Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Высокой пропускной способ в Ситу Метод оценки гепатоцитов ядерной плоиди у мышей

Published: April 19, 2020 doi: 10.3791/60095
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1,3
1Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)

Summary

Мы представляем надежный, экономичный и гибкий метод измерения изменений в количестве гепатоцитов и ядерной флоиди в фиксированных/криоконсервированных образцах тканей, которые не требуют цитометрии потока. Наш подход обеспечивает мощную выборку всей подписи цитологии печени идеально подходит для отслеживания прогрессирования травмы печени и болезни.

Abstract

Когда печень повреждена, число гепатоцитов уменьшается, в то время как размер клеток, ядерный размер и ploidy увеличиваются. Расширение непаренхимальных клеток, таких как холангиоциты, миофибробласты, прародители и воспалительные клетки, также указывает на хроническое повреждение печени, ремоделирование тканей и прогрессирование болезни. В этом протоколе мы описываем простой высокопроизводительный подход к расчету изменений в клеточеском составе печени, связанных с травмами, хроническими заболеваниями и раком. Мы показываем, как информация, извлеченная из двухмерных (2D) разделов ткани может быть использована для количественной оценки и калибровки гепатоцитов ядерной ploidy в образце и позволяют пользователю найти конкретные подмножества ploidy в печени на месте. Наш метод требует доступа к фиксированной/ замороженной печени материал, основные иммуноцитохимии реагентов и любой стандартной высокой содержаниеизображения платформы. Он служит мощной альтернативой стандартным методам цитометрии потока, которые требуют нарушения свежесобранных тканей, потери пространственной информации и потенциальной предвзятости дезагрегирования.

Introduction

Гепатоциты в печени млекопитающих могут пройти застопорился цитокинез для производства двухядерных клеток, и ДНК эндорепликации для производства полиплоидных ядер, содержащих до 16N содержание ДНК. Общее количество клеточных и ядерных ploidy увеличивается во время послеродового развития, старения и в ответ на различные клеточные стрессы1. Процесс полиплоидизации динамичный иобратимый 2,хотя его точная биологическая функция остаетсянеясной 3. Повышенная ploidy связана с уменьшенной пролиферативной емкостью4,генетическим разнообразием2,адаптацией к хронической травме5 и защитой от рака6. Гепатоцит ploidy изменения происходят в результате изменения циркадного ритма7, и отляги8. Наиболее примечательно, ploidy профиль печени изменяется травмы и болезни9, и убедительные доказательства свидетельствуют о том, что конкретные изменения ploidy, такие как увеличение 8N ядер или потери 2N гепатоцитов, обеспечивают полезные подписи для отслеживания безалкогольных жировых заболеваний печени (NAFLD) прогрессии3,10, или дифференциального воздействия вирусных инфекций11.

В общих чертах, повреждение печени и регенерации связаны с увеличением размера клеток гепатоцитов и ядерной области12, вместе с сокращением общего числа гепатоцитов, особенно те, с содержанием ДНК 2N10,11. Паранхимальная травма печени также часто сопровождается расширением непаранхимальных клеток (НПК), включая стромальные миофибробласты, воспалительные клетки и бипотентные клетки-прародители печени. Высокопроизводительные методы, которые обеспечивают количественный цитологический профиль parenchymal номер клетки и ядерной ploidy, в то время как также учета изменений в NPCs, поэтому имеют значительный потенциал в качестве научных исследований и клинических инструментов для отслеживания реакции печени во время травмы и болезни. Принуждение последние на месте анализ ploidy спектра в человеческих образцах гепатоцеллюлярной карциномы также показывают, что ядерная плоида резко увеличивается в опухолях и специально усиливается в более агрессивных подтипов опухоли с уменьшенной дифференциацией и потерей TP5313. Таким образом, существует высокая вероятность того, что методологические достижения в количественной оценке ядерной плоиди помогут в будущем прогностическом профилировании рака печени.

В этом протоколе описана гибкая методика высокой пропускной связи для сравнительного анализа секций тканей печени мыши, которая обеспечивает детальное цитометрическое профилирование числа гепатоцитов, ответ NPC и внутренне откалиброванный метод оценки ядерной флоидии(рисунок 1). Гепатоциты отличаются от НПК иммуномаркировкой гепатоцитов 4 альфа (HNF4) до характеристики ядерного размера и ядерной морфометрии. "Минимальное содержание ДНК" оценивается для всех круговых ядерных масок путем интеграции средней интенсивности Hoechst 33342 (прокси для плотности ДНК) с интерполированным трехмерным (3D) ядерным объемом. Гепатоцитминимальное содержание ДНК затем откалибровано с помощью NPC для создания ядерного профиля ploidy.

Приобретение изображений, ядерная сегментация и анализ изображений выполняются с использованием изображений с высоким содержанием, что позволяет обсуливать большие участки двумерных (2D) секций печени, содержащих десятки тысяч клеток. Предусмотрена специально написанная программа для автоматической пост-обработки данных анализа изображений высокого содержания для получения профиля флоиди для всех круговых ядер гепатоцитов. Это выполняется с помощью бесплатного скачать программное обеспечение для расчета ядерной ploidy на основе стерилологического анализа изображений (SIA)10,11,14,15. Методология SIA была ранее подтверждена цитометрией потока как точный, хотя и трудоемкий, метод для оценки гепатоцитов ядерной флоиди и в печени14, предполагая круговую ядерную морфологию и монотоническую связь между ядерным размером и содержанием ДНК. В этом протоколе оба ядерных параметра измеряются путем оценки ядерной морфометрии и маркировки Hoechst 33342. Расчет «минимального содержания ДНК» для каждой ядерной маски сопровождается калибровкой гепатоцитной ядерной флоиды с использованием NPC, которые имеют известное содержание ДНК 2х4N и поэтому служат полезным внутренним контролем.

По сравнению с обычными методами цитометрии потока16 описанный подход позволяет оценивать ядерную флуиду гепатоцитов на месте и не требует доступа к свежим тканям или методам дезагрегирования, которые могут предусмотреть результаты и быть трудно стандартизированными. Как и во всех подходах, основанных на SIA, подклассы ядерных ploidy sgt;2N недопредставлены 2D-выборкой из-за секции больших ядер за пределами экваториальной плоскости. Профиль флоиди по всей ткани также описывает минимальное содержание ДНК для всех круглых гепатоцитов ядерных масок и не проводит прямой различать моноядерные гепатоциты и двухядерные клетки, которые имеют два дискретных ("не прикосновения") ядра одной и той же флоиди. Однако простота этого протокола позволяет адаптировать его к дополнительным параметрам, таким как межядерное расстояние или анализ периметра ячейки, что облегчит идентификацию двухядерных ячеек, обеспечивающих более детальную оценку клеточной плоиды.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных были ранее одобрены комитетом по этике CIPF. Мыши были размещены в центре, свободном от патогенов, в Центре по борьбе с патогенами Пренсипе Фелипе (Валенсия, Испания), зарегистрированных в качестве экспериментального животновода, пользователя и центра снабжения (reg. No. ES 46 250 0001 002) в соответствии с действующими европейскими и испанскими правилами защиты животных (RD 53/2013).

1. Сбор тканей и подготовка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает, как заморозить ткани без предварительной фиксации или криоконсервации. Для ранее фиксированных/криоконсервированных образцов переходят в раздел 2 и опускают шаг 3.1. Все анализы проводились с использованием взрослых самок C57BL/6 мышей в возрасте 12–16 недель.

  1. Пожертвование животных фентанил / пентобарбитальной интраперитонеальной инъекции с последующим вывихом шейки матки. С мышью, обращенной к вентральной стороне вверх, откройте брюшную полость и разоблачить печень, схватив кожу пинцетом и выполняя вертикальный разрез от основания нижней части живота до основания грудины с помощью хирургических ножниц.
  2. Аккуратно удалите желчный пузырь с помощью тонкого пинцета, вскрыть печень и промыть выбранную печень lobule в 10 см Петри блюдо пластины заполнены фосфат-буфера соливого (PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сравнить одну и ту же доли печени для каждого животного, в этом случае была использована средняя доли.
  3. Заполните помеченный криомольд с оптимальной температурой резки (OCT) среды при комнатной температуре (RT). Избегайте пузырьков OCT. Если они появляются, нажмите их на край формы с помощью иглы или пипетки отзыв.
  4. Вложить печень lobule в заполненные OCT криомолд и сразу же поместите его на сухой лед, чтобы обеспечить быстрое замораживание. Храните криомольды при -80 градусов по Цельсию до криосекции.

2. Криосекция

  1. Транспорт криомолды на сухом льду, чтобы избежать деградации тканей. Перед криосекцией уравновешивать внутри криостата установить до -20 градусов по Цельсию в течение 20 мин.
  2. Извивайте образец, применяя давление на основание пластикового криомолда. Нанесите жидкий OCT на теплый образец диска на RT, положение в криостате и приложите OCT встроенный образец печени. Применить мягкое давление и ждать 3 мин для OCT заморозить обеспечения образца прилипает к диску.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте обработки образца пальцами как можно больше, чтобы избежать деградации тканей.
  3. Заблокируйте образец в руку криостата и отрегулируйте ориентацию так, чтобы край образца был параллельным лезвию криостата. Вырезать в образец, пока ткань не будет достигнута.
  4. Разделите образец толщиной 6 мкм. Поместите помеченные полиамид покрытием слайд над образцом в течение 5 с, чтобы образец придерживаться на слайде. Поместите слайд на RT в течение 3-5 минут, затем, для достижения наилучших результатов, перейдите непосредственно к разделу 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки нескольких свежезамороженных образцов воспроизводимые результаты были получены путем временного хранения слайдов в слайд-бокснах на сухом льду до тех пор, пока все образцы не будут обработаны. При использовании этого подхода позволяют всем слайдам уравновесить RT, прежде чем перейти к разделу 3. Формалин фиксированной парафина встроенных (FFPE) образцы могут быть использованы, хотя фон овефлуоресценции увеличивается с помощью этого метода. Чтобы исходить из образцов FFPE, раздел на 4 мкм. Гора, ловя разделы от 40 градусов по Цельсию водяной ванны на полиамид-обработанных горках. Тепло слайдов для 1 ч при температуре 60 градусов по Цельсию, затем deparaffinize серийным RT washes (5 мин) в Коплин банки, содержащие ксилен (x2), этанол 100% (x2), 96% (x2), 70% (x1) и dH2O (x1). Чтобы разоблачить антигены место слайды в цитрат буфера в течение 20 минут при температуре 90 градусов по Цельсию до закалки слайдов в PBS на RT. Приступить к шагу 3.2.

3. Иммуномаркировка флуоресценции

  1. Исправить секции тканей в дым капот, применяя 1 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS в течение 10 минут на RT. Передача слайдов на PBS заполнены Coplin банку и мыть в течение 3 минут с использованием нежного возбуждения (повторить 3x).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отныне и до конца процесса иммуностоинга, избегайте высыхания образца.
  2. Высушите область вокруг каждой секции ткани и окружите с помощью гидрофобной ручки. Пермяки с 0,5% неионический сурфактант (т.е. Тритон X-100) в PBS в течение 15 минут на RT. Затем промыть в PBS заполнены Коплин банку в течение 3 минут с помощью нежного возбуждения (повторить 2x).
  3. Блок с помощью фильтрованного раствора 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 5% лошадиной сыворотки, 0,2% неионического сурфактанта в PBS (не менее 1 ч на RT).
  4. Инкубировать с первичными HNF4 'антитела разбавленной в блокирующем буфере в течение ночи при 4 градусах по Цельсию в темной влажной камере окрашивания (см. Таблица материалов для антител и специфических разбавлений).
  5. Место слайды в PBS заполнены Coplin банку и мыть в течение 3 минут с помощью нежного возбуждения (повторить 4x).
  6. Инкубировать с Alexa-488 конъюгированных вторичных антител и Hoechst разбавленной в фильтрованных 1% BSA и 0,2% нонионических сурфактант ов 2 ч на RT в темной влажной камере окрашивания (см. Таблица материалов для антител и конкретных разбавлений).
  7. Место слайды в PBS заполнены Coplin банку и мыть в течение 3 минут с помощью нежного возбуждения (повторить 4x). Вымойте в ddH2O в течение 3 мин с помощью нежного возбуждения (повторить 2x).
  8. Маунт слайды, поместив две капли флуоресцентных монтажных носителей на крышку (24 х 60 мм) и прокладка слайдов над ним, устраняя пузырьки, применяя мягкое давление. Для длительного хранения, печать coverslip по краям с четким лаком для ногтей и хранить в темноте при 4 градусах Цельсия.
  9. Перед началом работы проверьте слайды с помощью обычного флуоресцентного микроскопа, чтобы обеспечить хорошую фиксацию и иммуномаркировку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См Рисунок 2A,B для ожидаемых результатов.

4. Приобретение изображения флуоресценции

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага требуется платформа высококонтентных изображений(Таблица материалов),которая поддерживает автоматическое приобретение изображения флуоресценции.

  1. Включите систему визуализации и откройте новый протокол приобретения.
  2. Выберите 10-разную цель, обратите внимание на область поля зрения (в данном случае 0,6 мм2).
  3. Установить параметры для получения флуоресценции изображения с использованием соответствующих фильтров возбуждения и выбросов (в соответствии с шагом 3.6). Для Hoechst и Alexa-488 выберите каналы "DAPI" и "GFP" с 390/18 и 438/24 нм и 432,5/48 и 475/24 нм соответственно.
  4. Сосредоточьте образец и убедитесь, что интенсивность сигнала не насыщена. Убедитесь, что захват изображения осуществляется с одинаковым временем экспозиции для всех изображений или использовать систему, где интенсивность флуоресценции корректируется для времени экспозиции.
  5. Сканирование образца и получить достаточно евких изображений для получения полного покрытия ткани разделе (приблизительно 20-50 полей зрения, в зависимости от размера выборки).
  6. Просмотрите базу данных изображений, вручную устраняя (i) плохо сфокусированные поля, (ii) те, на границах каждого раздела ткани (чтобы избежать смещения расчетов плотности клеток), и (iii) те, которые содержат сложенные/физически поврежденные участки ткани, если они присутствуют.

5. Автоматизированный анализ флуоресценции изображения

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг требует соответствующего программного обеспечения для анализа изображений(Таблица материалов),способных: (1) автоматически идентифицировать ядра Hoechst в пределах изображений на уровне 405 нм (ядерная сегментация), (2) оценка средней ядерной интенсивности и морфометрии, и (3) анализ порога для определения состояния ядерной флуоресценции на уровне 488 нм (HNF4). Некоторые основные подготовки оператора / экспертизы требуется для визуальной оценки и корректировки сегментации и пороговых параметров в рамках программы, чтобы обеспечить оптимальное состояние ядер и HNF4 "/- статус оптимально закрытой(рисунок 2).

  1. В программном обеспечении для анализа изображений откройте файл приобретения, содержащий изображения Hoechst (405 нм) и HNF4 (488 нм) со ступени 4.5, и создайте новый протокол анализа.
  2. Определите длины волн, которые будут использоваться для ядерной сегментации (Hoechst, 405 нм) и для анализа пороговых значений гепатоцитов/NPC (HNF4, 488 нм).
  3. Отрегулируйте параметры ядерной сегментации программного обеспечения (такие как "минимальная ядерная область" и "чувствительность к обнаружению ядерного оружия"), чтобы обеспечить оптимальную сегрегацию ядер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая сегментация гепатоцитов должна быть приоритетной по сравнению с NPC. Ядра гепатоцитов характерно округлены (диапазон размеров межкварти: 40-64 мкм2). NPC ядра, такие, как синусоидальные эндетели, сплющены / эллиптические или нерегулярные формы и, как правило, меньше и более тесно упакованы, чем у гепатоцитов (диапазон размеров межквартилы: 30-43 мкм2). Для печени мыши использовалась минимальная ядерная область 23 мкм2 и «чувствительность» обнаружения 65% (см. рисунок 2C,D для ожидаемых результатов). Чувствительность определяет, как пиксельные кластеры распознаются как отдельные ядра на основе их интенсивности и должны быть эмпирически протестированы для каждого образца, установленного пользователем, прежде чем приступить к автоматическому анализу изображений.
  4. Измените пороговую интенсивность на уровне 488 нм, чтобы обеспечить оптимальное gating гепатоцитов (HNF4) и непархимальных клеток (HNF4'-).
    ПРИМЕЧАНИЕ: См Рисунок 2C,D для ожидаемых результатов. Значение интенсивности порога является относительным и будет зависеть от эффективности окрашивания и параметров приобретения, таких как интенсивность лазера. Поэтому он должен быть стандартизирован пользователем. Используйте известные HNF4 -клетки, такие как эндотелиальные клетки и перипортальные NpCs в качестве внутреннего отрицательного контроля и двухядерных ядер гепатоцитов в качестве положительной ссылки на окрашивание. Проверьте параметры анализа с использованием небольшого количества изображений, чтобы обеспечить хорошую ядерную сегментацию и сегрегацию порога интенсивности перед применением параметров анализа ко всему набору данных.
  5. Выберите следующие ядерные параметры, которые будут количественно: (1) ядерная область, основанная на окрашивании Hoechst (мкм2),(2) означает ядерная интенсивность Hoechst (RU), (3) ядерный коэффициент удлинения (среднее отношение короткой оси ядра к длинной оси ядра, в тех случаях, когда центросимметричный «неудлиненный» объект имеет значение 1, (4) Nuc 1/(форм-фактор), означает ядерный индекс «округлие», рассчитанный по периметру 2/(4'x области). Значения варьируются от 1 до бесконечности, где 1 является идеальным кругом, (5) статус HNF4 "(положительный-1 или отрицательный-0), и (6) ядерных x/y координаты на основе "центр тяжести" (cg), метод для определения центра объекта из серого масштаба изображения с субпиксельной точностью.
  6. Выполнить анализ для всех наборов выборок и экспортных численных данных от шага 5.5 до программного обеспечения для электронных таблиц.

6. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг анализа данных может быть выполнен с помощью любого стандартного программного обеспечения электронной таблицы.

  1. Рассчитайте гепатоциты и номера клеток, не являевась гепатоцитами.
    1. Рассчитайте общую площадь раздела печени, проанализированное для каждого образца, умножая количество полей зрения по области поля зрения (шаг 4.2).
    2. Работая с файлами электронной таблицы, созданными для каждого раздела печени, отфильтруйте данные, выбрав только ядра HNF4. Рассчитайте общее количество проанализированных ядер HNF4 и разделите это по общей площади, проанализированному для получения средней плотности гепатоцитов для каждого образца(рисунок 2F).
    3. Выполните тот же расчет для не-паранхимальных клеток, фильтруя электронную таблицу для клеток HNF4 " (Рисунок 2E).
  2. Рассчитайте распределение ядерных размеров гепатоцитов.
    1. Используя программное обеспечение для электронных таблиц, фильтруйте данные, чтобы выбрать только ядра HNF4.
    2. Участок значения ядерной области в гистограмме(Рисунок 2G). Установите ширину бендов до 5 мкм2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения частоты могут быть скорректированы для области (ядра/мм2)в каждом шаге 6.1.1.
  3. Выполните гепатоцитный ядерный анализ ploidy.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные электронной таблицы с шага 5.6 используются для создания профиля ядерной ploidy для каждого образца. Этот процесс был автоматизирован и может быть выполнен с помощью пользовательского письменного программного обеспечения, которое свободно доступно для загрузки с вспомогательной информацией и демонстрационными наборами данных вhttps://github.com/lukeynoon(см.Дополнительные файлы). Исходный код предоставляется пользователям, желающим адаптировать методологию. Ниже описано описание алгоритма, а также инструкции по установке и использованию. Программа использует данные электронных таблиц для автоматического разделения ядер гепатоцитов на две группы; (1) те, с "простыми" круговыми ядрами и (2) "сложными" некруглыми ядрами, репрезентативными двухядерных клеток с плоейдию 2с. Минимальное содержание ядерной ДНК (функция ядерной области и плотность ДНК) затем рассчитывается для всех "простых" ядер. Последующий шаг затем автоматически калибрует HNF4 "гепатоцитов ядерной ploidy с помощью HNF4 "-ядра, как известный 2'4N внутреннего контроля.
    1. Скачать и установить программное обеспечение.
      1. Скачать упакованное приложение от: https://github.com/lukeynoon
      2. Запуск MATLAB. Перейдите на вкладку APP toolstrip, нажмите Установить приложение и открыть загруженное приложение под"Ploidy_Application.mlappinstall". Появится сообщение, подтверждая успешную установку.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Приложение теперь готово к использованию и останется во вкладке APP toolstrip.
    2. Данные ввода формата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: До автоматизированного анализа ядерной ploidy, все файлы электронной таблицы, содержащие данные высокой визуализации контента (шаг 5.6) должны храниться и отформатироваться в соответствии со следующими инструкциями.
      1. В каждом экспортируемом файле данных (. XLS 97-2004 трудовая книжка) от шага 5.6, включите лист термин «измерения клетки» содержа все данные необходимые для анализа ploidy установленных в столбцах(рисунок 3A). Убедитесь, что макет таблицы, включая имена заголовков столбцов, остается неизменным по сравнению с рисунком 3A,поскольку метод анализа находит правильные данные столбца, ища эти имена (см. наборы демонстрационных данных в дополнительных файлах для справки). Если, например, программное обеспечение для анализа изображений с высоким содержанием контента не производит столбец "Light flux"(рисунок 3A),вручную вставьте столбец "Light flux" в том же месте, т.е. столбец K и заполните его нулями.
      2. Для каждого экспериментального состояния (например, "Injured-d14") предусмотрен контрольный набор данных, который будет использоваться для расчета внутреннего контроля для калибровки ядерной флоидной 2'4N (шаг 6.3.4.3). Здесь выберите образцы печени из необработанных взрослых littermates ("Контроль-d0"; Рисунок 3БКД).
      3. Для биологических репликаций (в каждом состоянии) храните каждую электронную таблицу в своей папке (как на рисунке 3B). Назовите префиксы папки постепенно, например, "Sample1, Sample2, Sample3... SampleN", согласно именам файлов, содержащимся внутри. Таким образом, каждая папка набора данных (например, "Control-d0") должна содержать ряд субфолок ("Sample1", "Sample2" и т.д.), каждый из которых содержит файл электронной таблицы с одинаковым соответствующим именем.
    3. Запустите приложение.
      1. В MATLAB, запустить "Ploidy_Application", нажав на значок в вкладке MY APPS toolstrip (Рисунок 3C). Появится Ploidy_Application графический пользовательский интерфейс (GUI)(рисунок 3C).
      2. Нажмите кнопку «Путь» для управления данными, чтобы перейти к папке, в которой находятся репатриды данных управления (например, «Control-d0»). Этот путь данных будет отображаться в интерфейсе (например, /Пользователи/Настольная/Контрольная группа).
      3. Далее, в типе "папка префикса" имя, которое будет дано выходным файлам (например, "Образец").
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эта приставка может быть изменена на любой текст, при условии, что папки и имена файлов остаются постепенно названными.
      4. Нажмите кнопку «Путь» и перейдите к папке, в которой находятся сравнительные репликации данных (например, «Поврежденный-d14»). Этот путь данных будет отображаться в интерфейсе (например, /Пользователи/Настольная группа/Поврежденный-d14).
      5. Нажмите Run!. Когда анализ будет завершен, в баре статуса будет написано "Анализ завершен!..".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Приложение будет сообщать, для каждого образца, стратификации "простых" ядер в 2n, 2n-4n, 4n'8n и 8n " с точки зрения абсолютных подсчетов и в процентах от общего числа (Рисунок 3D). Эти файлы будут автоматически сохранены в каждой папке образца:"Count_2n.txt","Count_2n_to_4n.txt", "Count_4n_to_8n.txt", "Count_8n_and_higher.txt", "Percentage_2n.txt", "Percentage_2nto4n.txt", "Percentage_4nto8n.txt", "Percentage_8n_and_higher.txt". Ploidy_Application автоматически сохранит список для каждого образца, из всех индивидуальных оценок ploidy для "простых" гепатоцитов и негепатоцитов ядер в "Ploidy_All_Hepatocytes.txt" и "Ploidy_NonHepatocytes.txt". Для набора данных управления метод также сохраняет минимальные пороги содержания ДНК, рассчитанные для расслоения ploidy (см. шаг 6.3.4.3.7) в файле под названием "Normalised_Thresholds_Control". Наконец, приложение будет производить папку как для управления, так и для выбранных данных сравнительного состояния под «Summary». Эта папка содержит два субфалеры, "Ploidy" и "Стратификация", которые содержат средние показатели всех предоставленных образцов(рисунок 3D).
    4. Описание методологии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем разделе подробно описывается методология, используемая программным обеспечением для анализа ядерной плоиди. Если пользователь решит не использовать приложение, эти шаги могут быть продолжены с помощью программного обеспечения электронной таблицы для расчета профиля ядерной ploidy вручную.
      1. Отделите ядра на «простые» или «сложные» в соответствии с ядерной морфометрией.
        1. Рассчитайте "индекс круговорота" для всех ядер, определяемый как ядерный "коэффициент удлинения", разделенный на "Nuc 1/(форм-фактор)", где значение 1.0 указывает на идеальный круг.
          ПРИМЕЧАНИЕ: "Ядерное удлинение" и "Nuc 1/(форм-фактор)" являются двумя дискретными мерами "круговости" объекта, которые оценивают взаимодополняющие, неперекрывающиеся морфометрические критерии. Первый измеряет длинные и короткие оси объекта, в то время как второй сравнивает длину периметра объекта с длиной его области. Для укрепления определения ядерной круговорота, используемого в данном протоколе, эти два измерения были объединены в единый "индекс круговорота". Предыдущий подход к оценке ядерной ploidy с использованием описанной методологии используется только ядерное удлинение17. Хотя с помощью этого подхода были получены приемлемые результаты, авторы отметили, что составной "индекс круговорота" улучшает дискриминацию вручную отобранных ядер от моноядерных и двухядерных гепатоцитов (данные не показаны).
        2. Классифицировать ядра с индексом круговой связи 0,8 как "сложные", а те, которые "должны быть" 0,8, как "простые".
      2. Оцените "минимальное" содержание ДНК (м) для всех "простых" ядер.
        1. Рассчитайте ядерный радиус (r) с помощью формулы:
        2. Рассчитайте ядерный объем (v) с использованием объема формулы сферы:
        3. Создание относительного значения для минимального содержания ДНК (м) с помощью формулы:
      3. Откалибровать набор данных с помощью ядер NPC (HNF4-) в качестве внутреннего элемента управления 2х4N.
        ПРИМЕЧАНИЕ: NPCs имеют содержание ДНК 2'4N в зависимости от состояния клеточного цикла. Таким образом, среднее значение NPC "минимальное" содержание ДНК (NPCм) увеличивается с травмой(рисунок 4A). Ошибка калибровки сведена к минимуму путем установления верхнего предела NPCm, представляющего порог 4c(рисунок 4B).
        1. В таблице выберите только ядра NPC со значениями для "m", которые находятся в пределах 1 стандартного отклонения (SD) режима (это отфильтровывает шум от возможной ошибки сегментации).
        2. В пределах этого отфильтрованного диапазона, изучить ядерных областях и их соответствующих средних интенсивности Hoechst(Рисунок 4C).
        3. Оцените наименьшую ядерную область в пределах этого отфильтрованного диапазона с максимальной ядерной интенсивностью Hoechst (т.е. точкой, в которой линия кривой изменяет направление в фильтрованном наборе данных, как показано красным кругом на рисунке 4C). Это значение представляет собой переходное состояние 2N'4N (t), над которым выборка ядер 4c преобладает над ядрами 2c, что приводит к максиме средней интенсивности Hoechst.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Это значение автоматически определяется программным обеспечением; однако пользователи электронных таблиц могут вручную выбрать этот пункт в качестве переходного размера.
        4. Рассчитайте минимальное содержание ДНК, представленное этим переходным размером (тм),следующим шагом 6.3.4.2.
        5. Чтобы оценить 4N плечо набора данных NPCm, добавьте 1 SD к значению tm. В результате число (Рисунок 4B) описывает верхний предел NPC минимальное содержание ДНК, которые будут использоваться для расслоения ядерной ploidy (S4c).
        6. Повторите шаги 6.3.4.3.1-6.3.3.3.5 для всех «контрольных» образцов.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Например, на рисунке 3невредимые контрольные печени ("Control-d0") используются в качестве контрольного состояния.
        7. Рассчитайте средний порог стратификации 4c (S4c)для "контрольных" образцов и используйте это для экстраполировать 2c (S2c)и 8c (S8c)границы для минимального содержания ДНК (м). Пороги стратификации автоматически генерируются и сохраняются программным обеспечением (шаг 6.3.3.3).
          ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от конструкции исследования, средние значения порога стратификации могут быть рассчитаны для каждого состояния или для конкретных условий (например, здоровой контрольной печени). Тем не менее, программное обеспечение для анализа ядерной ploidy требует, чтобы один из набора из 2 файлов был обозначен как "контроль" для целей расчета относительных значений ploidy.
        8. Рассчитайте значение ploidy для всех ядер, используя значение S2c, генерируемое в шаге 6.3.4.3.7 в каждом:
        9. Стратить "простые" гепатоциты (HNF4) ядра в 2c/4c/8c/'gt;8c кронштейны в соответствии со следующими критериями: "2c" HNF4 " "4c" HNF4" No 2 "lt; р- 4; "8c" HNF4" No 4 "lt; р No 8; "Зgt;8c" HNF4" No 8
        10. Чтобы реконструировать пространственное узор подгрупп, разделите ядерные данные в каждой таблице выборки в соответствии с соответствующими полями, в которых они были приобретены. Затем используйте связанные ядерные x/y координаты (от шага 5.5) для создания подгрупп по сюжету в 2D(рисунок 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот метод был использован для измерения воздействия холестатической травмы на печень взрослой мыши, кормя животных в течение 0-21 дней с гепатотоксическим питанием, содержащим 0,1% 3,5-диэтитоксикарбонил-1,4-дигидроколлайдин (DDC)17. Хроническое кормление DDC приводит к гепатоцеллю травмы увеличение ploidy и перипорт расширения NPCs. Пользователь должен знать, что напряжение мыши и возрастные различия могут существовать в ядерной плоиди и что все анализы были выполнены с использованием взрослых самок C57BL/6 мышей в возрасте 12-16 недель.

После иммуномаркировки HNF4 (протокольный раздел 3) важно проверить все слайды с помощью обычной флуоресценции микроскопии, чтобы обеспечить хорошее качество фиксации и окрашивания(рисунок 2A). Размазывание или размытие Hoechst может указывать на неадекватную фиксацию или деградацию образца до фиксации(рисунок 2B),и в этом случае вернуться к протоколу раздел 2 и сократить время между секцией и фиксацией (шаг 3.1). Успешная иммуномаркировка с антителами HNF4'а может быть легко оценена на данном этапе по явной дискриминации положительно обозначенных ядер гепатоцитов, как правило, более крупных и более округлых, чем у NPC (Рисунок 2A). Flattened / эллиптические эндотелиальные ядра в parenchyma, или плотные участки клеток, которые расширяются в перипортальных областях после травмы DDC может служить полезным визуальным ориентиром для выявления HNF4 -NPCs при оценке успеха / неудачи иммуносточинов.

Параметры порога ядерной сегрегации и HNF4 (шаги 5.2–5.4) должны быть тщательно оптимизированы до автоматического анализа изображений (шаг 5.6), чтобы широко отражать визуальный узор иммуностоинга, наблюдаемый обычной флуоресцентной микроскопией в конце протокольной секции 3(рисунок 2С). Примеры оптимальной против неоптимальной ядерной сегментации и пороговых протоколов HNF4 приведены в рисунке 2D. После анализа изображений (шаг 6.1.3), данные должны отражать увеличение числа NPCs в печени с травмой DDC(Рисунок 2E), от 52% и 2,0% ядер в контрольной печени до 72,8% и 1,4% после 21 дней лечения DDC. Гепатоциты составляют 48,0% и 2,0% от общего количества ядер в контрольной печени, согласующихся с предыдущими анализами гистологии печени, показывающими, что гепатоциты занимают 70-85% объема ткани, но только 45-50% от общего числа клеток печени18,19. Небольшое, но значительное сокращение количества ядер HNF4'а наблюдается в течение первых 14 дней кормления DDC(рисунок 2F). На участке распределения частот ы ядерной области гепатоцитов (шаг 6.2) показана пиковая ядерная область HNF4 в контрольной печени в диапазоне размеров 40–50 мкм2, а также четкий сдвиг правого размера ядерного размера после травмы DDC(рисунок 2G); в соответствии с повышенной флойди и гепатоцеллюлярной гипертрофии12.

В здоровой (день 0) контроль печени, 63,4% и 1,7% от HNF4 "ядра имеют "простой" круговой морфхометрии(рисунок 5A). Эта цифра уменьшается до 46,8% и 5,7% (P 0.042) после 21 дней травмы DDC, что отражает повышенную сложность в ядерной морфометрии предположительно связано с переходом между ploidy государств во время полиплоидизации (см. "Интерпретация ядерной морфометрии" ниже). Репрезентативные примеры распределения ядерных ploidy полученных с помощью этого метода в контрольных секциях печени показаны на рисунке 5A, который описывает, как интерполяция содержания ДНК позволяет стратификации отдельных клеток в рамках одного образца. Также показаны средние значения для подмножества "сложных" и "простых" ячеек HNF4(рисунок 5A). Данные согласуются с предыдущими оценками полиплоидии в 80-90% взрослых гепатоцитовморин 2. Частота сложных ядер (36,6% и 1,7%) в контрольной печени также приблизительна к двуклеарным клеткам (35%)20,хотя данные должны строго рассматриваться как мера ядерной, а не клеточной плоиды (см. "Интерпретация ядерной морфометрии" ниже). Сравнение относительной ploidy между контролем (день 0) и DDC обработанных групп должны отражать значительную потерю 2c и 4c гепатоцитов ядер с травмой вместе с увеличением числа клеток(рисунок 5B). Относительная позиционная информация для каждой подгруппы ploidy может быть допрошена рассеянием координат x-y, связанных с каждым ядром в наборе данных, или путем получения 2D-место отдельных подмножеств гепатоцитов в рамках программного обеспечения для анализа изображений высокого содержания(рисунок 5C).

Калибровки
Для оценки обоснованности используемого метода калибровки NPC была проведена двойная иммуномаркировка секций печени с использованием антител к HNF4 и пролиферативному маркеру Ki-67(рисунок 6A,B). Эти данные показали обогащение для Ki-67, который маркирует клетки во всех активных фазах клеточного цикла, на правой стороне nPC минимальной кривой распределения ДНК (между S2c и S4c)- где NPCs, как ожидается, будет репликации ДНК и, следовательно, имеют гт;2c ploidy (Рисунок 6A). После внутренней калибровки всех исследованных контрольных и поврежденных образцов печени, Ki-67, был значительно обогащен (P lt; 0.0001) в "простых" ядрах NPC с оценками ploidy из йgt;2c (82,5% и 6,6% SD, n no 12) по сравнению с теми, с 2c ploidy (17,5% SD, n 12) (Рисунок 6Bуспешной. Эти данные подтверждают достоверность используемого метода. Кроме того, предполагая точное пороговое значение Ki67, они дают некоторое количественное представление о том, в какой степени субэкваториальные ядерные маски из высших групп ploidy "загрязняют" группы ниже.

Для дальнейшей проверки обоснованности метода калибровки NPC был введен внешний калибратор на основе ранее сообщенного ядерного объема гепатоцитов мыши 2N (155,8 мкм3)14. Когда эта цифра была использована в сочетании со средним значением интенсивности Hoechst для HNF4a-ядра в результате оценки среднего гепатоцита ploidy в контрольной печени был неотличим от внутреннего (S2c) калибратора(Рисунок 6C). Кроме того, оценки среднего гепатоцита ploidy у мышей C57BL/6 мыши штамм сопоставимого возраста, были также похожи, подтверждающие, что до эмпирических знаний 2N гепатоцитов ядерного размера не требуется, что делает эту внутренне контролируемую методологию для оценки ядерной ploidy полностью автономной.

Интерпретация ядерной морподомы
Описанный метод обеспечивает считыватель гепатоцитов с "простым" круговой морфхометрией. Исключение "сложных" ядер основано на гипотезе, что они представляют собой долю двухядерных гепатоцитов с перекрывающимися/ касаясь ядерных масок, что делает точное определение ploidy для этого поднабора более сложным(Рисунок 7A). Важно отметить, что сегрегация ядер в соответствии с циркулярностью не позволяет пользователю различать ядра моноядерных гепатоцитов и ядра двухядерных клеток, в которых два ядра аналогичной ploidy четко разделены внутри клетки. Это было эмпирически протестировано путем ручного выбора двухядерных и моноядерных ячеек из наборов данных изображений и оценки их сегрегации по алгоритму(рисунок 7B). Ядра двуядерных гепатоцитов, которые были физически близки(рисунок 7C), но "не касаясь" были классифицированы алгоритмом как "простые", в то время как те, которые были "трогать" были явно дискриминированы как "сложные". Следовательно, этот анализ не обеспечивает считывание клеточной ploidy в печени, учитывая, что ядра двухядерных клеток подразделяются между "простыми" и "сложными" подклассами (см. Обсуждение). Тем не менее, некоторое понимание переключения между состояниями клеточной и ядерной ploidy могут быть получены из этих данных просто замышляя гистограммы ядерной морфометрии и ядерного размера и применения модели того, как "сложные" и "простые" состояния переходят между во время полиплоидизации (Рисунок 7D). В контрольной печени четко наблюдаются три фазы (I-III) ядерной морфометрии(рисунок 7E). Они представляют собой кластеризацию циркулярных 2N (I), 4N (II) и 8N (III) ядерных масок соответственно (как показано на рисунке 7D). Моноядерные 16N гепатоцитов крайне редки в печени взрослых мышей16,18,21, следовательно, 16N клеточной группы ploidy состоит почти полностью из двухядерных клеток с 8N ядер, расположенных внутри, и справа, фазы III(Рисунок 7E), объясняя падение в круговой справа от фазы III. Интересно, что после травмы (DDC день 14), количественный сдвиг в сторону повышенной сложности ("бинеклеарность") начинается в фазах I (отражающие 2n до 2x2n) и фазы III (отражая 8n до 2x8n), прежде чем он, наконец, консолидирован во всех трех фазах (I III). Авторы предполагают, что этот сдвиг в сторону повышенной сложности связанс с увеличением клеточной ploidy в результате застопорился цитокинез, в то время как справа от фазы III наблюдается противоположная тенденция, из-за увеличения представления циркулярных 16N моноядерных клеток в поврежденной печени из-за эндорепликации. Эти наблюдения, конечно, должны быть проверены путем адаптации метода правильно учитывать клеточной ploidy (см. Обсуждение).

Figure 1
Рисунок 1: Резюме рабочего процесса. Ткань печени собирается (1), криосекционные (2), фиксированной и иммуномаркировки с HNF4 "антитела позволяет parenchymal и не-паренхимальных клеток (NPCs) для дискриминации (3). После обработки образцы оцифровываются с помощью платформы высококонтентных изображений с помощью автоматизированного захвата изображения (4) и анализа(5). Клетки сегментированы hoechst ядерной флуоресценции и HNF4 "иммунофлуоресценции порога. Далее рассчитываются ядерная область Хёхст ("А") и круговое ("С"). Наконец, анализируются данные(6); HNF4 - NPC количественно (i) и нэнф4 "гепатоцитов ядра разделены на два подмножества ("простые" и "сложные") в соответствии с ядерной круговой (ii). Интерполяция гепатоцитов ядерной флоидизатем затем выполняется для всех "простых" ядер в качестве функции ядерного радиуса (r) и средней интенсивности флуоресценции Hoechst (в качестве прокси для плотности ядерной ДНК) (iii). Затем данные стратифицированы с помощью NPCs в качестве внутреннего калибратора 2N (iv) перед составлением сводки выборки (v). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Анализ изображений с высоким содержанием и цитометрическое профилирование печени мыши во время хронического кормления DDC. ()Представитель конфокального изображения HNF4 "/Hoechst иммунофлуоресценции окрашивания печени взрослой мыши после 21 дней кормления с диетой, содержащей 0,1% DDC; изображение показывает округлые ядра гепатоцитов HNF4 ("H") и расширение HNF4- NCS в районах, прилегающих к вене портала ("PV"). (B) Примеры оптимального ("правильного") и неоптимального (неправильного) ядерного окрашивания Hoechst, указывающие на плохую фиксацию. (C) Использование высокой пропускной связи платформы анализа изображений для сегрегации гепатоцитов и NPCs в соответствии с ядернымho Hoechst окрашивания и HNF4 "иммуномаркировки. Программные маски (красные/зеленые линии) показывают, как ядра правильно сегментируются в соответствии с флуоресценцией Hoechst и сортируются в гепатоциты (я) или NPCs (-) в соответствии со статусом HNF4. (D) Руководство по оптимизации настройки для сегментации / порогового анализа. Наложенные ядерные маски, распознаемые программным обеспечением, обозначены зелеными/голубыми линиями для ядерной сегментации и зелеными/голубыми (HNF4) или красными/синими (HNF4-) для анализа порога (H и гепатоциты). Устранение неполадок: чувствительность к обнаружению ядерного оружия слишком низка (i) или слишком высока (ii). Порог для HNF4 "установлен слишком низкий (iii) или слишком высок (iv). (E,F) Количественный анализ ядер NPC и гепатоцитов во время кормления DDC: (E) HNF4" и (F) HNF4 "ядерная плотность сравниваются со временем лечения DDC (дней). Было проанализировано в общей сложности 5,7 х 105 клеток, начиная от 4–6 животных за время. Данные представлены в виде среднего значения : SEM. Для сравнения средств использовалась одностороннее ANOVA. Значения значения значение P были рассчитаны с помощью наименее существенной разницы Фишера (LSD) тест. (G) Частотное распределение ядерной области HNF4 "во время обработки DDC. Данные показывают, право сдвиг в гепатоцитов ядерной области во время травмы в соответствии с клеточной гипертрофии и полиплоидизации. Было проанализировано в общей сложности 2,5 х 105ядер HNF4 " от 4-6 животных за время. Эта цифра была изменена из Мансано-Нусес и др.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Автоматизированный анализ гепатоцитов ядерной ploidy с использованием пользовательского письменного программного обеспечения. (A) Скриншот, показывающий правильное форматирование данных электронной таблицы для ввода в программное обеспечение для анализа ядерной ploidy. Столбцы, содержащие важные данные (шаг 5.5 протокола), выделены желтым цветом. Все заголовки столбцов должны точно соответствовать указанным. (B) Скриншот, показывающий, как отдельные файлы электронной таблицы, содержащие данные из биологических репликаторов ("Sample1", "Sample2" и т.д.), должны быть названы и организованы в subfolders для каждого состояния (под названием "Control-d0" и "Injured-d14" в этом примере). (C) Скриншот после успешной установки приложения ploidy (красный круг). При запуске приложения (нажав "Ploidy_Appl..") во вкладке MY APPS инструмента появляется "Ploidy_GUI" (нижняя панель). Название эксперимента ("Образец") и пути к управлению (например, "Control-d0") и тест (например, "Injured-d14") наборы данных вводятся перед нажатием run. Программное обеспечение затем вычисляет, калибрует и расстраляет ядерную флоиды для всех образцов, используя набор данных "Control-d0" для создания пороговых значений для минимального содержания ДНК. (D) Выход данных из Ploidy_Application показывает отдельные файлы данных, автоматически сохраненные в каждой папке образца (i), содержащей абсолютное и процентное число "простых" ядер в каждой группе ploidy. Для каждого состояния (в данном случае как "Control-d0" и "Injured-d14"), резюме папку также автоматически генерируется, содержащий средние оценки ядерной ploidy для всех "простых" гепатоцитов и не-гепатоцитов ядер (ii) и разбивка о том, как ядерная плоидная расслоита для каждого образца (iii). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Использование NPC в качестве внутреннего калибратора ploidy. (A) График, показывающий влияние травмы DDC на среднее минимальное содержание ДНК (м) гепатоцитов (HNF4) и NPC (HNF4-) ядер. Все данные нормализуются до дня 0 NPCs (n и 4 животных в точке времени). (B) Гистограмма, описывающая распределение значений NPCm в одном репрезентативном образце печени (день 0, всего 7180 ядер). Схема (см. выше) показывает, как круглые маски NPC могут происходить из клеток с содержанием ДНК 2'4c. Цель метода калибровки состоит в том, чтобы определить порог стратификации, представляющий 4c (S4c) на верхнем пределе распределения NPCm (пунктирная линия), при минимизации шума из-за ошибок сегментации в крайностях кривой распределения. (C) Наметились изменения в средней интенсивности Hoechst и ядерной области для ядер NPC (HNF4-) . Чтобы избежать ошибки сегментации, изучаются только те ядра с соответствующим значением NPCm в пределах 1 SD от значения nPCm (желтый ящик). В пределах этого диапазона рассчитывается и используется в качестве якорной точки в данных размер перехода 2c'4c (t) для оценки S4c. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Высокая пропускная стоимость анализа ядерной плоиди в печени мыши во время хронического кормления DDC. (A) Анализ контроля печени взрослой с использованием описанной методологии. Ядра гепатоцитов HNF4' из 2D секций печени подразделяются в соответствии с ядерной циркулярностью Hoechst на две группы: «простые» и «сложные». (Вверху) Представленная флуоресценция Hoechst изображения клеток, принадлежащих к этим двум группам, показаны. (Слева) Scatterplot, показывающий расслоение простых ядер HNF4 "из одного образца (день 0) в соответствии с интерполированной флоидной ценностью, ядерной областью и средней ядерной интенсивностью Hoechst. (Справа) Круговая диаграмма с подробным описанием типичного распада клеток HNF4 в контрольной печени (день 0), указывающих пропорции каждого подкласса ядерной флоиды. Было проанализировано в общей сложности 6,7 х 104 ядер HNF4 "от 4 животных. (B) Влияние травмы печени DDC на гепатоцитов ядерной ploidy высокой пропускной результат в анализе situ. Графики демонстрируют относительное снижение доли 2c и 4c ядер гепатоцитов в течение первых 14 дней после кормления DDC в то время как полиплоидные ядра резко увеличиваются. Было проанализировано в общей сложности 1,5 х 105 ядер HNF4 (n - 4 животных в часы). Данные представлены в виде среднего значения : SEM. Для сравнения средств использовалась одностороннее ANOVA. Значения значение P были рассчитаны с помощью многократного теста сравнения Tukey. (C) Пример, чтобы показать, как ядерные ploidy подклассы могут быть пространственно отслеживаются в рамках parenchyma с помощью этого метода, путем допроса высокого содержания изображений данных с теми же количественными критериями, используемыми для плоидного стратификации (круговость, ядерный размер и средняя интенсивность Hoechst). Изображения флуоресценции Hoechst показаны с программными масками (красными точками) маркировки 2c ядер в печени в два времени во время хронического кормления DDC (день 14 и 21). Указывается вену портала (синяя пунктирная линия) и перипорты, в которых расширяются NPc (желтая линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Критическая оценка метода калибровки NPC. (A, B) Распространяются NPCs успешно классифицируются с йgt;2c ploidy оценка. (A) Гистограмма NPC минимального содержания ДНК от контрольной печени иммуномаркировки с антителами к HNF4 и пролиферативного маркера Ki-67 (n No 4, данные представлены как средние - SEM). Указано пороговые значения стратификации для 2c (S2c)и 4c (S4c). (B) Стратификация NPCs в соответствии с описанной методологией приводит к значительному обогащению Ki-67 иммуномаркировки в ядрах назначены йgt;2c ploidy оценка (n No 12). Данные представлены в виде среднего значения - SEM. Unpaired t тест был использован для сравнения средств, которые были использованы для сравнения средств, полученных в порядке, и 0,0001. (C)Внешняя проверка метода калибровки NPC. Оценки среднего гепатоцита ядерной ploidy, полученные с помощью внутреннего метода калибратора NPC были сравнены с теми, полученные путем калибровки тех же образцов (Контроль C57BL/6 мыши печени 3'4 месяцев, n No 4) с известным ядерным объемом для 2N гепатоцитов14. Данные также представлены из двух независимых анализов21,22 описания гепатоцитов ядерной флоиды от мышей того же штамма в возрасте от 2 до 6 месяцев (показано справа от пунктирной линии). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Гепатоцитядерной ядерной морфометрии имеет "сложные" отношения с клеточной флойдией. (A) Резюме того, как гепатоцитов клеточной флоиди (2N, 4N, 8N и 16N) частично сегрегации 2D анализ ядерной морфхометрии. Бинуклеарные клетки (красные) подразделяются между "простыми" ("S") и "сложными" ("C") мордометриями в зависимости от того, касаются ядра или нет. (B, C) Индивидуальные гепатоциты были вручную отобраны и проанализированы на ядерную морфометрию и межядерное расстояние. (B) Бинуклеарные гепатоциты с "трогательными" ядрами были "сложными" (100% 0,8), в то время как моноядерные клетки (черные) и двуядерные гепатоциты с нетрогами ядерными масками были "простыми" (94% (C) "Простые" ядра двуядерных гепатоцитов можно отличить от моноядерных клеток из-за значительно горит межядерного интервала (n No 3, всего 94 ядер проанализированы). (D) Модель приближения, как клеточные состояния ploidy из панели А могут быть распределены с точки зрения 2D ядерной морфхометрии и ядерной области в результате кластеризации простых круговых форм в четыре фазы (I QIV). (E) Сравнение HNF4 "ядерной морфометрии / размера участков в контрольной печени (день 0) и после 14 дней (слева) и 21 дней (справа) травмы DDC. Морфхометрии фазы указаны выше (I'V). Стрелки указывают на сдвиги в ядерной морфометрии в результате травмы, которые согласуются с двукленацией 2c ("а"), 4c ("b") и 8c ("с") ядрам, а также увеличение монуклекленизации 16N клеточной ploidy класса (d). Всего 29 х 103 ядер, проанализированных на состояние (n No 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительные файлы: Демонстрационные наборы данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эти файлы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описан высокопосевной, высокопроизводительный подход к анализу ремоделирования тканей и оценке гепатоцитов ядерной флоиди в печени мурин. После того, как пользователь ознакомился с процедурой, пользователь может обрабатывать, изображения и анализировать несколько образцов в течение 3–5 дней, создавая большие наборы тестируемых данных, которые обеспечивают детальную подпись здоровья печени. Учитывая простоту метода подготовки образца, а также большое количество анализируемых2клеток и области тканей (в среднем 14 мм 2/образец), результаты являются надежными и высоко воспроизводимыми. Автоматизация захвата и анализа изображений также устраняет ошибки пользователей и потенциальную предвзятость от этих важных шагов. Важным нововведением является использование NPC в качестве внутреннего калибратора ploidy, который позволяет относительную оценку содержания гепатоцитов ядерной ДНК как внутри, так и между образцами. Поэтому включение шага по маркировке HNF4 является ключом к предоставлению этому протоколу уникального технического преимущества по сравнению с ранее опубликованными 2D-методами33,12,,22. В отличие от этого, относительная простота методологии по сравнению с 3D-восстановительными рабочими процессами18 делает ее технически менее трудоемкой и потенциально более гибкой.

По сравнению с точным методом цитометрии потока, важным предостережением для экстраполяции содержания ядерной ДНК из 2D разделов тканей, является ограниченная уверенность, которая может быть отнесена к категоризации отдельных ядер в отношении статуса ploidy. К этому следует добавить присущие смещения в SIA на основе подходов к overrepresent небольших подгрупп ploidy из-за субэкваториальной выборки. Однако, нормализуя данные до внутреннего стандарта и применяя большой подход, основанный на численности населения, ошибка, вызванная этими последствиями, смягчается и сравнима между выборками. Гепатоциты характеризуются высокоокруглыми ядерной морфологии, по сравнению, например, NPCs, а это означает, что они особенно поддаются точной оценки содержания ДНК на основе ядерной поперечной области только10,11,14,15,23. Подход, основанный на SIA, был усовершенствован в этом протоколе для учета как ядерной круговой, так и плотности ДНК путем интеграции показателей морфхометрии и средней интенсивности флуоресценции Hoechst, что привело к предполагаемому "минимальному содержанию ДНК" для отдельных ядер. Важно отметить, что использование NPC в качестве контроля флоидов 2х4N обеспечивает важный внутренний стандарт для объективной калибровки и расслоения минимального содержания ядерной ДНК, что делает описанную методологию применимой к образцам любого вида или формата, учитывая, что можно получить соответствующее антитело для HNF4 (или аналогичного ядерного маркера гепатоцитов).

Хотя оценка ядерной ploidy было показано, чтобы обеспечить полезные подписи для прогрессирования заболевания печени10,13, для того, чтобы полностью установить разнообразие ploidy изменения в печени было бы желательно и необходимо адаптировать описанную методологию для учета гепатоцеллюлярного периметра и, следовательно, клеточной ploidy. Картирование клеточной ploidy ранее было достигнуто путем маркировки периметра гепатоцитов с использованием маркеров, таких как бета-катенин10,13,24, актин12,22 и цитокератин10,11 в человеческих и мышей образцов печени. Однако, когда это было проверено после травмы DDC, драматические эпителиальной реконструкции исключается надежная оценка гепатоцеллюлярного периметра как фаллоидин (данные не показаны) или антитела к бета-катенин17. Таким образом, хотя этот подход осуществим, он не может быть применим ко всем моделям травм, но если они будут достигнуты, то это позволит заранее составить отображение клеточной флоиди, а также сделать оценки размера и количества гепатоцитов более точными. Также остается вероятным, что путем учета дополнительных ядерных параметров, таких как межядерное расстояние(рисунок 7С),моноядерные клетки могут быть дискриминированы от "простых" двухядерных гепатоцитов, и что дальнейшая сегрегация "сложных" двухядерных клеток может быть достигнута путем радиальных измерений ядер, которые содержат их 2D маски.

Учитывая, что проверенные человеческие антитела HNF4 существуют для ткани FFPE25 и что внутренняя калибровка освобождает эту методологию от любых видовконкретных ограничений, протокол почти сразу же применим к человеческим образцам. Таким образом, он имеет значительный потенциал для обеспечения ориентира для высокой пропускной связи анализа гепатоцитов ядерной флоиди и повреждения печени при болезни человека. Кроме того, путем мультиплексирования с другими антителами, этот метод может выявить новые роли для конкретных подмножеств гепатоцитов и их ответ на травмы печени и болезни. С этой целью мы успешно объединили методологию с иммунодефицитом для пролиферативного ядерного маркера Ki-67(рисунок 6),который позволяет почерпнуть полезную информацию , включая выявление нераспространительных 2N популяций NPC для улучшения внутренней калибровки ploidy (Полдень, неопубликованные данные 2019). Таким образом, связывая гибкость с позиционными и количественными данными, которые предоставляет метод, мы предполагаем, что его будущие приложения улучшат понимание роли полиплоидии в печени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была профинансирована испанским правительством MINECO гранты BFU2014-58686-P (LAN) и SAF-2017-84708-R (DJB). LAN была поддержана национальным MINECO Рамон у Cajal стипендий RYC-2012-11700 и план GenT награду (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), и FMN регионального ValI-D студентов Валенсии Generalitat ACIF/2016/020. РП хотела бы отметить профессора Эву К. Палух за финансирование. Мы благодарим д-ра Алисию Мартинес-Ромеро (CIPF Cytometry service) за помощь в платформе IN Cell Analyzer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) TestDiet 1810704 Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) Invitrogen A11055 Dilution 1:500
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cryostat Leica CM1850 UV Leica biosystems CM1850 UV Tissue sectioning
Fluorescent Mounting medium Dako S3023
GraphPad Prism GraphPad Software Prism 8 Statistical software for graphing data
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Final concentration 5 µg/mL
IN Cell Analyzer 1000 GE Healthcare Bio-Sciences Corp High-Content Cellular Imaging and Analysis System
MATLAB MathWorks R2019a Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy
Microscope coverslides VWR International 630-2864 Size of 24 x 60 mm
Microsoft Office Excel Microsoft Speadsheet software
OCT Tissue Tek Pascual y Furió 4583
Paraformaldehyde Panreac AppliChem 141451.121
Pen for immunostaining Sigma-Aldrich Z377821-1EA 5mm tip width
Polysine Microscope Slides VWR International 631-0107
Rabbit polyclonal Anti-HNF4α Thermo Fisher Scientific PA5-79380 Dilution 1:250 (alternative)
Rabit polyclonal Anti-HNF4α Santa Cruz Biotechnology sc-6556 Dilution 1:200 (antibody used in the study)
Tween 20 Sigma-Aldrich P5927

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
  2. Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
  3. Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide? Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
  4. Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
  5. Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
  6. Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
  7. Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
  8. Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
  9. Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
  10. Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
  11. Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
  12. Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
  13. Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
  14. Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
  15. Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  16. Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
  17. Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
  18. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
  19. Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
  20. Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
  21. Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
  22. Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
  23. Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
  24. Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
  25. Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).

Tags

Медицина Выпуск 158 печень полиплоидия гепатоциты высокосодержание изображений гепатология гепатоцитов ядерный фактор 4 альфа (HNF4)
Высокой пропускной способ в Ситу Метод оценки гепатоцитов ядерной плоиди у мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manzano-Núñez, F., Peters, … More

Manzano-Núñez, F., Peters, R., Burks, D. J., Noon, L. A. A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice. J. Vis. Exp. (158), e60095, doi:10.3791/60095 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter