Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

Summary

Een veelzijdig cryoslicing BN-MS protocol met behulp van een microtoom wordt gepresenteerd voor hoge-resolutie complexome profilering.

Abstract

Eiwitten oefenen over het algemeen biologische functies uit via interacties met andere eiwitten, hetzij in dynamische eiwit assemblages of als onderdeel van stabiel gevormde complexen. De laatste kan elegant worden opgelost volgens de moleculaire grootte met behulp van inheemse Polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). De koppeling van dergelijke scheidingen aan gevoelige massaspectrometrie (BN-MS) is goed vastgesteld en maakt theoretisch een uitputtende beoordeling mogelijk van de extractabele complexis in biologische monsters. Echter, deze aanpak is nogal moeizaam en biedt beperkte complexe grootte resolutie en gevoeligheid. Ook, de toepassing ervan is beperkt gebleven tot overvloedige mitochondriale en de eiwitten. Voor een meerderheid van eiwitten ontbreekt dus informatie over integratie in stabiele eiwitcomplexen nog steeds. Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerde aanpak voor complexome profilering bestaande uit de preparatieve schaal BN-pagina scheiding, sub-millimeter bemonstering van brede gellanes door cryomicrotome slicing, en massaspectrometrische analyse met label-vrije eiwit kwantificering. De procedures en hulpprogramma's voor kritieke stappen worden gedetailleerd beschreven. Als een toepassing, het rapport beschrijft complexome analyse van een ontbindend endosoom verrijkte membraan Fractie van muis nieren, met 2.545 eiwitten geprofileerd in totaal. De resultaten tonen identificatie van uniforme, laag-abundantie membraan proteïnen zoals intracellulaire ionenkanalen en hoge resolutie, complexe eiwit assemblage patronen, waaronder glycosylatie isoforms. De resultaten zijn in overeenstemming met onafhankelijke biochemische analyses. Kortom, deze methodologie maakt een alomvattende en onbevooroordeelde identificatie mogelijk van eiwit (Super) complexen en hun samenstelling van de subeenheid, wat een basis vormt voor het onderzoeken van stoichiometrie, assemblage en interactie dynamiek van eiwitcomplexen in biologisch systeem.

Introduction

BN-pagina scheiding werd voor het eerst direct gekoppeld aan LC-MS-analyse (BN-MS) door de onderzoeksgroepen Majeran¹ en Wessels² met behulp van handmatige segmentering van bn-page gel Lanes. Hun analyses identificeerden een aantal overvloedige membraan-eiwitcomplexen met bekende samenstelling van de subeenheid van planten plastiden en de mitochondriën van de HEK cellen, respectievelijk. Deze analyses waren echter verre van alomvattend en maakten geen objectieve identificatie van nieuwe assemblages mogelijk. De prestaties van massaspectrometers en de etiket vrije kwantificeringsmethoden zijn sindsdien aanzienlijk verbeterd, waardoor uitgebreide BN-MS-analyses zijn ingeschakeld. Dit heeft de term ' complexome profiling ' bedacht. Bijvoorbeeld, Heide en collega's geanalyseerd rat hart mitochondriën identificeren en clusteren 464 mitochondriale eiwitten, waardoor vele bekende assemblages te bevestigen. Daarnaast vonden ze TMEM126B een nieuwe en cruciale subeenheid van een specifiek assemblage complex³. Vergelijkbare resultaten (met 437 mitochondriale eiwit profielen) werden verkregen in een parallelle studie van de mitochondriën van de HEK cellen⁴.

Ondanks deze verbeteringen zijn er verschillende kwesties gebleven die het volledige potentieel van BN-MS voor complexome profilering beperken. Een belangrijke beperking is de effectieve grootte resolutie van complexen die wordt bepaald door twee factoren: de (i) kwaliteit van de BN-pagina scheiding, die afhangt van de uniformiteit van de gelmatrix porie gradiënt, evenals de stabiliteit/oplosbaarheid van de monster complexen, en (II) stapgrootte van de gel bemonstering, die op zijn best 1 mm bij het gebruik van conventionele handmatige snijden^5,6. Slechte grootte resolutie mist niet alleen subtiele complexe isovormen en heterogeneities, maar het heeft ook een negatieve invloed op het dynamische bereik en het vertrouwen van onbevooroordeelde, de Novo subeenheid toewijzing en kwantificering.

Andere uitdagingen zijn de precisie van de eiwit kwantificering en de dekking van het werkelijke dynamische bereik van proteïne Abundances in het monster door massa spectrometrische analyse. Daarom is de toepassing van bn-MS complexome profilering grotendeels beperkt gebleven tot biologische monsters met een lagere complexiteit, hoge expressie van doel complexen en gunstige solubilisatie-eigenschappen (d.w.z. plastiden, mitochondriën en micro-organismen)^6,7,8,9,10.

We introduceerden onlangs cryomicrotome slicing-Assisted BN-MS (csBN-MS), die nauwkeurige sub-millimeter bemonstering van BN-pagina gellanes combineert met uitgebreide MS-analyse en uitgebreide MS-gegevensverwerking voor de bepaling van eiwit profielen met hoge vertrouwen¹¹. Toepassing op een mitochondriale membraan preparaat van rat hersenen toonde eerder onvervulde effectieve complexe grootte resolutie en maximale dekking van oxidatieve respiratoire keten complex (OXPHOS) subeenheden (dat wil zeggen, 90 van 90 MS-toegankelijk). Dit voorbeeld identificeerde ook een aantal nieuwe eiwit assemblages.

Hier beschreven zijn geoptimaliseerde procedures voor preparatieve schaal BN-pagina scheiding van eiwitcomplexen (niet beperkt tot een bepaalde biologische bron), het gieten van grote preparatieve BN-pagina gels, cryomicrotome segmentering van brede gelbanen en MS data Verwerking. Prestaties van hoge resolutie profilering wordt aangetoond voor een eiwit complex preparaat van muis nier endosome-verrijkt membranen. Ten slotte worden de voordelen van het verhogen van de resolutie en de nauwkeurigheid van massaspectrometrische kwantificering besproken.

Protocol

1. preparatief BN-pagina

1. Gel preparaat
   1. Gebruik een middel-naar-groot formaat verticale gel elektroforese systeem (> 10 cm gel scheiding afstand; 14 cm x 11 cm, 1,5 mm spacer) met effectieve koeling ingesteld op 10 °C.
   2. Gegoten lineaire of hyperbolische porie gradiënt gel (1,5-3,0 mm spacers) met behulp van een roeren twee-kamer gradiënt mixer aangedreven door een pomp (Zie tabel met materialen en reagentia). In het gepresenteerde voorbeeld (lineaire gradiënt Gel 1%-13%):
      1. Bereid een 13 mL oplossing voor de voorste (Meng) kamer bestaande uit: 13% acrylamide (van 30% stamoplossing, 37,5:1.0 acrylamide: bisacrylamide), 0,75 M aminocapinezuur, 50 mM bis-tris (pH = 7,0), en 10% glycerol.
      2. Bereid een 10 mL oplossing voor de reservoir kamer bestaande uit: 1% acrylamide (van 30% stamoplossing, 37,5:1.0 acrylamide: bisacrylamide), 0,75 M aminocaproïnezuur, 50 mM bis-tris (pH = 7,0), en 0,2% CL-47 reinigingsmiddel.
   3. Start de roerder en Voeg 30 micro liters APS (ammonium peroxodisulfaat, 10% stockoplossing) en 2,5 μL TEMED (N, N, N ', N'-tetramethylethyleendiamine) en 2,5 microliter TEMED toe aan de oplossing in de voorste kamer. Start de pomp en open de klep aan de voorzijde (debiet moet worden afgesteld om het gieten in 10 minuten te voltooien). Voeg na 1 minuut 90 μL APS en 5 μL TEMED toe aan de oplossing in de reservoir kamer en open de kamer aansluiting.
   4. Laat de gel langzaam, maar grondig voor ten minste 24 uur polymeriseren bij kamertemperatuur (RT) om een homogene poriegrootte gradiënt te genereren. Bij vochtig gehouden kan de gepolymeriseerde gel rechtop worden bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.
      Opmerking: met opzet zal de bovenkant van de gel een zachte/Slimy consistentie hebben. Dit zal later worden verwijderd, maar zorgt voor een soepele invoer van eiwitten in de gel, met een minimaal risico op eiwit precipitatie dat anders kan leiden tot migratie artefacten (dat wil zeggen, strepen of eiwit precipitatie).
2. Monstervoorbereiding en laden
   1. Laadsleuven voorbereiden door geschikte spacers (bijv. siliconen buizen) tussen de glasplaten te plaatsen voor het scheiden van 0,5-2,0 mg eiwit. De sleuven moeten worden gemaakt ten minste 3 cm breed (of beter, 5-6 cm breed).
   2. Solubilize ~ 2,5 mg membraan (muis nier endoeen-verrijkt preparaat) in 2 ml solubilisatie buffer met 1% (w/v) niet-denaturerende reinigingsmiddel (complexiolyte cl-47) gedurende 30 min op ijs. Ultracentrifugate (afsnijden van sedimentatie = 200 S of minder; hier wordt 130.000 x g/11 min gebruikt).
   3. Concentreer de solubilisate op een korte 50%/20% (w/v, 0,3 ml elk) sucrose stap gradiënt door ultracentrifugatie voor 1 h bij 400.000 x g. De uiteindelijke eiwitopbrengst moet ten minste 1 mg zijn.
   4. Voeg 0,05% (w/v) Coomassie G-250 toe aan de solubilisate en laad het monster op de gel. Beperk de eiwit belasting tot een doorsnede van 10-15 μg/mm² gel Lane om hoge resolutie te verkrijgen en artefacten te voorkomen die voortvloeien uit eiwit precipitatie.
3. BN-pagina hardloop condities
   1. Voor het uitvoeren van buffers, bereid een standaard kathode buffer bestaande uit 50 mM tricine, 15 mM bis-Tris, en 0,01% Coomassie G-250. Bereid een standaard anode-buffer bestaande uit 50 mM bis-tris (pH = 7,0).
   2. Voer een preparatieve BN-pagina uit bij 10 °C 's nachts met behulp van een driefasenspanningsprotocol¹³ bestaande uit: een evenwichts fase voor 30 min bij 100 V, dan een langzame (3 uur) helling naar maximale spanning (40-50 v/cm gellengte) die ten minste 6 uur lang wordt gehandhaafd voor Endpoint focus van eiwitten.
      Opmerking: het wordt aanbevolen om elektroforese te onderbreken wanneer de migratie voorzijde het midden van de gel heeft bereikt en de kathode buffer voor verse buffer uitwisselde zonder Coomassie G250. Dit helpt om te voorkomen dat precipitatie artefacten in de gel die voortvloeien uit de lokale ineenstorting van de matrix poriënstructuur.

2. gel bemonstering en spijsvertering

1. Excisie van gelbanen
   1. Scan na de uitvoering de gels voor documentatiedoeleinden en houd deze tussen de glazen platen.
   2. Demonteer de platen en accijns op de rijstrook sectie (s) die van belang is.
   3. Neem een monster strook van de baan voor analyse met 2D BN/SDS-PAGE en eiwit kleuring of Western blotting (zoals weergegeven in Figuur 1B) om de regio's van belang, effectieve complexe grootte resolutie en eiwit overvloed te bepalen.
   4. Repareer geselecteerde gellanes tweemaal gedurende minstens 30 min met 30% (v/v) ethanol en 15% (v/v) azijnzuur.
   5. Breng het monster over naar het insluitings medium en laat het gedurende ten minste 2 uur op 4 °C weken en equilibraten, terwijl de gelplaat in slow motion op een rondschudapparaat blijft.
      Opmerking: de scheiding van de gel moet zorgvuldig worden gecontroleerd op algehele scheidings kwaliteit en migratie artefacten. Gelbanden die dominante eiwitten vertegenwoordigen, moeten vervormingsvrij en homogeen van intensiteit zijn. Lokale artefacten op de gel moeten worden weggesneden of uit de analyse worden weggelaten.
2. Insluiten en cryomicrotome snijden
   Opmerking: dit is een verbeterde versie van de beschreven insluitings procedure en eerder foto-gedocumenteerd die het mogelijk maakt om bredere gellanes van maximaal 8 cm¹¹in te sluiten en te snijden.
   1. Snijd eerst vaste gelbanen in secties (hier, 3 cm) precies parallel aan het eiwit migratie front/band patroon. Voor eenvoudiger gebruik, plaats elke sectie op een plastic film ondersteuning met gelijke afmetingen.
   2. Breng de rijstroken in een open buis met stoppers (gesloten op de bodem, centraal geperforeerd op de bovenkant, beide nauwkeurig uitgelijnd met de bovenste en onderste uiteinden van de gel sectie).
   3. Dompel de cilinder kort in vloeibare stikstof om het stollen snel te initiëren. Het transparante insluitings medium verstevigt binnen enkele seconden en wordt wit van kleur.
   4. Vul de holte met insluitings medium, dompel het kort in vloeibare stikstof en Vries de cilinder gedurende enkele uren bij-20 °C.
      Opmerking: koeling van de cilinder snel door het dompelen in vloeibare stikstof helpt om verplaatsing van de gelplaat in de buis te voorkomen. Vervorming moet worden vermeden om een hoge resolutie te waarborgen in de volgende analyse van de MS.
   5. Na demontage, verwijder de plastic folie en breng het blok met de ingesloten gelsectie naar een gekoelde, grotere diameter, metalen cilinder geplaatst op een vlakke steun (dat wil zeggen, Petri schaal) en verzegeld met insluitings medium aan de buitenkant van de cilinder. Vul de cilinder met insluitings medium en Vries grondig.
   6. Herhaal deze procedure met de andere kant van de cilinder om een solide blok met coplanaire oppervlakken te verkrijgen.
   7. Verwijder het blok uit de cilinder, lijm het met het insluitings medium op een voorgekookte metalen houder en steek de houder in de cryoslicing machine (cryotome). Het oppervlak van het blok moet zorgvuldig worden uitgelijnd ten opzichte van het snijden vlak. Laat het op de optimale temperatuur voor het snijproces (hier,-15 °C).
      Opmerking: gebruik een langzaam voortschrijdend handmatige snijden cyclus van 0,1 mm stapgrootte tot het oppervlak van het ingesloten gelgedeelte raakt om een juiste positionering te garanderen.
   8. Oogst de gelschijfjes een voor een, met een uiteindelijke gewenste dikte van 0,25 mm stapgrootte, en breng ze afzonderlijk over naar reactie buizen met lage eiwitbinding eigenschappen.
      Let op: in deze set-up kunnen uniforme gelschijfjes gemakkelijk worden verkregen zo dun als 0,1 mm en zo dik als 0,5 mm.
3. Tryptische spijsvertering
   1. Voer in-gel tryptische spijsvertering na uitgebreide wassing van de gelschijfjes (ten minste drie extra wasronden worden aanbevolen om polymere componenten van het insluitings medium te verwijderen) volgens een standaardprocedure¹¹.
   2. Vacuümdrooggeeleerde peptiden en reoplossen in 0,5% (v/v) trifluorazijnzuur door schudden bij 37 °C (10 min) gevolgd door Bad sonicatie (5 min) en korte centrifugeren.

3. massaspectrometrie

1. nanoHPLC en MS set-up
   1. Laad verteerde monsters op een C18-voor kolom (deeltjesgrootte = 5 μm; diameter = 300 μm) met 0,05% (v/v) trifluorazijnzuur met behulp van een (gesplitste vrije) nano-HPLC gekoppeld aan een massaspectrometer met hoge resolutie.
   2. Elute veroverde peptiden met een waterige-organische gradiënt (eluent A): 5 min. 3% B, 120 min van 3% B tot 30% B, 20 min van 30% B tot 99% B, 5 min 99% B, 5 min van 99% B tot 3% B, 15 min 3% B (debiet = 300 nL/min).
      Opmerking: csBN-MS-gelschijfjes resulteren meestal in monsters met een lage tot gemiddelde peptide overvloed en een beperkte mate van complexiteit. de analyse van nanoLC-MS/MS moet daarom worden uitgevoerd met een set-up die redelijke gevoeligheid en sequentie snelheid biedt, hoge massa resolutie (> 100000) en het maximale dynamische bereik (effectief 3-4 ordes van grootte). Het vereist echter geen lange kolom afmetingen of elutie-gradiënten die langer zijn dan 3 uur.
   3. Aparte geeleerde peptiden in een emitter (i.d. 75 μm; Tip = 8 μm) handmatig verpakt ongeveer 20 cm met C18-materiaal (deeltjesgrootte = 3 μm). Elektrospray de monsters bij 2,3 kV (positieve ionen modus) in het verwarmde overdrachts capillair (250 °C) van de massaspectrometer.
   4. Voer analyses uit met de volgende instrumentinstellingen¹¹: maximale MS/MS injectie tijd = 400 MS; uitsluitings duur = 60 s; minimale signaaldrempel = 5.000 tellingen, Top 10 precursoren gefragmenteerd; isolatie breedte = 1,0 m/z).
      Opmerking: ter vergemakkelijking van de kalibratie van de massa, retentietijd en toewijzing van peptide signalen in een groot aantal gegevenssets of metingen, wordt aanbevolen om de respectieve MS-meetreeksen uit te voeren zonder onderbrekingen of wijzigingen in parameters en hardware ( dat wil zeggen, op dezelfde C18-kolom/emitter).
2. Eiwit-identificatie (MS-gegevens geëvalueerd zoals eerder beschreven¹¹)
   1. Extract piek lijsten van fragment Ion spectra met behulp van de "msconvert. exe" tool (onderdeel van ProteoWizard).
   2. Verschuiving van alle voorloper m/z-waarden voor elke gegevensset door de mediane m/z offset van alle peptiden toegewezen aan eiwitten in een voorlopige database zoeken met 50 ppm peptide massa tolerantie.
   3. Doorzoek de gecorrigeerde Peak lists met een geschikte zoekmachine (hier, mascotte 2.6.2) tegen alle muis ingangen van de UniProtKB/Swiss-Prot database (release 2018_11).
   4. Selecteer "acetyl (proteïne N-term)", "Carbamidomethyl (C)", "GLN | Pyro-glu (N-term Q), Glu | Pyro-glu (N-term E) "," oxidatie (M) ", en" Propionamide (C) "als variabele modificaties.
   5. Stel peptide en fragment massa tolerantie tot ± 5 ppm en ± 0,8 da, en laat een gemiste tryptische decolleté. Stel de verwacht waarde cut-off voor Peptide-id 0,5 of minder. Gebruik een Decoy database zoeken om te bepalen van de vals-positieve Discovery rate (FDR). Stel de FDR in op 1% of pas aanvullende kwaliteitscriteria toe om een betrouwbare identificatie te garanderen.
      Opmerking: het gepresenteerde experiment identificeerde meer dan 3.500 eiwitten, met een gemiddelde peptide FDR van 4,4 ± 0,77% (n = 101 segment monsters), of 3.000 eiwitten wanneer peptide FDR was ingesteld op 1%. Belangrijker is dat er strengere criteria werden gehanteerd voor de selectie van geprofileerde eiwitten (2.568). Het omvatte alle eiwitten die werden geïdentificeerd met ten minste twee peptiden, waarvan ten minste één eiwit-specifiek, in ten minste één van de 101 segment monsters.
3. Eiwit kwantificering
   1. Gebruik Peptide signaal intensiteiten (piekvolumes [PVs]) voor eiwit kwantificering die zijn verkregen van FT volledige scans en correct voor retentietijd en massa verschuivingen met behulp van de juiste software (hier, MaxQuant v 1.6.3).
   2. Lijn MS-gegevenssets één voor één uit naar (totale gemiddelde) peptide elutie-tijden met behulp van loess regressie. Wijs Pv's toe aan peptiden, hetzij rechtstreeks (MS/MS-gebaseerde identificatie) of indirect (d.w.z. op basis van hun overeenkomende m/z-en elutie tijd binnen zeer nauwe toleranties).
      Opmerking: dit protocol gebruikt in-House software voor de toewijzing van de "ingevoegde" peptiden. Ingestelde parameters resulteren in effectieve tolerantie toleranties voor m/z en elutie tijd van respectievelijk ± 2 ppm en ± 1 min (Zie Figuur 2A, B).
   3. Correct voor systematische Run-to-run variaties in peptide belasting en ionisatie-efficiëntie door peptide intensiteit schaalaanpassing berekend op basis van de mediane verschillen van relatieve peptide intensiteiten tussen naburige segment monsters (Figuur 2C).
   4. Filter PV-gegevens voor uitschieters en resterende vals-positieve toewijzingen geïdentificeerd door interne PV-consistentie analyse.
   5. Normaliseer Pv's van elke peptide naar hun maximale waarden over alle segment gegevenssets die relatieve peptide abundantie profielen opleveren.
   6. Ten slotte, bereken relatieve eiwit abundantie profielen als gemiddelden van ten minste twee (en maximaal zes of 50%, welke waarde is groter) van de beste corgerelateerde peptide profielen over een venster van drie opeenvolgende segmenten. Dit maakt het overbruggen van ontbrekende PV-waarden mogelijk en vermindert ruis.
      NB: Dit resulteerde uiteindelijk in 2.545 (van 2.568 vooraf geselecteerde) eiwit profielen (Figuur 2D).
4. Karakterisering van eiwitcomplexen
   1. Analyseer eiwit profielen door eerst piek detectie uit te voeren met behulp van de lokale maxima-methode en de normale verdelingen op deze pieken af te passen, waardoor de positie (d.w.z. segment index of schijnbare complexe grootte) van hun maxima en FWHM (volledige breedte bij maximale intensiteit) (inset van Figuur 4).
      Opmerking: in de gegevensset worden profielen automatisch geanalyseerd met behulp van aangepaste scripts. De kleinste FWHM waarden zijn indicatief voor de effectieve grootte resolutie van de aanpak (hier, 6 x 0,25 = 1,5 mm).
   2. Gebruik referentie-eiwit complexe pieken met gedefinieerde moleculaire massa (zoals gerapporteerd in de UniProtKB/Swiss-Prot-database) voor lineaire regressieanalyse van de log10 (voorspelde moleculaire massa) waarden om Segmentnummer indices om te zetten naar schijnbare moleculaire grootten (d.w.z. een schijnbare complexe grootte in kDa).
      Opmerking: in deze studie werden 23 marker complexen in het monster geselecteerd (Figuur 4) op basis van (i) deeltjes vormen van profiel pieken, (II) experimentele ondersteuning van molecuulgewichten, en (III) distributies langs de onderzochte bn-pagina gelsecties.

Representative Results

De overgrote meerderheid van de conventionele BN-MS-studies en de recentelijk vastgestelde hoge-resolutie csBN-MS-aanpak zijn toegepast op mitochondriale en Plastide preparaten die (i) direct beschikbaar zijn, (II) beperkte complexiteit hebben, en (III) uitdrukkelijke doelwit (membraan) eiwitcomplexen bij hoge dichtheden. Dit protocol breidt de toepassing van High-Resolution complexome profilering uit naar niet-mitochondriale membranen die lage overvloedige eiwitten uitdrukken, waarover weinig informatie over hun integratie in complexen beschikbaar is. Voor demonstratiedoeleinden hebben we gekozen voor een endosome-verrijkt membraan preparaat van muis nier verkregen door dichtheidsgradiënt centrifugeren.

Optimalisatie van dit preparaat is geleid door de marker proteïne TPC1 die intracellulaire ionkanalen vormt die overwegend gelokaliseerd zijn voor vroege en recycling endosomes¹². Het wordt ook sterk uitgedrukt in nierproximale tubulaire cellen, zoals aangetoond door immunohistochemische analyse van nierweefsel secties (Figuur 1A). Deze membranen werden zachtjes gesolubiliseerd (ComplexioLyte 47 bij een laag eiwit: detergentia ratio van 1:8) en geconcentreerd op een sacharose kussen door ultracentrifugatie. De laatste bleek een belangrijke stap te zijn voor het verwijderen van overtollige lagere moleculair gewicht componenten (d.w.z. detergenten, lipiden, zouten, organische polymeren en metabolieten) die de neiging hebben om een negatieve invloed op de resolutie van de preparatieve BN-pagina scheidingen.

Complexe scheiding op een native 1%-13% (w/v) Polyacrylamide gradiënt gel (Figuur 1B, middelste paneel) toonde sterk gekleurd eiwit bands met zeer weinig migratie artefacten. SDS-PAGE scheiding van een smalle BN-pagina gelstrip (Figuur 1b, frame in rood) als tweede dimensie gevolgd door de westerse Blot-analyse toonde een goed opgelost patroon van verschillende TPC1-geassocieerde complexe populaties (Figuur 1b , bovenste paneel, gekenmerkt door rode pijlen), hoogstwaarschijnlijk als gevolg van associatie met aanvullende eiwit subeenheden en/of posttranslationele modificaties (zoals glycosylatie¹²). Een deel van de interesse van 3 cm werd voor cryomicrotome snijden, zoals beschreven in¹¹, uitgeschechtigd, gefixeerd en verwerkt. De afzonderlijke stappen van deze procedure (met name de precieze uitlijning van de brede gelsectie), die van cruciaal belang is voor het behoud van de resolutie tijdens de bemonstering, worden gedocumenteerd in de begeleidende video. Het ingesloten gelgedeelte werd uiteindelijk in 101 gelschijfjes gesneden met een uniforme dikte van 0,25 mm (Figuur 1B, onderste paneel), die afzonderlijk werden verteerd en GEANALYSEERD door High Performance LC-gekoppelde massaspectrometrie.

Naast de grootte resolutie is de kwaliteit van de eiwit kwantificering essentieel voor succesvolle complexome profilering. Met de ingestelde en gebruikte instellingen van de MS was de analyse van de monsters behoorlijk uitgebreid, wat resulteerde in een gemiddelde identificatie van meer dan 1.000 eiwitten en 10.000 peptiden (waarvan 8.200 eiwit-specifiek waren) per segment, en rond 3.000 eiwitten en 43.000 peptiden (waarvan 38.500 eiwit-specifiek) in totaal. Niettemin, als gevolg van de stochastische aard van data-afhankelijke MS/MS sequencing en de beperkingen in dynamisch bereik, intensiteits informatie was nog fragmentarisch voor minder overvloedige eiwitten. Daarom is een uitgebreide MS-gegevensverwerkings procedure¹¹uitgevoerd die is gebaseerd op nauwkeurige toewijzing van peptide signalen (piekvolumes [PVS] = peptide-gerelateerde signaal intensiteiten die over m/z en tijd zijn geïntegreerd) over de gehele reeks gegevenssets.

Zoals weergegeven in Figuur 2A, B, zijn afwijkingen van de peptide signalen in massa en retentietijd die bleven na de kalibratie identiek voor MS-Sequenced en voor indirect toegewezen pv's (met zeer nauwe toleranties van < 1 ppm en < 0,5 min voor 95% van de PVs), indicatief voor een zeer laag tarief voor vals-positieve PV-toewijzing. Resterende uitschieters werden gefilterd op basis van hun consistentie met andere gerelateerde Pv's. Aangezien alle MS-metingen opeenvolgend zijn uitgevoerd op dezelfde LC-MS-opstelling zonder wijzigingen in parameters of hardwarecomponenten, worden Run-to-run variaties (bepaald als de mediaan van alle PV-intensiteiten in een monster ten opzichte van die in de naburige segmenten) waren klein en gemakkelijk geëlimineerd door schaalbaarheid van de PV-gegevenssets (Figuur 2C). De resulterende peptide intensiteits informatie werd vervolgens gebruikt voor het reconstrueren van 2.545 eiwit relatieve abundantie profielen. Zoals weergegeven in Figuur 2D, was meer dan 75% van deze eiwit profielen gebaseerd op ten minste drie onafhankelijke proteïne-specifieke peptiden.

Vervolgens beoordeelde het protocol de relevantie van de stapgrootte van BN-PAGE gel sampling voor de oplossing van eiwitcomplexen. Voor dit doel werden segment gegevenssets samengevoegd door de PV-informatie op te nemen uit twee, drie of vier opeenvolgende segmenten, waardoor de uitkomst voor stap grootten van 0,5 mm, 0,75 mm en 1 mm werd gesimuleerd (vergeleken met de oorspronkelijke steekproef van 0,25 mm). Figuur 3 illustreert de resulterende abundantie profielen voor eiwit TPC1 als voorbeeld (A-D). Bij 0,25 mm waren de relatieve intensiteiten en de grootte scheiding van TPC1-geassocieerde complexe populaties (Figuur 3A) goed in overeenstemming met de resultaten van de Western Blot-analyse (Figuur 1B, bovenste paneel); Hoewel, het profiel toonde enige ruis, meestal als gevolg van ontbrekende waarden ("gaps") in de PV-matrix gebruikt voor kwantificering.

De samenvoeging van twee segmenten overeenkomend met 0,5 mm hield de juiste intensiteiten en scheiding van de TPC1-geassocieerde complexen en verwijderde kwantificerings ruis (Figuur 3B). De grotere stapgroottes van 0,75 mm en 1 mm (Figuur 3C, D) leidden daarentegen tot een verlies van de grootte resolutie en de afschaffing van discriminatie van TPC1 complexe subpopulaties. Opgemerkt moet worden dat de overgrote meerderheid van gepubliceerde conventionele bn-MS-analyses handmatig gesneden 2 mm-sneden (rond 60 om de hele gellane te bedekken)^7,8,9,10.

Conversie van migratie afstand of segment index naar moleculaire grootte is over het algemeen gebaseerd op markers, ofwel commercieel verkrijgbare native standaard eiwitten of goed gekarakteriseerde endogene eiwitcomplexen met bekende subeenheid compositie (meestal [Super] complexen van de Mitochondriale oxidatieve Ademhalings keten [OXPHOS])¹³. Aangezien BN-pagina scheiding echter is gebaseerd op de effectieve moleculaire dwarsdoorsnede die niet alleen wordt bepaald door de moleculaire massa, maar ook door de 3D-structuur en het aantal geassocieerde lipiden, detergens en Coomassie-moleculen, kunnen individuele eiwitten grotere afwijkingen. Daarom werd gekozen voor het gebruik van grotere sets van eiwitcomplexen als markers¹¹. De plot in Figuur 4 toont 23 geselecteerde markeringen met een representatieve subeenheid die wordt weergegeven als een zwarte cirkel, met vermelding van de log10-waarden van de voorspelde moleculaire massa (volgens de UniProtKB/Swiss-Prot-database) versus de segment index van het corresponderende profiel piek maximum. De laatste werden verkregen van geautomatiseerde Gaussiaanse past op de relatieve overvloed gegevens, zoals weergegeven in de inzet van Figuur 4 toont het voorbeeld met chaperonne BCS1. Lineaire regressie (rode lijn) voorzag in een functie om segment indexwaarden om te zetten in schijnbare moleculaire grootten, die varieerden van 160-630 kDa, langs de onderzochte gelsectie.

Tot slot heeft de analyse informatie verschaft over goed gekarakteriseerde complexen en het bestaan van nieuwe subeenheden en complexe assemblages aangetoond. Voorbeelden van verschillende aspecten van de complexome worden weergegeven in Figuur 5 (a-C: eiwitten uitgedrukt of bij voorkeur in endosomale compartimenten; D-F: complexen van andere subcellulaire lokalisaties). Het ijzer-transporterende eiwit Ferritine is bekend om complexen te vormen van 24 lichte (FRIL1) en/of zware (FRIH) subeenheden, met een totaal molecuulgewicht van 440 kDa¹⁴ (Figuur 5a, gevulde pijl). De subeenheid profielen (Figuur 5A) suggereren het bestaan van ten minste twee kleinere vormen van het complex (met een schijnbare massa van 360 kDa en 340 kDa; open pijlen) met verschillende zware/lichte ketting stoichiometrieën (beter zichtbaar na het opnieuw abundanten, inzet Figuur 5A) die overvloedig aanwezig zijn in endosomes.

In tegenstelling tot de nicalin-nomo1 complexen¹⁵ (Figuur 5D), het gamma-secretase kern complex¹⁶ (Figuur 5B), en de GPI-transamidase machine¹⁷ (Figuur 5E) tonen vaste abundantie verhoudingen van hun kern subeenheden over het gehele omvang bereik en onafhankelijk van de associatie met extra eiwitten. Dit geeft aan dat hun subeenheden exclusief voor elkaar zijn. Vacuolar H⁺-atpases zijn multi-proteïne complexen samengesteld uit een pool van meer dan 20 subeenheden op een modulaire manier met een totaal molecuulgewicht van ongeveer 900 kDa. Figuur 5C onthult subcomplexen met verschillende composities uit ten minste 17 subeenheden, ofwel biologische (DIS) assemblage tussen producten of subcomplexen die worden gegenereerd door de experimentele omstandigheden, waarvan sommige ook zijn waargenomen in een recente BN-MS studie¹⁸. Een ander multi-proteïne complex voorbeeld is het proteasoom¹⁹ (Figuur 5F). Nauwe inspectie van de abundantie profielen van de Alfa-en bèta-subeenheden die de 20s proteasoom core suggereert twee grote complexe populaties met subtiele verschillen in grootte (590 kDa en 575 kDa, aangegeven door grijze pijlen) en de integratie van drie bèta-subeenheden.

Samengevat, csbn-MS complexome profilering van endosome-verrijkte niermembranen bieden uitgebreide en gedetailleerde resultaten met betrekking tot de (i) integratie van uniforme, laag-overvloedige doel eiwitten in complexen, (II) algemene complexe subeenheid samenstelling en en (III) complexe heterogeneities, substructuren en (DIS) assemblage tussen producten.

Figuur 1: preparatieve bn-pagina scheiding van opgeloste endosome-verrijkte membranen van muis nier met behulp van intracellulaire kanaal TPC1 als een marker. A) immunohistochemische LOKALISATIE van TPC1 eiwit in renale proximale tubuli door confocale microscopie. Groen: anti-TPC1 antilichaam¹² kleuring gevisualiseerd met secundaire Cy3-biotinylated geit anti-konijn IgG; rood: biotinyleerd Lotus tetragonolobus lectine (LTL, 10 μg/ml, FITC-geconjugeerd) markeert het Luminale oppervlak van proximale tubulus cellen. De inzet toont kleuring van een corresponderende sectie van een TPC1-KO nier als een negatieve controle. Witte schaal staven zijn 20 μm. Ook van nota is sterke TPC1 expressie in intracellulaire blaasjes, bekend van onafhankelijke experimenten om vroege en recycling endosomes¹²te vertegenwoordigen. B) voorbereiding van bn-pagina scheiding van 2,5 mg opgeloste endosome-verrijkt membranen op een 1%-13% (w/v) Polyacrylamide gradiënt gel. Een smalle baan (ingelijst in rood) werd gesneden voor volgende SDS-page/Western Blot analyse (bovenste paneel), het oplossen van verschillende TPC1-geassocieerde complexen en glycosylatie patronen (rode pijlen: anti-TPC1/anti-konijn HRP/ecl Prime; groen: posities en voorspelde massa's [MDa] van marker-eiwitcomplexen geïdentificeerd door totale eiwit kleuring [SYPRO ruby Blot Stain]) van de Blot. Van rechts naar links: na⁺/k⁺-het transporteren van ATPase, cytochroom b-C1 complex dimer, ATP SYNTHASE, NADH: ubiquinone oxidoreductase. Een 3 cm rubriek van de belangstelling van de gel Lane werd weggesneden, ingebed in weefsel insluiting medium, gemonteerd, en gesneden in 101 secties (0,25 mm) langs de eiwit migratie front met behulp van een cryomicrotome (onderste paneel; zie video link). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: belangrijke parameters die de nauwkeurigheid bepalen van de signaal toewijzing en-kwantificering van MS en de diepte van de analyse. A) verdeling van de relatieve massa fouten (in ppm) na m/z-kalibratie van MS/MS-geordend (rode balken) en indirect toegewezen (d.w.z. op basis van nauw overeenkomende massa-en retentietijden, zie protocol; blauwe staven) peptide signalen. Dit suggereert een definitieve massa fout van < 1 ppm (voor 95% van de signalen/toegewezen Pv's) en zeer lage frequentie van vals positieve toewijzingen. B) distributie van nano-HPLC-retentietijd afwijkingen van het totale gemiddelde na de elutie tijd van peptide signalen, met behulp van loess regressie (Zie Protocol) en kleurcodering zoals gebruikt in (a). Tijd fout is minder dan 30 s voor > 95% van peptide signalen/toegewezen PVs. (C) variatie in Run-to-run van totale MS-intensiteiten uitgezet ten opzichte van het gemiddelde van de twee naburige monsters. Deze schaalfactoren werden toegepast op de ruwe PV-tabellen om systematische technische fouten te minimaliseren. D) peptide informatie die wordt gebruikt voor de berekening van relatieve abundantie profielen van eiwitten. Na het filteren van eiwit-specifieke peptiden voor uitschieters, slecht gescoord, of enkele identificaties (Zie Protocol), 2.545 eiwit abundantie profielen werden bepaald, > 75% van die waren gebaseerd op ten minste drie peptiden met redelijk vertrouwen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: kritische impact van stapgrootte in gel bemonstering op complexome resolutie van TPC1. Gegevenssets werden samengevoegd door het optellen van de signaal intensiteiten in groepen van 1, 2, 3 en 4 opeenvolgende segmenten (A-D, respectievelijk) en identiek verwerkt om verschillende stapgroottes te simuleren in gelslicing zoals aangegeven. Het TPC1-profiel toont enkele (oversampling) ruis op 0,25 mm maar een goede resolutie van drie complexe populaties (Zie ook Figuur 1B), die grotendeels wordt bewaard bij een stap breedte van 0,5 mm. De discriminatie van deze populaties gaat verloren als 1 mm wordt benaderd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: bepaling van het schijnbare molecuulgewicht. 23 marker complexen met gedefinieerde moleculaire samenstelling (zoals aangegeven, volgens UniProtKB/Swiss-Prot) werden gebruikt als grootte markeringen. Logaritmische waarden van hun verwachte molecuulgewichten (in kDa) werden uitgezet versus de maximale segment index van de profiel piek van de aangegeven representatieve proteïne-subeenheid (gevulde cirkels in zwart). Lineaire regressie aanpassing aan deze gegevens (rode lijn) voorzag in een functie om segment indexwaarden om te zetten in schijnbare molecuulgewichten. Piek maxima werden bepaald door geautomatiseerde Gaussiaanse past op eiwit profiel pieken zoals weergegeven in de inzet (rechts) voor de chaperonne eiwit BCS1 (primaire gegevens in blauw, passen grenzen aangegeven door oranje lijnen, Fit functie in het rood). Bovendien, deze past bepaalde piek helft-maximale breedtes (groene lijn, 6,5 segmenten, of 1,6 mm voor het getoonde voorbeeld) met de scherpste focus complexen verspreid over een 1,5 mm gel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: voorbeelden van eiwit complexe subeenheid profielen. Relatieve eiwit overvloed VS. schijnbaar moleculair gewicht uitgezet voor de zware en lichte keten van Ferritine (a) die de moleculaire heterogeniteit van de Ferritine-subeenheid van de stoichiometrie onthult, duidelijker zichtbaar na het rescaleren van abundanties (inzet). Gevulde pijl en open pijlen duiden de volledige complex (440 kDa) en twee subcomplexen, respectievelijk. De subeenheden van het gamma-secretase (B) zijn kwantitatief geïntegreerd in een single-core complexe populatie. De subcomplexen van vacuole H⁺-atpases (C) vertoonden meerdere assemblages met een duidelijke samenstelling van de subeenheid, allemaal uitgedrukt in endosomes. De nomo1 en nicalin eiwitten (D) vormden een exclusief complex (de GPI-transamidase), een multi-subunit enzymatische machine die meerdere complexen vormt. (E) het proteasoom-kern complex van 20s toont (F) een subtiel subcomplex patroon met twee populaties aangegeven door pijlen in het grijs, allemaal afkomstig van andere subcellulaire lokalisaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

De gepresenteerde studie gebouwd op de csbn-MS techniek eerder gebenchmarkt met een mitochondriale voorbereiding¹¹ en opgenomen verbeteringen in monstervoorbereiding, gel verwerking, en MS data-evaluatie. Gerichte analyse van een deel van de grootschalige scheiding BN-pagina op voorwaarde dat een uitgebreide set van gegevens tonen van kwaliteitsmetingen vergelijkbaar met de studie met mitochondriale membranen. Massa-en retentietijd fouten, evenals Run-to-run variaties werden zeer laag gehouden en de basis voor het bepalen van betrouwbare eiwit overvloed profielen. De grootte resolutie leek goed te zijn, met de helft-maximale piek breedtes zo laag als zes sneetjes (overeenkomend met 1,5 mm, Figuur 4) en relatieve grootte verschillen van minder dan 10% verdwenen (Figuur 3, Figuur 5A). Deze waarden niet volledig voldoen aan de grootte resolutie kwaliteit van de vorige csBN-MS analyse van mitochondriën (ondanks de kleinere gel bemonstering stapgrootte gekozen), maar ze zijn aanzienlijk beter dan de prestaties van conventionele BN-MS of grootte-uitsluiting MS benaderingen²⁰ die onlangs populair geworden.

Het belang van een hoge effectieve complexe grootte resolutie wordt onderstreept door het simulatie-experiment in Figuur 3 (met behulp van de TPC1-geassocieerde complexen) dat nauwelijks kan worden opgelost met 2D bn/SDS-page Western Blot analyse (Figuur 1B). Deze resultaten suggereren dat de 0,25 mm snijden in dit geval resulteerde in een aantal oversampling, maar dit bleek nog steeds nuttig voor de eliminatie van "kwantificerings ruis" zonder afbreuk te doen aan de effectieve grootte resolutie. Dus, in overeenstemming met de vorige resultaten¹¹, een steekproef stapgrootte van ~ 0,3 mm is over het algemeen aan te bevelen.

Met name, discriminatie van TPC1-geassocieerde complexen is volledig verloren met 1 mm gel bemonstering, dat is de kleinste stapgrootte voorzien door handmatig snijden in conventionele bn-MS^5,6. Dit kan verklaren dat ondanks het feit dat krachtige MS-technologieën beschikbaar zijn, zeer weinig eiwitcomplexen en subeenheden geïdentificeerd zijn door complexome profiling. Naast zijn goede oplossend vermogen biedt csBN-MS een grote veelzijdigheid. Membraangebonden complexen en oplosbare eiwitcomplexen variërend van 50 kDa tot verschillende MDa kunnen effectief worden opgelost in een enkel experiment met minimale bias¹¹. Dit contrasteert met alternatieve scheidingstechnieken die worden gebruikt voor complexome profilering zoals grootte uitsluiting of ionenwisselingschromatografie, die werken met subsets van oplosbare eiwitten met bepaalde grootte bereiken of laad eigenschappen. Aan de andere kant, csBN-MS is minder schaalbaar (maximale belasting van ~ 3 mg eiwit per gel), kan technisch uitdagend zijn, en kan niet worden geautomatiseerd.

Over het algemeen tonen de resultaten aan dat op csBN-MS gebaseerde complexome profilering met succes kan worden toegepast op niet-mitochondriale doelstellingen, maar ook enkele bijbehorende uitdagingen aangeven. Dus, efficiënte extractie en biochemische stabiliteit van eiwitcomplexen vereisen meer optimalisatie, en schoonmaak stappen en kan nog steeds beperkt zijn. Binnen het onderzochte formaat venster was het aantal goed gerichte, deeltjes eiwitcomplexen inderdaad aanzienlijk lager (gegevens niet weergegeven) in vergelijking met een mitochondriaal monster. Het wordt ook aanbevolen om de monster belasting van BN-PAGINA'S te verlagen om acceptabele gelschei ding te verkrijgen. Voor hogere belastingen kunnen bredere gellanes nodig zijn die moeilijker te verwerken zijn voor snijden (Zie begeleidende video). Bovendien, eiwit complexiteit van de monsters was hoger (rond twee-voudige) dan de mitochondriën-afgeleide segment verteerd, wat leidt tot meer ontbrekende PV-waarden en een verminderd dynamisch bereik. Sommige kleine eiwitten die naar verwachting deel zouden uitmaken van de in Figuur 5 getoonde complexen ontbreken in de analyses. Deze problemen kunnen in de toekomst worden opgelost door het gebruik van snellere en meer gevoelige instrumenten van de MS of Data-onafhankelijke acquisitie modes.

Monstervoorbereiding is zeer kritisch voor eiwit complex ophalen, stabiliteit en gel scheiding kwaliteit. Parameters en procedures moeten worden geoptimaliseerd voor elk bron weefsel, cellysaat, membraan (breuk) en eiwit complex van belang. De volgende algemene aanbevelingen zijn beschikbaar die kunnen helpen bij het uitbreiden van toepassingen van csBN-MS:

i) het bereiden van verse monsters en het vermijden van opwarming/bevriezing, sterke verdunningen, veranderingen in buffer condities en onnodige vertragingen;

II) het gebruik van buffers die in wezen verstoken zijn van zouten (vervangen door 500-750 mm betaïne of aminocapinezuur), over een neutrale pH en bevattende maximaal 1% (w/v) van niet-denaturerende detergens (eiwit: detergens verhouding tussen 1:4-1:10 voor solubilisatie van membraan eiwitcomplexen, geen wasmiddel nodig voor oplosbare eiwitcomplexen);

III) zorgvuldige tests en aanpassing van detergenten voorwaarden door analytische BN-pagina, aangezien deze een sterk effect kunnen hebben op de efficiëntie van complexe solubilisatie, weergave van membraan-eiwitcomplexen in het monster, de stabiliteit en de homogeniteit van eiwit-reinigingsmiddel micellen. De laatste zijn voorwaarden voor eiwitten om zich te concentreren als verschillende bands/complexe populaties op BN-PAGE gels. Eerdere literatuur biedt een breed scala aan neutrale reinigingsmiddelen. Echter, DDM (n-dodecyl β-d-maltoside)^1,2,4,5,6 en digitonine^{3,5,7,8, 9,10,13,18} zijn de meest populaire keuzes voor bn-MS analyses tot nu toe. Er moet worden benadrukt dat elke wasmiddel voorwaarde noodzakelijkerwijs een compromis vormt tussen de solubilisatie-efficiëntie en het behoud van eiwit interacties en mogelijk niet even geschikt is voor alle soorten doel eiwitten en uitgangsmateriaal;

IV) het verwijderen van geladen polymeren zoals fibrils, filamenten, poly lysine, DNA en overvloedige componenten van een lager moleculair gewicht (d.w.z. metabolieten, lipiden of peptiden). Dit kan worden bereikt door ultracentrifugatie, gel filtratie of dialyse. Dit is met name belangrijk voor de totale cel of weefsel lysaten;

(v) toevoeging van Coomassie G-250 (eindconcentratie 0,05%-0,1%) en sucrose (om de dichtheid te verhogen voor het laden, eindconcentratie 10%-20% [w/v]) aan het monster vlak voor het laden, om te wissen door korte ultracentrifugatie, het monster te laden zonder perturbatie, en start de run onmiddellijk daarna.

Als toekomstig perspectief biedt csBN-MS gebaseerde complexome profilering opties voor multiplexing om eiwit complexe dynamiek te bestuderen of veranderingen in verband met specifieke biologische omstandigheden. Gecombineerde scheiding van monsters met een Metabo-label zoals voorgesteld voor op grootte-uitsluiting gebaseerde profilering²¹ lijkt eenvoudig, maar kan worden belemmerd door spontane uitwisseling van subeenheid in complexen die onafhankelijk van de gebruikte scheiding plaatsvinden Methode. Als alternatief kunnen gelabelde monsters worden opgelost in naburige gellanes, die vervolgens samen kunnen worden gesneden of gecombineerd na verteren voor differentiële analyse met hoge gevoeligheid en robuustheid.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio Rad	#1610158	Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13%
30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio Rad	#1610154	Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13%
SYPRO Ruby Protein Blot Stain	Bio Rad	#1703127	Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection
Coomassie Brilliant Blue G-250	Serva	no. 35050	Centrifugate stock solutions prior to use
ComplexioLyte 47	Logopharm	CL-47-01	Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins
Embedding Medium / Tissue Freezing Medium	Leica Biosystems	14020108926	Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome
Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm	Merck	IPVH00010
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE Healthcare	RPN2232
Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml	n.a.	n.a.	any supplier, important for making gel section embedding tool
broad razor blade	n.a.	n.a.	any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes
metal tube / cylinder, ca. 4 cm long	n.a.	n.a.	mold for embedding and freezing of gel samples
Protein LoBind Tubes, 1.5 ml	Eppendorf	Nr. 0030108116	highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption
sequencing-grade modified trypsin	Promega	V5111
C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm	Dionex / Thermo Scientific	P/N 160454
PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm)	New Objective	FS360-75-8
ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm)	Dr. Maisch GmbH	r13.93.	columns packed manually
rabbit anti-TPC1 antibody	Gramsch Laboratories	custom production	described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG	Vector Laboratories	CY-1300	described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated	Vector Laboratories	#B1325	described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
cryo-microtome Leica CM1950	Leica Biosystems	14047743905
Mini Protean II Cell with wetblot unit	Bio Rad	n.a.	for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more)
Penguin Midi Gel Electrophoresis System	PeqLab	n.a.	for BN-PAGE (not sold any more)
Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera	Zeiss / Photometrics	n.a.
peristaltic pump (IP high precision multichannel)	Ismatec	ISM940	for casting of gradient polyacrylamide gels
gradient mixer with stirring (two chambers)	selfmade, alternatively Bio Rad	1652000 or 1652001	for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)
ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor	Sorvall / Thermo Scientific	n.a.	for sample preparation (not sold any more)
UltiMate 3000 RSLCnano HPLC	Dionex / Thermo Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Orbitrap Elite mass spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMAZQ