Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En hög genomströmning in Situ metod för uppskattning av Hepatocyte Nuclear Ploidy hos möss

Published: April 19, 2020 doi: 10.3791/60095
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1,3
1Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)

Summary

Vi presenterar en robust, kostnadseffektiv och flexibel metod för att mäta förändringar i hepatocyte nummer och nukleära ploidy inom fasta / kryoreserverade vävnadsprover som inte kräver flöde cytometri. Vår metod ger en kraftfull provomfattande signatur av lever cytologi perfekt för att spåra utvecklingen av leverskada och sjukdom.

Abstract

När levern är skadad, hepatocyte tal minskar, medan cellstorlek, nukleärstorlek och ploidy ökar. Expansionen av icke-parenkymala celler såsom cholangiocytes, myofibroblasts, stamfader och inflammatoriska celler indikerar också kronisk leverskada, vävnad remodeling och sjukdomsprogression. I detta protokoll beskriver vi en enkel hög genomströmning metod för att beräkna förändringar i den cellulära sammansättningen av levern som är associerade med skada, kronisk sjukdom och cancer. Vi visar hur information som extraheras från tvådimensionella (2D) vävnad sektioner kan användas för att kvantifiera och kalibrera hepatocyte nukleära knep inom ett prov och göra det möjligt för användaren att lokalisera specifika ploidy delmängder inom levern på plats. Vår metod kräver tillgång till fast/fryst levermaterial, grundläggande immunocytokemireagenser och alla vanliga högkvalitativa bildplattform. Det fungerar som ett kraftfullt alternativ till standard flöde cytometri tekniker, som kräver störningar av nysamlad vävnad, förlust av rumslig information och potentiella uppdelning bias.

Introduction

Hepatocyter i däggdjurlever kan genomgå avstannad cytokinesi att producera binuclear celler, och DNA endoreplication att producera polyploida kärnor som innehåller upp till 16N DNA-innehåll. Övergripande cellulära och nukleära knep ökar under postnatal utveckling, åldrande och som svar på olika cellulära påfrestningar1. Processen för polyploidatisering är dynamisk och reversibel2, även om dess exakta biologiska funktion är fortfarandeoklart 3. Ökad knep är associerad med minskad proliferative kapacitet4, genetisk mångfald2, anpassning till kronisk skada5 och cancer skydd6. Hepatocyte ploidy förändringar sker som ett resultat av förändrad dygnsrytm7, och avvänjning8. Framför allt, ploidy profilen av levern ändras av skada och sjukdom9, och övertygande bevis tyder på att specifika knep förändringar, såsom ökad ≥8N atomkärnor eller förlust av 2N hepatocyter, ger användbara signaturer för att spåra alkoholfria fettlever (NAFLD) progression3,,10, eller den differentiella effekten av virusinfektioner11.

Generellt sett är leverskada och regenerering förknippade med ökad hepatocyte cellstorlek och kärnområde12, tillsammans med minskat totalt antal hepatocyter, särskilt de med 2N DNA-halt10,11. Parenchymal skada i levern är också ofta åtföljs av expansion av icke-parenkymala celler (NPC), inklusive stromal myofibroblasts, inflammatoriska celler och bipotenta lever stamgenitor celler. Metoder med hög genomströmning som ger en kvantitativ cytologisk profil av parenkymalt cellnummer och kärnsken, samtidigt som de också står för förändringar i NPC,har därför stor potential som forskning och kliniska verktyg för att spåra leverns svar under skada och sjukdom. Övertygande senaste in situ analys av ploidy spektra i mänskliga prover av hanpatocellular carcinom visar också att nukleära knep är dramatiskt ökat inom tumörer och förstärks specifikt i mer aggressiva tumör subtyper med minskad differentiering och förlust av TP5313. Därför finns det en stor möjlighet att metodologiska framsteg i kvantitativ bedömning av nukleära knep kommer att bidra till framtida prognostisk profilering av levercancer.

I detta protokoll beskrivs en flexibel hög genomströmningsmetodik för jämförande analys av muslevvävnadssektioner, som ger detaljerad cytometrisk profilering av hepatocytenummer, NPC-svaret och en internt kalibrerad metod för att uppskatta kärntrick (figur 1). Hepatocyter skiljer sig från NPC genom hepatocyte nukleära faktor 4 alfa (HNF4α) immunmärkning, före karakterisering av nukleärstorlek och nukleära morfomi. "Minimal DNA-innehåll" uppskattas för alla cirkulära kärnmasker genom att integrera medelvärdet Hoechst 33342 intensitet (en proxy för DNA-densitet) med interpolerad tredimensionell (3D) kärnvolym. Hepatocyte minimal DNA-innehåll kalibreras sedan med hjälp av NPC för att generera en nukleär ploidy profil.

Bildinsamling, kärnsegmentering och bildanalys utförs med höginnehållsavbildning, vilket gör att stora områden med tvådimensionella (2D) leversektioner som innehåller tiotusentals celler kan kontrolleras. Ett specialskrivet program tillhandahålls för automatiserad efterbehandling av höginnehållsbildanalysdata för att producera en provomfattande ploidyprofil för alla cirkulära hepatocytekärnor. Detta utförs med hjälp av gratis för att ladda ner programvara för att beräkna nukleära knep baserat på stereological bildanalys (SIA)10,11,14,15. SIA-metoden har tidigare validerats av flödescytometri som en korrekt, om än mödosam, metod för att uppskatta hepatocyte nukleära knep i levern14, förutsatt cirkulär nukleär morfologi och ett monotont förhållande mellan nukleär storlek och DNA-innehåll. I detta protokoll mäts båda nukleära parametrar genom bedömning av kärnmorometri och Hoechst 33342-märkning. Beräkning av "minimal DNA-innehåll" för varje kärnmask följs av kalibrering av hepatocytkärnacom med hjälp av NPC, som har en känd 2−4N DNA-innehåll och därför fungerar som en användbar intern kontroll.

Jämfört med konventionella flöde cytometri metoder16 den metod som beskrivs gör hepatocyte nukleära knep som skall bedömas på plats och kräver inte tillgång till färsk vävnad eller disaggregering metoder som kan bias resultat och vara svårt att standardisera. Som med alla SIA-baserade metoder är underklasser av kärnlexi >2N underrepresenterade genom 2D-provtagning på grund av snittning av större kärnor utanför ekvatorialplanet. Den vävnadsomfattande ploidyprofilen beskriver också det lägsta DNA-innehållet för alla cirkulära hepatocytekärnmasker och diskriminerar inte direkt mellan mononukleära hepatocyter och binukleära celler som har två diskreta (icke-rörande) kärnor av samma knep. Enkelheten i detta protokoll ger dock stort utrymme för att anpassas för att ta hänsyn till ytterligare parametrar såsom internukleära avstånd eller cell perimeteranalys, som skulle underlätta identifiering av binukleära celler som ger en mer detaljerad bedömning av cellulära knep.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök godkändes tidigare av CIPF:s etikkommitté. Möss var inrymt i en patogenfri anläggning vid Centro de Investigación Príncipe Felipe (Valencia, Spanien), registrerad som försöksdjur uppfödare, användare och leveranscentrum (reg. nr. ES 46 250 0001 002) enligt gällande tillämpliga europeiska och spanska djurskyddsbestämmelser (RD 53/2013).

1. Vävnadsskörd och provberedning

OBS: Detta protokoll beskriver hur man fryser vävnad utan föregående fixering eller kryobevarande. För tidigare fasta/kryokonserverade prover fortsätt till avsnitt 2 och utelämna steg 3.1. Alla analyser har utförts med vuxna C57BL/6 möss i åldern 12−16 veckor.

  1. Offra djur genom fentanyl/pentobarbital intraperitoneal injektion följt av cervikal störning. Med musen vänd ventrala sidan upp, öppna bukhålan och exponera levern genom att gripa tag i huden med pincett och utföra ett vertikalt snitt från basen av nedre delen av buken till basen av bröstbenet med kirurgisk sax.
  2. Ta försiktigt bort gallblåsan med hjälp av fina pincett, dissekera ut levern och skölj den valda leverlobulen i en 10 cm petriskålsplatta fylld med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
    OBS: Det rekommenderas att jämföra samma leverloben för varje djur, i detta fall användes medianloben.
  3. Fyll en märkt kryomold med optimal skärtemperatur (OCT) medium vid rumstemperatur (RT). Undvik OCT bubblor. Om de visas, tryck dem till kanten av formen med hjälp av en nål eller pipett spets.
  4. Bädda in leverlobule i en fylld OCT cryomold och omedelbart placera den på torris för att säkerställa snabb frysning. Förvara kryomolds vid -80 °C tills kryosection.

2. Kryosectioning

  1. Transportera kryomolder på torris för att undvika vävnadsnedbrytning. Före kryosection equilibrate inuti cryostat inställd på -20 °C i 20 min.
  2. Mata ut provet genom att trycka på botten av plast cryomold. Applicera flytande OCT på varm provskiva på RT, placera i cryostat och fäst ett OCT-inbäddat leverprov. Tryck försiktigt och vänta 3 min på att OCT fryser och ser till att provet fastnar på disken.
    OBS: Undvik att hantera provet med fingrarna så mycket som möjligt för att undvika vävnadsnedbrytning.
  3. Lås provet i kryostatens arm och justera orienteringen så att provets kant är parallellt med kryostatbladet. Skär i provet tills vävnaden har uppnåtts.
  4. Dela upp provet med en tjocklek på 6 μm. Placera en märkt polyamidbelagd bild över provet i 5 s för att låta provet fastna på bilden. Placera bilden på RT i 3−5 min och fortsätt sedan direkt till avsnitt 3 för bästa resultat.
    OBS: För bearbetning av flera nyfrysta prover har reproducerbara resultat erhållits genom att man tillfälligt lagrar diabilder i en lådlåda på torris tills alla prover har bearbetats. När du använder den här metoden kan alla diabilder balansera till RT innan du fortsätter till avsnitt 3. Formalin fast paraffin inbäddade (FFPE) prover kan användas, även om bakgrunden autofluorescens ökas med denna metod. För att utgå från FFPE-prover, avsnitt vid 4 μm. Montera genom att fånga sektioner från 40 °C vattenbad på polyamidbehandlade diabilder. Värmerutschbanor i 1 h vid 60 °C och deparaffinisera sedan med seriella RT-tvättar (5 min) i Coplinburkar som innehåller xylen (x2), etanol 100% (x2), 96% (x2), 70% (x1) och dH2O (x1). För att exponera antigener placerar du diabilder i citratbuffert i 20 minuter vid 90 °C innan anlöpningsglas i PBS vid RT. Fortsätt till steg 3.2.

3. Fluorescens immunmärkning

  1. Fäst vävnadssektionerna i en rökhuva genom att applicera 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 10 min vid RT. Överför diabilder till en PBS-fylld Coplin-burk och tvätta i 3 min med skonsam agitation (upprepa 3x).
    OBS: Från och med nu fram till slutet av immunfläckande processen, undvik torkning av provet.
  2. Torka området runt varje vävnadssektion och omge med en hydrofoba penna. Permeabilize med 0.5% nonionic ytaktivt syra (dvs. Triton X-100) i PBS för 15 min på RT. Tvätta sedan i PBS-fylld Coplin burk i 3 min med mild omrörning (upprepa 2x).
  3. Blockera med en filtrerad lösning av 1% bovin serum albumin (BSA), 5% häst serum, 0,2% nonionic ytaktivt i PBS (i minst 1 h vid RT).
  4. Inkubera med primär HNF4α-antikropp utspädd vid blockering av buffert över natten vid 4 °C i en mörk fuktig färgningskammare (se Tabell över material för antikroppar och specifika utspädningar).
  5. Placera diabilder i en PBS-fylld Coplin burk och tvätta i 3 min med hjälp av mild omrörning (upprepa 4x).
  6. Inkubera med Alexa-488 konjugerad sekundär antikropp och Hoechst utspätt i filtrerade 1% BSA och 0,2% nonjoniskt ytaktivt ämne i PBS för 2 h vid RT i en mörk fuktig färgningskammare (se Tabell över material för antikroppar och specifika utspädningar).
  7. Placera diabilder i en PBS-fylld Coplin burk och tvätta i 3 min med hjälp av mild omrörning (upprepa 4x). Tvätta i DDH2O i 3 min med skonsam omrörning (upprepa 2x).
  8. Montera diabilder genom att placera två droppar fluorescerande monteringsmedia på ett täckslip (24 x 60 mm) och lägga diabilder över det, vilket eliminerar bubblor genom att applicera ett lätt tryck. För långtidsförvaring, tätningsskydd i kanter med klart nagellack och förvaras i mörker vid 4 °C.
  9. Innan du fortsätter, kontrollera diabilder med hjälp av en konventionell fluorescens mikroskop för att säkerställa god fixering och immunmärkning.
    OBS: Se figur 2A,B för förväntade resultat.

4. Fluorescens bild förvärv

OBS: För detta steg krävs en högkvalitativ bildplattform (Tabell över material) som stöder automatisk fluorescensbild förvärv.

  1. Slå på bildsystemet och öppna ett nyförvärvsprotokoll.
  2. Välj 10x-målet, notera området för synfältet (i det här fallet 0,6 mm2).
  3. Ställ in parametrar för att förvärva fluorescensbilder med lämpliga magnetiserings- och utsläppsfilter (enligt steg 3.6). För Hoechst och Alexa-488 väljer du "DAPI" och "GFP"-kanaler med 390/18 respektive 438/24 nm excitation och 432,5/48 respektive 475/24 nm utsläpp.
  4. Fokusera provet och se till att signalintensiteten inte mättar. Se till att bildhämtningen sker med samma exponeringstid för alla bilder eller använd ett system där fluorescensintensiteten korrigeras för exponeringstiden.
  5. Skanna provet och hämta tillräckligt med bilder för att få fullständig täckning av vävnadssektionen (cirka 20−50 synfält, beroende på provstorlek).
  6. Granska bilddatabasen, eliminera (i) dåligt fokuserade fält, (ii) de vid gränserna för varje vävnad avsnitt (för att undvika partiskhet celltäthet beräkningar), och (iii) de som innehåller vikta / fysiskt skadade områden i vävnadsdelen om sådana finns.

5. Automatiserad analys av fluorescensbild

OBS: Detta steg kräver lämplig bildanalysprogramvara (Tabell över material) som kan: (1) automatiskt identifiera Hoechst-märkta kärnkärnor i bilder vid 405 nm (kärnsegmentering), (2) bedömning av medelvärdet Hoechst kärnintensitet och morfologi, och (3) tröskelanalys för att bestämma +/- status för nukleär fluorescens vid 488 nm (HNF4α). Viss grundläggande operatörsutbildning/expertis krävs för att visuellt bedöma och justera segmenterings- och tröskelparametrar inom programmet för att säkerställa att kärnor och HNF4α+/- status är optimalt gated (figur 2).

  1. Öppna förvärvsfilen som innehåller Hoechst-bilder (405 nm) och HNF4α (488 nm) från steg 4.5 i bildanalysprogrammet och skapa ett nytt analysprotokoll.
  2. Definiera våglängder som ska användas för kärnsegmentering (Hoechst, 405 nm) och för hepatocyte/NPC tröskelanalys (HNF4α, 488 nm).
  3. Justera programvarans parametrar för kärnsegmentering (t.ex. "minsta kärnområde" och kärndetekteringskänslighet) för att säkerställa att kärnorna är optimalt segregerade.
    OBS: Bra segmentering av hepatocyter bör prioriteras framför NPC: s. Hepatocyte kärnor är karakteristiskt rundade (interkvartil storleksintervall: 40−64 μm2). NPC-kärnor, såsom sinusformade endotromen, är tillplattade/elliptiska eller oregelbundna till formen och i allmänhet mindre och närmare förpackade än hepatocyter (interkvartilstorleksintervall: 30−43 μm2). För muslever användes ett minimalt kärnområde ≥23 μm2 och detektions "känslighet" på 65 % (se figur 2C,D för förväntade resultat). Känsligheten avgör hur pixelkluster känns igen som enskilda kärnor baserat på deras intensitet och bör testas empiriskt för varje prov som anges av användaren innan du fortsätter med automatiserad bildanalys.
  4. Ändra tröskelintensiteten vid 488 nm för att säkerställa optimal gating av hepatocyter (HNF4α+) och icke-parenkymala celler (HNF4α-).
    OBS: Se figur 2C,D för förväntade resultat. Värdet av tröskelintensiteten är relativt och beror på färgningseffektivitet och förvärvsinställningar som laserintensitet. Det bör därför standardiseras av användaren. Använd kända HNF4α- celler som endotelceller och periportal-NPC som en intern negativ kontroll och binukleära hepatocytekärnor som en positiv referens för färgning. Testa analysparametrarna med hjälp av ett litet antal bilder för att säkerställa god kärnsegmentering och intensitetströskelsegregering innan analysparametrar tillämpas på hela datauppsättningen.
  5. Välj följande nukleära parametrar som ska kvantifieras: (1) kärnområde baserat på Hoechst-färgning (μm2), (2) genomsnittlig hoechstintensitet (RU), (3) kärntöppningsfaktor (medelkvot för kärnans korta axel och kärnans långa axel, om ett mittsymmetriskt [icke-långsträckt] föremål har ett värde på 1, (4) Nuc 1/(formfaktor), medelvärde för kärnkraft "rundhetsindex" beräknat med omkrets 2/(4π x område). Värdena sträcker sig från 1 till oändlighet, där 1 är en perfekt cirkel, (5) HNF4α-status (positiv-1 eller negativ-0) och (6) kärn- x/y-koordinater baserade på "tyngdpunkt" (cg), en metod för att lokalisera objektets mitt från gråskalabilder med subpixelprecision.
  6. Kör analysen för alla exempeldatauppsättningar och exportera numeriska data från steg 5.5 till kalkylprogram.

6. Dataanalys

Dataanalyssteget kan utföras med vilket vanligt kalkylbladsprogram som helst.

  1. Beräkna hepatocyte och icke-hepatocyte cellnummer.
    1. Beräkna den totala ytan av leversektionen som analyserats för varje prov genom att multiplicera antalet visningsfält med området för synfältet (steg 4.2).
    2. Genom att arbeta med kalkylbladsfiler som genereras för varje leveravsnitt filtrerar du data genom att bara välja HNF4α+-kärnor. Beräkna det totala antalet HNF4α+ kärnor som analyserats och dividera detta med den totala analyserade arealen för att erhålla genomsnittlig hepatocytdensitet för varje prov (figur 2F).
    3. Utför samma beräkning för icke-parenkymala celler genom att filtrera kalkylbladet för HNF4α- celler (figur 2E).
  2. Beräkna hepatocyte nukleär storleksfördelning.
    1. Filtrera data med hjälp av kalkylprogram för att välja endast HNF4α+-kärnor.
    2. Tomtvärden för kärnområdet i ett histogram (figur 2G). Ställ in lagerplatsbredden på 5 μm2.
      OBS: Frekvensvärden kan korrigeras för område (kärnor/mm2)enligt steg 6.1.1.
  3. Utför hepatocyte nukleära knep analys.
    Kalkylbladsdata från steg 5.6 används för att generera en kärnprickidprofil för varje prov. Denna process har automatiserats och kan utföras med hjälp av en anpassad skriftlig programvara som är fritt tillgänglig för nedladdning med stödjande information och demonstrationsdatauppsättningar påhttps://github.com/lukeynoon(seKompletterande filer). Källkod tillhandahålls för användare som vill anpassa metoden. Nedan beskrivs en beskrivning av algoritmen, tillsammans med instruktioner för installation och användning. Programmet använder kalkylbladsdata för att automatiskt separera hepatocytekärnor i två grupper. (1) de med "enkla" cirkulära kärnor och (2) "komplexa" icke-cirkulära kärnor som är representativa för binukleära celler med "2c ploidy. Den minimala kärn-DNA-halten (en funktion av kärnområdet och DNA-densitet) beräknas nästa för alla "enkla" kärnor. Ett efterföljande steg kalibrerar sedan automatiskt HNF4α+ hepatocyte nukleärt trick med HNF4α- kärnkärnor som en känd intern kontroll på 2−4N.
    1. Ladda ner och installera programvara.
      1. Ladda ner det paketerade programmet från: https://github.com/lukeynoon
      2. Starta MATLAB. Navigera till fliken APP i verktygsremsan, klicka på Installera app och öppna det nedladdade programmet"Ploidy_Application.mlappinstall". Ett meddelande visas för att bekräfta den lyckade installationen.
        Obs: Programmet är nu klar för användning och kommer att finnas kvar i APP fliken i verktygsremsan.
    2. Formatera indata.
      Obs: Före automatiserad kärnplädring ska alla kalkylbladsfiler som innehåller bilddata med högt innehåll (steg 5.6) lagras och formateras enligt följande instruktioner.
      1. I varje exporterad datafil (. XLS 97-2004 arbetsbok) från steg 5.6, innehålla ett ark som kallas "Cell åtgärder" som innehåller alla uppgifter som krävs för ploidy analys som anges i kolumner (figur 3A). Kontrollera att kalkylbladslayouten inklusive kolumnrubriknamn förblir oförändrad från figur 3A, eftersom analysmetoden hittar rätt kolumndata genom att söka efter dessa namn (se demonstrationsdatauppsättningar i tilläggsfiler som referens). Om till exempel programvara för bildanalys med högt innehåll till exempel inte ger en "Ljusflödeskolumn"(bild 3A)) sätter du manuellt in en "Ljusflödeskolumn" på samma plats, dvs.
      2. För varje försökstillstånd (t.ex. "Skadad-d14"), tillhandahålla en kontrolldatauppsättning, som kommer att användas för att beräkna den interna kontrollen för 2−4N kärnknä kalibrering (steg 6.3.4.3). Här väljer du leverprover från obehandlade vuxna littermates ("Control-d0"; Bild 3B−D).
      3. För biologiska replikat (per villkor) lagrar du varje kalkylblad i sin egen mapp (som i figur 3B). Namnge mappprefixen stegvis, t.ex., "Sample1, Sample2, Sample3... SampleN", enligt de filnamn som finns i. Därför bör varje datauppsättningsmapp (t.ex. "Control-d0") innehålla en serie undermappar ("Sample1", "Sample2" etc.) som var och en innehåller en kalkylbladsfil med samma motsvarande namn.
    3. Kör programmet.
      1. Inom MATLAB, starta "Ploidy_Application" genom att klicka på ikonen i fliken MINA APPAR på verktygsremsan (Bild 3C). Det Ploidy_Application grafiska användargränssnittet (GUI) visas (bild 3C).
      2. Klicka på sökvägen om du vill styra dataknappen för att navigera till mappen där kontrolldata replikeras finns (t.ex. Den här datasökvägen visas sedan i gränssnittet /Users/Desktop/Control-d0(t.ex.
      3. Skriv sedan namnet som ska ges till utdatafilerna i "mappprefix" (t.ex.
        Det här prefixet kan ändras till valfri text, förutsatt att mapparna och filnamnen förblir stegvis namngivna.
      4. Klicka på sökvägen till andra dataknappar och navigera till mappen där jämförande data replikerar finns (t.ex. Den här datasökvägen visas sedan i gränssnittet /Users/Desktop/Injured-d14(t.ex.
      5. Klicka på Kör!. När analysen är klar kommer statusfältet att läsa "Analysis Complete!..".
        OBS: Ansökan kommer för varje prov att rapportera stratifiering av "enkla" kärnor till ≤2n, 2n−4n, 4n−8n och 8n+ i absoluta antal och i procent av det totala antalet (figur 3D). Dessa filer sparas automatiskt i varje exempelmapp som: "Count_2n.txt", "Count_2n_to_4n.txt", "Count_4n_to_8n.txt", "Count_8n_and_higher.txt", "Percentage_2n.txt", "Percentage_2nto4n.txt", "Percentage_4nto8n.txt", "Percentage_8n_and_higher.txt". Den Ploidy_Application kommer automatiskt att spara en lista för varje prov, av alla enskilda ploidy uppskattningar för "enkel" hepatocyte och icke-hepatocyte kärnor i "Ploidy_All_Hepatocytes.txt" och "Ploidy_NonHepatocytes.txt". För kontrolldatauppsättningen sparar metoden också de minimala tröskelvärden för DNA-innehåll som beräknas för stratifiering av ploidy (se steg 6.3.4.3.7) i en fil med namnet "Normalised_Thresholds_Control". Slutligen kommer programmet att producera en mapp för både kontroll och de valda jämförande villkorsdata som kallas "Sammanfattning". Denna mapp innehåller två undermappar, "Ploidy" och "Stratifiering" som innehåller medelvärdet av alla prover som tillhandahålls (figur 3D).
    4. Beskrivning av metoden.
      OBS: I följande avsnitt beskrivs i detalj den metod som används av programvaran Nuclear Ploidy Analysis. Om användaren väljer att inte använda programmet kan dessa steg följas med hjälp av kalkylprogram för att beräkna profilen för kärnpläsk manuellt.
      1. Separera kärnor i "enkel" eller "komplex" enligt nukleär morfologi.
        1. Beräkna ett "cirkuläritetsindex" för alla kärnor, definierat som den nukleära "töjningsfaktorn" dividerat med "Nuc 1/(formfaktorn)", där ett värde på 1,0 indikerar en perfekt cirkel.
          ANMÄRKNING: "Nuclear tongation" och "Nuc 1/(formfaktor)" är två diskreta mått på ett objekts "cirkuläritet" som bedömer kompletterande, icke-överlappande morfometriska kriterier. Den förstnämnda mäter ett objekts långa och korta axlar, medan den senare jämför ett objekts längd med dess område. För att stärka definitionen av kärncirkelform som används i detta protokoll har dessa två mätningar kombinerats till ett enda "cirkuläritetsindex". Ett tidigare tillvägagångssätt för att uppskatta kärntekniska knep med den beskrivna metoden används endast för att töjning av kärnmaterial17. Medan godtagbara resultat erhölls med hjälp av detta tillvägagångssätt, författarna har observerat att en sammansatt "cirkuläritet index" förbättrar diskriminering av manuellt utvalda kärnor från mononukleära och binuclear hepatocyter (data visas inte).
        2. Klassificera kärnor med ett cirkuläritetsindex ≤ 0,8 som "komplexa" och de > 0,8 som "enkla".
      2. Uppskatta "minimal" DNA-halt (m) för alla "enkla" kärnor.
        1. Beräkna kärnradien (r) med hjälp av formeln:
        2. Beräkna kärnvolymen (v) med hjälp av volymen för en sfärformel:
        3. Generera ett relativt värde för minimal DNA-innehåll (m) med hjälp av formeln:
      3. Kalibrera datauppsättningen med NPC-kärnorna (HNF4α-) som en intern 2−4N-kontroll.
        NPC:er har ett 2−4N DNA-innehåll beroende på cellcykelstatus. Därför ökar medelvärdet av NPC "minimal" DNA-innehåll (NPCm)med skada (figur 4A). Kalibreringsfel minimeras genom att en övre gräns för NPCm representerar en tröskel på 4c (figur 4B).
        1. I kalkylbladet väljer du endast NPC-kärnor med värden för "m" som ligger inom 1 standardavvikelse (SD) i läget (detta filtrerar bort brus från eventuellt segmenteringsfel).
        2. Inom detta filtrerade område, undersöka kärnområden och deras motsvarande medelvärde Hoechst-intensiteter (figur 4C).
        3. Uppskatta det minsta kärnkraftsområdet inom detta filtrerade område med maximal kärnintensitet för Hoechst (dvs. den punkt där kurvans linje ändrar riktning i den filtrerade datauppsättningen, vilket illustreras av den röda cirkeln i figur 4C). Detta värde representerar ett övergångstillstånd på 2N−4N (t) över vilket provtagning av 4c kärnor dominerar över 2c kärnor, vilket resulterar i en maxima av genomsnittlig Hoechst-intensitet.
          OBS: Detta värde bestäms automatiskt av programvaran; Kalkylbladsanvändare kan dock manuellt välja den här punkten som övergångsstorlek.
        4. Beräkna det minimala DNA-innehåll som representeras av denna övergångsstorlek (tm)genom att följa steg 6.3.4.2.
        5. Om du vill uppskatta 4N-axeln för NPC m-datauppsättningen lägger du till 1 SD till värdet av tm.m Det resulterande talet (figur 4B) beskriver den övre gränsen för NPC minimal DNA-innehåll som ska användas för nukleär ploidy stratifiering (S4c).
        6. Upprepa steg 6.3.4.3.1−6.3.4.3.5 för alla "kontrollprover".
          OBS: I figur 3används till exempel oskadade kontrolllever ("Control-d0") som ett kontrolltillstånd.
        7. Beräkna en genomsnittlig 4c stratifieringströskel (S4c)för "kontrollprover" och använd detta för att extrapolera gränserna 2c (S2c) och 8c (S8c)för minimalt DNA-innehåll (m). Stratifieringströsklar genereras automatiskt och lagras av programvaran (steg 6.3.3.3).
          OBS: Beroende på studiens utformning kan de genomsnittliga stratifieringströskelvärdena beräknas för varje tillstånd eller för specifika tillstånd (t.ex. frisk kontrolllever). Programvaran Nuclear Ploidy Analysis kräver dock att en av en uppsättning med 2 filer betecknas som "kontroll" för beräkning av relativa ploidyvärden.
        8. Beräkna ett ploidy-värde för alla kärnor med hjälp av S2c-värdet som genereras i steg 6.3.4.3.7 enligt:
        9. Stratifiera "enkla" hepatocyter (HNF4α+) kärnor till 2c/4c/8c/>8c-parentes enligt följande kriterier: "2c" HNF4α+ = p ≤ 2; "4c" HNF4α+ = 2 < p ≤ 4; "8c" HNF4α+ = 4 < p ≤ 8; ">8c" HNF4α+ = 8 < p.
        10. Om du vill rekonstruera den rumsliga mönstringen för ploidy-undergrupper separerar du kärndata i varje urvalskalkylblad enligt motsvarande fält där de förvärvades. Använd sedan associerade kärn-x/y-koordinater (från steg 5.5) för att rita ploidy-undergrupper i 2D (figur 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna metod har använts för att mäta effekten av kolestatisk skada på den vuxna muslevern genom att mata djur i 0−21 dagar med en hepatotoxisk diet som innehåller 0,1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidin (DDC)17. Kronisk DDC utfodring resulterar i hepatocellular skada ökad ploidy och periportal expansion av NPC. Användaren bör vara medveten om att musstam och åldersberoende skillnader kan förekomma i kärnknöjighet och att alla analyser har utförts med hjälp av vuxna C57BL/6-möss i åldern 12−16 veckor.

Efter HNF4α-immunmärkning (protokoll avsnitt 3) är det viktigt att kontrollera alla diabilder med konventionell fluorescensmikroskopi för att säkerställa god kvalitetfixering och färgning (figur 2A). Utsmetning eller oskärpa av Hoechst kan tyda på otillräcklig fixering eller provförsämring före fixering (figur 2B),i vilket fall återgå till protokoll avsnitt 2 och förkorta tiden mellan snittning och fixering (steg 3.1). Framgångsrik immunmärkning med HNF4α-antikroppen kan lätt bedömas i detta skede genom tydlig diskriminering av positivt märkta hepatocytekärnor, vanligtvis större och mer rundade än nPC:erna (figur 2A). Tillplattad/elliptisk endotelkärnor i parenkymet eller täta fläckar av celler som expanderar i periportalområden efter DDC skada kan fungera som en användbar visuell referens för att identifiera HNF4α- NPC vid bedömning av framgång / misslyckande immunstainning.

Kärnsegregation och HNF4α-tröskelparametrar (steg 5.2−5.4) bör optimeras noggrant före automatisk bildanalys (steg 5.6) för att i stort sett återspegla det visuella mönster av immunhalt som observeras av konventionell fluorescensmikroskopi i slutet av protokollavsnitt 3 (figur 2C). Exempel på optimala kontra suboptimala kärnsegmenteringsprotokoll och HNF4α-tröskelprotokoll sammanfattas i figur 2D. Efter bildanalys (steg 6.1.3) bör uppgifterna återspegla ett ökande antal NPC i levern med DDC-skada (figur 2E), från 52 % ± 2,0 % av kärnorna i kontrolllever till 72,8 % ± 1,4 % efter 21 dagars DDC-behandling. Hepatocyter utgör 48,0 % ± 2,0 % av de totala kärnorna i kontrolllever, samstämmiga med tidigare analyser av leverknologi som visar att hepatocyter upptar 70−85% av vävnadsvolymen, men endast 45−50% av de totala levercellerna18,19. En liten men signifikant minskning av antalet HNF4α+ kärnor observeras under de första 14 dagarna av DDC-utfodring (figur 2F). En frekvensfördelningstomt för hepatocytkärnområdet (steg 6.2) visar en topp HNF4α + kärnområde i kontroll lever i 40−50 μm2 storleksområde, och en tydlig höger-förändring i kärnstorlek efter DDC skada (figur 2G); överensstämmer med ökad ploidy och hepatocellular hypertrofi12.

Hos friska (dag 0) kontrolllever har 63,4 % ± 1,7 % av HNF4α+-kärnorna ett "enkelt" cirkulärt morfometri (figur 5A). Denna siffra minskar till 46,8 % ± 5,7 % (P = 0,042) efter 21 dagars DDC-skada, vilket återspeglar ökad komplexitet i kärnmorfometri som förmodligen är förknippat med att flytta mellan ploidytillstånd under polyploidatisering (se "Tolkning av nukleär morfologi" nedan). Representativa exempel på nukleära knepsfördelningar som erhållits med denna metod i kontrollleversektioner visas i figur 5A, som beskriver hur interpolation av DNA-innehåll möjliggör stratifiering av enskilda celler i ett enda prov. Medelvärden för undergrupper av "komplexa" och "enkla" HNF4α+-celler visas också (figur 5A). Uppgifterna överensstämmer med tidigare uppskattningar av polyploiday i 80−90% av vuxna murine hepatocyter2. Frekvensen av komplexa kärnor (36,6% ± 1,7%) kontroll lever också approximerar binuclear celler (35%)20, även om data bör strikt betraktas som ett mått på nukleära snarare än cellulära knep (se "Tolkning av nukleära morfologi" nedan). Jämförelse av relativa knep mellan kontrollgrupper (dag 0) och DDC-behandlade grupper bör återspegla betydande förlust av 2c och 4c hepatocytekärnor med skada tillsammans med ökat antal >8c celler (figur 5B). Relativ positionsinformation för varje ploidy-undergrupp kan förhöras av punktdiagram av x-y-koordinater som är associerade med varje kärna inom datauppsättningen eller genom att hämta 2D-platsen för särskilda hepatocyte-delmängder inom programvaran för bildanalys med högt innehåll (figur 5C).

Kalibrering
För att bedöma giltigheten av den NPC-kalibreringsmetod som används utfördes dubbel immunomärkning av leversektioner med antikroppar mot HNF4α och proliferativ markör Ki-67 (figur 6A,B). Dessa data visade anrikning för Ki-67, som etiketter celler i alla aktiva faser av cellcykeln, på höger sida av NPC minimal DNA-distribution kurva (mellan S2c och S4c) - där NPC skulle förväntas replikera DNA och därför har >2c ploidy (figur 6A). Efter intern kalibrering av all kontroll och skadade leverprover studerade, Ki-67, var betydligt berikad (P & lt; 0,0001) i "enkla" NPC-kärnor med ett uppskattat knep på >2c (82,5 % ± 6,6 % SD, n = 12) jämfört med dem med ≤2c ploidy (17,5 % ± 6,6 % SD, n = 12) (figur 6B), vilket indikerar framgångsrik ploidykalibrering. Dessa data stöder giltigheten av den metod som används. Dessutom, förutsatt att korrekt trösklar av Ki67, ger de en viss kvantitativ inblick i i vilken utsträckning subekvatorial kärnmasker från högre ploidy grupper "förorena" grupper nedan.

För att ytterligare testa giltigheten av NPC-kalibreringsmetoden introducerades en extern kalibrator baserat på den tidigare rapporterade kärnvolymen av mus 2N hepatocyter (155,8 μm3)14. När denna siffra användes i kombination med ett genomsnittligt värde av Hoechst intensitet för HNF4a- kärnor den resulterande uppskattningen för genomsnittlig hepatocyte ploidy i kontroll levern var omöjlig att skilja från den interna (S2c)kalibrator (figur 6C). Dessutom var uppskattningar av genomsnittlig hepatocytplackidy hos möss av C57BL/6-musstammen av jämförbar ålder också likartade, vilket bekräftade att tidigare empirisk kunskap om 2N hepatocyte nukleärstorlek inte krävs, vilket gör denna internt kontrollerade metod för att uppskatta kärntrick helt autonom.

Tolkning av kärnmorometri
Den beskrivna metoden ger en ploidy avläsning för hepatocyte kärnor med "enkla" cirkulär morfometri. Uteslutandet av "komplexa" kärnor bygger på hypotesen att de utgör en andel binukleära hepatocyter med överlappande/vidrörande kärnmasker, vilket gör korrekt ploidybestämning för denna delmängd mer utmanande (figur 7A). Viktigt är att segregering av kärnor enligt cirkuläritet inte gör det möjligt för användaren att skilja mellan atomkärnorna hos mononukleära hepatocyter och de av binukleära celler, där två kärnor av liknande ploidy är tydligt åtskilda i cellen. Detta testades empiriskt genom att manuellt välja binuclear- och mononukleära celler från bilddatauppsättningarna och bedöma deras segregering genom algoritmen (figur 7B). Kärnor av binuclear hepatocyter som var fysiskt nära (figur 7C) men "inte röra" kategoriserades av algoritmen som "enkel", medan de som var "rörande" var tydligt diskriminerade som "komplexa". Därför ger denna analys inte en avläsning av cellulära knep i levern, med tanke på att kärnor av binukleära celler är uppdelade mellan "enkla" och "komplexa" underklasser (se Diskussion). Men en viss insikt i växlingen mellan stater av cellulära och nukleära knep kan vinnas från dessa uppgifter helt enkelt genom att rita histogram av nukleära morfologi och nukleära storlek och tillämpa en modell för hur "komplexa" och "enkla" stater övergår mellan under polyploidation (figur 7D). I kontroll lever tre faser (I−III) av nukleära morfologi är tydligt observerats (figur 7E). De representerar klustring av cirkulära 2N (I), 4N (II) respektive 8N (III) kärnmasker (vilket illustreras i figur 7D). Mononukleära 16N hepatocyter är extremt sällsynta i vuxna mus lever16,,18,21, därav 16N cellulära knep gruppen består nästan helt av binukleära celler med 8N atomkärnor, ligger inom och till höger, av fas III ( figur7E), förklarar nedgången i cirkuläritet till höger om fas III. Intressant, vid skada (DDC dag 14), en kvantitativ övergång till ökad komplexitet ("binuclearity") börjar i faser I (som återspeglar 2n till 2x2n) och faser III (återspeglar 8n till 2x8n), innan den slutligen konsolideras i alla tre faser (I−III). Författarna spekulerar att denna övergång till ökad komplexitet beror på en ökad cellulära knep till följd av avstannat cytokinesi, medan till höger om fas III den motsatta trenden observeras, på grund av ökad representation av cirkulära 16N mononukleära celler i den skadade levern på grund av att endoreplication. Dessa observationer måste naturligtvis testas genom att metoden anpassas till korrekt hänsyn till cellulärt knep (se Diskussion).

Figure 1
Bild 1: Sammanfattning av arbetsflödet. Levervävnaden skördas (1), kryosectioned (2), fast och immunmärkt med en HNF4α antikropp som gör det möjligt för parenkymala och icke-parenkymala celler (NCC) att diskrimineras (3). När prover har bearbetats digitaliseras de med hjälp av en bildplattform med hög innehåll med hjälp av automatisk bildtagning (4) och analys (5). Cellerna segmenteras efter Hoechsts kärnfluorescens och HNF4α-immunfluorescenströskel. Därefter beräknas Hoechst kärnområde ("A") och cirkuläritet ("C"). Slutligen analyseras data (6). HNF4α- NPC kvantifieras (i) och HNF4α+ hepatocytekärnor delas upp i två undergrupper ("enkla" och "komplexa") enligt kärncirkelhet (ii). Interpolering av hepatocytkärnepidy utförs sedan för alla "enkla" kärnkärnor som en funktion av kärnradie (r) och medelvärdet Hoechst fluorescensintensitet (som en proxy för nukleär DNA-densitet) (iii). Uppgifterna stratifieras sedan med NPC som en intern 2N-kalibrator (iv) innan en provsammanfattning (v) sammanställs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Bildanalys med högt innehåll och cytometrisk profilering av muslevern vid kronisk DDC-utfodring. ( A)En representativ konfokal bild av HNF4α/Hoechst immunofluorescensfärgning av den vuxna muslevern efter 21 dagars utfodring med en diet som innehåller 0,1% DDC. bilden visar rundade HNF4α+ hepatocytekärnor ("H") och expansion av HNF4α- NPC i områden som omger portalvenen ("PV"). (B)Exempel på optimal ("korrekt") och suboptimal ("felaktig") nukleär Hoechst-färgning som indikerar dålig fixering. (C)Användning av bildanalysplattform med hög genomströmning för att segregera hepatocyter och NPC enligt nukleär Hoechst-färgning och HNF4α-immunmärkning. Programvarumasker (röda/gröna linjer) visar hur kärnor är korrekt segmenterade enligt Hoechst fluorescens och sorteras i hepatocyter (+) eller NPC (-) enligt HNF4α status. (D)En guide för att optimera inställningarna för segmentering/tröskelanalys. Överlagrad kärnmasker som känns igen av programvaran indikeras av gröna/blå linjer för kärnsegmentering och grön/blå (HNF4α+) eller röd/blå (HNF4α-) för tröskelanalys (H = hepatocyter). Felsökning: Kärndetekteringskänsligheten är för låg (i) eller för hög (ii). Tröskelvärdet för HNF4α som är för lågt (iii) eller för högt (iv). (E,F) Kvantitativ analys av NPC- och hepatocytekärnor under DDC-utfodring: (E) HNF4α- och (F) HNF4α+ kärntäthet jämförs mot tidpunkten för DDC-behandling (dagar). Totalt analyserades 5,7 x 105 celler, från 4−6 djur per timepoint. Data presenteras som medelvärde + SEM. **P & 0.01 och ***P & 0.001. Enkelriktad ANOVA användes för att jämföra medel. Signifikans P-värden beräknades med Fishers minst signifikanta skillnadstest (LSD). G)Frekvensfördelning av HNF4α+ kärnkraftsområde under DDC-behandling. Uppgifterna visar en rätt-shift i hepatocyte kärnkraftsområdet under skada överensstämmer med cellulära hypertrofi och polyploidation. Totalt analyserades 2,5 x 105HNF4α+-kärnor, från 4−6 djur per timepoint. Denna siffra har ändrats från Manzano-Núñez et al.17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Automatiserad analys av hepatocyte nukleära knep med hjälp av anpassad skriftlig programvara. (A)Skärmdump som visar korrekt formatering av kalkylbladsdata för inmatning i programvaran för analys av kärnarpapp. Kolumner som innehåller viktiga data (steg 5.5 i protokollet) markeras gult. Alla kolumntitlar ska exakt matcha de angivna. (B) Skärmdump som visar hur enskilda kalkylbladsfiler som innehåller data från biologiska replikat ("Sample1", "Sample2", etc.) ska namnges och organiseras i undermappar för varje villkor (med titeln "Control-d0" och "Injured-d14" i det här exemplet). (C) Skärmdump efter framgångsrik installation av ploidy ansökan (röd cirkel). När programmet startas (genom att klicka på "Ploidy_Appl..") på fliken MINA APPAR i verktygsremsan visas "Ploidy_GUI" (nedre panelen). Experimentnamnet ("Exempel") och sökvägar till kontrolldatauppsättningarna (t.ex. "Control-d0") och testdatauppsättningar (t.ex. "Skadade-d14") anges innan du klickar på Kör. Programvaran beräknar, kalibrerar och stratifierar nukleärt knep för alla prover med hjälp av "Control-d0" datauppsättning för att generera trösklar för minimalt DNA-innehåll. (D)Datautdata från Ploidy_Application visar enskilda datafiler som automatiskt sparas i varje provmapp (i) som innehåller absoluta och procentuella tal av "enkla" kärnor i varje ploidygrupp. För varje villkor (i detta fall både "Control-d0" och "Injured-d14" genereras också automatiskt en sammanfattande mapp som innehåller genomsnittliga uppskattningar av kärntrick för alla "enkla" hepatocyter och icke-hepatocytekärnor (ii) och en uppdelning av hur kärntrick stratifieras för varje prov (iii). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Användning av NPC som intern ploidykalibrator. (A)Diagram som visar DDC-skadans inverkan på medelvärdet för minimal DNA-halt (m) hepatocyter (HNF4α+) och NPC-kärnor (HNF4α-). Alla data normaliseras till dag 0 NPC (n = 4 djur per timepoint). B)Histogram som beskriver fördelningen av NPCm-värden i ett enda representativt leverprov (dag 0, totalt 7 180 kärnor). Schemat (ovan) visar hur cirkulära NPC-masker kan härledas från celler med ett 2−4c DNA-innehåll. Syftet med kalibreringsmetoden är att definiera stratifieringströskeln som representerar 4c (S4c)vid den övre gränsen för NPCm-fördelningen (prickad linje), samtidigt som buller minimeras på grund av segmenteringsfel vid fördelningskurvans ytterligheter. CC) Förändringar i genomsnittlig Hoechst-intensitet och kärnområde för NPC-kärnor (HNF4α-) ritas. För att undvika segmenteringsfel granskas endast de kärnor med motsvarande NPCm-värde inom 1 SD i läget NPCm-värdet (gul ruta). Inom detta intervall beräknas och används 2c−4c-övergångsstorlek (t) som en ankarpunkt i data för att uppskatta S4c. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Hög genomströmning in situ-analys av nukleära ploidy i muslevern under kronisk DDC utfodring. (A)Analys av kontroll vuxen lever med den beskrivna metoden. HNF4α+ hepatocytekärnor från 2D-leversektioner är indelade enligt Hoechsts kärncirkulär cirkuläritet i två grupper: "enkel" och "komplex". -Jag vet inte vad du ska gå till. Representativ fluorescens Hoechst bilder av celler som tillhör dessa två grupper visas. -Jag vet inte vad du ska ta dig till. Scatterplot visar stratifiering av enkla HNF4α+ kärnor från ett prov (dag 0) enligt interpolerat ploidyvärde, kärnområde och genomsnittlig nukleär Hoechst-intensitet. -Jag vet inte vad du ska ta. Cirkeldiagram med uppgifter om den typiska nedbrytningen av HNF4α+ celler i kontrolllever (dag 0) som anger proportionerna för varje underklass för nukleärtrick. Totalt 6,7 x 104 HNF4α+ kärnor från 4 djur analyserades. ( B)Inverkan av DDC leverskada på hepatocyte nukleära knep genom hög genomströmning in situ-analys. Grafer visar den relativa minskningen av andelen 2c och 4c hepatocyte atomkärnor inom de första 14 dagarna av DDC utfodring medan >8c polyploida kärnor dramatiskt ökning i antal. Totalt analyserades 1,5 x 105 HNF4α+ kärnor (n = 4 djur per timepoint). Data presenteras som medelvärde + SEM. **P & 0.01 och ***P & 0.001. Enkelriktad ANOVA användes för att jämföra medel. Signifikans P-värden beräknades med Tukeys flertal jämförelsetest. C)Exempel för att visa hur underklasser av kärnpappalitet kan spåras rumsligt inom parenkymen med denna metod genom att förhöra högkvalitativa bilddata med samma kvantitativa kriterier som används för ploidystratifiering (cirkuläritet, kärnstorlek och genomsnittlig Hoechst-intensitet). Hoechst fluorescensbilder visas med programvarumasker (röda prickar) som markerar 2c kärnor i levern vid två tidpunkter under kronisk DDC-utfodring (dag 14 och 21). Portalvenen (blå prickad linje) och periportalområden där NPC expanderar (gul linje) anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Kritisk bedömning av NPC-kalibreringsmetoden. (A,B) Prolifererande NPC:er kategoriseras med en >2c ploidy-poäng. (A)Histogram av NPC minimal DNA-innehåll från kontroll lever immunmärkta med antikroppar mot HNF4α och proliferative markör Ki-67 (n = 4, data presenteras som medelvärdet + SEM). Stratifieringströsklar för 2c (S2c)och 4c (S4c)anges. b)Stratifiering av NPC enligt den beskrivna metoden resulterar i en betydande anrikning av Ki-67-immunmärkning i kärnor som tilldelats en >2c ploidypoäng (n = 12). Data presenteras som medelvärde + SEM. Unpaired t test användes för att jämföra medel **** P < 0,0001. CC) Extern validering av NPC-kalibreringsmetoden. Uppskattningar av genomsnittlig hepatocyt nukleärt knep som erhållits med den interna NPC-kalibratormetoden jämfördes med de uppskattningar som erhållits genom kalibrering av samma prover (Kontroll C57BL/6 muslever 3−4 månader, n = 4) med en känd kärnvolym för 2N hepatocyter14. Data presenteras också från två oberoende analyser21,22 som beskriver hepatocyte nukleärt trickidy från möss av samma stam i åldrarna 2−6 månader (visas till höger om den streckade linjen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Hepatocyte nukleära morfologi har en "komplex" relation med cellulära knep. (A)Sammanfattning av hur hepatocyte cellulära ploidy (2N, 4N, 8N och 16N) är delvis segregerad genom 2D-analys av nukleära morometri. Binuclearceller (röda) är indelade mellan "enkla" ("S") och "komplexa" ("C") morfometri beroende på om kärnor verkar röra eller inte. (B,C) Enskilda hepatocyter valdes manuellt och analyseras för nukleära morfometry och internuclear avstånd. B)Binuclear hepatocyter med "rörande" kärnor var "komplexa" (100 % ≤0,8), medan mononukleära celler (svarta) och binukleära hepatocyter med icke-rörande kärnmasker var "enkla" (94 % >0,8). (C)"Enkla" kärnor av binukleära hepatocyter kan skiljas från de mononukleära celler på grund av signifikant minskat internukleärt avstånd (n = 3, totalt 94 analyserade kärnor). (D)Modell som approximerar hur cellulärt ploidy tillstånd från panel A kan fördelas i termer av 2D nukleära morfologi och kärnområde vilket resulterar i klustring av enkla cirkulära former i fyra faser (I−IV). E)Jämförelse av HNF4α+ kärnmorometri/storleksritor med kontrolllever (dag 0) och efter 14 dagar (vänster) och 21 dagar (höger) DDC-skada. Morfometry faser anges ovan (I−V). Pilar indikerar förändringar i kärnmorometri till följd av skada som överensstämmer med binuklearisering av 2c ("a"), 4c ("b") och 8c ("c") kärnor, tillsammans med ökad mononuclearization av 16N cellulära ploidy klass (d). Totalt 29−30 x 103 kärnor analyserade per tillstånd (n = 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande filer: Demonstrationsdatauppsättningar. Klicka här för att se dessa filer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En hög-innehåll, hög genomströmning strategi för analys av vävnad ombyggnad och uppskattning av hepatocyte nukleära ploidy i murine levern beskrivs. När en användare är bekant med proceduren kan han eller hon bearbeta, avbilda och analysera flera exempel under en 3–5-dagarsperiod, vilket genererar stora testbara datauppsättningar som ger en detaljerad signatur av leverhälsa. Med tanke på att provberedningsmetoden är enkel, tillsammans med det stora antalet analyserade celler och vävnadsyta (i genomsnitt 14 mm2/prov),är resultaten robusta och mycket reproducerbara. Automatisering av bildtagning och analys tar också bort användarfel och potentiell partiskhet från dessa viktiga steg. En viktig nyhet är användningen av NPC som en intern ploidykalibrator som möjliggör relativ bedömning av hepatocyter kärn-DNA-innehåll både inom och mellan prover. Införlivande av ett HNF4α-märkningssteg är därför avgörande för att ge detta protokoll en unik teknisk fördel jämfört med tidigare publicerade 2D-metoder3,,12,22. Däremot gör den relativa enkelheten i metoden i jämförelse med 3D återuppbyggnad arbetsflöden18 det tekniskt mindre mödosam och potentiellt mer flexibel.

Jämfört med precisionsmetoden för flödescytometri är en viktig varning för att extrapolera nukleärt DNA-innehåll från 2D-vävnadssektioner det begränsade förtroende som kan hänföras till kategorisering av enskilda kärnor när det gäller ploidystatus. Till detta kommer den inneboende partiskheten inom SIA-baserade metoder för att överrepresentera mindre ploidy-undergrupper på grund av subekvatorialprovtagning. Genom att normalisera data till en intern standard och ta en stor populationsbaserad metod mildras dock felet på grund av dessa effekter och är jämförbart mellan olika urval. Hepatocyter kännetecknas av en mycket rundad nukleär morfologi, jämfört med till exempel NPC, vilket innebär att de är särskilt mottagliga för noggrann uppskattning av DNA-innehåll baserat på nukleära tvärsnittsarea ensam10,11,14,15,23. Den SIA-baserade metoden har förfinats i detta protokoll för att ta hänsyn till både kärnränlighet och DNA-densitet genom att integrera mått på morfometri och medelvärdet hoechst fluorescensintensitet vilket resulterar i en uppskattad "minimal DNA-innehåll" deskriptor för enskilda kärnor. Viktigt är att användningen av NPC-kort som en 2−4N-ploidykontroll utgör en viktig intern standard för objektiv kalibrering och stratifiering av minimalt kärn-DNA-innehåll, vilket gör att den metod som beskrivs är tillämplig på prover av någon art eller ett format, med tanke på att en lämplig antikropp för HNF4α (eller liknande hepatocytkärnnötsmarkör) kan anskaffas.

Även om bedömning av nukleära knep har visat sig ge användbara signaturer för leversjukdom progression10,13, för att fullt ut fastställa mångfalden av ploidy förändringar i levern skulle det vara både önskvärt och nödvändigt att anpassa den beskrivna metoden för att ta hänsyn till hanpatocellulära omkrets och därmed cellulära knep. Kartläggning av cellulära knep har tidigare uppnåtts genom märkning av hepatocyte omkrets med hjälp av markörer såsom beta catenin10,13,24, aktin12,,22 och cytokeratin10,11 i människa och mus lever prover. Men när detta testades efter DDC skada, dramatiska epitelial remodeling utesluts tillförlitlig bedömning av hepatocellular omkrets både av falloidin (data som inte visas) eller antikroppar mot beta catenin17. Även om detta tillvägagångssätt är genomförbart, kan det inte vara tillämpligt på alla skademodeller, men om det uppnås skulle förhandskartläggning av cellulärt knep samt göra uppskattningar av hepatocytestorlek och antal mer exakta. Det är också rimligt att mononukleära celler kan diskrimineras från "enkla" binuclearhemcyter genom att redovisa ytterligare nukleära parametrar, såsom internukleära avstånd (figur 7C),och att ytterligare segregering av "komplexa" binuclearceller skulle kunna uppnås genom radiella mätningar av kärnorna som deras 2D-masker innehåller.

Med tanke på att validerade HNF4α-antikroppar från människa finns för FFPE-vävnad25 och att intern kalibrering frigör denna metod för alla artspecifika begränsningar, är protokollet nästan omedelbart tillämpligt på humanprover. Således har det stor potential att ge ett riktmärke för hög genomströmning analys av hepatocyte nukleära knep och leverskada i mänskliga sjukdomar. Också, genom multiplexering med andra antikroppar, denna metod kan avslöja nya roller för särskilda hepatocyte delmängder och deras svar på leverskada och sjukdom. För detta ändamål har vi framgångsrikt kombinerat metoden med immunstainning för den proliferative nukleära markör Ki-67(Figur 6), som gör det möjligt att samla användbar information - inklusive identifiering av icke-prolifererande 2N populationer av NPC för förbättrad intern kalibrering av ploidy (Noon, opublicerade data 2019). Genom att koppla flexibiliteten till de positionella och kvantitativa data som metoden tillhandahåller föreslår vi därför att dess framtida tillämpningar kommer att förbättra förståelsen för polyploidys roll i levern.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av den spanska MINECO regeringens bidrag BFU2014-58686-P (LAN) och SAF-2017-84708-R (DJB). LAN stöddes av en nationell MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 och Plan GenT award (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) och FMN av ett regionalt ValI+D studentskap i Valencias Generalitat ACIF/2016/020. RP vill tacka professor Ewa K. Paluch för finansiering. Vi tackar Dr Alicia Martínez-Romero (CIPF Cytometri tjänst) för hjälp med IN Cell Analyzer plattform.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) TestDiet 1810704 Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) Invitrogen A11055 Dilution 1:500
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cryostat Leica CM1850 UV Leica biosystems CM1850 UV Tissue sectioning
Fluorescent Mounting medium Dako S3023
GraphPad Prism GraphPad Software Prism 8 Statistical software for graphing data
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Final concentration 5 µg/mL
IN Cell Analyzer 1000 GE Healthcare Bio-Sciences Corp High-Content Cellular Imaging and Analysis System
MATLAB MathWorks R2019a Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy
Microscope coverslides VWR International 630-2864 Size of 24 x 60 mm
Microsoft Office Excel Microsoft Speadsheet software
OCT Tissue Tek Pascual y Furió 4583
Paraformaldehyde Panreac AppliChem 141451.121
Pen for immunostaining Sigma-Aldrich Z377821-1EA 5mm tip width
Polysine Microscope Slides VWR International 631-0107
Rabbit polyclonal Anti-HNF4α Thermo Fisher Scientific PA5-79380 Dilution 1:250 (alternative)
Rabit polyclonal Anti-HNF4α Santa Cruz Biotechnology sc-6556 Dilution 1:200 (antibody used in the study)
Tween 20 Sigma-Aldrich P5927

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
  2. Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
  3. Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide? Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
  4. Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
  5. Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
  6. Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
  7. Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
  8. Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
  9. Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
  10. Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
  11. Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
  12. Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
  13. Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
  14. Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
  15. Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  16. Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
  17. Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
  18. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
  19. Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
  20. Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
  21. Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
  22. Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
  23. Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
  24. Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
  25. Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).

Tags

Medicin Nummer 158 lever polyploidy hepatocyte höginnehållsbild hepatologi Hepatocyte nukleär faktor 4 alfa (HNF4α)
En hög genomströmning in Situ metod för uppskattning av Hepatocyte Nuclear Ploidy hos möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manzano-Núñez, F., Peters, … More

Manzano-Núñez, F., Peters, R., Burks, D. J., Noon, L. A. A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice. J. Vis. Exp. (158), e60095, doi:10.3791/60095 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter