det er behandlet, digitaliseres prøvene ved hjelp av en høyinnholdsbildeplattform ved hjelp av automatisert bildeopptak (4) og analyse (5). Celler er segmentert av Hoechst kjernefysisk fluorescens og HNF4α immunofluorescens terskler. Deretter beregnes Hoechst kjernefysisk område ("A") og sirkularitet ("C"). Til slutt analyseres dataene (6); HNF4α- NPCer er kvantifisert (i) og HNF4α+ hepatocyttkjerner er delt inn i to undergrupper ("enkle" og "komplekse") i henhold til kjernefysisk sirkularitet (ii). Interpolering av hepatocytt kjernefysisk ploidy utføres deretter for alle "enkle" kjerner som en funksjon av kjernefysisk radius (r) og gjennomsnittlig Hoechst fluorescensintensitet (som en proxy for kjernefysisk DNA tetthet) (iii). Dataene blir deretter stratifisert ved hjelp av NPCer som en intern 2N kalibrator (iv) før du kompilerer et eksempelsammendrag (v). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Bildeanalyse med høyt innhold og cytometrisk profilering av museleveren under kronisk DDC-fôring. (A) Et representativt konfokalt bilde av HNF4α/Hoechst immunofluorescensfarging av den voksne museleveren etter 21 dager med fôring med en diett som inneholder 0,1% DDC; bildet viser avrundede HNF4α+ hepatocyttkjerner ("H") og utvidelse av HNF4α- NPCer i områder rundt portalvenen ("PV"). (B) Eksempler på optimal ("riktig") og suboptimal ("feil") kjernefysisk Hoechst flekker som indikerer dårlig fiksering. (C) Bruk av høy gjennomstrømning bildeanalyse plattform for å segregere hepatocytter og NPCer i henhold til kjernefysisk Hoechst farging og HNF4α immunmerking. Programvaremasker (røde/grønne linjer) viser hvordan kjerner er riktig segmentert i henhold til Hoechst fluorescens og sortert i hepatocytter (+) eller NPCer (-) i henhold til HNF4α-status. (D) En veiledning for optimalisering av oppsettet for segmentering/terskelanalyse. Overliggende kjernefysiske masker anerkjent av programvaren er angitt av grønne / blå linjer for kjernefysisk segmentering og grønn / blå (HNF4α +) eller rød / blå (HNF4α-) for terskelanalyse (H = hepatocytter). Feilsøking: Kjernefysisk deteksjonsfølsomhet satt for lavt (i) eller for høyt (ii). Terskel for HNF4α satt for lavt (iii), eller for høyt (iv). - Jeg har ikke noe åsi. Kvantitativ analyse av NPC og hepatocyttkjerner under DDC-fôring: (E) HNF4α- og (F) HNF4α+ kjernefysiske tettheter sammenlignes mot tidspunktet for DDC-behandling (dager). Totalt 5,7 x 105 celler ble analysert, fra 4-6 dyr per tidspunkt. Data presenteres som gjennomsnittlig + SEM. **P < 0,01 og ***P < 0,001. Enveis ANOVA ble brukt til å sammenligne midler. Betydning P-verdier ble beregnet ved hjelp av Fishers minst signifikante differanse (LSD)-test. (G) Frekvensfordeling av HNF4α+ kjernefysisk område under DDC-behandling. Dataene viser et høyreskifte i hepatocytt kjernefysisk område under skade i samsvar med cellulær hypertrofi og polyplaitoisering. Totalt 2,5 x 105HNF4α+ kjerner ble analysert, fra 4-6 dyr per tidspunkt. Dette tallet er endret fra Manzano-Núñez et al.17. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Automatisert analyse av hepatocytt kjernefysisk ploidy ved hjelp av tilpasset skriftlig programvare. (A) Skjermbilde som viser riktig formatering av regnearkdata for inndata i kjernefysisk ploidy analyseprogramvare. Kolonner som inneholder viktige data (trinn 5.5 i protokollen) er uthevet gult. Alle kolonnetitler skal samsvare nøyaktig med de som er angitt. (B) Skjermbilde som viser hvordan individuelle regnearkfiler som inneholder data fra biologiske replikater ("Sample1", "Sample2", etc.) skal navngis og organiseres i undermapper for hver tilstand (med tittelen "Control-d0" og "Injured-d14" i dette eksemplet). (C) Skjermbilde etter vellykket installasjon av ploidy programmet (rød sirkel). Når programmet startes (ved å klikke på "Ploidy_Appl..") i MINE APPER-fanen i verktøyturen vises "Ploidy_GUI" (nedre panel). Eksperimentnavnet ("Eksempel") og baner til kontrollen (f.eks. "Kontroll-d0") og test (f.eks. "Skadet-d14") datasett angis før du klikker Kjør. Programvaren beregner, kalibrerer og stratifiserer kjernefysisk ploidy for alle prøver ved hjelp av datasettet "Control-d0" for å generere terskler for minimalt DNA-innhold. (D)Datautdata fra Ploidy_Application viser individuelle datafiler automatisk lagret i hver eksempelmappe (i) som inneholder absolutte og prosenttall av "enkle" kjerner i hver ploidy gruppe. For hver tilstand (i dette tilfellet både "Control-d0" og "Injured-d14"), genereres en sammendragsmappe også automatisk som inneholder gjennomsnittlige kjernefysiske ploidyestimater for alle "enkle" hepatocytt og ikke-hepatocyttkjerner (ii) og en oversikt over hvordan kjernefysisk ploidi er stratifisert for hver prøve (iii). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Bruk av NPCer som en intern ploidy kalibrator. (A) Graf som viser virkningen av DDC-skade på gjennomsnittlig minimalt DNA-innhold (m) av hepatocyt (HNF4α+) og NPC (HNF4α-) kjerner. Alle data normaliseres til dag 0 NPCer (n = 4 dyr per tidspunkt). (B) Histogrammet som beskriver fordelingen av NPCm-verdier i en enkelt representativ leverprøve (dag 0, totalt 7180 kjerner). Skjematisk (ovenfor) viser hvordan sirkulære NPC-masker kan komme fra celler med 2-4c DNA-innhold. Målet med kalibreringsmetoden er å definere stratifiseringsterskelen som representerer 4c (S4c) ved den øvre grensen for NPCm-fordelingen (stiplet linje), samtidig som støy minimeres på grunn av segmenteringsfeil på ytterpunktene i fordelingskurven. (C) Endringer i gjennomsnittlig Hoechst intensitet og kjernefysisk område for NPC (HNF4α-) kjerner er plottet. For å unngå segmenteringsfeil er bare de kjernene med en tilsvarende NPCm-verdi på innenfor 1 SD i modusen NPCm-verdien gransket (gul boks). Innenfor dette området beregnes og brukes 2c−4c-overgangsstørrelsen (t) som et ankerpunkt i dataene for å estimere S4c. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Høy gjennomstrømning i situ analyse av kjernefysisk ploidy i museleveren under kronisk DDC fôring. (A) Analyse av kontroll voksen lever ved hjelp av den beskrevne metodikken. HNF4α+ hepatocytkjerner fra 2D leverseksjoner er delt inn i henhold til Hoechst kjernefysisk sirkularitet i to grupper: "enkel" og "kompleks". (Øverst) Representativ fluorescens Hoechst bilder av celler som tilhører disse to gruppene er vist. (Venstre) Scatterplot som viser stratifisering av enkle HNF4α + kjerner fra en prøve (dag 0) i henhold til interpolert ploidy verdi, kjernefysisk område og gjennomsnittlig kjernefysisk Hoechst intensitet. (Høyre) Sektordiagram som beskriver den typiske nedbrytningen av HNF4α+ celler i kontrollleveren (dag 0) som indikerer proporsjonene til hver kjernefysisksokkelunderklasse. Totalt 6,7 x 104 HNF4α+ kjerner fra 4 dyr ble analysert. (B) Virkningen av DDC leverskade på hepatocytt kjernefysisk ploidy ved høy gjennomstrømning i situ analyse. Grafer viser den relative nedgangen i andelen 2c og 4c hepatocyttkjerner innen de første 14 dagene av DDC-fôring mens > 8c polyploidkjerner dramatisk øker i antall. Totalt 1,5 x 105 HNF4α+ kjerner ble analysert (n = 4 dyr per tidspunkt). Data presenteres som gjennomsnittlig + SEM. **P < 0,01 og ***P < 0,001. Enveis ANOVA ble brukt til å sammenligne midler. Signifikansp-verdier ble beregnet ved hjelp av Tukeys flere sammenligningstest. (C) Eksempel for å vise hvordan kjernefysiske ploidy underklasser kan romlig spores innenfor parenchyma ved hjelp av denne metoden, ved å forhøre høyinnhold bildedata med de samme kvantitative kriteriene som brukes for ploidy stratifisering (sirkularitet, kjernefysisk størrelse og gjennomsnittlig Hoechst intensitet). Hoechst fluorescens bilder er vist med programvare masker (røde prikker) merking 2c kjerner i leveren på to tidspunkter under kronisk DDC fôring (dag 14 og 21). Portalvene (blå stiplet linje) og periportalområder der NpCer utvider (gul linje) er angitt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Kritisk vurdering av NPC-kalibreringsmetoden. - Jeg har ikkenoe å si. Proliferating NPCer er vellykket kategorisert med en > 2c ploidy score. (A) Histogram av NPC minimalDNA-innhold fra kontroll lever immunmerket med antistoffer til HNF4α og proliferativ markør Ki-67 (n = 4, data presenteres som gjennomsnitt + SEM). Stratifiseringsterskler for 2c (S2c) og 4c (S4c)er angitt. (B) Stratifisering av NPCer i henhold til den beskrevne metodikken resulterer i en betydelig berikelse av Ki-67 immunmerking i kjerner tildelt en > 2c ploidy score (n = 12). Data presenteres som gjennomsnittlig + SEM. Unpaired t test ble brukt til å sammenligne midler ****P < 0.0001. (C) Ekstern validering av NPC-kalibreringsmetoden. Estimater av gjennomsnittlig hepatocytkjerne nukleær ploidy oppnådd ved hjelp av den interne NPC kalibratormetoden ble sammenlignet med de som ble oppnådd ved kalibrering av de samme prøvene (kontroll C57BL/6 muselever 3-4 måneder, n = 4) med et kjent kjernefysisk volum for 2N hepatocytter14. Data presenteres også fra to uavhengige analyser21,22 som beskriver hepatocytkjerne nukleær ploidy fra mus av samme belastning i alderen 2-6 måneder (vist til høyre for den stiplede linjen). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Hepatocytt kjernefysisk morfotri har et "komplekst" forhold til cellulær ploidi. (A) Sammendrag av hvordan hepatocytcellulær ploidi (2N, 4N, 8N og 16N) er delvis segregert av 2D-analyse av kjernefysisk morfotri. Toukleære celler (rød) er delt mellom "enkel" ("S") og "komplekse" ("C") morfometries avhengig av om kjerner ser ut til å være rørende eller ikke. - Jeg har ikke noe åsi. Individuelle hepatocytter ble manuelt valgt og analysert for kjernefysisk morfotri og internukleær avstand. (B) Toukleære hepatocytter med "rørende" kjerner var "komplekse" (100% ≤ 0,8), mens mononukleære celler (svart) og toukleukleære hepatocytter med ikke-rørende kjernefysiske masker var "enkle" (94% > 0,8). (C) "Enkle" kjerner av toukleære hepatocytter kan skilles fra de av mononukleære celler på grunn av betydelig redusert inter-nukleær avstand (n = 3, totalt 94 kjerner analysert). (D) Modell som nærmer seg hvordan cellulære ploidy tilstander fra panel A kan fordeles i form av 2D kjernefysisk morfoferi og kjernefysisk område som resulterer i klynger av enkle sirkulære former i fire faser (I-IV). (E) Sammenligning av HNF4α + kjernefysisk morfoferi/størrelse tomter i kontroll lever (dag 0) og etter 14 dager (venstre) og 21 dager (høyre) av DDC skade. Morphometry-fasene er angitt ovenfor (I-V). Piler indikerer endringer i kjernefysisk morfoftri som følge av skade som er i samsvar med toukleærisering av 2c ("a"), 4c ("b") og 8c ("c") kjerner, sammen med økt mononukleærisering av 16N cellulær ploidy klasse (d). Totalt 29-30 x 103 kjerner analysert per tilstand (n = 2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfiler: Demonstrasjonsdatasett. Vennligst klikk her for å se disse filene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En høy-innhold, høy gjennomstrømning tilnærming for analyse av vev remodeling og estimering av hepatocytkjerne nukleær ploidy i murine leveren er beskrevet. Når en kjent med prosedyren, kan en bruker behandle, bildeog analysere flere prøver i en 3-5 dagers periode, og generere store testbare datasett som gir en detaljert signatur av leverhelse. Gitt enkelheten i prøveforberedelsesmetoden, sammen med det store antallet celler og vevsområde analysert (i gjennomsnitt 14 mm2/ prøve), resultatene er robuste og svært reproduserbare. Automatisering av bildeopptak og analyse fjerner også brukerfeil og potensielle skjevheter fra disse viktige trinnene. En viktig innovasjon er bruken av NPCer som en intern ploidy kalibrator som muliggjør relativ vurdering av hepatocytt kjernefysisk DNA-innhold både innenfor og mellom prøver. Inkorporering av et HNF4α merkingstrinn er derfor nøkkelen til å gi denne protokollen en unik teknisk fordel sammenlignet med tidligere publiserte 2D-metoder3,,12,22. Derimot gjør den relative enkelheten i metodikken sammenlignet med 3D-rekonstruksjonsarbeidsflyter18 det teknisk mindre arbeidskrevende og potensielt mer fleksibelt.

Sammenlignet med presisjonsmetoden for flytcytometri, en viktig påminnelse til ekstrapolering av kjernefysisk DNA-innhold fra 2D-vevsseksjoner, er den begrensede tilliten som kan tilskrives kategorisering av individuelle kjerner med hensyn til ploidy status. Lagt til dette er den iboende skjevhet en SIA basert tilnærminger til overrepresentere mindre ploidy undergrupper på grunn av subekvatorial prøvetaking. Men ved å normalisere data til en intern standard og ta en stor befolkningsbasert tilnærming, reduseres feilen på grunn av disse effektene og kan sammenlignes på tvers av prøver. Hepatocytter er preget av en svært avrundet kjernefysisk morfologi, sammenlignet med for eksempel NPCer, noe som betyr at de er spesielt mottagelige for nøyaktig estimering av DNA-innhold basert på kjernefysisk tverrsnittsområde alene10,11,14,15,23. Den SIA-baserte tilnærmingen er raffinert i denne protokollen for å redegjøre både for kjernefysisk sirkularitet og DNA-tetthet ved å integrere tiltak for morfoometri og gjennomsnittlig hoechst fluorescensintensitet som resulterer i en estimert "minimalDNA-innhold" beskrivelse for individuelle kjerner. Viktigere, bruk av NPCer som en 2-4N ploidy kontroll gir en viktig intern standard for objektiv kalibrering og stratifisering av minimalkjernefysisk DNA-innhold, noe som gjør metodikken beskrevet som gjelder for prøver av alle arter, eller format, gitt at et passende antistoff for HNF4α (eller lignende hepatocytt kjernefysisk markør) kan hentes.

Selv om vurdering av kjernefysisk ploidy har vist seg å gi nyttige signaturer for leversykdomprogresjon10,13, for å fullt ut fastslå mangfoldet av ploidy endringer i leveren ville det være både ønskelig og nødvendig å tilpasse den beskrevne metodikken for å ta hensyn til hepatocellulær omkrets og dermed cellulær ploidy. Kartlegging av cellulær ploidy har tidligere blitt oppnådd ved merking av hepatocyttomkretsen ved hjelp av markører som beta catenin10,13,24, actin12,22 og cytokeratin10,11 i menneskelige og mus leverprøver. Men da dette ble testet etter DDC-skade, utelukket dramatisk epitelombygging pålitelig vurdering av hepatocellulær omkrets både ved phalloidin (data som ikke er vist) eller antistoffer mot betacatenin17. Derfor, mens denne tilnærmingen er mulig, det kan ikke være aktuelt for alle skademodeller, men hvis oppnådd ville fremme kartlegging av cellulær plaide samt gjøre estimater av hepatocytt størrelse og nummer mer nøyaktig. Det er også sannsynlig at ved å ta hensyn til ytterligere kjernefysiske parametere, for eksempel internukleær avstand (Figur 7C),kan mononukleære celler diskrimineres fra "enkle" biukleære hepatocytter, og at ytterligere segregering av "komplekse" tonukleære celler kan oppnås ved radiale målinger av kjernene som deres 2D masker inneholder.

Gitt at validerte menneskelige HNF4α antistoffer eksisterer for FFPE vev25 og at intern kalibrering frigjør denne metodikken av eventuelle artsspesifikke begrensninger, er protokollen nesten umiddelbart anvendelig for menneskelige prøver. Dermed har det betydelig potensial til å gi en benchmark for høy gjennomstrømning analyse av hepatocytt kjernefysisk ploidy og leverskade i menneskelig sykdom. Også, ved multiplexing med andre antistoffer, denne metoden kan avsløre nye roller for spesielle hepatocytt undersett og deres respons på leverskade og sykdom. For dette formål har vi med hell kombinert metodikken med immunfarging for den proliferative kjernefysiske markøren Ki-67 (Figur 6), som gjør det mulig å hente nyttig informasjon - inkludert identifisering av ikke-sprekende 2N-populasjoner av NPCer for forbedret intern kalibrering av ploidi (Noon, upubliserte data 2019). Derfor, ved å koble fleksibilitet med de posisjonelle og kvantitative dataene som metoden gir, foreslår vi at fremtidige applikasjoner vil forbedre forståelsen av polyploidiens rolle i leveren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av den spanske MINECO regjeringen gir BFU2014-58686-P (LAN) og SAF-2017-84708-R (DJB). LAN ble støttet av en nasjonal MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 og Plan GenT award (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), og FMN av en regional ValI + D studentship av Valencian Generalitat ACIF/2016/020. RP vil gjerne anerkjenne prof. Ewa K. Paluch for finansiering. Vi takker Dr. Alicia Martínez-Romero (CIPF Cytometry service) for hjelp med IN Cell Analyzer-plattformen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) TestDiet 1810704 Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) Invitrogen A11055 Dilution 1:500
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cryostat Leica CM1850 UV Leica biosystems CM1850 UV Tissue sectioning
Fluorescent Mounting medium Dako S3023
GraphPad Prism GraphPad Software Prism 8 Statistical software for graphing data
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Final concentration 5 µg/mL
IN Cell Analyzer 1000 GE Healthcare Bio-Sciences Corp High-Content Cellular Imaging and Analysis System
MATLAB MathWorks R2019a Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy
Microscope coverslides VWR International 630-2864 Size of 24 x 60 mm
Microsoft Office Excel Microsoft Speadsheet software
OCT Tissue Tek Pascual y Furió 4583
Paraformaldehyde Panreac AppliChem 141451.121
Pen for immunostaining Sigma-Aldrich Z377821-1EA 5mm tip width
Polysine Microscope Slides VWR International 631-0107
Rabbit polyclonal Anti-HNF4α Thermo Fisher Scientific PA5-79380 Dilution 1:250 (alternative)
Rabit polyclonal Anti-HNF4α Santa Cruz Biotechnology sc-6556 Dilution 1:200 (antibody used in the study)
Tween 20 Sigma-Aldrich P5927

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
  2. Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
  3. Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide? Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
  4. Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
  5. Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
  6. Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
  7. Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
  8. Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
  9. Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
  10. Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
  11. Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
  12. Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
  13. Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
  14. Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
  15. Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  16. Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
  17. Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
  18. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
  19. Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
  20. Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
  21. Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
  22. Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
  23. Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
  24. Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
  25. Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).

Tags

Medisin Utgave 158 lever polyploid hepatocytt høyinnholdsavbildning hepatologi hepatocytkjernekjernefaktor 4 alfa (HNF4α)
En høy-gjennomstrømning i Situ metode for estimering av hepatocytt kjernefysisk ploidy i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manzano-Núñez, F., Peters, … More

Manzano-Núñez, F., Peters, R., Burks, D. J., Noon, L. A. A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice. J. Vis. Exp. (158), e60095, doi:10.3791/60095 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter