Summary
Ion 流动性质谱和分子建模技术可以描述设计金属结合肽和铜结合肽美他可辛的选择性金属结合性能。开发新的金属包合肽类将有助于治疗与金属子失平衡相关的疾病。
Abstract
电喷雾电位化（ESI）可以将水相肽或肽复合物转移到气相，同时保存其质量、总电荷、金属结合相互作用和构象形状。ESI 与电子流动性质谱法 （IM-MS） 耦合提供了一种工具技术，允许同时测量肽的量位 （m/z） 和碰撞横截面 （CCS），和构象形状。肽复合物的总体电荷由肽的酸性和基本位点1）和2）金属电的氧化状态控制。因此，复合物的总体电荷状态是影响肽金属电结合亲和力的溶液的pH的函数。对于 ESI-IM-MS 分析，肽和金属离子溶液由仅水溶液制备，pHH 与稀水醋酸或氢氧化铵一起调整。这允许为特定的肽确定pH依赖性和金属电位选择性。此外，肽复合物的m/z和CCS可与B3LYP/LanL2DZ分子建模一起使用，以识别该复合物的金属电协调结合点位和三级结构。结果表明，ESI-IM-MS如何描述一组替代的美他可辛肽的选择性结合性能，并将其与铜结合肽美他可曲蛋白进行比较。
Introduction
铜和锌离子对生物体至关重要，对包括氧化保护、组织生长、呼吸、胆固醇、葡萄糖代谢和基因组读数1在内的过程至关重要。为了启用这些功能，组，如Cys的硫酸盐，他的2，3，（更罕见）的硫丹，和Glu和Asp的甲苯选择性地将金属作为辅助因子到活动位点金属酶。这些协调小组的相似性提出了一个耐人寻味的问题，即他和Cys配体如何选择性地将Cu（I/II）或Zn（II）纳入，以确保正确的功能。
选择性结合通常通过获取和贩运肽来完成，这种肽控制锌（II）或Cu（I/II）的i/II）子浓度4。Cu（I/II）具有高度反应性，对酶造成氧化损伤或异化结合，因此其自由浓度受到铜伴和铜调节蛋白的严格调节，这些蛋白质安全地将其输送到细胞中的各个位置，并紧密地调节控制其平衡5，6。铜代谢或平衡的中断与门克斯和威尔逊的疾病7以及癌症7和神经紊乱直接相关，如普里昂8和阿尔茨海默氏病9。
Wilson 的疾病与眼睛、肝脏和大脑部分的铜含量增加有关，其中 Cu（I/II） 的氧化还原反应产生活性氧，导致肝神经退化。现有的包合疗法是小的三醇氨基酸阴西胺和三甲四胺。或者，甲抗凝铜采集肽甲酰沙棘素（mb）10，11表现出治疗潜力，因为它们对Cu（I）12具有高结合亲和力。当甲基三磷酸三甲杆菌OB3b的甲胺素（mb-OB3b）在威尔逊病的动物模型中被研究时，铜有效地从肝脏中取出，并通过胆汁13排泄。体外实验证实，mb-OB3b可以从肝细胞醇13中所含的铜金属醇素中洗去铜。激光消融电耦合等离子体质谱成像技术研究了威尔逊病肝样本14、15、16中铜的空间分布，并表明mb-OB3b去除铜与短处理期只有8天17。
mb-OB3b还将与其他金属离子结合，包括Ag（I）、Au（III）、Pb（II）、Mn（II）、Co（II）、Fe（II）、Ni（II）和Zn（II）18、19。Ag（I）展示的生理Cu（I）结合位点的竞争，因为它可以取代Cu（I）从mb-OB3b复合体，与Ag（I）和Ni（II）也表现出不可逆转的绑定Mb，不能取代Cu（I）19。最近，研究了一系列具有2His-2Cys结合图案的甲酰亚布辛（amb）寡肽，其锌（II）和Cu（I/II）结合特性具有特征。他们的主要氨基酸序列是相似的，他们都包含2His-2Cys主题，Pro和乙酰化N-总站。它们主要不同于mb-OB3b，因为2His-2Cys图案取代了mb-OB3b的两个enethiol牛酮结合位点。
电喷雾电位化与电力流动性质谱（ESI-IM-MS）相结合，为确定肽的金属结合特性提供了强大的工具技术，因为它测量其质量电荷（m/z）和碰撞横截面 （CCS），同时从溶液相中保存其质量、电荷和构象形状。m/z和 CCS 与肽体测定学、原形状态和构象形状有关。由于明确确定了物种中每个元素的身份和数量，因此确定骨化学计量。肽复合物的总体电荷与酸性和基本位点的原位和金属电的氧化状态有关。CCS提供了肽复合物的构象形状信息，因为它测量了与复体三级结构相关的旋转平均大小。复合物的整体电荷状态也是pH的函数，影响肽的金属电结合亲和力，因为脱质子的基本或酸性位点，如carboxyl、His、Cys和Tyr也是金属电的的潜在结合位点。在分析中，肽和金属离子在水溶液中制备，pH由稀水性醋酸或氢氧化铵调整。这允许为肽确定pH依赖性和金属电位选择性。此外，ESI-IM-MS测定的m/z和CCS可与B3LYP/LanL2DZ分子建模一起使用，以发现复合体金属电一致的类型和三级结构。本文中显示的结果揭示了ESI-IM-MS如何描述一组amb肽的选择性包合性能，并将其与铜结合肽mb-OB3b进行比较。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 试剂制备
- 培养甲基肌酸三角性四氯环带，分离无Cu（I）的mb-OB3b 18，22，23，冷冻干燥样品，并储存在-80°C，直到使用。
- 合成 amb 肽（>98% 纯度为 amb1，amb2，amb4;> 70% 纯度为 amb7），冷冻干燥样品，并将其储存在 -80°C 直到使用。
- 购买 >98% 纯度氯化锰（II）氯化物、氯化钴（II）氯化物、氯化铜（II）氯化物、硝酸铜（II）硝酸银、氯化锌（II）氯化物、氯化铁（III）和氯化铅（II）。
- 购买用作校准剂的聚DL-丙氨酸聚合物，用于测量amb物种的碰撞横截面和HPLC级或更高氢氧化铵、冰川醋酸和乙酰乙酰酯。
2. 准备库存解决方案
-
肽库存溶液
- 在 1.7 mL 塑料小瓶中，使用至少三个显著数字准确称量，即 10.0–20.0 mg 的 mb-OB3b 或 amb 的质量。
注：当添加1.00 mL的去离子（DI）水时，称重质量应产生12.5 mM或1.25 mM，具体取决于肽的溶解度。 - 使用移液器，在称重肽样品中加入 1.00 mL 的去离子水（>17.8 MΩ cm），以产生 12.5 mM 或 1.25 mM 溶液。将盖牢固放置，并彻底与至少 20 个反转混合。
- 使用微管将肽样品中的50.0 μL等分分分分分放入单独标记的1.5 mL小瓶中，并将其储存在-80°C，直到使用。
- 在 1.7 mL 塑料小瓶中，使用至少三个显著数字准确称量，即 10.0–20.0 mg 的 mb-OB3b 或 amb 的质量。
-
金属子架溶液
- 使用至少三个显著数字准确称量，在 1.7 mL 小瓶中，金属氯化物或硝酸银的质量为 10.0–30.0 mg。
注：添加 1.00 mL 的 DI 水时，称重质量应产生 125 mM。 - 将 1.00 mL 的 DI 水添加到 1.7 mL 小瓶中的称重金属样品中，以产生 125 mM 溶液。将盖牢固放置，并彻底与至少 20 个反转混合。
- 使用至少三个显著数字准确称量，在 1.7 mL 小瓶中，金属氯化物或硝酸银的质量为 10.0–30.0 mg。
- 氢氧化铵库存溶液：通过将DI水稀释99.5%醋酸溶液的57μL，最终体积达到1.00 mL，制备1.0M醋酸溶液。将 21% 氢氧化铵溶液中的 90 μL 与 DI 水稀释至 1.00 mL 的最终体积，制备 1.0 M 氢氧化铵溶液。通过采用 1.0 M 溶液的 100 μL 来制备 0.10 M 和 0.010 M 醋酸和氢氧化铵溶液，使每个溶液连续稀释两次。
- Poly-DL-丙氨酸库存溶液：通过称量1.0毫克PA并溶解在1.0 mL的DI水中，制备聚DL-丙氨酸（PA），以1，000ppm。彻底混合。使用微管，分配50.0μL等分，并分别放入1.7 mL小瓶中，储存在-80°C。
3. 电喷雾-电子流动性-质谱分析
- 用约 500 μL 的 0.1 M 冰川醋酸、0.1 M 氢氧化铵彻底清洁 ESI 入口管和针毛细管，最后清洁 DI 水。
- 解冻 1，000 ppm PA 库存溶液的 50.0 μL 等分，用 450 μL 的 DI 水稀释，使其达到 100 ppm PA。用500 μL的DI水和500μL的乙酰乙酰乙醚将其稀释至1.00 mL，以提供10ppm PA溶液。
- 使用讨论部分中所述的原生 ESI-IM-MS 条件，收集 10 ppm PA 溶液的负子和正组 IM-MS 光谱，每次 10 分钟。
- 解冻 12.5 mM 或 1.25 mM amb 库存溶液的 50.0 μL 等分，用 DI 水连续稀释，最终浓度为 0.125 mM amb。彻底混合每个稀释。
- 移液 100.0 μL 的 125 mM 金属孔积溶液，放入 1.7 mL 小瓶中，用 DI 水稀释至 1.00 mL，以产生 12.5 mM 金属孔。重复两个连续稀释，给出最终的0.125 mM金属离子浓度。彻底混合每个稀释。
- 将 0.125 mM amb 的移液 200.0 μL 放入 1.7 mL 小瓶中，用 500 μL 的 DI 水稀释，并将溶液彻底混合。
- 加入50μL的1.0M醋酸溶液，将样品的pH值调整到3.0。
- 将 0.125 mM 金属电的 200.0 μL 添加到 pH 调整样品中。加入DI水，产生1.00 mL的样品最终体积，彻底混合，并允许样品在RT时平衡10分钟。
- 使用钝鼻注射器采集500μL的样品，并收集负子和正电子（ES-IM-MS）光谱各5分钟。使用样品的剩余 500 μL 使用经过校准的微 pH 电极记录其最终 pH 值。
- 重复步骤 3.6-3.9，同时修改步骤 3.7，通过添加新体积的 0.010 M、0.10 M 或 1.0 M 醋酸或氢氧化铵溶液，将 pH 量调整为 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 或 10.0。
- 收集 10 ppm PA 溶液的负极和正电子管 ESI-IM-MS 光谱各 10 分钟。
4. 安布样品金属滴定的准备
- 按照步骤 3.1_3.5 中描述的步骤操作。
- 将 0.125 mM amb 的移液 200.0 μL 放入 1.7 mL 小瓶中，用 500.0 μL 的 DI 水稀释，并将溶液彻底混合。
- 加入0.010 M氢氧化铵溶液的80 μL，将样品的pH值调整为pH = 9.0。
- 加入0.125 mM金属电液的28 μL，以产生0.14摩尔当量的金属电偶，加入DI水，使样品的最终体积达到1.00 mL，彻底混合，并允许样品在RT时平衡10分钟。
- 使用钝鼻注射器采集500μL的样品，并收集负极和正的ESI-IM-MS光谱各5分钟。使用样品的剩余 500 μL 使用经过校准的微 pH 电极记录其最终 pH 值。
- 重复步骤 4.2_4.5，同时修改步骤 4.3 以添加 0.125 mM 金属 ion 溶液的适当体积，以提供 0.28、0.42、0.56、0.70、0.84、0.98、1.12、1.26 或 1.40 摩尔等价物。
- 收集 10 ppm PA 溶液的负子和正子 IM-MS 光谱，每次 10 分钟。
5. ESI-IM-MS pH 滴定数据分析
- 从IM-MS光谱中，通过将带电的abs物种与其理论m/z同位素模式相匹配来识别哪些带电的abs物种。
- 打开 MassLynx 并单击色度图以打开色度图窗口。
- 转到"文件"菜单并打开以查找并打开 IM-MS 数据文件。
- 通过右键单击并拖动色谱并释放 IM-MS 频谱。频谱窗口将打开，显示 IM-MS 频谱。
- 在频谱窗口中，单击工具和同位素模型。在同位素建模窗口中，输入 amb 物种的分子公式，检查显示充电电位框，然后进入充电状态。单击"确定"。
- 重复此操作以识别 IM-MS 光谱中的所有物种，并记录其 m/z 同位素范围。
- 对于每个 amb 物种，分离任何巧合的 m/z 物种，并使用其 m/z 同位素模式提取其到达时间分布 （ATD） 来识别它们。
- 在 MassLynx 中，单击漂移范围以打开程序。在 DriftScope 中，单击"文件并打开"以查找并打开 IM-MS 数据文件。
- 使用鼠标和左键单击放大 amb 物种的 m/z 同位素模式。
- 使用"选择"工具和鼠标左键选择同位素图案。单击"接受当前选择"按钮。
- 要分离任何巧合的 m/z 物种，请使用选择工具和鼠标左键选择 ATD 时间与 amb 物种的同位素模式对齐。单击"接受当前选择"按钮。
- 要导出 ATD，请访问文件 |导出到 MassLynx，然后选择"保留漂移时间"并将文件保存在相应的文件夹中。
- 确定 ATD 的质心，并将 ATD 曲线下的面积整合为物种种群的量度。
- 在 MassLynx 的色谱图窗口中打开保存的导出文件。点击流程 |从菜单集成。选中"顶点轨道峰值集成"框，然后单击"确定"。
- 记录心托 ATD （tA） 和集成区域，如色谱图窗口所示。对所有保存的 amb 和 PA IM-MS 数据文件重复上述步骤。
- 对每个滴定点处的正离子或负离子的所有提取的 amb 物种使用集成 ATD，以将其标准化为相对百分比刻度。
- 将amb物种的身份及其在每个pH的集成ATD输入电子表格。
- 对于每个 pH，使用集成的 ATD 的总和将单个 amb 的 ATD 规范化为百分比刻度。
- 在图表中绘制每个 amb 物种与 pH 的百分比强度，以显示每个物种的种群如何随 pH 的函数而变化。
6. 碰撞横截面
- 使用电子表格，使用下面的公式 1 将 PA 负25、26和正27离子的CCS （Ω） 转换为使用下面的公式1校正的 CCS（+c），其中：z = 离子电荷;ec = 电位（1.602×10-19 C）;mN2 = N2气体（Da）的质量;和m子=子质量。29
- 使用下面的公式 2将 PA 校准剂和 amb 物种的平均到达时间 （tA） 转换为漂移时间 （tD），其中：c = 增强的占空比延迟系数 （1.41），m/z 是肽子的量为电荷。
- 绘制 PA 校准器 tD与其 +c。然后，使用下面所示的公式 3的最小二乘回归拟合，确定 A' 和 B 值，其中：A' 是温度、压力和电场参数的校正;和 B 补偿 IM 设备的非线性效应。
- 使用这些 A' 和 B 值以及来自 ambs ATD 的质心 tD值，使用公式 3确定它们的 + c，并使用公式 1确定它们的 +c。该方法为肽类提供CCS，估计绝对误差约为2%25，26，27。
7. 计算方法
- 使用B3LYP/LanL2DZ级理论，包括贝克3参数混合功能30和Dunning基础集31和电子核心电位32，33，34定位用于观测到的 m/z amb 物种35的所有可能协调类型的几何优化的构件。
注：有关如何生成和提交计算的详细信息，请参阅补充文件中的高斯视图用法。 - 比较每个构件的预测自由能量，并使用西格玛程序36中的电量Lennard-Jones（LJ）方法计算其理论CCS。
- 从最低的自由能量构算器中，确定哪个coners具有LJ CCS，该标准与IM-MS测量的CCS一致，以识别实验中观察到的构同器的三级结构和协调类型。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
amb1的金属绑定
Amb1的 IM-MS 研究20（图 1A） 显示，铜离子和锌离子以 pH 依赖性的方式结合到 amb1（图 2）。然而，铜和锌通过不同协调部位的不同反应机制与amb1结合。例如，将Cu（II）添加到amb1中，通过二硫化物桥形成导致amb1（amb 1ox）氧化，在pH>6时，形成[安布1ox[3H[Cu（II）]= ii（图2A）。这表明两个imidazolium、carboxyl组和另外两个正在协调Cu（II）的位点脱硫了。
使用B3LYP/LanL2DZ测定最低能量复合物的分子建模是Cu（II），通过他1的imidazoleμN和Cys 2的骨干中分子组的脱质子氮和格利3。然而，在pH值为6以下，将Cu（II）添加到amb1中形成一个m/z同位素模式，该模式只能由Cu（I）结合来解释，形成[amb 1ox[Cu（I）]= 电（图2B）。相比之下，pH高于6导致m/z同位素模式降低1 m/z，由正电荷[amb 1ox]H[Cu（II）]+ion计算。添加Zn（II）没有氧化amb1，在pH值>6处观察到Zn（II）结合，主要形成[amb 1[3H+Zn（II）]= ion（图2C）。这表明，硫丹、硫醇和甲酰基的脱硫。[amb1[3H_Zn（II）] 的分子建模–通过 2His-2Cy 或 His-2Cy 和 C 端的卡博基酸盐，确定最低能量构合体为四面体 Zn（II） 协调。
amb2的多个 Cu（I） 绑定
Cu（II）和amb2（图1B）之间的氧化还原反应导致Cu（I）结合。本文使用IM-MS、UV-Vis分光度测定学和B3LYP分子建模37进行了更详细的研究。在pH为5时，Cu（II）滴定的主要产物是amb2氧化（通过二硫化物桥形成）和未氧化的amb2物种，协调三Cu（I）离子。
使用B3LYP/LanL2DZ方法的搜索，找到两个低能量复合体，争夺3Cu（I）协调物种。第一个是图3A所示的复杂，其中3Cu（I）离子通过Cys2和Cys6（他的1）的桥接硫酸盐组38以及+N1和+N5（他的5个）进行协调。).第二个复合体（3c）在质子状的1侧组和C端卡博比酸盐组之间有一个盐桥。这些结果表明，在pH为3.0~6.0时，主amb 2+3Cu（I）复合物是盐桥结构，只需极少的结构重排，即可成功地从溶液转移到气相。
理论LJ CCS的209 × 6 ×2，使用西格玛程序36计算复杂3c， 同意IM-MS测量的CCS， 表明3c表示[amb2[2H+3Cu（I）]=在pH 3.0-6.0的构象。然而，在pH>6，这个复合物没有观察到IM-MS，可能是因为他的1（p Ka =6.0）的进一步去向导致一个整体中性复合物。一旦他的1的imidazoleum组被去质子化，3Cu（I）协调可以转换为Cys2和Cys6的桥接硫酸盐组，以及他的1和5中的+N1和+N5，分别（3a）。
amb4 Cu（I/II）结合和氧化还原活性的pH依赖性
IM-MS 和 B3LYP 技术已用于研究 amb4的 Cu（II） 和 pH 次位（图 1C），并识别了安布4的单体、二聚体、三元组和四联体复合物，其中最多包含三个 Cu（I） 离子或两个 Cu（II）） 离子每个单体子单元39。复合物还含有各种二硫化物桥，无论Cu（II）反应与amb4是否在厌氧或有氧水溶液中进行，这些产品都是生产的。
使用IM-MS技术，表明这些物种可以分离和量化，即使它们具有重叠的同位素模式，因为它们的到达时间不同（图4）。识别和量化这些密切相关的物种是其他工具或分析技术无法完成的任务。这些IM-MS研究提供了对pH依赖氧化还原反应的相当深入的见解，并准确确定了分子间或分子内二硫化物桥的数量、Cu（I）或Cu（II）离子的数量以及每个复合物中的脱硫位点数（图 5.
此外，测量复合物CCS还允许确定每个物种的构象大小，这与广泛的B3LYP/LanL2DZ搜索一起使用，以找到符合结构的结构，同时符合正确的分子由 IM-MS 测量的测数和 CCS。通过该方法，确定了各种复合物的Cu（I/II）协调。Cu（II）和amb4之间的反应包括聚二体、修剪器和四联体的形成，根据溶液的pH。
例如，在轻度酸性溶液（pH = 3.0~6.0）中，它们主要结合Cu（I）离子，未氧化，而在稍微基本（pH = 8.0~11.0）的溶液中，它们主要结合Cu（II）离子，并被所有形成二硫化物的Cys氧化债券（图6）。B3LYP/LanL2DZ 确定 Cu（I） 离子是线性的，由硫酸盐和硫丹组桥接，而 Cu（II） 离子则通过变形的 T 形或方形平面几何体通过 imidazole 和脱质子骨干氮进行包罗万分。胺组。
mb-OB3b 的 IM-MS 分析
IM-MS 研究19，40 mb-OB3b （图 1D） 显示，在气相中，无 Cu（I）的 mb-OB3b 作为三个负电荷物种存在：[mb-OB3b_H] 、[mb-OB3b_2H] 和 [mb-OB3b_3H]3+，符合预期的解决方案阶段行为。对19个金属子的去角进行测定，以确定mb-OB3b的金属电位选择性。图7显示了所选金属电离的结果显示，mb-OB3b的表观结合选择性可分为三大类：1）Cu（I）和Ag（I）;2） Ni（II）、锌（II）和Co（II）;3） Pb（II）、铁（II）和Mn（II）。这种约束选择性的阶数与荧光淬火实验19和等温滴热18的发现一致。
mb-OB3b 和 amb 的比较7金属结合选择性
将mb-OB3b的明显结合选择性与pH为7的amb7的绑定选择性进行了比较。amb7的设计与 mb-OB3b 相同的氨基酸序列，但用两个 enethiol 牛磺酮组替换为两个 His-Cys 组。amb7（图1E）在Cys6和Cys12之间有一个二硫化物键。负电荷复合物的形成结果（图8）显示，Ni（II）和Zn（II）（60%）的amb7首选结合选择性，其次是Co（II）和Pb（II）（40%）。此外，还有约20%的Cu（II）结合。有痕迹或无Amb7绑定的Ag（I），Mn（II）或Fe（II）。这与mb-OB3b对Cu（I）和Ag（I）绑定的首选绑定选择性超过90%相比。
图1：替代美他可辛（安布）和甲基布他辛（mb-OB3b）肽的主要结构。（A）乙酰 -他1-Cys2-Gly3-Pro4- 他的5-Cys6 （amb1）;（B）乙酰 -他1-Cys2- Tyr3- Pro4- 他5-Cys6 （amb2）;（C）乙酰 - 他1-Cys2- Gly3-Ser4- Tyr5- Pro6-他的7- Cys8- Ser9 （amb4）;（D） 1-（N-_mercapto-（5-oxo-2-（3-甲基丁二烯）奥沙佐尔-（Z）-4-二利苯基-Gly1=Ser2=Ser3=Tyr4）-皮尔利丁-2-yl-（mercapto-5-oxo-oxazol-（Z）-4-二氧化苯甲醚*Cys6=Met7 （mb-OB3b）;和（E）乙酰-Leu1-他的2-Cys3-Gly4-Ser5-Cys6-Tyr7-Pro8-他的9-Cys10-Ser11-Cys12-Met13 （amb7）色带显示： 2His-2Cys 或 enethiol-oxazolone 结合
位点 （ ）;丙氨酸或苯丙胺铰链 （
）;乙酰或甲基丁醇组N-总站（
）;和酪氨酸，它可以通过第二个溶解壳[阳离子相互作用（）]
稳定金属离子协调。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2： 替代甲氨基霉素 （amb1） 乙酰 - 他1- Cys2- Gly3-Pro4- 他的5-Cys6和金属绑定复合物 （amb1+X） （其中X = Cu 或 Zn）。在amb的1：1摩尔比溶液的负和正电质谱分析中进行了观察：XCl2在pH范围为3.0~11.0。误差条显示三个复制pH滴定实验中相对强度和pH值均值的标准偏差。amb：CuCl2的 1：1 摩尔溶液导致 Amb （ambox）与 Cys2和 Cys6的氧化，形成一个二硫化物桥。（A） amb 的负电分析：CuCl2显示 [amb牛[ H]和[ambox[3H_Cu（II）]。（B） amb 的正子分析：CuCl2显示 [ambox]和 [amb牛[Cu（I/II）]=复合物中Cu的氧化状态是pH依赖的，是[amb牛[Cu（I）]; 低于pH值8和[安布牛[H]Cu（II）];pH 为 8 以上。（C） amb 的负子电分析：ZnCl2显示 [amb]n]和 [amb_Zn（II）]n。（D） amb 的正子分析：ZnCl2显示 [amb]n]和 [amb_Zn（II）]n。这个数字是从以前的出版物20改编而成的。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：提出[amb 2+3Cu（I）]结构——使用来自B3LYP/LanL2DZ理论水平的最低能量和几何优化结构。（A） 3 Cu（I） 协调通过 +N1+ N5他的1和他的5和硫酸盐桥接硫酸盐组 Cys2和 Cys6的理论横截面 217 × 6 +2。（B） 说明 βN1+ N5和硫酸盐桥接协调。（C） 盐桥结构显示 3 Cu（I） 协调通过卡博比酸端子 （Cys6），+N5和硫酸盐桥接与理论横截面 209 × 6 +2.（D） 卡比酸盐端子的插图，#N5，和硫酸盐桥接协调。粘合距离 A、B、C、D、E 和 F 显示在 + 的单位中。这个数字已由以前的出版物37改编而成。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：在pH = 4.4时，对amb4：Cu（II）混合物的1：1混合物产品的IM-MS分析。 （A）提取的同位素模式为[amb 4][2H+3Cu（I）][直径4[4H+6Cu（I）]2]，[三联体4+6H+9Cu（I）]3+和[四元4+8H+12Cu（I）]4个物种。（B）将提取的到达时间的[amb4]2H[3Cu（I）]的[直径4[4H+6Cu（I）]2=[三联体4+6H+9Cu（I）]和[四元4[8H+12Cu（I）]4]用于计算其相对强度。为了计算相对强度的百分比，使用每个滴定点的所有提取物种的集成区域的总和来规范化到百分比比例。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：在Cu（II）的pH值滴定过程中观察到的单独Cu（I/II）结合的同位素模式：在pH = 4.04、6.02和9.98时观察到的amb4。在pH = 4.04时，实验结果主要与[amb 4[Cu（I）]的同位素模型匹配。在pH = 6.02时，有-2 m/z的偏移，表示二硫化物桥的形成（显示为安布4ox氧化），并与[amb4ox[Cu（I）]的同位素模式一致。在pH = 9.98时，进一步移动-1 m/z，表示Cu（II）结合和质子的去除以保持+1电荷状态，然后与[amb4ox[H_Cu（II）]的同位素模式匹配。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6：在 pH 范围 3.0–11.0 范围内更改 amb4的单体、二聚体和修剪器的 Cu（I/II） 复合物的相对标识强度。 （A）带一个 Cu（I/II） 离子的单色器、（B）带 2 个 Cu（I/II） 离子的二分器和（C）带 3 Cu（I/II） 离子的修剪器。标题说明建筑群中有多少二硫化物债券。这个数字已由以前的出版物39改编而成。请点击此处查看此图的较大版本。
图7：甲他杆菌（I）、Ag（I）、Zn（II）、Ni（II）、Co（II）、Mn（II）、Pb（II）或铁（II）甲苯甲基复合物的组成百分比。在麦他可辛的单个金属子炎中观察到。应当指出，Cu（I）约束是由于添加Fe（II）和Fe（II）结合而增加了Fe（III）。这个数字已由上一份出版物19改编而成。请点击此处查看此图的较大版本。
图8：在pH = 7时，以mb-OB3b和amb 7的b-OB3b和amb7的百分比比较，即甲基（I/II）、锌（II）、尼（II）、Mn（II）、Pb（II）或Fe（II） 的合相百分比。比较是负电荷离子的形成。请点击此处查看此图的较大版本。
补充文件。高斯视图用法。请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
关键步骤：通过 ESI-IM-MS 保存用于检查的解决方案阶段行为
必须使用本机 ESI 仪器设置来保存肽的化学测量、电荷状态和构象结构。对于原生条件，必须优化 ESI 源中的条件，如锥电压、温度和气体流量。此外，必须检查源、陷阱、电子移动性和传输移动波（尤其是控制注入电压进入 IM 单元的直流陷印偏置）中的压力和电压，以检查其对充电状态和电子移动分布的影响。
以下是本工作中使用的典型操作条件。使用10 μL最小±1流速、2.0 kV毛细管电压（负离子）或±1.8 kV（负离子）、130°C源温度、250°C解压、20 V采样锥和4.0 V的正离子，将水性肽样品注射提取锥体。IM 部分在疏水阀单元的 6.0 V 入口电压下工作，使用 1.5 mL/min 流速，其气孔压力为 2.25 x 10±2 mbar。向 IM 电池注入离子（陷阱直流偏置）的电压设置为 12 V，以避免离子最初与氮缓冲气体碰撞时解散。IM电池根据离子的电荷和碰撞横截面分离离子，并利用0.52 mbar氮压和20.0 mL最小±1流速。IM 的运行速度为 12.0±20.0 V （+） 或 8.0±30.0 V （+） 移动波高，每次扫描 IM 移动波的细胞时，速度为 800*1，500 ms +1 （+） 或 250*1，000 ms +1 （+） 速度。转移单元在与陷阱单元相同的气态压力下操作，并将 IM 解析离子引导至正交飞行质量充电分析仪。离子流动性-质量光谱是通过使用飞行时间质量-电荷分析仪将离子的封闭释放同步到IM单元而获得的。
使用本机 ESI 条件，在 IM-MS 分析期间将保留解相属性（如充电状态和构象状态）。例如，在IM-MS分析20、37期间观察到的mb-OB3b和ambs的电荷状态与溶液阶段40中预期的电荷状态密切相关。mb-OB3b肽是四联体，在IM-MS分析40期间只形成带负电荷的离子，无论是Cu（I）边界还是无Cu（I）基，因为它含有C-端法（pKa <1.7），两个enethiol牛酮组（pKa = 5.0和9.7），和蒂尔组（pKa = 11.0）42。由于 C 终点站（pKa = 2）、两个 His（pKa = 6.0）、两个 Cys（pKa = 8.3）和 Tyr（pKa = 11.0）站点19、41，因此其完全质子形式的 amb 将具有 ±2 的总电荷。因此，它们通常以 <6 的 pHH 形式形成带正电荷的离子，在 pH>6 时形成带负电荷的离子。
ambs 还显示了明显的 pH 相关 Cu（I/II） 结合行为和氧化还原活性，其中低 pH 的 Cu（I） 结合在较高的 pH 下转换为 Cu（II） 结合。Cu（I/II）反应包括形成含有二硫化物键和各种多聚体和多Cu（I/II）结合的氧化安布物种（ambox）（图5和图6）。这些氧化还原反应是时间相关的，研究表明，样品制备和IM-MS分析之间的时间间隔（长达210分钟）时间越长，氧化性的产物越长37。因此，还需要仔细考虑反应时间对产品观察的依赖。
限制：IM-MS 和理论碰撞横截面确定每个金属电池喜欢哪种协调类型
为了帮助解释IM-MS m/z和CCS数据，使用B3LYP/LanL2DZ理论水平进行了广泛的搜索。将具有不同协调位点的几何优化构件进行比较，比较其预测的自由能量和与IM-MS测量的CCS的一致。 这些肽及其复合物的分子建模受电子类型的限制结构计算，可应用于这些相对较大的系统。研究或推荐的其他方法包括Truhlar等人43的研究，他们发现M05-2X是最好的DFT功能，PM7和MNDO/d是含有Zn（II）化合物44的良好NDDO半经验方法。这些肽具有较大的构象空间，为了找到最低能量的构象，必须包括比较各种金属包合位点、各种cis和转肽键、盐桥、氢键和+阳芳香蒂尔侧组和金属阳离子之间的相互作用。
相对于现有方法的重要性：Cu（I/II）和其他选定的金属结合比较mb-OB3b和ambs
X射线晶体学和NMR光谱学是用于测定肽三级结构原子分辨率的最常见技术。然而，由于这些复合物的结晶存在问题，金属肽的X射线晶体学研究很少。NMR也不适合解释存在密切相关个体寡肽物种的样本46。因此，IM-MS 和 DFT 分子建模是研究肽反应的替代方法，尤其是由复杂氧化还原和 Cu（I/II）结合反应20、37、40产生的肽反应。47.IM-MS的强度在于，它可以通过同时测量其m/z和到达时间来解析每个产品，并识别其分子组成，这些时间与化学测量、原发性状态和构象结构有关。
例如，mb-OB3b 会处理各种金属离子，IM-MS 金属离子的位子显示了对每个离子的选择性（图 7）。结果表明，mb-OB3b偏好结合Cu（I）和Ag（I），同时将pH为7和amb7的结果进行比较。图 8显示了 amb7优先使用锌（II）和 Ni（II）。总体而言，amb研究表明，用2His-2Cy替换两个enethiol-oxazolones并不排除Cu（I/II）结合，但它通过线性桥接协调（图3）导致多个Cu（I）结合，而不是单核Cu（I）mb-OB3b的四面体协调的绑定48。Cu（II）还原也由硫醇氧化和二硫化物桥的形成所调节，与阿波-mb-OB3b中现有的二硫化物桥形成和铜负载mb-OB3b的高还原潜力形成，这支持了对Cu（I）49的强烈偏好.
未来应用
对 amb 肽的进一步 IM-MS 研究正在进行中，其中，通过用 Gly 或 Asp 替换"他"或"Cys"来修改其主要序列，而 Tyr 残渣则替换为 Gly 或 Phe。这些研究也在10.0 mM醋酸铵中进行，用氢氧化铵（pH值= 7、8和9）对pH进行了改性，以保持每个样品的总离子强度恒定。这些结果将很快公布。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
此材料基于国家科学基金会支持的工作，包括 1764436、NSF 仪器支持 （MRI-0821247）、韦尔奇基金会 （T-0014） 以及能源部的计算资源 （TX-W-20090427-0004-50） 和 L3 通信.我们感谢鲍尔的加州大学圣巴巴拉分校小组分享了西格玛计划，阿约巴米·伊莱桑米在视频中演示了这项技术。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile HPLC-grade | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A998SK-4 | |
| ammonium hydroxide (trace metal grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A512-P500 | |
| cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 255599-5G | |
| copper(II) chloride 99.999% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203149-10G | |
| copper(II) nitrate hydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 229636-5G | |
| designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides | Neo BioLab (neobiolab.com) | designed peptides were synthized by order | |
| designed amb5B,C,D,E,F peptides | PepmicCo (www.pepmic.com) | designed peptides were synthized by order | |
| Driftscope 2.1 software program | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
| Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b | cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce) | ||
| glacial acetic acid (Optima grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A465-250 | |
| Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 12357-09 | |
| lead(II) nitrate ACS grade | Avantor (www.avantormaterials.com) | 128545-50G | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203734-5G | |
| MassLynx 4.1 | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
| nickel chloride hexahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203866-5G | |
| poly-DL-alanine | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | P9003-25MG | |
| silver nitrate 99.9%+ | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 11414-06 | |
| Waters Synapt G1 HDMS | Waters (www.waters.com) | quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer | |
| zinc chloride anhydrous | Alfa Aesar (www.alfa.com) | A16281 |
References
- Dudev, T., Lim, C. Competition among Metal Ions for Protein Binding Sites: Determinants of Metal Ion Selectivity in Proteins. Chemical Reviews. 114 (1), 538-556 (2014).
- Sovago, I., Kallay, C., Varnagy, K. Peptides as complexing agents: Factors influencing the structure and thermodynamic stability of peptide complexes. Coordination Chemistry Reviews. 256 (19-20), 2225-2233 (2012).
- Sóvágó, I., Várnagy, K., Lihi, N., Grenács, Á Coordinating properties of peptides containing histidyl residues. Coordination Chemistry Reviews. 327, 43-54 (2016).
- Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. Journal of Inorganic Biochemistry. 107 (1), 129-143 (2012).
- Robinson, N. J., Winge, D. R. Copper Metallochaperones . Annual Review of Biochemistry. 79, 537-562 (2010).
- Scheiber, I. F., Mercer, J. F. B., Dringen, R. Metabolism and functions of copper in brain. Progress in Neurobiology. 116 (0), 33-57 (2014).
- Tisato, F., Marzano, C., Porchia, M., Pellei, M., Santini, C. Copper in Diseases and Treatments, and Copper-Based Anticancer Strategies. Medicinal Research Reviews. 30 (4), 708-749 (2010).
- Millhauser, G. L. Copper and the prion protein: Methods, structures, function, and disease. Annual Review of Physical Chemistry. 58, 299-320 (2007).
- Arena, G., Pappalardo, G., Sovago, I., Rizzarelli, E. Copper(II) interaction with amyloid-beta: Affinity and speciation. Coordination Chemistry Reviews. 256 (1-2), 3-12 (2012).
- Kim, H. J., et al. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. 305 (5690), 1612-1615 (2004).
- Di Spirito, A. A., et al. Methanobactin and the link between copper and bacterial methane oxidation. Microbiology Molecular Biology Reviews. 80 (2), 387-409 (2016).
- Kenney, G. E., Rosenzweig, A. C. Chemistry and biology of the copper chelator methanobactin. ACS Chemical Biology. 7 (2), 260-268 (2012).
- Summer, K. H., et al. The biogenic methanobactin is an effective chelator for copper in a rat model for Wilson disease. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 25 (1), 36-41 (2011).
- Hachmoeller, O., et al. Investigating the influence of standard staining procedures on the copper distribution and concentration in Wilson's disease liver samples by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 71-75 (2017).
- Hachmoeller, O., et al. Spatial investigation of the elemental distribution in Wilson's disease liver after D-penicillamine treatment by LA-ICP-MS. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 26-31 (2017).
- Hachmoeller, O., et al. Element bioimaging of liver needle biopsy specimens from patients with Wilson's disease by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 35, 97-102 (2016).
- Mueller, J. C., Lichtmannegger, J., Zischka, H., Sperling, M., Karst, U. High spatial resolution LA-ICP-MS demonstrates massive liver copper depletion in Wilson disease rats upon Methanobactin treatment. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 119-127 (2018).
- Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of Ag(I), Au(III), Cd(II), Co(II), Fe(III), Hg(II), Mn(II), Ni(II), Pb(II), U(IV), and Zn(II) binding by methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b. Journal of Inorganic Biochemistry. 100, 2150-2161 (2006).
- McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Binding Selectivity of Methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b for Copper(I), Silver(I), Zinc(II), Nickel(II), Cobalt(II), Manganese(II), Lead(II), and Iron(II). Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 28, 2588-2601 (2017).
- Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19 (6), 463-473 (2013).
- Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility - mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrom. 51 (12), 1120-1129 (2016).
- Bandow, N. L., et al. Isolation of methanobactin from the spent media of methane-oxidizing bacteria. Methods in Enzymology. 495, 259-269 (2011).
- Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of methanobactin from γ-proteobacterial methane oxidizing bacteria: a case for copper competition on a molecular level. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1240-1247 (2010).
- Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261 (1), 1-12 (2007).
- Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 14 (20), 6853-6861 (2015).
- Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141 (3), 884-891 (2016).
- Bush, M. F., Campuzano, I. D. G., Robinson, C. V. Ion Mobility Mass Spectrometry of Peptide Ions: Effects of Drift Gas and Calibration Strategies. Analytical Chemistry. 84 (16), 7124-7130 (2012).
- Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
- Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 113-130 (2009).
- Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98 (7), 5648-5652 (1993).
- Dunning, T. H., Hay, P. J. Gaussian basis sets for molecular calculations. Modern Theoretical Chemistry. 3, 1-27 (1977).
- Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for potassium to gold including the outermost core orbitals. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 299-310 (1985).
- Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for the transition metal atoms scandium to mercury. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 270-283 (1985).
- Wadt, W. R., Hay, P. J. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for main group elements sodium to bismuth. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 284-298 (1985).
- Gaussian 09, Revision C.01. Gaussian, Inc. , Wallingford CT. (2012).
- Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8 (3), 275-282 (1997).
- Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50 (2), 316-325 (2015).
- Rigo, A., et al. Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (9), 1495-1501 (2004).
- Vytla, Y., Angel, L. A. Applying Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Explicitly Identifying the Products of Cu(II) Reactions of 2His-2Cys Motif Peptides. Analytical Chemistry. 88 (22), 10925-10932 (2016).
- Choi, D., Sesham, R., Kim, Y., Angel, L. A. Analysis of methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b via ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 18 (6), 509-520 (2012).
- Martell, A. E., Motekaitis, R. J. NIST Standard Reference Database 46. Institute of Standards and Technology. , Gaithersburg, MD. (2001).
- Pesch, M. L., Christl, I., Hoffmann, M., Kraemer, S. M., Kretzschmar, R. Copper complexation of methanobactin isolated from Methylosinus trichosporium OB3b: pH-dependent speciation and modeling. Journal of Inorganic Biochemistry. 116, 55-62 (2012).
- Amin, E. A., Truhlar, D. G. Zn Coordination Chemistry: Development of Benchmark Suites for Geometries, Dipole Moments, and Bond Dissociation Energies and Their Use To Test and Validate Density Functionals and Molecular Orbital Theory. Journal of Chemical Theory and Computation. 4 (1), 75-85 (2008).
- Sorkin, A., Truhlar, D. G., Amin, E. A. Energies, Geometries, and Charge Distributions of Zn Molecules, Clusters, and Biocenters from Coupled Cluster, Density Functional, and Neglect of Diatomic Differential Overlap Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 5 (5), 1254-1265 (2009).
- Lillo, V., Galan-Mascaros, J. R. Transition metal complexes with oligopeptides: single crystals and crystal structures. Dalton Transactions. 43 (26), 9821-9833 (2014).
- Choutko, A., van Gunsteren, W. F. Conformational Preferences of a beta-Octapeptide as Function of Solvent and Force-Field Parameters. Helvetica Chimica Acta. 96 (2), 189-200 (2013).
- Angel, L. A. Study of metal ion labeling of the conformational and charge states of lysozyme by ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 17 (3), 207-215 (2011).
- Kelso, C., Rojas, J. D., Furlan, R. L. A., Padilla, G., Beck, J. L. Characterisation of anthracyclines from a cosmomycin D-producing species of Streptomyces by collisionally-activated dissociation and ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 73-81 (2009).
- El Ghazouani, A., et al. Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorganic Chemistry. 50 (4), 1378-1391 (2011).
