Complexome-profilering med høj opløsning ved Cryoslicing BN-MS-analyse

Summary

En alsidig cryoslicing bn-MS protokol ved hjælp af en mikrotomen er præsenteret for høj opløsning complexome profilering.

Abstract

Proteiner udøver generelt biologiske funktioner gennem interaktioner med andre proteiner, enten i dynamiske protein samlinger eller som en del af stabilt dannede komplekser. Sidstnævnte kan elegant løses efter molekyl størrelse ved hjælp af Native polyacrylamid gel elektroforese (BN-side). Koblingen af sådanne separationer til følsom massespektrometri (BN-MS) er veletableret og giver teoretisk mulighed for en udtømmende vurdering af det ekstruderbare complexome i biologiske prøver. Men denne fremgangsmåde er temmelig omstændelig og giver begrænset kompleks størrelse opløsning og følsomhed. Også, dens anvendelse er forblevet begrænset til rigelige mitokondrie og plastid proteiner. Derfor mangler der stadig oplysninger om integration i stabile protein komplekser for et flertal af proteiner. Præsenteret her er en optimeret tilgang til complexome profilering omfattende præparativ-skala BN-side separation, sub-millimeter prøveudtagning af brede gel baner ved cryomicrotome udskæring, og massespektrometrisk analyse med etiket-fri protein kvantificering. Procedurerne og værktøjerne til kritiske trin er beskrevet i detaljer. Som en applikation beskriver rapporten complexome analyse af en solubiliseret endosome-beriget membran fraktion fra mus nyrer, med 2.545 proteiner profileret i alt. Resultaterne viser identifikation af ensartede, lavtliggende membran proteiner såsom intracellulære Ionkanaler samt høj opløsning, komplekse protein samlings mønstre, herunder glykosylering isoformer. Resultaterne er i enighed med uafhængige biokemiske analyser. Sammenfattende giver denne metode mulighed for omfattende og upartisk identifikation af protein (Super) komplekser og deres underenhed sammensætning, der giver et grundlag for at undersøge støkiometri, samling, og interaktion dynamik af protein komplekser i enhver biologisk system.

Introduction

BN-PAGE separation blev først direkte koblet til LC-MS Analysis (BN-MS) af Majeran¹ og Wessels² forskergrupper ved hjælp af manuel UDSKÆRING af bn-Page gel Lanes. Deres analyser identificerede en række rigelige membran protein komplekser med kendte underenhed sammensætning fra plante blødninger og hek celle mitokondrier hhv. Disse analyser var imidlertid langtfra omfattende og gav ikke mulighed for objektiv identifikation af nye forsamlinger. Resultaterne af massespektrometre og mærknings frie kvantificeringsmetoder er blevet væsentligt forbedret siden da, hvilket har muliggjort omfattende mia-MS-analyser. Dette har opfundet udtrykket "complexome profilering". For eksempel, Heide og kollegaer analyseret rotte hjerte mitokondrier identificere og klyngedannelse 464 mitokondrie proteiner, hvilket bekræfter mange kendte forsamlinger. Desuden fandt de TMEM126B at være en roman og afgørende underenhed af en bestemt samling kompleks³. Sammenlignelige resultater (med 437 mitokondrie protein profiler) blev opnået i en parallel undersøgelse af hek celle mitokondrier⁴.

På trods af disse forbedringer er der stadig flere spørgsmål, som begrænser det fulde potentiale af BN-MS til complexome profilering. En væsentlig begrænsning er den effektive størrelses opløsning af komplekser, der er bestemt af to faktorer: (i) kvaliteten af BN-side separationen, som afhænger af ensartetheden af gel-matrix pore gradient såvel som stabiliteten/opløseligheden af prøve komplekser, og (II) trin størrelse af gel prøvetagning, som er i bedste 1 mm ved brug af konventionel manuel udskæring^5,6. Dårlig størrelse opløsning ikke kun savner subtile komplekse isoformer og heterogeneities, men det også negativt påvirker det dynamiske område og tillid af objektive, de Novo underenhed tildeling og kvantificering.

Andre udfordringer omfatter præcisionen af protein kvantificering og dækning af det faktiske dynamiske område af protein mængder i prøven ved massespektrometrisk analyse. Derfor har anvendelsen af bn-MS complexome profilering stort set været begrænset til biologiske prøver med lavere kompleksitet, høj ekspression af målkomplekser og gunstige solubilisering egenskaber (dvs. blødninger, mitokondrier og mikroorganismer)^6,7,8,9,10.

Vi har for nylig introduceret cryomicrotome Slicing-Assisted BN-MS (csBN-MS), som kombinerer præcis submillimeter prøvetagning af BN-side gel baner med omfattende MS-analyse og udførlige MS data processing til bestemmelse af protein profiler med høj tillid¹¹. Ansøgning til en mitokondriel membran forberedelse fra rotte hjerner demonstreret tidligere uopfyldte effektiv kompleks størrelse opløsning og maksimal dækning af oxidativ respiratorisk kæde kompleks (OXPHOS) under enheder (dvs., 90 af 90 MS-tilgængelig). Dette eksempel identificerede også en række nye protein samlinger.

Beskrevet her er optimerede procedurer for præparativ skala BN-side adskillelse af protein komplekser (ikke begrænset til en bestemt biologisk kilde), støbning af store præparative BN-side gels, cryomicrotome udskæring af brede gel baner, og MS data Behandling. Ydeevnen af høj opløsning profilering er demonstreret for en protein kompleks forberedelse fra mus nyre endosome-beriget membraner. Endelig diskuteres fordelene ved øget opløsning og præcision af massespektrometrisk kvantificering.

Protocol

1. præparativ BN-side

1. Gel præparat
   1. Brug et mellemstort format lodret gel elektroforese system (> 10 cm gel separationsafstand; 14 cm x 11 cm, 1,5 mm spacer) med effektiv køling indstillet til 10 °C.
   2. Støbt lineær eller hyperbolske pore gradient gel (1.5-3,0 mm Spacers) ved hjælp af en omrøring to-kammer gradient mixer drevet af en pumpe (Se tabel over materialer og reagenser). I det præsenterede eksempel (lineær gradient gel 1%-13%):
      1. Der fremstilles en 13 mL opløsning til forreste (blande) kammer bestående af: 13% acrylamid (fra 30% stamopløsning, 37,5:1,0 acrylamid: bisacrylamid), 0,75 M aminocapinsyre, 50 mM bis-tris (pH = 7,0) og 10% glycerol.
      2. Der fremstilles en 10 mL opløsning til reservoir kammeret bestående af: 1% acrylamid (fra 30% stamopløsning, 37,5:1,0 acrylamid: bisacrylamid), 0,75 M aminocapinsyre, 50 mM bis-tris (pH = 7,0) og 0,2% CL-47 vaskemiddel.
   3. Start omrører og tilsæt 30 mikroliter APS (ammonium peroxodisulfat, 10% stamopløsning) og 2,5 μL TEMED (N, N, N ', N'-tetramethyl ethylenediamin) og 2,5 mikroliter af TEMED til opløsningen i front kammeret. Start pumpen og Åbn den forreste ventil (strømmen skal justeres for at fuldføre støbning i 10 min). Efter 1 min. tilsættes 90 μL APS og 5 μL til opløsningen i reservoir kammeret og åbnes kammer tilslutningen.
   4. Lad gelen polymerisere langsomt, men grundigt i mindst 24 timer ved stuetemperatur (RT) for at generere en homogen pore størrelses gradient. Når den holdes fugtig, kan den polymeriserede gel opbevares oprejst ved 4 °C i op til 1 uge.
      Bemærk: med vilje vil toppen af gelen have en blød/slimet konsistens. Dette vil senere blive fjernet, men giver mulighed for jævn indtastning af proteiner i gelen, med minimal risiko for protein nedbør, der ellers kan føre til migration artefakter (dvs., striber eller protein nedbør).
2. Prøveforberedelse og lastning
   1. Forbered læsse åbninger ved at indsætte passende afstandsstykker (f. eks. silicium slanger) mellem glaspladerne til adskillelse af 0,5-2,0 mg protein. Åbningerne skal laves mindst 3 cm brede (eller bedre, 5-6 cm bred).
   2. Solubilize ~ 2,5 mg membran (mus nyre endosome-beriget præparat) i 2 ml solubilisering buffer indeholdende 1% (w/v) ikke-denatureringsmiddel (complexiolyte CL-47) for 30 min på is. Ultracentrifugate (afskæring af sedimentering = 200 S eller derunder; 130.000 x g/11 min bruges her).
   3. Solubilisat koncentreres på en kort 50%/20% (w/v, 0,3 ml hver) saccharose trin gradient af ultracentrifugering for 1 h ved 400.000 x g. Det endelige proteinudbytte bør være mindst 1 mg.
   4. Tilsæt 0,05% (w/v) Coomassie G-250 til solubilisate og læg prøven på gelen. Begræns protein belastningen til en 10-15 μg/mm² gel Lane tværsnit for at opnå høj opløsning og undgå artefakter som følge af protein udfældning.
3. Kørselsbetingelser for BN-side
   1. Ved kørsel af buffere forberedes en standard katode buffer bestående af 50 mM tricine, 15 mM bis-Tris og 0,01% Coomassie G-250. Forbered en standard anode buffer bestående af 50 mM bis-tris (pH = 7,0).
   2. Kør en præparativ BN-side ved 10 °C natten over ved hjælp af en tretrins spændings protokol¹³ bestående af: en ækvibrations fase i 30 min ved 100 v, derefter en langsom (3 h) rampe til maksimal spænding (40-50 V/cm gel længde), der endelig opretholdes i mindst 6 h for Endpoint fokusering af proteiner.
      Bemærk: det anbefales at sætte elektroforese på pause, når migrations fronten har nået midten af gelen og udveksler katode bufferen for frisk buffer uden Coomassie G250. Dette hjælper med at undgå nedbør artefakter i gelen som følge af lokale kollaps af matrix pore struktur.

2. prøvetagning og fordøjelse af gel

1. Excision af gelbaner
   1. Efter kørslen skal du scanne gelerne til dokumentationsformål, mens du holder den mellem glaspladerne.
   2. Demontering af pladerne og punkt på banen (e) Lane sektion (r) af interesse.
   3. Tag en prøvestrimmel af Lane til analyse af 2D BN/SDS-side og protein farvning eller Western blotting (som vist i figur 1B) for at bestemme regioner af interesse, effektiv kompleks størrelse opløsning, og protein overflod.
   4. Fastgør de valgte gelbaner to gange i mindst 30 min med 30% (v/v) ethanol og 15% (v/v) eddikesyre.
   5. Prøven overføres til indlejrings medium, og den kan suge og ækvibrere i mindst 2 timer ved 4 °C, mens gel-pladen holdes i slowmotion på en orbital shaker.
      Bemærk: gelseparationen skal inspiceres omhyggeligt for den samlede separations kvalitet og migrerings artefakter. Gel-bands, der repræsenterer dominerende proteiner, skal være forvrængnings frie og homogene i intensitet. Lokale artefakter på gelen skal exciseres eller lades ude af analyse.
2. Indlejring og kryomicrotome udskæring
   Bemærk: Dette er en forbedret version af indlejrings proceduren beskrevet og foto-dokumenteret tidligere, der giver mulighed for indlejring og udskæring af bredere gel baner på op til 8 cm¹¹.
   1. Først skæres faste gel baner i sektioner (her, 3 cm) nøjagtigt parallelt med protein migration front/band mønster. For lettere håndtering, placere hver sektion på en plastikfilm støtte med lige dimensioner.
   2. Overfør banerne til et åbent rør med propper (lukket på bunden, centralt perforeret på toppen, begge præcist justeret med de øvre og nedre ender af gel sektion).
   3. Dyp cylinderen kortvarigt i flydende nitrogen for hurtigt at påbegynde størkning. Den gennemsigtige indlejrings medium størkner inden for sekunder og bliver hvid i farve.
   4. Fyld hulrummet med indlejrings medium, kort dyp det i flydende nitrogen, og fryse cylinderen ved-20 °C i flere timer.
      Bemærk: afkøling af cylinderen hurtigt ved at dyppe den i flydende nitrogen hjælper med at undgå forskydning af gel pladen i røret. Forvrængning bør undgås for at sikre høj opløsning i følgende MS-analyse.
   5. Efter demontering fjernes plastik filmen og overføres blokken med den indlejrede gel sektion til en afkølet, større i diameter, metalcylinder placeret på en flad støtte (dvs. Petri skål) og forseglet med indlejring medium på yderside af cylinderen. Fyld cylinderen med indlejrings medium og fryse grundigt.
   6. Gentag denne procedure med den anden side af cylinderen for at opnå en solid blok med koplanare overflader.
   7. Fjern blokken fra cylinderen, lim den med indlejrings medium på en forkølet metalholder, og Sæt holderen i kryoslicing-maskinen (cryotome). Overfladen af blokken skal være omhyggeligt justeret med hensyn til udskæring flyet. Gør det muligt at ækvibrere ved den optimale temperatur for udsnitnings processen (her-15 °C).
      Bemærk: Brug en langsomt fremskridende manuel udskæring Cycle på 0,1 mm trin størrelse, indtil du rammer overfladen af den indlejrede gel sektion for at sikre korrekt positionering.
   8. Høst gel skiver den ene efter den anden, med en endelig ønsket tykkelse på 0,25 mm trin størrelse, og overføre dem individuelt til reaktions slanger med lav proteinbinding egenskaber.
      Bemærk: i denne opsætning kan ensartede gel skiver let opnås så tynde som 0,1 mm og så tyk som 0,5 mm.
3. Tryptic fordøjelse
   1. Udfør in-gel trypticase fordøjelse efter omfattende vask af gel skiver (mindst tre yderligere vaske runder anbefales at fjerne polymere komponenter i indlejrings mediet) efter en standardprocedure¹¹.
   2. Vakuum-tørre elueret peptider og genopløses i 0,5% (v/v) trifluoroeddikesyre ved omrystning ved 37 °c (10 min) efterfulgt af Bad sonikering (5 min) og kort centrifugering.

3. massespektrometri

1. nanoHPLC og MS set-up
   1. Ilægning af fordrevne prøver på en C18-forkolonne (partikelstørrelse = 5 μm; diameter = 300 μm) med 0,05% (v/v) trifluoroeddikesyre ved hjælp af en (Split-fri) Nano-HPLC koblet til et massespektrometer med høj opløsning.
   2. Elute opfangede peptider med en vandig-organisk gradient (eluent A): 5 min 3% B, 120 min fra 3% b til 30% B, 20 min fra 30% B til 99% B, 5 min 99% B, 5 min fra 99% B til 3% B, 15 min 3% B (strømningshastighed = 300 nL/min).
      Bemærk: csBN-MS gel-skiver resulterer typisk i prøver med lavt til mellemliggende peptid-overflod og en begrænset grad af kompleksitet. nanoLC-MS/MS-analyse bør derfor udføres med en opsætning, der giver rimelig følsomhed og sekvens hastighed, høj masse opløsning (> 100000) og maksimal dynamikområde (effektivt 3-4 størrelsesordener). Det kræver dog ikke lange Kolonnedimensioner eller elueringsgradienter, der forlænges ud over 3 timer.
   3. Separate elueret peptider i en emitter (id 75 μm; Tip = 8 μm) pakkes manuelt ca. 20 cm med C18-materiale (partikelstørrelse = 3 μm). Elektro spray prøverne ved 2,3 kV (positiv ion-tilstand) i det opvarmede overførings kapillar (250 °C) i massespektrometeret.
   4. Udfør analyser med følgende instrument indstillinger¹¹: maksimal MS/MS-indsprøjtningstidspunkt = 400 MS; udelukkelses varighed = 60 s; mindste signal tærskel = 5.000 tæller, top 10 prækursorer fragmenteret; Isolations bredde = 1,0 m/z).
      Bemærk: for at lette kalibrering af masse, retentions tid og tildeling af peptidsignaler i et stort antal datasæt eller målinger anbefales det at udføre de respektive MS-måle serier uden afbrydelser eller ændringer i parametre og hardware ( dvs. på samme C18-kolonne/-emitter).
2. Protein identifikation (MS data evalueret som beskrevet tidligere¹¹)
   1. Uddrag peak lister fra fragment ion Spectra ved hjælp af "msconvert. exe" værktøj (del af ProteoWizard).
   2. Skift alle prækursorer m/z værdier for hvert datasæt ved den mediane m/z offset af alle peptider tildelt proteiner i en foreløbig database Søg med 50 ppm peptid masse tolerance.
   3. Søg i de rettede spids lister med en egnet søgemaskine (her MASCOT 2.6.2) mod alle muse indgange i UniProtKB/Swiss-Prot-databasen (release 2018_11).
   4. Vælg "acetyl (protein N-term)", "Carbamidomethyl (C)", "GLN | pyro-Glu (N-term Q), Glu | pyro-Glu (N-term E) "," oxidation (M) "og" Propionamid (C) "som variable modifikationer.
   5. Sæt peptid og fragment masse tolerance til henholdsvis ± 5 ppm og ± 0,8 da, og Tillad en savnet trypticase spaltning. Indstil forventet værdi cut-off for peptid identifikation til 0,5 eller derunder. Brug en lokke database Search til at bestemme falsk positive Discovery rate (FDR). Fastsætte FDR til 1% eller anvende yderligere kvalitetskriterier for at sikre pålidelig identifikation.
      Bemærk: det præsenterede eksperiment identificerede mere end 3.500 proteiner, med et gennemsnitligt peptid FDR på 4,4 ± 0,77% (n = 101 skive prøver), eller 3.000 proteiner, når peptid FDR blev sat til 1%. Vigtigere er det, at der blev anvendt strengere kriterier til udvælgelse af profilerede proteiner (2.568). Det omfattede alle proteiner, der blev identificeret med mindst to peptider, hvoraf mindst en af dem er protein-specifikke, i mindst en af de 101 skive prøver.
3. Protein kvantificering
   1. Brug peptidsignal intensiteter (peak volumener [PVs]) til protein kvantificering, der er opnået fra FT fuld scanninger og korrigere for retentionstiden og masse Skift ved hjælp af passende software (her, MaxQuant v 1.6.3).
   2. Juster MS-datasæt én efter én til reference (samlet gennemsnit) peptidelueringstider ved hjælp af LOESS regression. Tildel PVs til peptider enten direkte (MS/MS-baseret identifikation) eller indirekte (dvs. baseret på deres matchende m/z og elueringstid inden for meget snævre tolerancer).
      Bemærk: denne protokol bruger in-House software til tildeling af "indsatte" kaldte peptider. Set parametre resulterer i effektiv m/z og elueringstid, der svarer til tolerancerne på henholdsvis ± 2 ppm og ± 1 min (Se figur 2A, B).
   3. Korrekt for systematiske køre-til-Run-variationer i peptidbelastningen og ioniserings effektiviteten ved nyskalering af peptidintensitet beregnet ud fra median forskellene mellem relative peptidintensiteter mellem tilstødende udsnit prøver (figur 2C).
   4. Filtrere PV-data for afvigende værdier og resterende falsk-positive tildelinger, der identificeres ved intern analyse af PV-konsistens.
   5. Normaliser PVs for hvert peptid til deres maksimumværdier over alle udsnit datasæt, som giver relative peptidtæthed profiler.
   6. Endelig beregnes relative protein overflod profiler som gennemsnit af mindst to (og op til seks eller 50%, hvilken værdi er større) af de bedste korrelation peptid profiler over et vindue på tre på hinanden følgende skiver. Dette gør det muligt at bygge manglende PV-værdier og reducere støjen.
      Bemærk: Dette resulterede endelig i 2.545 (af 2.568 præudvalgte) protein profiler (figur 2D).
4. Karakterisering af protein komplekser
   1. Analyser protein profiler ved først at udføre peak Detection ved hjælp af den lokale Maxima metode, og fortløbende passe normale fordelinger til disse toppe, hvilket giver positionen (dvs. skive indeks eller tilsyneladende komplekse størrelse) af deres Maxima og FWHM (fuld bredde på halv-maksimal intensitet) (Indsæt af figur 4).
      Bemærk: i datasættet analyseres profiler automatisk ved hjælp af brugerdefinerede scripts. De mindste FWHM-værdier er vejledende for den effektive størrelses opløsning af tilgangen (her 6 x 0,25 = 1,5 mm).
   2. Brug referenceprotein komplekse toppe med defineret molekylmasse (som rapporteret i UniProtKB/Swiss-Prot databasen) til lineær regressionsanalyse af log10 (forventet molekylmasse) værdier til at omdanne skive nummer indekser til tilsyneladende molekylære størrelser (dvs. tilsyneladende komplekse størrelse i kDa).
      Bemærk: 23 markerings komplekser i prøven blev udvalgt i dette studie (figur 4) baseret på (i) monodispers former af profil toppe, (II) eksperimentel støtte af molekylvægte, og (III) fordelinger langs de undersøgte bn-side gel sektioner.

Representative Results

Langt størstedelen af de konventionelle BN-MS-undersøgelser samt den nyligt etablerede csBN-MS-tilgang med høj opløsning er blevet anvendt på mitokondrie-og plastid-præparater, der er (i) let tilgængelige, (II) har begrænset kompleksitet, og (III) udtrykker mål (membran) protein komplekser ved høje tætheer. Denne protokol udvider anvendelsen af høj opløsning complexome profilering til ikke-mitokondrielle membraner udtrykker lav-rigelige proteiner, som kun få oplysninger om deres integration i komplekser er til rådighed. Til demonstrationsformål valgte vi en endosome-beriget membran præparat fra mus nyre opnået ved tæthed gradient centrifugering.

Optimering af denne forberedelse har været styret af markør protein TPC1, der danner intracellulære ion kanaler overvejende lokaliseret til tidlig og genbrug endosomes¹². Det er også stærkt udtrykt i renal proximale rørformede celler, som påvist ved immunohistokemisk analyse af nyre vævs sektioner (figur 1A). Disse membraner blev forsigtigt opløstes (ComplexioLyte 47 ved et lavt proteinindhold: vaskemiddel forhold på 1:8) og koncentreret på en saccharose pude ved ultracentrifugering. Sidstnævnte viste sig at være et vigtigt skridt for at fjerne overskydende lavere molekylvægt komponenter (dvs. vaskemidler, lipider, salte, organiske polymerer, og metabolitter), der har en tendens til at have en negativ indvirkning på opløsningen af præparative BN-side separationer.

Kompleks adskillelse på en indfødt 1%-13% (w/v) polyacrylamid gradient gel (figur 1B, midterste panel) viste stærkt farvede protein bånd med meget lidt migration artefakter. SDS-side adskillelse af en smal BN-side gel strimmel (figur 1B, ramme boxed i rødt) som en anden dimension efterfulgt af Western blot analyse viste et godt løst mønster af særskilte TPC1-associerede komplekse populationer (figur 1B , øvre panel, markeret med røde pile), sandsynligvis som følge af Association med yderligere proteinunderenheder og/eller posttranslationelle modifikationer (såsom glykosylering¹²). En 3 cm sektion af interesse blev skåret, fast, og forarbejdet til cryomicrotome udskæring som beskrevet¹¹. De enkelte trin i denne procedure (især den præcise justering af den brede gel-sektion), som er af afgørende betydning for at bevare opløsningen under prøveudtagningen, dokumenteres i den medfølgende video. Den indlejrede gel sektion blev endeligt skåret i 101 gel skiver med en ensartet tykkelse på 0,25 mm (figur 1B, lavere panel), som blev separat fordøjet og ANALYSERET af høj ydeevne LC-koblede massespektrometri.

Ud over størrelses opløsning er kvaliteten af protein kvantificering nøglen til vellykket complexome profilering. Med MS set-up og indstillinger, der anvendes, analyse af prøverne var ganske omfattende, hvilket resulterede i en gennemsnitlig identifikation af mere end 1.000 proteiner og 10.000 peptider (8.200 hvoraf var protein-specifikke) pr skive, og omkring 3.000 proteiner og 43.000 peptider (38.500 heraf var protein-specifikke) i alt. På grund af den stokastiske karakter af den dataafhængige MS/MS-sekvensering og dens begrænsninger i det dynamiske område var intensitets oplysninger dog stadig fragmentariske for mindre udbredte proteiner. Derfor blev en udførlig MS data processing procedure¹¹udført, der er baseret på præcis tildeling af peptid signaler (peak volumener [PVS] = peptid-relaterede signal intensiteter integreret over m/z og tid) over hele serien af datasæt.

Som vist i figur 2A, B, var afvigelser af peptidsignaler i masse-og retentionstiden, der forblev efter KALIBRERINGEN, identiske for MS-sekvenserede og for indirekte tildelte PVS (med meget snævre tolerancer for < 1 ppm og < 0,5 min for 95% af (PVs), hvilket indikerer en meget lav sats for falsk-positiv PV-tildeling. Resterende outliers blev filtreret baseret på deres konsistens med andre relaterede PVs. Da alle MS-målinger blev udført fortløbende på samme LC-MS-opsætning uden ændringer i parametre eller hardwarekomponenter, blev der kørt til Run-variationer (bestemt som median for alle PV-intensiteter i en prøve i forhold til dem i de tilstødende skiver). var små og let elimineret ved nyskalering af PV datasæt (figur 2C). Den resulterende peptid intensitet oplysninger blev derefter brugt til at rekonstruere 2.545 protein relative overflod profiler. Som vist i figur 2Dvar mere end 75% af disse protein profiler baseret på mindst tre uafhængige protein specifikke peptider.

Dernæst vurderede protokollen relevansen af trin størrelsen på BN-PAGE gel-prøveudtagning til opløsningen af protein komplekser. Til dette formål blev udsnit datasæt sammenføjet ved at opsummere PV-oplysningerne fra to, tre eller fire på hinanden følgende udsnit, hvilket simulerede resultatet for trinstørrelser på 0,5 mm, 0,75 mm og 1 mm (sammenlignet med den oprindelige prøveudtagning på 0,25 mm). Figur 3 illustrerer de resulterende overflod profiler for protein TPC1 som et eksempel (A-D). Ved 0,25 mm var relative intensiteter og størrelses adskillelse af TPC1-associerede komplekse populationer (figur 3A) pænt efter aftale med resultaterne fra Western blot-analyse (figur 1B, øvre panel); selv om profilen viste nogle støj, for det meste som følge af manglende værdier ("huller") i PV matrix anvendes til kvantificering.

To skiver svarende til 0,5 mm fastholdt de korrekte intensiteter og adskillelse af de TPC1-associerede komplekser og fjernede kvantificerings støj (figur 3B). I modsætning hertil førte større trinstørrelser på 0,75 mm og 1 mm (figur 3C, D) til et tab af størrelses opløsning og AFSKAFFEDE diskrimination af TPC1 komplekse delpopulationer. Det skal bemærkes, at langt størstedelen af de offentliggjorte konventionelle bn-MS-analyser bruger manuelt skåret 2 mm skiver (ca. 60 til at dække hele gelbanen)^7,8,9,10.

Konvertering af migrations afstand eller udsnit indeks til molekyl størrelse er generelt baseret på markører, enten kommercielt tilgængelige indfødte standard proteiner eller velkarakteriserede endogene protein komplekser med kendt underenhed sammensætning (for det meste [super] komplekser af mitokondrie oxidativ respirations kæde [oxphos])¹³. Da BN-PAGE-adskillelse imidlertid er baseret på det effektive molekylære tværsnit, der ikke kun bestemmes af molekyl massen, men også af 3D-strukturen og antallet af associerede lipider, vaskemiddel og Coomassie-molekyler, kan individuelle proteiner vise større afvigelser. Derfor blev det valgt at bruge større sæt af protein komplekser som markører¹¹. Plottet i figur 4 viser 23 udvalgte markører med en repræsentativ underenhed vist som en sort cirkel, der angiver log10 værdierne af dens forventede molekylære masse (ifølge UniProtKB/Swiss-Prot database) vs. udsnitsindekset for den tilsvarende profil peak maksimum. Sidstnævnte blev opnået fra automatiserede Gaussian passer til de relative overflod data, som vist i justerings af figur 4 viser eksemplet med chaperone BCS1. Lineær regression (rød linje) leverede en funktion til at konvertere udsnitsindeks værdier til tilsyneladende molekylære størrelser, som varierede fra 160-630 kDa, langs den undersøgte gel sektion.

Endelig fremlagde analysen oplysninger om velkarakteriserede komplekser og påviste eksistensen af nye under enheder og komplekse samlinger. Eksempler på forskellige aspekter af complexome er vist i figur 5 (A-C: proteiner, der udtrykkes eller fortrinsvis findes i endosomale rum; D-F: komplekser fra andre subcellulære lokaliseringer). Det jern-transport protein ferritin er kendt for at danne komplekser fra 24 lys (FRIL1) og/eller tunge (FRIH) under enheder, med en total molekylvægt på 440 kDa¹⁴ (figur 5a, fyldt pil). Under enheds profilerne (figur 5A) antyder eksistensen af mindst to mindre former af komplekset (med en tilsyneladende masse på 360 kDa og 340 kDa; åbne pile) med særskilte tunge/lyskæde støkiometre (bedre synlige efter nyskalering af Isæt af figur 5A), der er rigeligt til stede i endosomes.

I modsætning hertil, nicalin-nomo1^{komplekser 15} (figur 5D), gamma-sekretase Core Complex¹⁶ (figur 5B), og GPI-transamidase maskiner¹⁷ (figur 5E) viser faste overflod nøgletal for deres kerne under enheder i hele størrelsesintervallet og uafhængigt af Association med yderligere proteiner. Dette indikerer, at deres under enheder er eksklusive til hinanden. Vakuolar H⁺-ATPaser er multiprotein komplekser samlet fra en pulje på mere end 20 under enheder på en modulær måde med en total molekylvægt på ca. 900 kDa. Figur 5C afslører sub-komplekser med særskilte kompositioner fra mindst 17 under enheder, der enten repræsenterer biologiske (DIS) samle mellemprodukter eller subkomplekser genereret af forsøgsbetingelserne, hvoraf nogle også er blevet observeret i en nylig mia-MS-undersøgelse¹⁸. Et andet multi-protein kompleks eksempel er proteasomet¹⁹ (figur 5F). Tæt inspektion af de overflod profiler af alpha og beta under enheder danner 20S proteasomet kerne antyder to store komplekse populationer med subtile forskelle i størrelse (590 kDa og 575 kDa, indikeret med grå pile) og integration af tre beta-under enheder.

Kort sagt giver csBN-MS complexome-profilering af endosome-berigede nyre membraner omfattende og detaljerede resultater med hensyn til (i) integrering af ensartede, lav-rigelige målproteiner i komplekser, (II) generel kompleks sammensætning af under enheder og støkiometri og III) komplekse heterogeniteter, substrukturer og (DIS) samle mellemprodukter.

Figur 1: præparativ bn-side adskillelse af opløslede endosome-beriget membraner fra mus nyre ved hjælp af intracellulære kanal TPC1 som en markør. (A) immun Histokemisk LOKALISERING af TPC1 protein i renal proksimale tubuli ved Konfokal mikroskopi. Grøn: anti-TPC1 antistof¹² farvning visualiseret med sekundær Cy3-biotinyleret ged anti-kanin IgG; rød: biotinyleret Lotus tetragonolobus lektin (LTL, 10 μg/ml, FITC-konjugeret), som markerer den luminale overflade af proksimale tubulus-celler. Justerings viser farvning af en tilsvarende sektion fra en TPC1-ko nyre som en negativ kontrol. Hvide skala stænger er 20 μm. Også af note er stærk TPC1 udtryk i intracellulære vesikler, kendt fra uafhængige eksperimenter til at repræsentere tidligt og genbrug endosomes¹². B) PRÆPARATIV bn-side separation af 2,5 mg opløste endosome-berigede membraner på en 1%-13% (w/v) polyacrylamid gradient gel. En smal bane (indrammet i rødt) blev skåret for efterfølgende SDS-side/Western blot analyse (øverste panel), løse forskellige TPC1-associerede komplekser og glykosylering mønstre (røde pile: anti-TPC1/anti-kanin HRP/ECL Prime; grøn: positioner og forventet masser [MDa] af markør protein komplekser identificeret ved total protein farvning [SYPRO Ruby blot bejdsning]) af blottet. Fra højre mod venstre: na⁺/k⁺-transport ATPase, cytochrom b-C1 kompleks dimer, ATP syntase, NADH: ubiquinon oxidoreductase. En 3 cm sektion af interesse fra gel Lane blev fjernet, indlejret i væv indlejring medium, monteret, og skåret i 101 sektioner (0,25 mm) langs protein migration front ved hjælp af en cryomicrotome (lavere panel; Se video link). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: nøgleparametre, som bestemmer nøjagtigheden af MS-signal tildelingen og kvantificeringen samt analyse dybden. A) fordeling af relative masse fejl (i ppm) efter m/z-kalibrering af MS/MS-sekvenserede (røde bjælker) og indirekte tildelt (dvs. baseret på nøje matchende masse-og retentionstider, se protokol; blå bjælker) peptidsignaler. Dette antyder en endelig masse fejl på < 1 ppm (for 95% af signalerne/tildelte PVs) og meget lav rate af falske positive tildelinger. (B) fordeling af Nano-HPLC-retentionstiden afvigelser fra det samlede gennemsnit efter elueringstid justering af peptidsignaler ved hjælp af loess regression (Se protokol) og farvekodning som anvendt i (A). Tids fejl er mindre end 30 s for > 95% af peptidsignaler/tildelte PVs. (C) kørsel-til-Run-variation af de samlede MS-intensiteter afbildet i forhold til gennemsnittet af de to tilstødende prøver. Disse Skaleringsfaktorer blev anvendt på de rå PV-tabeller for at minimere systematiske tekniske fejl. (D) peptidoplysninger, der anvendes til beregning af relative tæthed profiler af proteiner. Efter filtrering af protein-specifikke peptider for afvigende værdier, dårligt scoret eller enkelte identifikationer (se protokollen) blev 2.545 protein overflod profiler fastlagt, > 75% af dem var baseret på mindst tre peptider med rimelig tillid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: kritisk effekt af trin størrelse i gel prøvetagning på complexome opløsning af TPC1. Datasæt blev forenet ved at opsummere signal intensiteterne i grupper på 1, 2, 3 og 4 på hinanden følgende skiver (A-D) og forarbejdet identisk for at simulere forskellige trinstørrelser i gel udskæring som angivet. Den TPC1 profil viser nogle (oversampling) støj på 0,25 mm men god størrelse opløsning af tre komplekse populationer (Se også figur 1B), som er stort set bevaret ved en 0,5 mm Trinbredde. Diskrimination af disse populationer går tabt, da 1 mm nærmer sig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: bestemmelse af den tilsyneladende molekylære vægt. 23 markerings komplekser med defineret molekyl sammensætning (som angivet ifølge UniProtKB/Swiss-Prot) blev anvendt som størrelses markører. Logaritmiske værdier af deres forventede molekylvægt (i kDa) blev afbildet vs. profil peak Maximum Slice index af den angivne repræsentative protein underenhed (fyldte cirkler i sort). Lineær regressions tilpasning til disse data (rød linje) leverede en funktion, der konverterer udsnitsindeks værdier til tilsyneladende molekylære vægte. Peak Maxima blev bestemt af automatiserede Gaussian passer til protein profil toppe som vist i justerings (højre) for chaperone protein BCS1 (primære data i blå, fit grænser indikeret af orange linjer, fit funktion i rødt). Hertil kommer, at disse passer fastsatte peak halv maksimale bredder (grøn linje, 6,5 skiver, eller 1,6 mm for eksemplet vist) med de skarpeste fokus komplekser spænder omkring en 1,5 mm gel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: eksempler på protein komplekse under enhedsprofiler. Relativ protein tæthed vs. tilsyneladende molekylvægt afbildet for tung og lys kæde af ferritin (A) afslørende Molekylær heterogenitet af ferritin underenhed støkiometri, tydeligere synlig efter nyskalering af mængder (inset). Udfyldt pil og åbne pile angiver henholdsvis det fulde kompleks (440 kDa) og to under komplekser. Gamma-sekretase (B) under enheder kvantitativt integreret i en enkelt-Core kompleks population. Under komplekserne af vakuolær H⁺-atpases (C) udstillede flere samlinger med distinkt under enheds sammensætning, alle udtrykt i endosomer. Nomo1-og nicalin-proteinerne (D) dannede et eksklusivt kompleks (GPI-transamidase), som er en multi-subunit enzymatisk maskine, der danner flere komplekser. E) 20 ' erne proteasomet Core Complex viser (F) en subtile subcomplex mønster med to populationer angivet med pile i grå, alle stammer fra andre subcellulære lokaliseringer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den præsenterede undersøgelse byggede på csBN-MS-teknikken, der tidligere var benchmærket med en mitokondriel forberedelse¹¹ og indarbejdet forbedringer i prøveforberedelse, gel behandling og MS dataevaluering. Fokuseret analyse af en del af den store separation BN-PAGE gel leverede et omfattende sæt data, der viste kvalitetsforanstaltninger svarende til studiet med mitokondrie membraner. Masse-og retentionstiden fejl samt køre-til-Run variationer blev holdt meget lav og gav grundlag for fastsættelsen af pålidelige protein overflod profiler. Størrelses opløsningen syntes at være god, med halv maksimale spids bredder så lavt som seks skiver (svarende til 1,5 mm, figur 4) og relative størrelsesforskelle på mindre end 10% forsvandt (figur 3, figur 5A). Disse værdier opfyldte ikke fuldt ud størrelses opløsnings kvaliteten af den tidligere csBN-MS-analyse af mitokondrier (på trods af den valgte mindre gel prøveudtagnings trin), men de er væsentligt bedre end ydeevnen af konventionelle BN-MS-eller size-eksklusions-MS nærmer sig²⁰ , der for nylig er blevet populære.

Betydningen af en høj effektiv kompleks størrelses opløsning understreges af simulerings eksperimentet i figur 3 (ved hjælp af TPC1-associerede komplekser), som næppe kan løses med 2D bn/SDS-Page Western blot-analyse (figur 1B). Disse resultater tyder på, at 0,25 mm udskæring i dette tilfælde resulterede i nogle oversampling, men det dette stadig viste sig at være nyttigt for eliminering af "kvantificering støj" uden at kompromittere effektiv størrelse opløsning. Således, i overensstemmelse med tidligere resultater¹¹, en prøveudtagnings trin størrelse på ~ 0,3 mm er generelt anbefalelig.

Navnlig er diskrimination af TPC1-associerede komplekser helt tabt med 1 mm gel prøvetagning, som er den mindste trin størrelse, der leveres af manuel udskæring i konventionelle bn-MS^5,6. Dette kan forklare det faktum, at trods kraftfulde MS-teknologier er tilgængelige, meget få protein komplekser og under enheder er blevet identificeret de Novo ved complexome profilering. Ud over den gode løsnings effekt tilbyder csBN-MS høj alsidighed. Membranbundne komplekser og opløselige protein komplekser, der spænder fra 50 kDa til flere MDa, kan løses effektivt i et enkelt eksperiment med minimum bias¹¹. Dette står i kontrast til alternative separationsteknikker, der anvendes til complexome profilering som størrelses udelukkelse eller ionbytningskromatografi, som opererer med undergrupper af opløselige proteiner med visse størrelsesintervaller eller opladnings egenskaber. På bagsiden er csBN-MS mindre skalerbar (maksimal belastning på ~ 3 mg protein pr. gel), kan være teknisk udfordrende og kan ikke automatiseres.

Samlet set viser resultaterne, at csBN-MS-baseret complexome-profilering kan anvendes med succes på ikke-mitokondrielle mål, men også indikerer nogle tilknyttede udfordringer. Således, effektiv udvinding og biokemiske stabilitet af protein komplekser kræver mere optimering, og rengøring trin og kan stadig være begrænset. Inden for den undersøgte størrelse vindue, antallet af velfokuserede, monodispers protein komplekser var faktisk betydeligt lavere (data ikke vist) sammenlignet med en mitokondrie prøve. Det anbefales også at sænke BN-side prøve belastninger for at opnå acceptabel gel separation. Højere belastninger kan kræve bredere gelbaner, der er vanskeligere at bearbejde korrekt til udskæring (Se medfølgende video). Desuden var protein kompleksiteten af prøverne højere (omkring to gange) end de mitokondria-afledte skive fordøjer, hvilket førte til mere manglende PV værdier og et reduceret dynamikområde. Faktisk manglede nogle små proteiner, der forventes at være en del af de komplekser, der er vist i figur 5 , i analyserne. Disse problemer kan løses i fremtiden ved hjælp af hurtigere og mere følsomme MS-instrumenter eller data-uafhængige erhvervelse modes.

Prøveforberedelse er meget kritisk for protein kompleks hentning, stabilitet og gel separations kvalitet. Parametre og procedurer bør optimeres for hvert kilde væv, celle lysat, membran (fraktion), og protein kompleks af interesse. Der gives følgende generelle anbefalinger, som kan medvirke til at forlænge ansøgninger fra csBN-MS:

i) at forberede prøverne frisk og undgå opvarmning/frysning, kraftige fortyndinger, ændringer i buffer forhold og unødvendige forsinkelser

II) anvendelse af buffere, der i det væsentlige er blottet for salte (Udskift med 500-750 mM betain eller aminocapolsyre), om en neutral pH-værdi, og som indeholder op til 1% (w/v) ikke-denatureringsmiddel (protein: forholdet mellem 1:4-1:10 og opløsningsmiddel for opløsning af membran protein komplekser, ingen vaskemiddel kræves til opløselige protein komplekser);

III) omhyggelig afprøvning og justering af vaskemiddel forholdene ved analytisk BN-side, da disse kan have en stærkt indvirkning på effektiviteten af kompleks opløselibilisering, repræsentation af membran protein komplekser i prøven, stabilitet og homogenitet af miceller af protein-vaskemiddel. Sidstnævnte er forudsætninger for proteiner til at fokusere som særskilte bands/komplekse populationer på BN-PAGE gels. Tidligere litteratur tilbyder en bred vifte af neutrale rengøringsmidler. Dog er DDM (n-dodecyl β-d-maltoside)^1,2,4,5,6 og digitonin^{3,5,7,8, 9,10,13,18} har været de mest populære valg for bn-MS analyser indtil videre. Det skal understreges, at enhver form for vaskemiddel tilstand nødvendigvis udgør et kompromis mellem opløselibiliserings effektivitet og bevarelse af protein interaktioner og måske ikke er lige velegnet til alle typer målprotein og udgangsmateriale;

IV) fjernelse af ladede polymerer som fibrier, filamenter, polylysin, DNA og rigelige komponenter med lavere molekylvægt (dvs. metabolitter, lipider eller peptider). Dette kan opnås ved ultracentrifugering, gel filtrering, eller dialyse. Dette er især vigtigt for total celle-eller vævs lysates;

v) tilsætning af Coomassie G-250 (endelig koncentration 0,05%-0,1%) og saccharose (for at øge tæthed for lastning, endelig koncentration 10%-20% [w/v]) til prøven lige før lastning, for at klare ved korte ultracentrifugering, indlæse prøven uden perturbation, og starte kørslen umiddelbart derefter.

Som et fremtidigt perspektiv tilbyder csBN-MS-baseret complexome-profilering muligheder for multiplexing for at studere protein kompleks dynamik eller ændringer i forbindelse med specifikke biologiske forhold. Kombineret adskillelse af metabolisk mærkede prøver som foreslået for størrelses udelukkelse baseret profilering²¹ forekommer ligetil, men det kan blive hæmmet af spontan udveksling af under enheder i komplekser, der opstår uafhængigt af den anvendte adskillelse Metode. Alternativt kan mærkede prøver løses i tilstødende gel baner, som derefter kan skæres sammen eller kombineres efter fordøje for differentiel analyse med høj følsomhed og robusthed.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio Rad	#1610158	Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13%
30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio Rad	#1610154	Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13%
SYPRO Ruby Protein Blot Stain	Bio Rad	#1703127	Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection
Coomassie Brilliant Blue G-250	Serva	no. 35050	Centrifugate stock solutions prior to use
ComplexioLyte 47	Logopharm	CL-47-01	Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins
Embedding Medium / Tissue Freezing Medium	Leica Biosystems	14020108926	Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome
Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm	Merck	IPVH00010
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE Healthcare	RPN2232
Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml	n.a.	n.a.	any supplier, important for making gel section embedding tool
broad razor blade	n.a.	n.a.	any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes
metal tube / cylinder, ca. 4 cm long	n.a.	n.a.	mold for embedding and freezing of gel samples
Protein LoBind Tubes, 1.5 ml	Eppendorf	Nr. 0030108116	highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption
sequencing-grade modified trypsin	Promega	V5111
C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm	Dionex / Thermo Scientific	P/N 160454
PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm)	New Objective	FS360-75-8
ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm)	Dr. Maisch GmbH	r13.93.	columns packed manually
rabbit anti-TPC1 antibody	Gramsch Laboratories	custom production	described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG	Vector Laboratories	CY-1300	described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated	Vector Laboratories	#B1325	described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
cryo-microtome Leica CM1950	Leica Biosystems	14047743905
Mini Protean II Cell with wetblot unit	Bio Rad	n.a.	for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more)
Penguin Midi Gel Electrophoresis System	PeqLab	n.a.	for BN-PAGE (not sold any more)
Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera	Zeiss / Photometrics	n.a.
peristaltic pump (IP high precision multichannel)	Ismatec	ISM940	for casting of gradient polyacrylamide gels
gradient mixer with stirring (two chambers)	selfmade, alternatively Bio Rad	1652000 or 1652001	for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)
ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor	Sorvall / Thermo Scientific	n.a.	for sample preparation (not sold any more)
UltiMate 3000 RSLCnano HPLC	Dionex / Thermo Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Orbitrap Elite mass spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMAZQ