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Chemistry

धातु आयन मान्यता और धातु बंधन Oligopeptides के Redox गतिविधि की संरचना और तंत्र का निर्धारण करने के लिए आयन गतिशीलता-मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक

Published: September 7, 2019 doi: 10.3791/60102
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Texas A&M University-Commerce

Summary

आयन गतिशीलता-मास स्पेक्ट्रोमेट्री और आणविक मॉडलिंग तकनीक डिजाइन धातु बाध्यकारी पेप्टाइड्स और तांबे बाध्यकारी पेप्टाइड्स methanobactin के चयनात्मक धातु chelating प्रदर्शन की विशेषता कर सकते हैं. धातु chelating पेप्टाइड्स के नए वर्गों का विकास धातु आयन misbalance के साथ जुड़े रोगों के लिए चिकित्सकीय करने के लिए नेतृत्व में मदद मिलेगी.

Abstract

Electrospray आयनन (ESI) गैस चरण के लिए एक जलीय चरण पेप्टाइड या पेप्टाइड जटिल हस्तांतरण कर सकते हैं, जबकि इसके द्रव्यमान संरक्षण, समग्र प्रभारी, धातु बाध्यकारी बातचीत, और conformational आकार. आयन गतिशीलता-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईएम-एमएस) के साथ ईएसआई युग्मन एक सहायक तकनीक है कि एक पेप्टाइड के बड़े पैमाने पर चार्ज (m/z) और टकराव पार अनुभाग (सीसीएस) है कि अपनी stoichimetry, प्रोटोनेशन राज्य से संबंधित के एक साथ माप के लिए अनुमति देता है प्रदान करता है, और अनुरूपआकार आकार. पेप्टाइड परिसर के समग्र प्रभारी के प्रोटोनेशन द्वारा नियंत्रित किया जाता है 1) पेप्टाइड अम्लीय और बुनियादी साइटों और 2) धातु आयन (ओं) के ऑक्सीकरण राज्य). इसलिए, एक जटिल के समग्र प्रभारी स्थिति पेप्टाइड्स धातु आयन बंधन समानता को प्रभावित करता है कि समाधान के पीएच का एक समारोह है. ईएसआई-आईएम-एमएस विश्लेषण के लिए, पेप्टाइड और धातु आयनों समाधान जलीय केवल समाधान से तैयार कर रहे हैं, पीएच के साथ समायोजित तनु जलीय एसिटिक एसिड या अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ समायोजित. यह पीएच निर्भरता और धातु आयन चयनात्मकता के लिए एक विशिष्ट पेप्टाइड के लिए निर्धारित किया जा करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, एक पेप्टाइड परिसर के m/z और सीसीएस B3LYP/LanL2D] आणविक मॉडलिंग के साथ इस्तेमाल किया जा सकता धातु आयन समन्वय और जटिल के तृतीयक संरचना के बाध्यकारी स्थलों को समझने के लिए. परिणाम बताते हैं कि कैसे ईएसआई-आईएम-एमएस वैकल्पिक methanobactin पेप्टाइड्स के एक सेट के चयनात्मक chelating प्रदर्शन की विशेषता और उन्हें तांबे बाध्यकारी पेप्टाइड methanobactin की तुलना कर सकते हैं.

Introduction

कॉपर और जिंक आयनों जीवों के लिए आवश्यक हैं और ऑक्सीडेटिव संरक्षण, ऊतक विकास, श्वसन, कोलेस्ट्रॉल, ग्लूकोज चयापचय, और जीनोम पढ़ने1सहित प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन कार्यों को सक्षम करने के लिए, Cys के thiolate जैसे समूहों, उसके2के imidazole,3, (अधिक शायद ही कभी) methionine के thioether, और ग्लू और Asp के carboxylate के रूप में धातुओं को शामिल करने के सक्रिय साइटों में cofactors के रूप में धातुएंजाइम। इन समन्वय समूहों की समानता इस बारे में एक पेचीदा प्रश्न उठाती है कि सही कार्यकरण सुनिश्चित करने के लिए उनके और साइस लिगंड्स को चुनिंदा रूप से क्यू (I/II) या n(II) को कैसे शामिल किया जाता है।

चयनात्मक बंधन अक्सर अधिग्रहण और तस्करी पेप्टाइड्स द्वारा पूरा किया जाता है, जो नियंत्रण n(II) या Cu(I/II) आयन सांद्रता4. Cu (I/II) अत्यधिक प्रतिक्रियाशील है और ऑक्सीडेटिव क्षति या एंजाइमों के लिए आकस्मिक बंधन का कारण बनता है, इसलिए इसकी मुक्त एकाग्रता कसकर तांबे chaperones और तांबे विनियमन प्रोटीन है कि यह सुरक्षित रूप से सेल में विभिन्न स्थानों के लिए परिवहन और कसकर द्वारा विनियमित है अपने homeostasis5,6पर नियंत्रण . तांबे के चयापचय या homeostasis के विघटन सीधे Menkes और विल्सन रोग7 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कैंसर7 और तंत्रिका विकारों, जैसे prion8 और अल्जाइमर रोग9में फंसा हुआ है.

विल्सन की बीमारी आंखों में तांबे के स्तर में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है, जिगर और मस्तिष्क के वर्गों, जहां Cu (मैं /II) के redox प्रतिक्रियाओं reactive ऑक्सीजन प्रजातियों का उत्पादन, hepatolenticular और तंत्रिका संबंधी अध: पतन के कारण. मौजूदा chelation चिकित्सा छोटे थायोल एमिनो एसिड penicillamine और triethylenetetramine हैं. वैकल्पिक रूप से, methanotrophic तांबा-अधिग्रहण पेप्टाइड्स methanobactin (एमबी)10,11 प्रदर्शन चिकित्सीय क्षमता Cu(I) के लिए अपने उच्च बंधन संबंध की वजह से12. जब मेथिलोसिनस ट्राइकोस्पोरियम ओबी 3 बी से मेथानोबैक्टिन (एमबी-ओबी3बी) विल्सन की बीमारी के एक पशु मॉडल में अध्ययन किया गया था, तांबे कुशलतापूर्वक जिगर से हटा दिया गया था और पित्त13के माध्यम से उत्सर्जित किया गया था। इन विट्रो प्रयोगों में इस बात की पुष्टि की गई है कि एमबी-ओबी3बी यकृत साइटोसोल13में निहित कॉपर धातुलोथीओनिन से तांबे को चीला दे सकता है। लेजर अपक्षरण आगमन आगमनात्मक युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग तकनीक विल्सन रोग जिगर के नमूने में तांबे के स्थानिक वितरण की जांच की है14,15,16 और पता चला है कि एमबी-OB3b तांबे को केवल 8 दिन17की कम उपचार अवधि के साथ हटा देता है .

एमबी-OB3b भी एजी (I), Au(III), Pb(II), Mn(II), सह(II), Fe(II), Ni(II), और n(II)18,19सहित अन्य धातु आयनों के साथ बाध्य करेगा। शारीरिक Cu (I) बाध्यकारी साइट के लिए प्रतियोगिता एजी (I) द्वारा प्रदर्शित किया जाता है क्योंकि यह एमबी-OB3b परिसर से Cu(I) विस्थापित कर सकते हैं, दोनों एजी (I) और Ni(II) के साथ भी एमबी के लिए अपरिवर्तनीय बाध्यकारी दिखा रहा है जो Cu(I)19द्वारा विस्थापित नहीं किया जा सकता है। हाल ही में, 2His-2Cys बाध्यकारी आकृति के साथ वैकल्पिक methanobactin (एम्ब) ओलिगोपेप्टाइड की एक श्रृंखला का अध्ययन किया गया है20,21, और उनके n (II) और Cu (I/II) बाध्यकारी गुण विशेषता. उनकी प्राथमिक एमिनो एसिड दृश्यों समान हैं, और वे सभी 2His-2Cys आकृति, प्रो और एक एसिटाइलेटी एन-टर्मिनस होते हैं। वे मुख्य रूप से एमबी-OB3b से अलग है क्योंकि 2His-2Cys आकृति एमबी-OB3b के दो enethiol oxazolone बाध्यकारी साइटों की जगह.

इलेक्ट्रोस्प्रे आयननीकरण आयन गतिशीलता-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ईएसआई-आईएम-एमएस) के साथ मिलकर पेप्टाइड्स के धातु-बाध्यकारी गुणों का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली वाद्य तकनीक प्रदान करता है क्योंकि यह उनके द्रव्यमान-से-चार्ज के उपाय करता है (m/ अनुप्रस्थ अनुभाग (सीसीएस) जबकि समाधान चरण से उनके द्रव्यमान, प्रभारी, और conformational आकार संरक्षण. m/z और सीसीएस पेप्टाइड्स स्टोइकियोमेट्री, प्रोटोनेशन राज्य, और अनुरूपता आकार से संबंधित हैं। Stoichimetry निर्धारित किया जाता है क्योंकि पहचान और प्रजातियों में मौजूद प्रत्येक तत्व की संख्या स्पष्ट रूप से पहचान की है. पेप्टाइड परिसर के समग्र प्रभारी अम्लीय और बुनियादी साइटों के प्रोटोनेशन राज्य और धातु आयन (ओं) के ऑक्सीकरण राज्य से संबंधित है. सीसीएस पेप्टाइड परिसर के अनुरूप आकार की जानकारी देता है क्योंकि यह घूर्णन औसत आकार को मापता है जो जटिल की तृतीयक संरचना से संबंधित है। परिसर के समग्र प्रभारी राज्य भी पीएच का एक समारोह है और पेप्टाइड धातु आयन बाध्यकारी संबंध को प्रभावित करता है क्योंकि deprotonated बुनियादी या अम्लीय साइटों जैसे carboxyl, उसके, Cys और Tyr भी धातु आयन के लिए संभावित बाध्यकारी साइटों रहे हैं. विश्लेषण के लिए पेप्टाइड और धातु आयन जलीय समाधानों में तैयार किए जाते हैं जिन्हें तनु जलीय एसिटिक एसिड या अमोनियम हाइड्रॉक्साइड द्वारा समायोजित किया जाता है। यह पीएच निर्भरता और धातु आयन चयनात्मकता पेप्टाइड के लिए निर्धारित किया जा करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, ईएसआई-आईएम-एमएस द्वारा निर्धारित m/z और सीसीएस का उपयोग B3LYP/LanL2D] आणविक मॉडलिंग के साथ किया जा सकता है ताकि परिसर की धातु आयन समन्वय और तृतीयक संरचना के प्रकार की खोज की जा सके। इस लेख में दिखाए गए परिणामों से पता चलता है कि कैसे ESI-IM-MS amb पेप्टाइड्स के एक सेट के चयनात्मक chelating प्रदर्शन की विशेषता और उन्हें तांबे बाध्यकारी पेप्टाइड एमबी-OB3b के लिए तुलना कर सकते हैं.

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Protocol

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. संस्कृति मिथाइलोसिनस ट्राइकोस्पोरियम ओबी3बी, का उपयोग होने तक क्यू (आई)-मुक्त एमबी-OB3b18,22,23, फ्रीज-ड्रा नमूना और स्टोर को -80 डिग्री सेल्सियस पर अलग करें।
  2. एम्ब पेप्टाइड्स को संश्लेषित करें (और amb1, amb2, amb 4 ;amb7के लिए 70% शुद्धता ) , नमूनों को फ्रीज-ड्रा करें, और उपयोग होने तक उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. खरीद -98% शुद्धता मैंगनीज (II) क्लोराइड, कोबाल्ट (II) क्लोराइड, निकले(II) क्लोराइड, कॉपर(II) क्लोराइड, कॉपर (II) नाइट्रेट, चांदी (I) नाइट्रेट, जस्ता (II) क्लोराइड, लोहा (III) क्लोराइड और सीसा (II) क्लोराइड।
  4. अम्ब प्रजातियों और एच पीएलसीसी ग्रेड या उच्च अमोनियम हाइड्रॉक्साइड, हिमनदीय एसीटिक एसिड, और एसीटोनिट्रिल के टकराव क्रॉस वर्गों को मापने के लिए कैलिब्रेटर्स के रूप में इस्तेमाल किया पाली-डीएल-एनाइन पॉलिमर खरीद।

2. स्टॉक समाधान की तैयारी

  1. पेप्टाइड स्टॉक समाधान
    1. वजन सही, कम से कम तीन महत्वपूर्ण आंकड़ों का उपयोग कर, एक 1.7 एमएल प्लास्टिक शीशी में एमबी-OB3b या अम्ब के 10.0-20.0 मिलीग्राम के द्रव्यमान.
      नोट: तौला द्रव्यमान या तो 12.5 m या 1.25 M M उपज चाहिए, पेप्टाइड की घुलनशीलता के आधार पर, जब deionized (DI) पानी के 1.00 एमएल जोड़ा जाता है.
    2. एक पाइप का उपयोग करके, 12.5 उम या 1.25 एम एम समाधान उपज के लिए तौला पेप्टाइड नमूना करने के लिए deionized पानी के 1.00 एमएल जोड़ें (gt; 17.8 एम $सेमी)। टोपी सुरक्षित रखें और कम से कम 20 व्युत्क्रम के साथ अच्छी तरह से मिश्रण.
    3. एक माइक्रोपाइप का उपयोग करके पेप्टाइड नमूने से 50.0 डिग्री एल एलिकोट्स को व्यक्तिगत रूप से लेबल 1.5 एमएल शीशियों में वितरित करें और उपयोग होने तक उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. धातु आयन शेयर समाधान
    1. कम से कम तीन महत्वपूर्ण आंकड़ों का उपयोग करते हुए, 1.7 एमएल शीशी में धातु क्लोराइड या चांदी नाइट्रेट का द्रव्यमान 10ण्0-30.0 मिलीग्राम का उपयोग करते हुए।
      नोट: जब डि वाटर का 1.00 एमएल जोड़ा जाता है तो तौला हुआ द्रव्यमान 125 एमएम उत्पन्न करना चाहिए।
    2. 1.7 एमएल शीशी में तौला गया धातु के नमूने में 1.00 एमएल DI पानी जोड़ें 125 एमएल समाधान उपज. टोपी सुरक्षित रखें और कम से कम 20 व्युत्क्रम के साथ अच्छी तरह से मिश्रण.
  3. अमोनियम हाइड्रॉक्साइड स्टॉक समाधान:1.00 एमएल के अंतिम आयतन के लिए DI जल के साथ 99.5% एसिटिक अम्ल विलयन के 57 डिग्री सेल्सियस को कम करके 1.0 एम ऐसीटिक अम्ल विलयन तैयार करें। DI जल के साथ 21% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड विलयन के 90 डिग्री सेल्सियस को 1ण्00 एमएल के अंतिम आयतन तक कम करके 1ण्0 एम अमोनियम हाइड्रॉक्साइड विलयन तैयार की जा सकता है। 0ण्10 ड और 0ण्010 उ एसिटिक अम्ल तथा अमोनियम हाइड्रॉक्साइड विलयन तैयार करने के लिए 1ण्0 ड विलयनों में से 100 उप्र का 100 उल तथा 0ण्010 उ एसिटिक अम्ल तथा अमोनियम हाइड्रॉक्साइड विलयन तैयार करके प्रत्येक विलयन के दो क्रमिक तनुकरण की अनुमति दें।
  4. पाली-डीएल-एलैनिन स्टॉक समाधान:पाली-डीएल-एलैनिन (पीए) को 1.0 मिलीग्राम पीए का वजन और 1000 पीपीएम देने के लिए डीआई पानी के 1.0 एमएल में भंग करके तैयार करें। अच्छी तरह से मिलाएं. एक माइक्रोपाइप का उपयोग करके, 50.0 [एल एलिकोट्स वितरित करें, और प्रत्येक को 1.7 एमएल शीशी में रखें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. इलेक्ट्रोस्प्रे-आयन गतिशीलता-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

  1. ईएसआई प्रवेश ट्यूबिंग और सुई केशिका को 0.1 एम हिमनदीय एसीटिक एसिड, 0.1 एम अमोनियम हाइड्रॉक्साइड, और अंत में डि पानी के बारे में 500 डिग्री सेल्सियस के साथ अच्छी तरह से साफ करें।
  2. 1,000 पीपीएम पीए स्टॉक समाधान के एक 50.0 $L aliquot thaw और यह DI पानी के 450 डिग्री सेल्सियस के साथ पतला करने के लिए एक 100 पीपीएम पीए दे. इस विलयन का पाइप्ट 100.0 $ल और इसे 10 पीपीएम पीए समाधान देने के लिए 500 डिग्री सेल्सियल डीआई जल के साथ 1.00 एमएल और एसीटोनिट्रिल का 500 डिग्री सेल्सियस तक पतला कर देता है।
  3. चर्चा अनुभाग में वर्णित के रूप में देशी ESI-IM-MS शर्तों का उपयोग कर 10 मिनट प्रत्येक के लिए 10 पीपीएम पीए समाधान के नकारात्मक और सकारात्मक आयन IM-MS स्पेक्ट्रम लीजिए।
  4. 12.5 उM या 1.25 एम एम एम्ब स्टॉक विलयन का 50.0 डिग्री सेल्सियस एलिकोत था और डीआई जल के साथ क्रमिक तनुकरण करके 0ण्125 उम अम्ब की अंतिम सांद्रता प्रदान की। अच्छी तरह से प्रत्येक कमजोर पड़ने मिक्स.
  5. 125 एमएल धातु आयन स्टॉक विलयन का पिपीट 100.0 डिग्री सेल्सियस, 1.7 एमएल शीशी में रखें तथा 12.5 लाख धातु आयन देने के लिए DI जल के साथ 1.00 एमएल तक पतला हो जाता है। एक अंतिम 0.125 मीटर धातु आयन एकाग्रता देने के लिए दो और लगातार कमजोर पड़ने के साथ दोहराएँ। अच्छी तरह से प्रत्येक कमजोर पड़ने मिक्स.
  6. पिप्पल 200.0 $ल 0ण्125 उम अम्ब का 1ण्7 एमएल शीशी में, 500 डिग्री सेल्सियस डि वाटर के साथ पतला हो जाता है और विलयन को अच्छी तरह मिला देते हैं।
  7. 1ण्0 एम एसिटिक अम्ल विलयन के 50 डिग्री सेल्सियस को जोड़कर नमूने के पीएच को 3.0 में समायोजित करें।
  8. पीएच-समायोजित नमूने में 0ण्125 उम धातु आयन का 200.0 $ल जोड़ें। DI पानी जोड़ें नमूना के 1.00 एमएल की एक अंतिम मात्रा उपज, अच्छी तरह से मिश्रण, और नमूना आरटी पर 10 मिनट के लिए बराबर करने के लिए अनुमति देते हैं.
  9. एक कुंद नाक सिरिंज का उपयोग नमूना के 500 डिग्री सेल्सियस ले और 5 मिनट प्रत्येक के लिए नकारात्मक और सकारात्मक आयन ES-IM-MS स्पेक्ट्रम इकट्ठा. एक calibrated माइक्रो पीएच इलेक्ट्रोड का उपयोग कर अपने अंतिम पीएच रिकॉर्ड करने के लिए नमूने के शेष 500 डिग्री एल का उपयोग करें।
  10. चरण 3.6-3.9 दोहराएँ, जबकि चरण 3.7 को संशोधित करने के लिए पीएच को समायोजित करने के लिए 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, या 10.0 0 0.10 M, 0.10 M, या 1.0 एम एसिटिक एसिड या ammonium हाइड्रॉक्साइड समाधान के नए संस्करणों को जोड़कर.
  11. 10 मिनट प्रत्येक के लिए 10 पीपीएम पीए समाधान के नकारात्मक और सकारात्मक आयन ईएसआई-आईएम-एमएस स्पेक्ट्रम लीजिए।

4. अम्ब नमूनों की धातु आयन अनुमापन की तैयारी

  1. 3-1-3-5 चरणों में वर्णित चरणों का पालन करें.
  2. पिप्पल 200.0 $ल 0ण्125 उम अम्ब का 1ण्7 एमएल शीशी में, 500.0 डिग्री सेल्सियस डि जल के साथ पतला हो जाता है और विलयन को अच्छी तरह मिला देते हैं।
  3. 0ण्010 उ अमोनियम हाइड्रॉक्साइड विलयन के 80 ल् को जोड़कर नमूने के चह को चह के लिए 9ण्0 में समायोजित करें।
  4. धातु आयन के 0ण्14 मोलर तुल्यादेने के लिए 0ण्125 उम धातु आयन विलयन का 28 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, नमूना 1.00 एमएल की अंतिम मात्रा बनाने के लिए DI जल जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण करें, और नमूने को आरटी पर 10 मिनट के लिए बराबर करने की अनुमति दें।
  5. एक कुंद नाक सिरिंज का उपयोग नमूना के 500 डिग्री सेल्सियस ले और 5 मिनट प्रत्येक के लिए नकारात्मक और सकारात्मक आयन ईएसआई-आईएम-एमएस स्पेक्ट्रम इकट्ठा. एक calibrated माइक्रो पीएच इलेक्ट्रोड का उपयोग कर अपने अंतिम पीएच रिकॉर्ड करने के लिए नमूने के शेष 500 डिग्री एल का उपयोग करें।
  6. कदम 4.2-4.5 दोहराएँ, जबकि चरण 4.3 को संशोधित करने के लिए या तो 0.28, 0.42, 0.56, 0.70, 0.84, 0.98, 1.12, 1.26, या 1.40 मोलर समकक्ष देने के लिए 0.25 मीटर धातु आयन समाधान की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ने के लिए।
  7. 10 मिनट प्रत्येक के लिए 10 पीपीएम पीए समाधान के नकारात्मक और सकारात्मक आयन IM-MS स्पेक्ट्रम लीजिए।

5. ईएसआई-आईएम-एमएस पीएच अनुमापन डेटा का विश्लेषण

  1. आईएम-एमएस स्पेक्ट्रम से पहचान की पहचान जो ambs के आरोप प्रजातियों उन्हें उनके सैद्धांतिक m/z आइसोटोप पैटर्न के लिए मिलान करके मौजूद हैं.
    1. बड़े पैमाने पर खुला और क्रोमैटोग्राम विंडो खोलने के लिए क्रोमैटोग्राम पर क्लिक करें।
    2. फ़ाइल मेनू पर जाएँ और IM-MS डेटा फ़ाइल ढूँढने और खोलने के लिए खोलें.
    3. राइट-क्लिक करके और क्रोमैटोग्राम भर में खींच कर और जारी करके IM-MS स्पेक्ट्रम निकालें। स्पेक्ट्रम विंडो आईएम-एमएस स्पेक्ट्रम दिखा खुल जाएगा।
    4. स्पेक्ट्रम विंडो में, उपकरण और आइसोटोप मॉडलपर क्लिक करें। आइसोटोप मॉडलिंग विंडो में, अम्ब प्रजाति का आण्विक सूत्र दर्ज करें, चार्ज किए गए आयन बॉक्स को दिखाएँ चेक करें, और आवेश अवस्था दर्ज करें. ठीकक्लिक करें.
    5. आईएम-एमएस स्पेक्ट्रम में सभी प्रजातियों की पहचान करने और उनके m/z आइसोटोप रेंज रिकॉर्ड करने के लिए दोहराएँ।
  2. प्रत्येक अम्ब प्रजातियों के लिए, किसी भी संयोगm/z प्रजातियों को अलग करें और उनकी पहचान करने के लिए उनके m/z आइसोटोप पैटर्न का उपयोग करके उनके आगमन समय वितरण (ATD) निकालें।
    1. MassLynx में कार्यक्रम खोलने के लिए बहावस्कोप पर क्लिक करें। में ड्रिफ्टस्कोप फ़ाइल पर क्लिक करें और IM-MS डेटा फ़ाइल को ढूँढने और खोलने के लिए खोलें।
    2. माउस का उपयोग करें और amb प्रजातियों के m/z आइसोटोप पैटर्न पर ज़ूम करने के लिए बाएँ क्लिक करें.
    3. आइसोटोप पैटर्न का चयन करने के लिए चयन उपकरण और बाएँ माउस बटन का उपयोग करें। वर्तमान चयन स्वीकार करें बटन क्लिक करें.
    4. किसी भी संयोगm/z प्रजातियों को अलग करने के लिए चयन उपकरण का उपयोग करें और छोड़ दिया माउस बटन एएमबी प्रजातियों के आइसोटोप पैटर्न के साथ संरेखित ATD समय का चयन करने के लिए। वर्तमान चयन स्वीकार करें बटन क्लिक करें.
    5. ATD निर्यात करने के लिए, फ़ाइल पर जाएँ | MassLynx के लिए निर्यात,तो बहाव समय बनाए रखने का चयन करें और उचित फ़ोल्डर में फ़ाइल को बचाने के।
  3. ATD के centroid निर्धारित करने और प्रजातियों की आबादी के एक उपाय के रूप में ATD वक्र के तहत क्षेत्र को एकीकृत.
    1. MassLynx के क्रोमेटोग्राम खिड़की में बचाया निर्यात फ़ाइल खोलें। प्रक्रिया पर क्लिक करें ] मेनू से एकीकृत करें. ApexTrack पीक एकीकरण बॉक्स की जाँच करें और ठीकक्लिक करें.
    2. क्रोमैटोग्राम विंडो पर दर्शाए अनुसार सेंट्राइड एटीडी (टीए) और एकीकृत क्षेत्र को रिकॉर्ड करें। सभी सहेजे गए amb और PA IM-MS डेटा फ़ाइलों के लिए दोहराएँ।
  4. एक रिश्तेदार प्रतिशत पैमाने को सामान्य करने के लिए प्रत्येक अनुमापन बिंदु पर या तो सकारात्मक या नकारात्मक आयनों के सभी निकाले amb प्रजातियों के लिए एकीकृत ATD का प्रयोग करें.
    1. एक स्प्रेडशीट में प्रत्येक पीएच पर amb प्रजातियों और उनके एकीकृत ATD की पहचान दर्ज करें.
    2. प्रत्येक पीएच के लिए, एक प्रतिशत पैमाने पर व्यक्तिगत एम्ब के ATD सामान्य करने के लिए एकीकृत ATDs के योग का उपयोग करें।
    3. प्रत्येक अम्ब प्रजातियों के प्रतिशत तीव्रता को एक ग्राफ में पीएच में प्लॉट करें ताकि यह पता चले कि प्रत्येक प्रजाति की जनसंख्या पीएच के एक समारोह के रूप में भिन्न होती है।

6. टकराव पार वर्गों

  1. एक स्प्रेडशीट का उपयोग करते हुए, पीए नकारात्मक25,26 और सकारात्मक27 आयनों वह बफर गैस28 में मापा सीसीएस (जेडग) नीचे समीकरण 1 का उपयोग कर, जहां: z $ आयन प्रभारी के सीसीएस (जेड) परिवर्तित; ई ग ] इलेक्ट्रॉन आवेश (1ण्602 र्10-19 ब्); एम एन 2 ] छ2 गैस (दा) का द्रव्यमान; और mआयन ] आयन द्रव्यमान. 29

Equation 1

  1. PA calibrants और अम्ब प्रजातियों के औसत आगमन समय (टीए) बहाव समय में परिवर्तित (टीडी) नीचे समीकरण 2 का उपयोग कर, जहां: ग ] बढ़ाया शुल्क चक्र देरी गुणांक (1.41), और m/z पेप्टाइड आयन के बड़े पैमाने पर करने के लिए प्रभारी है।

Equation 2

  1. प्लॉट पीए कैलिब्रंट्स 'टीडी बनाम उनके जेडग| फिर, नीचे दिखाए गए समीकरण 3 के कम से कम-वर्ग प्रतिगमन फिट का उपयोग करके, A' और B मान निर्धारित करें, जहाँ: A' तापमान, दाब, और विद्युत फ़ील्ड पैरामीटर के लिए सुधार है; और B IM डिवाइस के गैर रेखीय प्रभाव के लिए क्षतिपूर्ति करता है।

Equation 3

  1. इन ए' और ठ मानों और एम्ब्स के ए टीडी से केंद्रक तद मान का उपयोग करके समीकरण 3 तथा उनके समीकरण 1का उपयोग करके उनके $ग का निर्धारण करते हैं। इस विधि के बारे में 2% 25,26,27के अनुमानित निरपेक्ष त्रुटियों के साथ पेप्टाइड प्रजातियों के लिए सीसीएस प्रदान करता है .

7. संगणकीय तरीके

  1. सिद्धांत के B3LYP/LanL2D] स्तर का उपयोग करें, जिसमें बेके 3-पैरामीटर संकर कार्यात्मक30 और डनिंग आधार सेट31 और इलेक्ट्रॉन कोर क्षमता32,33,34 का पता लगाने के लिए शामिल है। प्रेक्षित m/z अम्ब प्रजाति35के सभी संभव प्रकारके समन्वयों के लिए ज्यामिति-अनुकूलित अनुरूपक ।
    नोट: कैसे बनाने के लिए और गणना प्रस्तुत करने के विवरण के लिए पूरक फ़ाइलमें GausView उपयोग का संदर्भ लें।
  2. conformers में से प्रत्येक की भविष्यवाणी मुक्त ऊर्जा की तुलना करें और सिग्मा कार्यक्रम36से आयन स्केल Lennard-जोन्स (LJ) विधि का उपयोग कर उनके सैद्धांतिक सीसीएस की गणना .
  3. सबसे कम मुक्त ऊर्जा अनुरूपों से यह निर्धारित किया जाता है कि प्रयोग में पाए गए अनुमेयों के लिए तृतीयक संरचना और समन्वय के प्रकार की पहचान करने के लिए आईएम-एमएस मापित सीसीएस से सहमत एलजे सीसीएस को कौन-सा कंस्पर दर्शाता है।

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Representative Results

अम्ब1 की धातु बंधन
IM-MS अध्ययन20 अम्ब1 (चित्र 1क) से पता चला है कि कॉपर और जिंक आयन दोनों ही किसी पीएच-निर्भर तरीके से अम्ब1 से बंधे हुए हैं (चित्र 2)। हालांकि, तांबे और जस्ता विभिन्न समन्वय स्थलों पर विभिन्न प्रतिक्रिया तंत्र के माध्यम से अम्ब1 के लिए बाध्य. उदाहरण के लिए, कु(II) को अम्ब1 में जोड़ने के परिणामस्वरूप अम्ब1 (अम्ब1ox) का ऑक्सीकरण हुआ , जिसके परिणामस्वरूप , और $gt;6 के पीएच पर, [amb1ox]3H+Cu(II)] आयन (चित्र 2 ए) का गठन किया गया था। यह दो imidazoliums, carboxyl समूह, और दो अतिरिक्त साइटों है कि Cu(II) समन्वय कर रहे थे के deprotonation संकेत दिया.

[amb1ox] 3H+Cu(II)] की आण्विक मॉडलिंग B3LYP/LanL2D] का उपयोग करते हुए सबसे कम ऊर्जा परिसर Cu (II) उसके1 के imidazole [N के माध्यम से समन्वित किया गया था और Cys 2 की रीढ़ की हड्डी के ऐमाइड समूहों के deprotonated नाइट्रोजन और Gly3| हालांकि, 6 के एक पीएच के नीचे, Cu(II) को अम्ब1 में जोड़ने के लिए एक m/z आइसोटोप पैटर्न है कि केवल Cu(I) बाइंडिंग द्वारा के लिए जिम्मेदार हो सकता है का गठन किया, [amb1ox+Cu(I)]+ आयन (चित्र 2बी) के गठन. इसके विपरीत, एक pH 6 से अधिक m/z isotope पैटर्न को कम करने के लिए कारण 1 m/z, के लिए जिम्मेदार धनी चार्ज किया गया [amb1ox]H +Cu(II)]+ आयन. जोड़ना [n(II) amb1ऑक्सीकरण नहीं किया था , और [n(II) बाइंडिंग के एक pH पर मनाया गया था gt;6, मुख्य रूप से बनाने [amb1[3H+n(II)]आयन (चित्र 2ब्) . इससे इमिडाज़ोलियम, थायोल और कार्बोक्सिल समूहों का विप्रोटोनेशन का संकेत मिलता है। [amb1] 3H+n(II)] की आण्विक मॉडलिंग] आयन निर्धारित सबसे कम ऊर्जा conformers या तो tetrahedral [n(II) समन्वय के माध्यम से 2His-2Cys या His-2Cys और सी-टर्मिनस के carboxylate.

एकाधिक Cu(I) अम्ब2 की बाइंडिंग
क्यू(II) और अम्ब2 (चित्र 1ठ) के बीच रेडॉक्स अभिक्रियाओं के परिणामस्वरूप क्यू(I) बंधन हुआ। यह IM-MS, यूवी-Vis स्पेक्ट्रोफोटोट्री, और B3LYP आणविक मॉडलिंग37का उपयोग कर अधिक विस्तार से अध्ययन किया गया था. 5 के पीएच पर अम्ब2 के Cu (II) अनुमापन के मुख्य उत्पादों amb2 ऑक्सीकरण थे (डिसुलाइड पुल गठन के माध्यम से) और unoxidized अम्ब2 प्रजातियों तीन Cu (I) आयनों समन्वय.

B3LYP/LanL2D] विधि का उपयोग कर एक खोज 3Cu (I) समन्वित प्रजातियों के लिए संघर्ष कर दो कम ऊर्जा परिसरों स्थित. पहला परिसर चित्र 3कमें दिखाया गया था , जहां 3ब् (I) आयनों को ब्यास2 के ब्रिजिंग थायोलेट समूहों38 और Cys6 (उसके1के ) के साथ-साथदृ 1 और छ5 (उसके 5 में से ) के माध्यम से समन्वित किया गया था। ). दूसरे परिसर (3c) protonated उसके1 पक्ष समूह और सी-टर्मिनल carboxylate समूह के बीच एक नमक पुल है. इन परिणामों का सुझाव है कि 3.0-6.0 के पीएच पर, प्रिंसिपल अम्ब2+3Cu (I) जटिल नमक पुल संरचना है, जो सफलतापूर्वक समाधान से गैस चरण के लिए केवल न्यूनतम संरचनात्मक पुनर्व्यवस्था के साथ स्थानांतरित किया जा सकता है.

209 के सैद्धांतिक LJ सीसीएस - 6 $2, जटिल 3c के लिए सिग्मा कार्यक्रम36 का उपयोग कर की गणना, IM-MS मापा सीसीएस के साथ सहमत हुए, यह दर्शाता है कि 3c का प्रतिनिधित्व करता है [am2]2H+3Cu (I)]+ pH 3.0-6.0 पर रचना. तथापि, किसी समग्र तटस्थ संकुल में उसका1 (चKएक$ 6.0) का परिणाम है, शायद इसलिए कि इस जटिल को IM-MS द्वारा नहीं देखा गया था। एक बार जब उसके1 के इमिडाज़ोलियम समूह का विप्रोटोनेट हो जाता है, तो 3Cu (I) समन्वय Cys2 और Cys6 के ब्रिजिंग थायोलेट समूहों में परिवर्तित हो सकता है और साथ ही [N1 और उसके1 के N 5 और उसकी5 , क्रमशः (3क)।

अम्ब4 क्यू (I/II)-बाध्यकारी और रेडॉक्स गतिविधि की पीएच निर्भरता
IM-MS और B3LYP तकनीकों का उपयोग एम्ब4 के क्यू(II) और पीएच अनुमापनों की जांच करने के लिए किया गया है (चित्र 1ब्) औरएम्ब 4 के मोनोमर, डाइमर, ट्रिमर, और टेट्रामर परिसरों की पहचान की गई है जिसमें तीन क्यू (I) आयन या दो क्यू (II) होते हैं। ) प्रत्येक मोनोमर सबयूनिट39के लिए आयन . परिसरों भी disulfide पुलों की विभिन्न संख्या में निहित है, और इन उत्पादों का उत्पादन किया गया या नहीं, Amb4 के साथ Cu(II) प्रतिक्रियाओं अवायवीय या एरोबिक जलीय समाधान में आयोजित किए गए.

आईएम-एमएस तकनीक का उपयोग करके यह दर्शाया गया था कि इन अलग-अलग प्रजातियों को अलग किया जा सकता है और यह निर्धारित किया जा सकता है कि उनके आगमन के समय में अंतर के कारण समस्थानिक पैटर्न ओवरलैप हो गया हो (चित्र 4)। इन बारीकी से संबंधित प्रजातियों की पहचान और परिमाणीकरण एक कार्य है कि कोई अन्य वाद्य या विश्लेषणात्मक तकनीक प्राप्त कर सकते हैं. ये IM-MS अध्ययन पीएच-निर्भर रेडॉक्स प्रतिक्रियाओं में काफी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और वास्तव में अंतर-या अंतर-आण्विक डिस्क्लिफ पुलों की संख्या, क्यू (I) या क्यू (II) आयनों की संख्या, और प्रत्येक परिसरों में deprotonation साइटों की संख्या की पहचान की () चित्र 5) .

इसके अलावा, परिसरों सीसीएस को मापने भी व्यक्तिगत प्रजातियों conformational आकार में से प्रत्येक के दृढ़ संकल्प की अनुमति दी, जो एक व्यापक B3LYP/LanL2D के साथ इस्तेमाल किया गया था संरचनाओं के साथ conformers पता लगाने के लिए कि दोनों सही आणविक के साथ सहमत हुए आईएम-एमएस द्वारा मापा स्टोइकियोमेट्री और सीसीएस। इस विधि के माध्यम से विभिन्न परिसरों के क्यू (आई/II) समन्वय की पहचान की गई। Cu(II) और अम्ब4 के बीच प्रतिक्रियाओं में समाधान के पीएच के आधार पर या तो Cu(I) या Cu(II) समन्वय dimers, trimers, और tetramers के गठन शामिल थे।

उदाहरण के लिए, उन समाधानों में जो हल्के अम्लीय थे (च़् 3ण्0ण्6ण्0) आयनों को मुख्य रूप से बाध्य करते थे तथा उन समाधानों में अनुसूचत थे जो थोड़ा क्षारक (च़् 8.0-11.0) थे, वे मुख्य रूप से Cu(II) आयनों को बाध्य करते थे और सभी Cys द्वारा ऑक्सीकृत किए गए थे आबंध (चित्र 6) B3LYP/LanL2D] निर्धारित किया है कि Cu (I) आयनों रैखिक थे और थायोलेट और imidazole समूहों द्वारा पुल, जबकि Cu(II) आयनों विकृत टी के आकार का या वर्ग planar geometries के माध्यम से chelated थे एक imidazole के रूप में के रूप में अच्छी तरह से deprotonated रीढ़ नाइट्रोजन के रूप में अच्छी तरह से ऐमाइड समूह.

एमबी-OB3b के IM-MS विश्लेषण
IM-MS अध्ययन19,40 mb-OB3b ( चित्र1डी) से पता चला है कि गैस चरण में, Cu(I)मुक्त एमबी-OB3b तीन नकारात्मक आरोप लगाया प्रजातियों के रूप में मौजूद है: [mb-OB3b-H]-, [mb-OB3b-2H] 2-और [mb-OB3b-3H] 3-,अपेक्षित समाधान-चरण व्यवहार के अनुरूप. व्यक्तिगत धातु आयन titrations19 एमबी-OB3b की धातु आयन चयनात्मकता निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया गया। चित्र ााालं 7 चयनित धातु आयन अनुज्ञेयके परिणामों से पता चलता है और यह दर्शाता है कि एमबी-ओबी3बी की स्पष्ट बंधनीय चयनात्मकता को तीन प्रमुख समूहों के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है: 1) क्यू(I) और एजी(I); 2) Ni(II), n(II) और सह(II); और 3) पंजाब (II), फे(II), और Mn(II). बाध्यकारी चयनात्मकता का यह क्रम उस के साथ सामान्य समझौते में दिखाया गया था जो फ्लोरोसेंस शमन प्रयोगों द्वारा पायागया 19 और समतापी अनुमापन कैलोरी मिलिएट्री18.

एमबी-OB3b और अम्ब की तुलना 7 धातु बंधन वरणक्षमता
एमबी-OB3b के स्पष्ट बाध्यकारी चयनात्मकता 7 के पीएच पर अम्ब7 के बाध्यकारी चयनात्मकता की तुलना में किया गया था। अम्ब7 एमबी-OB3b के रूप में एक ही एमिनो एसिड अनुक्रम के साथ डिजाइन किया गया था, लेकिन दो enethiol oxazolone समूहों के साथ दो His-Cys समूहों के साथ प्रतिस्थापित. अम्ब7 (चित्र 1ई) का साइस 6 और साइस 12के बीच एक ही विरूत्ता आबंध है . ऋणात्मक आवेशित परिसरों के निर्माण केपरिणामोंसे पता चला है कि नि(II) और एन (II) (60%), इसके बाद सह(II) और पंजाब (II) (40%) के लिए एम्ब7 पसंदीदा बाध्यकारी चयनात्मकता। इसके अलावा, वहाँ के बारे में 20% Cu(II) बाध्यकारी था. वहाँ या तो ट्रेस या कोई amb7 Ag(I), Mn(II), या Fe(II) की बाध्यकारी था. यह Cu(I) और एजी (I) बाइंडिंग के लिए 90% से अधिक की एमबी-OB3b की पसंदीदा बाध्यकारी चयनात्मकता की तुलना में।

Figure 1
चित्र 1: वैकल्पिक मेथेनोबैक्टिन (एएमबी) और मेथेनोबैक्टिन (एमबी-ओबी3बी) पेप्टाइड्स की प्राथमिक संरचनाएं। (A) Acetyl-His1-Cys2-Gly3-Pro4-His5-Cys6 (amb1); (बी) acetyl-His1-Cys2-Tyr3-Pro4-His5-Cys6 (amb2); (C) acetyl-His1-Cys2-Gly3-Ser4-Tyr5-Pro6-His7-Cys8-Ser9 (amb4); (डी) 1-(N-$mercapto-(5-oxo-2-(3-methylbutanoyl)oxazol-($)-4-ylidene)मिथाइल]-Gly1-Ser2-Cys3-Tyr4)-pyrrolidin-2-yl-(mercapto-5-oxo-ox---4--ser -सस6-मट7 (mb-OB3b); और (ई) acetyl-Leu1-His2-Cys3-Gly4-Ser5-Cys6-Tyr7-Pro8-His9-Cys10-Ser11-Cys12-Met 13 (अम्ब7)। शेडिंग से पता चलता है: 2His-2Cys या enethiol-oxazolone बंधन साइटों ( ;Icon; प्रोलीन या पाइरोलिडीनIconटिका ( ; एसिटिल या मेथिलब्यूनॉल समूहIconएन-टर्मिनस ( ); और tyrosine, जो एक दूसरे solvation खोल के माध्यम सेIconधातु आयन समन्वय को स्थिर कर सकते हैं - -cation बातचीत (). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: वैकल्पिक methanobactin के मतलब रिश्तेदार तीव्रता (अम्ब1) एसिटाइल-उसकी1-Cys2-Gly3-Pro4-His5-Cys6 और धातु से बंधे परिसर (अम्ब1+एक्स) (जहां X ] Cu या $n). एम्ब के 1:1 मोलर अनुपात विलयन के ऋणात्मक तथा धनात्मक आयन द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के दौरान प्रेक्षण किए गए थे:Xब्2 3ण्0-11ण्0 की च ़ श्रेणी पर। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतिकृति पीएच अनुमापन प्रयोगों से सापेक्ष तीव्रता और पीएच दोनों के साधनों के मानक विचलन दिखाती हैं। अम्ब:क्यूसीएल2 का मोलर विलयन के परिणामस्वरूप अम्ब (अम्बबैल) का ऑक्सीकरण हुआ जिसके साथ Cys2 और Cys6ने एक डिसल्फाइड पुल का निर्माण किया। (A) अम्ब:CuCl2 का ऋणात्मक आयन विश्लेषण [ambox[H]] और [ambox]3H+Cu(II)]] (बी) अम्ब का सकारात्मक आयन विश्लेषण:CuCl2 दिखा रहा है [अम्बबैल]+ और [अम्बबैल+Cu(I/II)]+; परिसर में क्यू के ऑक्सीकरण राज्य पीएच-निर्भर था, जा रहा है [ambox+Cu(I)]+;  8 के पीएच के नीचे और [अम्बऑक्स]H+Cu(II)]+ ; 8 के पीएच के ऊपर. (C) अम्ब का ऋणात्मक आयन विश्लेषण:[nCl2] [amb]n] और [amb+n(II)]n]. (D) अम्ब का सकारात्मक आयन विश्लेषण:[nCl2 दिखा रहा है [amb]n+ और [amb+n(II)]n+. यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन20से अनुकूलित किया गया है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: [amb2+3Cu(I)] की प्रस्तावित संरचनाओं+ सिद्धांत के B3LYP/LanL2D] स्तर से स्थित सबसे कम ऊर्जा और ज्यामिति-अनुकूलित संरचनाओं का उपयोग कर। (क) 3 क (I) समन्वय के माध्यम से [छ1]न5 उसकी1 और उसकी5 तथा थायोलेट ब्रिजिंग थायोलेट समूह ों के Cys2 और Cys6 के एक सैद्धांतिक क्रॉस-सेक्शन के साथ 217 ] 6 ]2. (ख) र्ं1ंन1ं तथा थायोलेट ब्रिजिंग समन्वय का उदाहरण। (ग)नमक से तुझे का्षेय संरचना ं कु (१) समन्वय को कार्बोक्सिलेट टर्मिनल (साइस6) के माध्यम से दर्शाती है,और 209 के सैद्धांतिक क्रॉस सेक्शन के साथ थायोलेट ब्रिजिंग 209 ] 6 ]2. (घ)कार्बोक्सिलेट टर्मिनल का चित्रण, र्ं5तथा थायोलेट ब्रिजिंग समन्वय। बंधन दूरी ए, बी, सी, डी, ई, और एफ $ की इकाई में दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन37से अनुकूलित किया गया है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: IM-MS विश्लेषण amb4:1के 1:1 मिश्रण के उत्पादों का pH पर 4.4.  (A) [amb4] 2H+3Cu(I)]+ केलिए निकाले गए आइसोटोप पैटर्न + , [diamb4]4H+6Cu(I)]2 +, [trimb4]6H+9Cu(I)]3+ और [tetraamb4]8H+12Cu(I)]4+ प्रजातियां। (बी) [अम्ब4] 2H+3Cu(I)] + के निकाले गए आगमन समय का एकीकरण+, [diamb4]4H+6Cu (I)]2 +, [trimb4] 6H+9Cu(I)]3+ और [tetraamb4]8H+12Cu(I)]4+ उनके रिश्तेदार तीव्रता की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया. प्रतिशत सापेक्ष तीव्रता की गणना करने के लिए, प्रत्येक अनुमापन बिंदु के लिए सभी निकाले गए प्रजातियों के लिए एकीकृत क्षेत्र का संकलन प्रतिशत पैमाने पर सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: एकही cu (I/II) बाध्य अम्ब4 के लिए समस्थानिक पैटर्न बदलना Cu(II) के मोलर तुल्यकेस के पीएच अनुमापन के दौरान मनाया जाता है: एम्ब4 पीएच पर 4 - 4.04, 6.02, और 9.98. चह पर 4.04, प्रयोगात्मक परिणाम मुख्य रूप से [amb4+Cu(I)]+के लिए आइसोटोप मॉडल से मेल खाता है। चह ख् 6ण्02 में -2 उधज का एक परिवर्तन होता है, जो विखंडनी पुल के निर्माण को दर्शाता है (अम्ब4oxके ऑक्सीकरण के रूप में दिखाया गया है ) और ज़ाम्ब4ox+Cu (I)] के लिए समस्थानिक पैटर्न के साथ करार किया गयाहै। चह में 9ण्98 में,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: मोनोमर, डाइमर के क्यू (I/II) परिसरों की पहचान के सापेक्ष तीव्रता को बदलना, और 3ण्0-11.0 की पीएच सीमा पर अम्ब4 का ट्रिमर।  (A) एक Cu (I/II) आयन के साथ मोनोमर, (B) 2 Cu(I/II) आयनों के साथ dimer, और (C) 3 Cu (I/II) आयनों के साथ ट्रिमर। कैप्शन ध्यान दें कि परिसर में कितने डिससल्फाइड बांड मौजूद थे। यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन39से अनुकूलित किया गया है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: Cu(I), एजी (I), n(II), Ni(II), सह(II), Mn(II), Pb(II), या Fe(II) परिसरों के गठन का प्रतिशत। मेथेनोबैक्टिन के व्यक्तिगत धातु आयन अनुमापन के दौरान निरीक्षण किया गया. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि Cu(I) बाइंडिंग क्यू (II) और Fe(II) Fe(III) के अलावा से बाध्यकारी के अलावा से हुई. यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन19से अनुकूलित किया गया है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: Cu(I/II), एजी (I), n(II), Ni(II), सह(II), Mn(II), Pb(II), या Fe(II) chelation के प्रतिशत की तुलना mb-OB3b और amb7 द्वारा pH ] 7. तुलना ऋणावेशित आयनों के निर्माण के लिए है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary File
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Discussion

महत्वपूर्ण कदम: ईएसआई-आईएम-एमएस के माध्यम से परीक्षा के लिए समाधान चरण व्यवहार का संरक्षण
देशी ईएसआई वाद्य सेटिंग्स का उपयोग किया जाना चाहिए जो पेप्टाइड्स स्टोइकियोमिति, चार्ज राज्य, और अनुरूप संरचना के संरक्षण। देशी स्थितियों के लिए, शंकु voltages, तापमान, और गैस प्रवाह के रूप में ईएसआई स्रोत में शर्तों को अनुकूलित किया जाना है. इसके अलावा, दबाव और स्रोत में voltages, जाल, आयन गतिशीलता, और हस्तांतरण यात्रा तरंगों (विशेष रूप से डीसी जाल पूर्वाग्रह है कि IM सेल में इंजेक्शन वोल्टेज को नियंत्रित करता है) प्रभारी राज्य और आयन गतिशीलता वितरण पर उनके प्रभावों के लिए जाँच की जानी चाहिए.

इस कार्य में उपयोग किए गए विशिष्ट ऑपरेटिंग स्थितियाँ निम्न हैं। जलीय पेप्टाइड नमूनों को एक कुंद नाक 1.0 एमएल सी सिरिंज का उपयोग करके इंजेक्ट किया गया था, एक 10 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम]1 प्रवाह दर, सकारात्मक आयनों के लिए 2.0 केवी केशिका वोल्टेज (+) या नकारात्मक आयनों के लिए $1.8 केवी (-), 130 डिग्री सेल्सियस स्रोत तापमान, 250 डिग्री सेल्सियस कोन, 20 वी नमूना, और 4.0 वी निष्कर्षण शंकु. IM अनुभाग एक 1.5 mL/min प्रवाह दर का उपयोग कर 2.25 x 10डिग्री 2 mbar के एक argon दबाव के साथ जाल सेल के लिए 6.0 वी प्रवेश वोल्टेज के साथ संचालित किया गया था. आईएम सेल में आयनों (ट्रैप डीसी बायस) को इंजेक्ट करने के लिए आयनों के वियोजन से बचने के लिए 12 ट पर सेट किया गया था क्योंकि वे शुरू में नाइट्रोजन बफर गैस से टकराते थे। आईएम सेल ने अपने आवेश और टक्कर के क्रॉस-सेक्शन के आधार पर आयनों को अलग किया और 0ण्52 मीटरनाइट्रोजन प्रेशर तथा 20ण्0 एमएल न्यूनतम-1 प्रवाह दर का उपयोग किया। IM को RAMPed 12.0-20.0 V (+) या 8.0-30.0 V ($) यात्रा तरंग ऊँचाई के साथ संचालित किया गया था और 800-1,500 मीटर एस$1 (+) या 250-1,000 मीटर एस$1 ($) वेग को आईएम यात्रा तरंग की कोशिका के माध्यम से प्रत्येक स्वीप के लिए वेग बढ़ाया गया था। स्थानांतरण सेल जाल सेल के रूप में एक ही argon दबाव के साथ संचालित किया गया था और IM का समाधान आयनों orthogonal समय के लिए उड़ान जन-से-चार्ज विश्लेषक के लिए निर्देशित किया. आयन गतिशीलता-मास स्पेक्ट्रम समय के उड़ान जन-से-चार्ज विश्लेषक के साथ IM सेल में आयनों के gated रिलीज सिंक्रनाइज़ द्वारा अधिग्रहण किया गया.

देशी ईएसआई शर्तों का उपयोग करना, समाधान चरण गुण जैसे चार्ज राज्य और conformational राज्य IM-MS विश्लेषण के दौरान संरक्षित हैं। उदाहरण के लिए, आईएम-एमएस विश्लेषण20,37 के दौरान पाए गए एमबी-ओबी3बी और एम्ब्स के प्रभार िताये गए राज्य समाधान चरण40में अपेक्षित प्रभार अवस्थाओं से निकटता से संबंधित थे। एमबी-OB3b पेप्टाइड tetraprotic है और रूपों केवल नकारात्मक आरोप आयनों IM-एमएस विश्लेषण के दौरान40, चाहे Cu(I)-bound या Cu(I)-मुक्त, क्योंकि इसमें सी-टर्मिनस (पीकेएक और lt; 1.7), दो enethiol oxazolone समूहों (पीके$ 5.0 और 9.7), और टायर समूह (चKa $ 11.0)42| उनके पूरी तरह से protonated रूप में ambs का एक समग्र आरोप होगा +2 की वजह से सी-टर्मिनस (चKएक $ 2), दो अपने (पीKएक $ 6.0), दो Cys (पीKएक $ 8.3), और Tyr (पीKएक $ 11.0) साइटों19,41. अतः वे सामान्यतः धनावेशित आयनों का च्;6 के तथा ऋणावेषित आयनों पर जगद6 के च् पर आवेशित होते हैं।

Ambs भी स्पष्ट पीएच-निर्भर Cu(I/II) बाध्यकारी व्यवहार और redox गतिविधि जिसमें Cu(I)-एक कम पीएच पर बाध्यकारी एक उच्च पीएच पर Cu(II) बाइंडिंग दिखाया. Cu (I/II) अभिक्रियाओं में ऑक्सीकृत अम्ब प्रजाति (ऐम्बबैल) का निर्माण करना शामिल था जिसमें डिसल्फाइड आबंध तथा विभिन्न बहु-मरण तथा बहु-क (I/II) बंधन(चित्र 5 तथा चित्र 6) शामिल थे। ये रेडॉक्स अभिक्रियाएँ समय-निर्भर होती हैं और यह दर्शाया गया था कि नमूना तैयारी और आईएम-एमएस विश्लेषण के बीच लंबा समय अंतराल (210 मिनट तक) अधिक ऑक्सीकृत उत्पादों कोदेखागया। इसलिए, उत्पादों के प्रेक्षण पर अभिक्रिया समय निर्भरता पर सावधानीपूर्वक विचार करना भी आवश्यक है।

सीमाएं: IM-MS और सैद्धांतिक टकराव क्रॉस-सेक्शन की पहचान करते हैं कि प्रत्येक धातु आयन किस प्रकार का समन्वय पसंद करता है
IM-MS m/z और सीसीएस डेटा की व्याख्या करने में मदद करने के लिए, सिद्धांत के B3LYP/LanL2D] स्तर का उपयोग करके एक व्यापक खोज की गई थी। विभिन्न समन्वय स्थलों के साथ ज्यामिति-अनुकूलित अनुरूपों की तुलना उनकी अनुमानित मुक्त ऊर्जा और आईएम-एमएस द्वारा मापे गए सीसीएस के साथ समझौते के बीच की गई थी। इन पेप्टाइड्स की आण्विक मॉडलिंग और उनके परिसरों की इलेक्ट्रॉनिक के प्रकार तक सीमित है संरचना गणना है कि इन अपेक्षाकृत बड़े सिस्टम के लिए लागू किया जा सकता है. अन्य तरीकों है कि अध्ययन किया गया है या सिफारिश की है Truhlar एट अल द्वारा काम शामिल43, जो पाया कि M05-2X सबसे अच्छा DFT कार्यात्मक और PM7 और MNDO /d अच्छा NDDO अर्द्ध-अनुभवी तरीकों के लिए थे n (II) युक्त यौगिकों44. इन पेप्टाइड्स एक बड़ी संरचना अंतरिक्ष है और पूरी तरह से जांच के लिए सबसे कम ऊर्जा conformers का पता लगाने के लिए विभिन्न धातु chelating साइटों की तुलना शामिल होना चाहिए, विभिन्न cis- और ट्रांस-पेप्टाइड बांड, नमक पुल, हाइड्रोजन संबंध, और - और -cation खुशबूदार टायर पक्ष समूह और धातु cation के बीच बातचीत.

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व: Cu(I/II) और अन्य चयनित धातु आयन mb-OB3b और ambs के बीच तुलना में बाइंडिंग
पेप्टाइड्स तृतीयक संरचना के परमाणु संकल्प का निर्धारण करने के लिए एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी सबसे आम तकनीक है। तथापि, इन परिसरों45के क्रिस्टलीकरण के साथ समस्याओं के कारण धातु लोपेप्टाइडके शल् क- एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी अध् ययन दुर्लभ हैं। एनएमआर एक नमूने की व्याख्या के लिए भी उपयुक्त नहीं है जहां निकट से संबंधित व्यक्ति ओलिगोपेप्टाइड प्रजातियां46प्रकार की होती हैं . इसलिए, IM-MS और DFT आणविक मॉडलिंग पेप्टाइड प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए वैकल्पिक तकनीक है, विशेष रूप से उन है कि जटिल redox और Cu (I/II) से परिणाम बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं20,37,40, 47.IM-MS की ताकत यह है कि यह प्रत्येक उत्पाद को हल कर सकता है और उनके m/z और आगमन के समय को मापने के द्वारा उनकी आणविक संरचना की पहचान कर सकता है जो स्टोइकियोमिट्री, प्रोटोनेशन अवस्था और अनुरूप संरचना से संबंधित है।

उदाहरण के लिए, एमबी-OB3b विभिन्न प्रकार के धातु आयनों को चेलेट करेगा, और प्रत्येक आयन के प्रति इसकी चयनात्मकता आईएम-एमएस धातु आयन अनुमापन द्वारा प्रदर्शित की गई थी (चित्र 7)। परिणाम ों के लिए mb-OB3b वरीयता से पता चला cu(I) और एजी (I), जबकि amb7के साथ 7 के पीएच पर परिणामों की तुलना. चित्र 8 में अम्ब7 को वरीयता से चेलेट्स एन(II) और नी(II) दिखाया गया है। सामान्य तौर पर, एम्ब अध्ययनों से पता चला है कि दो enethiol-oxazolones 2His-2Cys के साथ जगह Cu (I/II)-बाध्यकारी बाहर नहीं किया है, लेकिन यह रैखिक-बृहठ समन्वय के माध्यम से कई Cu(I) बाध्यकारी के परिणामस्वरूप (चित्र 3) मोनोन्यूक्लियर क्यू (I) के रूप में विरोध किया mb-OB3b के चतुष्फलकीय समन्वय48की बाइंडिंग | Cu(II) कमी भी apo-mb-OB3b में मौजूदा disulfide पुल के विपरीत थायोल ऑक्सीकरण और disulfide पुल गठन द्वारा मध्यस्थता की गई थी और तांबे के लिए उच्च कमी क्षमता एमबी-OB3b, जो Cu(I) 49 के लिए मजबूत वरीयता का समर्थन करता है .

भविष्य अनुप्रयोगों
इसके अलावा IM-MS अध्ययन अम्ब पेप्टाइड्स के चल रहे हैं, जिसमें उनके प्राथमिक अनुक्रम Gly या Asp के साथ अपने या Cys की जगह द्वारा संशोधित किया जाता है, जबकि Tyr अवशेषों या तो Gly या Phe के साथ बदल दिया है. ये अध्ययन 10.0 एमएम अमोनियम एसीटेट में भी किए जा रहे हैं, जिसमें पीएच को अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ संशोधित किया गया है (पीएच के लिए 7, 8, और 9) प्रत्येक नमूने के लिए कुल आयनिक शक्ति स्थिर रखने के लिए। ये परिणाम शीघ्र ही प्रकाशित किए जाएँगे.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह सामग्री 1764436 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित काम पर आधारित है, NSF साधन समर्थन (MRI-0821247), वेल्च फाउंडेशन (टी-0014), और ऊर्जा विभाग से कंप्यूटिंग संसाधनों (TX-W-20090427-0004-50) और L3 संचार . हम कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के Bower समूह धन्यवाद - सांता बारबरा सिग्मा कार्यक्रम और Ayobami Ilesanmi वीडियो में तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए साझा करने के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281

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रसायन विज्ञान अंक 151 2His-2Cys आकृति methanobactin पेप्टाइड तृतीयक संरचना histidine प्रभारी राज्य cysteine प्रभारी राज्य नमक पुल B3LYP/LanL2D] आयन आकार स्केल Lennard-जोन्स टक्कर पार वर्गों
धातु आयन मान्यता और धातु बंधन Oligopeptides के Redox गतिविधि की संरचना और तंत्र का निर्धारण करने के लिए आयन गतिशीलता-मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक
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Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe,… More

Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).

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