Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Ion Mobility-Mass massespektrometri teknikker for fastsettelse av struktur og mekanismer for metal ion Recognition og Redox aktivitet av metall bindende Oligopeptides

Published: September 7, 2019 doi: 10.3791/60102
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Texas A&M University-Commerce

Summary

Ion mobilitet-masse massespektrometri og molekylære modellering teknikker kan karakterisere selektiv metall chelaterande ytelse av designet metall-binding peptider og kobber-binding peptid methanobactin. Utvikling av nye klasser av metall chelaterande peptider vil bidra til legemidler for sykdommer forbundet med metall ion misbalance.

Abstract

Electrospray ionisering (ESI) kan overføre en vandig-fase peptid eller peptid kompleks til gass-fase samtidig bevare sin masse, total kostnad, metall-bindende interaksjoner, og conformational form. Kopling ESI med ion mobilitet-Mass massespektrometri (IM-MS) gir en instrumental teknikk som gjør det mulig for samtidig måling av et peptid masse-å-lade (m/z) og kollisjon tverrsnitt (CCS) som forholder seg til sin støkiometri, protonation tilstand, og conformational form. Den samlede ansvaret for et peptid kompleks styres av protonation av 1) peptid er syrlig og grunnleggende nettsteder og 2) oksidasjon tilstand av metall ion (s). Derfor er den samlede ladetilstand av et kompleks en funksjon av pH i løsningen som påvirker peptider metall ion bindende affinitet. For ESI-IM-MS analyser, peptid og metall ioner løsninger er fremstilt fra vandige-bare løsninger, med pH justert med fortynnet vandig eddiksyre eller ammonium natriumhydroksid. Dette gjør det mulig for pH-avhengighet og metall ion selektivitet å bli bestemt for en bestemt peptid. Videre kan m/z og CCS av et peptid kompleks brukes med B3LYP/LanL2DZ molekylær modellering å skjelne bindende områder av metall ion koordinering og tertiær struktur av komplekset. Resultatene viser hvordan ESI-IM-MS kan karakterisere selektiv chelaterande ytelsen til et sett med alternative methanobactin peptider og sammenligne dem til kobber-binding peptid methanobactin.

Introduction

Kobber og sink ioner er avgjørende for levende organismer og avgjørende for prosesser inkludert oksidativt beskyttelse, vev vekst, åndedrett, kolesterol, glukose metabolisme, og Genova lesing1. For å aktivere disse funksjonene, grupper som thiolate av cys, imidazole av hans2,3, (mer sjelden) thioether av metionin, og carboxylat av Glu og ASP selektivt innlemme metaller som kofaktorer inn i aktive områder av metalloenzymes. Likheten av disse koordinerings grupper reiser et spennende spørsmål om hvordan hans og cys ligander selektivt innlemme enten Cu (I/II) eller Zn (II) for å sikre riktig funksjon.

Selektiv binding oppnås ofte ved oppkjøp og smugling av peptider, som kontrollerer konsentrasjoner av Zn (II) eller Cu (I/II) ion4. Cu (I/II) er svært reaktiv og forårsaker oksidativt skade eller adventitious binding til enzymer, så dens frie konsentrasjon er strengt regulert av kobber chaperones og kobber regulerings proteiner som transporterer den trygt til ulike steder i cellen og tett kontrollere homeostase5,6. Forstyrrelse av kobber metabolisme eller homeostase er direkte innblandet i Menkes og Wilsons sykdom7 samt kreft7 og nevrale lidelser, slik som Prion8 og Alzheimers sykdom9.

Wilsons sykdom er assosiert med økt kobber nivåer i øyne, lever og deler av hjernen, der Redox reaksjoner av Cu (I/II) produserer reaktive oksygen arter, forårsaker hepatolenticular og nevrologisk degenerasjon. Eksisterende Chelation terapier er de små tiolderivat aminosyre Penicillamine og triethylenetetramine. Alternativt methanotrophic kobber-oppkjøpet peptider methanobactin (MB)10,11 Exhibit terapeutisk potensial på grunn av deres høye bindende affinitet for Cu (I)12. Når methanobactin (MB-OB3b) fra Methylosinus trichosporium OB3b ble studert i et dyr modell av Wilson ' s sykdom, kobber ble effektivt fjernet fra leveren og utskilles gjennom galle13. In vitro eksperimenter bekreftet at MB-OB3b kunne chelate kobber fra kobber metallothionein som finnes i leveren stoffer13. Laser ablasjon Induktivt kombinert plasma Mass massespektrometri Imaging teknikker har undersøkt romlig fordeling av kobber i Wilson ' s sykdom leveren prøver14,15,16 og vist at MB-OB3b fjerner kobber med korte behandlingsperioder på bare 8 dager17.

MB-OB3b vil også binde med andre metall ioner, inkludert AG (I), Au (III), PB (II), MN (II), co (II), fe (II), ni (II) og Zn (II)18,19. Konkurranse om fysiologiske Cu (I) bindende området er utstilt ved AG (I) fordi den kan fortrenge Cu (I) fra MB-OB3b kompleks, med både AG (I) og ni (II) også viser irreversible binding til MB som ikke kan fordrevet av Cu (I)19. I den seneste tid, en serien av alternativ methanobactin (AMB) oligopeptides med det 2His-2Cys innbindingen motiv ha blitt studert20,21, og deres Zn (II) og Cu (jeg/II) innbindingen eiendom kjennetegnet. Deres primære aminosyre sekvenser er like, og de alle inneholder 2His-2Cys motiv, Pro og en acetylert N-Terminus. De hovedsakelig avvike fra MB-OB3b fordi 2His-2Cys motiv erstatter de to enethiol oxazolone bindende områder av MB-OB3b.

Electrospray ionisering kombinert med ion mobilitet-Mass massespektrometri (ESI-IM-MS) gir en kraftig instrumental teknikk for å bestemme metall-binding egenskaper av peptider fordi den måler deres masse-å-lade (m/z) og kollisjon tverrsnitt (CCS) og samtidig bevare sin masse, ladning, og conformational form fra løsnings fasen. M/z og CCS forholder seg til peptider støkiometri, protonation tilstand og conformational form. Støkiometri bestemmes fordi identiteten og antallet av hvert element i arten er eksplisitt identifisert. Den samlede ansvaret for peptid komplekset er relatert til protonation tilstand av Sure og grunnleggende nettsteder og oksidasjon tilstand av metall ion (s). CCS gir informasjon om den conformational formen av peptid komplekset fordi den måler rotasjons gjennomsnittet størrelse som er relatert til tertiær strukturen av komplekset. Den samlede ladetilstand av komplekset er også en funksjon av pH og påvirker peptid ' s metal ion bindende affinitet fordi deprotonated grunnleggende eller sure nettsteder som kar bok SYL, hans, cys og Tyr er også de potensielle bindende områder for metall ion. For analysene, peptid og metall ion er utarbeidet i vandige løsninger med pH justert ved å fortynne vandig eddiksyre eller ammonium natriumhydroksid. Dette gjør det mulig for pH-avhengighet og metall ion selektivitet skal fastsettes for peptid. Videre kan m/z og CCS BESTEMMES av ESI-im-MS brukes med B3LYP/LanL2DZ molekylær modellering å oppdage hvilken type metall ion koordinering og tertiær struktur av komplekset. Resultatene som vises i denne artikkelen avslører hvordan ESI-IM-MS kan karakterisere selektiv chelaterande ytelsen til et sett med AMB peptider og sammenligne dem til kobber-bindende peptid MB-OB3b.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. tilberedning av reagenser

  1. Kultur Methylosinus trichosporium OB3b, Isoler Cu (I)-gratis MB-OB3b18,22,23, Frys-tørk prøven og oppbevar ved-80 ° c til bruk.
  2. Syntetisere den AMB peptider (> 98% renhet for AMB1, AMB2, AMB4; > 70% renhet for AMB7), fryse-tørk prøvene, og oppbevar dem ved-80 ° c til bruk.
  3. Kjøp > 98% renhet mangan (II) klorid, kobolt (II) klorid, nikkel (II) klorid, kobber (II) klorid, kobber (II) nitrat, sølv (I) nitrat, sink (II) klorid, jern (III) klorid og bly (II) klorid.
  4. Kjøpe Poly-DL-alanin polymerer brukes som calibrants for å måle kollisjonen tverrsnitt av AMB arter og HPLC klasse eller høyere ammonium natriumhydroksid, isbre eddiksyre, og acetonitril.

2. utarbeidelse av lagerløsning

  1. Peptid lagerløsning
    1. Veie nøyaktig, ved hjelp av minst tre signifikante tall, massen av 10,0 – 20.0 mg MB-OB3b eller AMB i et 1,7 mL hetteglass i plast.
      Merk: den veide massen skal gi enten 12,5 mM eller 1,25 mM, avhengig av løselighet av peptid, når 1,00 mL deionisert (DI) vann tilsettes.
    2. Ved hjelp av en Pipet, tilsett 1,00 mL deionisert vann (> 17.8 MΩ cm) til veid peptid prøve for å gi enten 12,5 mM eller 1,25 mM løsning. Plasser hetten sikkert og bland godt med minst 20 inversions.
    3. Ved bruk av et micropipet dispensere 50,0 μL alikvoter fra peptid-prøven i individuelt merket 1,5 mL hetteglass og oppbevar dem ved-80 ° c til bruk.
  2. Metall ion lager løsninger
    1. Veie nøyaktig, med minst tre signifikante tall, massen av 10,0 – 30.0 mg av metall klorid eller sølv nitrat i et 1,7 mL hetteglass.
      Merk: den veide massen skal gi 125 mM når 1,00 mL av DI vann tilsettes.
    2. Tilsett 1,00 mL av DI vann til den veide metall prøven i 1,7 mL hetteglasset for å gi 125 mM oppløsning. Plasser hetten sikkert og bland godt med minst 20 inversions.
  3. Ammonium natriumhydroksid lager løsninger: klargjør en 1,0 M eddiksyreløsning ved å fortynne 57 μL av 99,5% eddiksyreløsning med di vann til et endelig volum på 1,00 ml. Klargjør en 1,0 M ammonium løsning ved å fortynne 90 μL av den 21% ammonium med DI-vann til et endelig volum på 1,00 mL. Lag to påfølgende fortynninger av hver løsning ved å ta 100 μL av 1,0 M-løsningene for å tilberede 0,10 M og 0,010 M eddiksyre og ammonium.
  4. Poly-DL-alanin lagerløsning: Forbered Poly-DL-ALANIN (PA) ved veiing 1,0 mg pa og oppløsning i 1,0 ml av di vann for å gi 1 000 ppm. Bland godt. Ved bruk av en micropipet, dispensere 50,0 μL alikvoter, og plasser hver av dem i et 1,7 mL hetteglass og oppbevar ved-80 ° c.

3. Electrospray mobilitet-masse massespektrometri analyse

  1. Rengjør ESI inngangs slangen og nål kapillær grundig med ca 500 μL av 0,1 M isbre eddiksyre, 0,1 M ammonium natriumhydroksid, og til slutt DI vann.
  2. Tin en 50,0 μL alikvot av den 1 000 ppm PA lager løsningen og fortynne den med 450 μL av DI vann for å gi en 100 ppm PA. Pipet 100,0 μL av denne oppløsningen og fortynne den til 1,00 mL med 500 μL av DI vann og 500 μL av acetonitril for å gi 10 ppm PA-løsning.
  3. Samle den negative og positive ion IM-MS Spectra av 10 ppm PA løsning for 10 min hver bruker native ESI-IM-MS forhold som beskrevet i diskusjonen delen.
  4. Tin en 50,0 μL alikvot av 12,5 mM eller 1,25 mM AMB-lagerløsning og gjør påfølgende fortynninger med DI vann for å gi en endelig konsentrasjon på 0,125 mM AMB. Bland grundig hver fortynning.
  5. Pipet 100,0 μL av 125 mM metall ion lagerløsning, plass i et 1,7 mL hetteglass og fortynnet til 1,00 mL med DI vann for å gi 12,5 mM metall ion. Gjenta med to påfølgende fortynninger for å gi en endelig 0,125 mM metall ion konsentrasjon. Bland grundig hver fortynning.
  6. Pipet 200,0 μL av 0,125 mM AMB i et 1,7 mL hetteglass, fortynnet med 500 μL av DI vann, og bland løsningen grundig.
  7. Juster pH-verdien i prøven til 3,0 ved å tilsette 50 μL av 1,0 M eddiksyreløsning.
  8. Tilsett 200,0 μL av 0,125 mM metall ion til den pH-justerte prøven. Tilsett DI vann for å gi et endelig volum på 1,00 mL av prøven, bland godt, og la prøven til likevekt i 10 min ved RT.
  9. Ved hjelp av en stump nese sprøyte ta 500 μL av prøven og samle den negative og positive ion ES-IM-MS Spectra for 5 min hver. Bruk de resterende 500 μL av prøven til å registrere sin endelige pH ved hjelp av en kalibrert mikro pH-elektrode.
  10. Gjenta trinn 3.6 – 3.9, mens du endrer trinn 3,7 for å justere pH til 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 eller 10,0 ved å legge til nye volumer av 0,010 M, 0,10 M eller 1,0 M eddiksyre eller ammonium.
  11. Samle den negative og positive ion ESI-IM-MS Spectra av 10 ppm PA løsning for 10 min hver.

4. utarbeidelse av metall ion titrering av AMB prøver

  1. Følg fremgangsmåten som er beskrevet i trinn 3.1 – 3.5.
  2. Pipet 200,0 μL av 0,125 mM AMB i et 1,7 mL hetteglass, fortynnet med 500,0 μL av DI vann og bland løsningen grundig.
  3. Juster pH-verdien i prøven til pH = 9,0 ved å tilsette 80 μL av den 0,010 M ammonium.
  4. Tilsett 28 μL av 0,125 mM metall ion løsning for å gi 0,14 molar ekvivalenter av metallet ion, tilsett DI vann for å gjøre det endelige volumet av prøven 1,00 mL, bland godt, og la prøven til likevekt i 10 min ved RT.
  5. Ved hjelp av en stump nese sprøyte ta 500 μL av prøven og samle de negative og positive ion ESI-IM-MS Spectra for 5 min hver. Bruk de resterende 500 μL av prøven til å registrere sin endelige pH ved hjelp av en kalibrert mikro pH-elektrode.
  6. Gjenta trinn 4.2 – 4.5, mens du endrer trinn 4,3 for å legge til et passende volum av 0,125 mM metall ion løsning for å gi enten 0,28, 0,42, 0,56, 0,70, 0,84, 0,98, 1,12, 1,26, eller 1,40 molar ekvivalenter.
  7. Samle den negative og positive ion IM-MS Spectra av 10 ppm PA løsning for 10 min hver.

5. analyse av ESI-IM-MS pH titrering data

  1. Fra IM-MS Spectra identifisere hvilke belastet arter av ambs er til stede ved å matche dem til deres teoretiske m/z isotop mønstre.
    1. Åpne MassLynx og klikk på kromatogram for å åpne kromatogram-vinduet.
    2. Gå til fil- menyen og Åpne for å finne og åpne im-MS datafilen.
    3. Pakk ut IM-MS spektrum ved å høyreklikke og dra over kromatogram og slippe. Spekteret vinduet vil åpne viser IM-MS spektrum.
    4. I spekteret vinduet, klikk på verktøy og isotop modell. I isotop modellering vinduet, Skriv inn den molekylære formelen for AMB arter, sjekk Vis ladet ion -boksen, og skriv inn ladetilstanden. Klikk på OK.
    5. Gjentagelse å identifisere alle Art inne det IM-MULTIPLE SCLEROSIS gjenferd og fortegnelse deres m/z isotop omfang.
  2. For hver AMB-Art, Skill tilfeldige m/z arter og trekke deres ankomsttid distribusjoner (ATD) ved hjelp av sine m/z isotop mønstre for å identifisere dem.
    1. I MassLynx klikker du på DriftScope for å åpne programmet. I DriftScope Klikk på fil og Åpne for å finne og åpne im-MS datafil.
    2. Bruk musen og venstre-klikk for å zoome inn på m/z isotop mønster av AMB arter.
    3. Bruk markeringsverktøyet og venstre museknapp for å velge isotop mønster. Klikk knappen godta gjeldende valg .
    4. For å skille alle tilfeldige m/z-arter, bruk markeringsverktøyet og venstre museknapp for å velge ATD-tid justert med isotop mønster for AMB-artene. Klikk knappen godta gjeldende valg .
    5. For å eksportere ATD, gå til fil | Eksporter til MassLynx, og velg deretter Behold drift tid og lagre filen i riktig mappe.
  3. Bestem centroid av ATD og integrere området under ATD kurven som et mål på arten befolkningen.
    1. I kromatogram-vinduet i MassLynx åpner du den lagrede eksporterte filen. Klikk på Process | Integrer fra menyen. Sjekk ApexTrack peak Integration boksen og klikk OK.
    2. Noter centroid ATD (tA) og det integrerte området som vist i kromatogram -vinduet. Gjenta for alle lagrede AMB og PA IM-MS datafiler.
  4. Bruk den integrerte ATD for alle utpakkede AMB-arter av enten positive eller negative ioner på hvert titrering punkt for å normalisere til en relativ prosent skala.
    1. Angi identiteten til AMB-artene og deres integrerte ATD ved hver pH i et regneark.
    2. For hver pH, bruk summen av den integrerte ATDs å normalisere den enkelte AMB ' s ATD til en prosent skala.
    3. Plot prosent intensiteten av hver AMB arter kontra pH i en graf for å vise hvordan befolkningen i hver art varierer som en funksjon av pH.

6. kollisjon tverrsnitt

  1. Ved hjelp av et regneark, konvertere CCSs (Ω) av pa negative25,26 og positive27 ioner målt i han buffer gass28 til korrigert CCS (Ωc) ved hjelp av ligningen 1 nedenfor, hvor: z = ion charge; e c = elektron ladning (1.602 × 10-19 c); m N 2 = massen av N2 gass (da); og mion = ion masse. 29 flere

Equation 1

  1. Konverter gjennomsnittlig ankomsttid (tA) av pa calibrants og AMB arter i drift ganger (tD) ved hjelp av ligning 2 nedenfor, hvor: c = forbedret driftssyklus forsinkelse koeffisient (1,41), og m/z er massen-til-charge av peptid ion.

Equation 2

  1. Plott PA calibrants ' tD vs. deres Ωc. Deretter, ved hjelp av en minst-kvadrater regresjon passer til ligningen 3 vist nedenfor, bestemme a ' og B verdier, der: a ' er korreksjon for temperatur, trykk og elektriske felt parametere; og B kompenserer for den ikke-lineære effekten av IM-enheten.

Equation 3

  1. Ved hjelp av disse A ' og B verdier og centroid tD verdi fra ATD av ambs bestemme deres Ωc ved hjelp av ligning 3 og deres Ω bruke ligning 1. Denne metoden gir CCSs for peptid arter med estimert absolutte feil på ca 2%25,26,27.

7. beregningsmetoder

  1. Bruk B3LYP/LanL2DZ nivå av teori, bestående av Becke 3-parameter hybrid functionals30 og purre grunnlaget satt31 og elektron kjerne potensialer32,33,34 å lokalisere geometri-optimalisert conformers for alle mulige typer coordinations av de observerte m/z amb arter35.
    Merk: for detaljer om hvordan du bygger og sender beregninger referere til GaussView bruk i supplerende fil.
  2. Sammenlign spådd fri energi av hver av conformers og beregne deres teoretiske CCSs ved hjelp av ion-skalert Lennard-Jones (LJ) metoden fra Sigma programmet36.
  3. Fra den laveste fri energi conformers bestemme hvilke conformer utstillinger av LJ CCS som er enig med IM-MS målt CCS å identifisere tertiær struktur og type koordinering for conformers observert i eksperimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metal binding av AMB1
IM-MS Study20 av AMB1 (figur 1A) viste at både kobber og sink ioner bundet til AMB1 i en pH-avhengig måte (figur 2). Men kobber og sink bundet til AMB1 gjennom ulike reaksjons mekanismer på ulike koordinering nettsteder. Hvis du for eksempel legger til Cu (II) i AMB1 resulterte i oksidasjon av AMB1 (AMB1ox) ved disulfide bro dannelse, og ved en pH på > 6, ble [AMB1ox− 3h + Cu (II)]− ion (figur 2a) dannet. Dette indikerte deprotonering av to imidazoliums, kar bok syl gruppe, og to ekstra områder som var koordinerende Cu (II).

Molekylær modellering av [AMB1ox− 3H + Cu (II)]- ion med B3LYP/LanL2DZ bestemmes lavest energi kompleks var Cu (II) koordinert via imidazole δN av hans1 og deprotonated nitrogens av ryggraden amid grupper av cys2 og Gly3. Men under en pH på 6, legger Cu (II) til AMB1 dannet en m/z isotop mønster som bare kunne regnskapsføres av Cu (i) bindende, danner [AMB1ox+ Cu (i)]+ ion (figur 2B). I kontrast, en pH høyere enn 6 forårsaket m/z isotop mønster for å redusere 1 m/z, utgjorde av den positive ladet [AMB1ox− H + Cu (II)]+ ion. Tilføyer Zn (II) oksidere ikke AMB1, og ZN (II) binding ble observert ved en pH på > 6, som primært utgjorde [AMB1− 3H + Zn (II)]− ion (figur 2C). Dette indikerte deprotonering av imidazoliums, tiolderivat og kar bok syl grupper. Molekylær modellering av [AMB1− 3H + ZN (II)]- ion bestemte den laveste energien conformers å være enten tetraedrisk Zn (II) koordinering via 2His-2Cys eller His-2Cys og carboxylat av C-Terminus.

Flere Cu (I) binding av AMB2
Den Redox reaksjoner mellom Cu (II) og AMB2 (figur 1B) resulterte i Cu (I) binding. Dette ble studert i detalj ved hjelp av IM-MS, UV-Vis Spektrofotometri, og B3LYP molekylær modellering37. De viktigste produktene av Cu (II) titrering av AMB2 ved en pH på 5 var AMB2 oksidasjon (gjennom disulfide bro formasjon) og unoxidized AMB2 arter koordinere tre Cu (I) ioner.

Et søk ved hjelp av B3LYP/LanL2DZ metoden ligger to lav-energi komplekser konkurrerer for 3Cu (I) koordinerte arter. Den første var kompleks vist i Figur 3A, hvor 3Cu (i) ioner ble koordinert via bygge bro Thiolate grupper38 av cys2 og cys6 (av hans1) samt δN1 og δN5 (av hans5 ). Det andre komplekset (3c) har en salt bro mellom protonerte hans1 sidegruppe og C-terminal carboxylat gruppe. Disse resultatene tyder på at en pH på 3,0-6,0, rektor AMB2+ 3Cu (I) kompleks er salt-bro struktur, som kan med hell overføres fra løsning til gass-fase med bare minimale strukturelle omorganisering.

Den teoretiske LJ CCS av 209 ± 6 å2, beregnet ved hjelp av Sigma programmet36 for komplekse 3C, avtalt med im-MS målt CCS, som indikerer at 3c representerer [AMB2− 2h + 3Cu (I)]+ konformasjon ved pH 3.0-6.0. Men ved en pH på > 6, Dette komplekset ble ikke observert av IM-MS, sannsynligvis fordi ytterligere deprotonering av hans1 (pKa= 6,0) resulterer i en samlet nøytral kompleks. Når imidazoleum gruppe av hans1 er Deprotonated, 3Cu (I) koordinering kan konvertere til bygge bro thiolate grupper av cys2 og cys6 samt ΔN1 og δN5 av hans1 og hans5, henholdsvis (3a).

PH-avhengigheten av AMB4 Cu (I/II)-bindende og Redox aktivitet
IM-MS og B3LYP teknikker har blitt brukt til å undersøke Cu (II) og pH titreringer av AMB4 (figur 1C) og identifiserte monomer, dimer, trimer, og tetramer komplekser av AMB4 inneholder opp til tre Cu (I) ioner eller to Cu (II ) ioner for hver monomer delenhet39. Komplekser inneholdt også ulike antall disulfide broer, og disse produktene ble produsert hvorvidt Cu (II) reaksjoner med AMB4 ble gjennomført i anaerob eller aerobic vandige løsninger.

Ved hjelp av IM-MS teknikk, ble det vist at disse individuelle arter kan skilles og kvantifisert selv om de hadde overlappende isotop mønstre på grunn av forskjeller i deres ankomsttid (Figur 4). Identifisering og kvantifisering av disse nært beslektede arter er en oppgave som ingen andre instrumental eller analytisk teknikk kan oppnå. Disse IM-MS studier gir betydelig innsikt i pH-avhengige Redox reaksjoner og nøyaktig identifisert antall Inter-eller intra-molekylær disulfide broer, antall Cu (I) eller Cu (II) ioner, og antall deprotonering nettsteder i hver av komplekser ( Figur 5).

Videre måle komplekser CCS også tillatt fastsettelse av hver av de enkelte artene conformational størrelse, som ble brukt med en omfattende B3LYP/LanL2DZ søk for å finne conformers med strukturer som avtalt med både riktig molekylær støkiometri og CCS målt ved IM-MS. Gjennom denne metoden, Cu (I/II) koordinering av de ulike komplekser ble identifisert. Reaksjonene mellom Cu (II) og AMB4 inkluderte dannelsen av dimers, trimers, og tetramers koordinerende enten Cu (I) eller Cu (II), avhengig av pH i løsningen.

For eksempel, i løsninger som var mildt sure (pH = 3,0 – 6.0), de primært bundet Cu (I) ioner og ble unoxidized, mens i løsninger som var litt grunnleggende (pH = 8.0-11.0), de primært bundet Cu (II) ioner og ble oksidert av alle cys forming disulfide obligasjoner (figur 6). Den B3LYP/LanL2DZ fastslått at CU (I) ioner var lineære og Brokoblet av thiolate og imidazole grupper, mens Cu (II) ioner ble chelated via forvrengt T-formet eller firkantet Planar geometri av en imidazole samt deprotonated ryggraden nitrogens av amid grupper.

IM-MS analyse av MB-OB3b
Den im-MS Studies19,40 av MB-OB3b (figur 1D) viste at i gass-fase, Cu (I)-gratis MB-OB3b eksisterer som tre negativt ladet arter: [MB-OB3b-H]-, [MB-OB3b-2h]2-og [MB-OB3b-3h] 3-, i samsvar med forventet løsning-fase atferd. Individuelle metall ion titreringer ble utført19 for å fastslå metall ion selektivitet av MB-OB3b. Figur 7 viser resultatene av den valgte metall ion titreringer og viser at den tilsynelatende bindende selektivitet av MB-OB3b kan kategoriseres som tre store grupper: 1) Cu (i) og AG (i); 2) ni (II), Zn (II) og co (II); og 3) PB (II), fe (II) og MN (II). Denne rekkefølgen av bindende selektivitet ble vist å være i generell enighet med det som ble funnet av fluorescens slukke eksperimenter19 og isotermiske titrering reaksjonskalorimetri18.

Sammenligning av MB-OB3b og AMB 7 andre er metall bindende selektivitet
Den tilsynelatende bindende selektivitet av MB-OB3b ble sammenlignet med binding selektivitet av AMB7 ved en pH på 7. Den AMB7 ble designet med samme aminosyre sekvens som MB-OB3b, men med de to enethiol oxazolone grupper erstattet med to cys grupper. AMB7 (figur 1E) har ett disulfide bånd mellom cys6 og cys12. Resultatene av dannelsen av negative ladet komplekser (Figur 8) viste at AMB7 foretrukket bindende SELEKTIVITET for ni (II) og Zn (II) (60%), ETTERFULGT av co (II) og Pb (II) (40%). Videre var det rundt 20% Cu (II) bindende. Det var enten spor eller ingen AMB7 binding av AG (I), MN (II), eller fe (II). Dette sammenlignet med MB-OB3b's foretrukket bindende selektivitet på over 90% for Cu (I) og AG (I) bindende.

Figure 1
Figur 1: primære strukturer av alternative methanobactin (AMB) og methanobactin (MB-OB3b) peptider. (A) acetyl-hans1-cys2-Gly3-Pro4-hans5-cys6 (AMB1); (B) acetyl-hans1-cys2-Tyr3-Pro4-hans5-cys6 (AMB2); (C) acetyl-hans1-cys2-Gly3-ser4-Tyr5-Pro6-hans7-cys8-ser9 (AMB4); (D) 1-(N-[mercapto-(5-Oxo-2-(3-methylbutanoyl) oxazol-(Z) -4-ylidene) methyl]-Gly1– ser2– cys3– Tyr4)-pyrrolidin-2-YL-(Mercapto-[5-Oxo-oxazol-(z) -4-ylidene] methyl)-ser5 – Cys6– møtte7 (megabyte-OB3b); og (E) acetyl-leu1-hans2-cys3-Gly4-ser5-cys6-Tyr7-Pro8-hans9-cys10-ser11-cys12-Met 13 (AMB7). Skyggelegging viser: 2His-2Cys eller enethiol-oxazolone bindings områder (Icon); proline eller pyrrolidin hengsler (Icon); acetyl eller methylbutanol gruppe N-Terminus (Icon); og tyrosin, som kan stabilisere metall ion koordinering via en andre løsnings Shell π – kontakt interaksjon (Icon). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: gjennomsnittlig relativ intensitet for den alternative methanobactin (AMB1) acetyl-hans1-cys2-Gly3-Pro4-hans5-cys6 og metall bundet kompleks (AMB1+X) (der X = Cu eller Zn). Observasjoner ble gjort under negative og positive ion Mass massespektrometri analyser av 1:1 molar ratio løsning av AMB:XCL2 over pH-området på 3,0 til 11.0. Feil stolper viser standardavvik for både den relative intensiteten og pH-verdien fra tre replikering av pH-titrering. Den 1:1 molar løsningen av AMB: CuCl2 resulterte i oksidasjon av AMB (AMBOx) med cys2 og cys6, som danner en disulfide bro. (A) negativ ion analyse av AMB: CuCl2 viser [AMBOx− H]− og [AMBokse− 3h + Cu (II)]−. (B) positiv ion analyse av AMB: CuCl2 viser [AMBOx]+ og [AMBOx+ Cu (I/II)]+; oksidasjon staten Cu i komplekset var pH-avhengig, som [AMBOx+ Cu (I)]+;  under en pH på 8 og [AMBOx− H + Cu (II)]+; over en pH på 8. (C) negativ ion-analyse av AMB:ZnCl 2 som viser [AMB]n − og [AMB + Zn (II)]n −. (D) positiv ion analyse av AMB: ZnCl2 viser [AMB]n + og [AMB + Zn (II)]n +. Dette tallet er tilpasset fra en tidligere publikasjon20. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: foreslåtte strukturer av [AMB2+ 3Cu (I)]+ bruke lavest energi og geometri-optimalisert strukturer som ligger fra B3LYP/LanL2DZ nivå av teori. (A) 3 Cu (i) koordinering via δN1δN5 av hans1 og hans5 og thiolate bygge bro thiolate grupper av cys2 og cys6 med en teoretisk tverrsnitt på 217 ± 6 å2. (B) illustrasjon av δN1δN5 og thiolate bro koordinering. (C) salt bro struktur som viser 3 Cu (I) koordinering via carboxylat Terminal (cys6), δN5, og thiolate bygge bro med et teoretisk tverrsnitt på 209 ± 6 å2. (D) illustrasjon av carboxylat Terminal, δN5, og thiolate bro koordinering. Bonding avstander A, B, C, D, E, og F er vist i enheten av å. Dette tallet er tilpasset fra en tidligere publikasjon37. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: IM-MS analyse av produkter av 1:1 blanding av AMB4: Cu (II) ved pH = 4,4.  (A) utpakkede isotop mønstre for [AMB4− 2h + 3Cu (i)]+, [diamb4− 4h + 6Cu (i)]2 +, [triamb4− 6h + 9Cu (I)]3 + og [tetraamb4− 8H + 12Cu (i)]4 + arter. (B) integrering av de utpakkede ankomsttidene til [AMB4− 2h + 3Cu (i)]+, [diamb4− 4h + 6Cu (i)]2 +, [triamb4− 6h + 9Cu (I)]3 + og [tetraamb4− 8H + 12Cu (i)]4 + ble brukt til å beregne deres relative intensitet. For å beregne prosent relative intensitet, ble summering av det integrerte området for alle utpakkede arter for hvert titrering punkt brukt til å normalisere til prosent skalaen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: endre isotop mønster for enkeltvis Cu (I/II) bundet AMB4 observert under pH-titrering av molar ekvivalenter av Cu (II): AMB4 ved pH = 4,04, 6,02 og 9,98. På pH = 4,04, det eksperimentelle resultatet primært samsvarer med isotop modellen for [AMB4+ Cu (I)]+. Ved pH = 6,02, er det et skifte av-2 m/z, som betegner dannelsen av disulfide brua (vist som oksidasjon av AMB4ox) og avtale med isotop mønster for [AMB4ox+ Cu (I)]+. Ved pH = 9,98, er det en ytterligere forskyvning av-1 m/z, som betegner Cu (II) binding og fjerning av et proton å opprettholde + 1 ladetilstand, som deretter matcher isotop mønsteret for [AMB4ox− H + Cu (II)]+. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: endre relative intensitet av identiteter av Cu (I/II) komplekser av monomer, dimer, og trimer av AMB4 over pH-området på 3,0 til 11.0.  (A) monomer med en Cu (i/II) ion, (B) dimer med 2 Cu (i/II) ioner, og (C) TRIMER med 3 Cu (i/II) ioner. Bildetekstene noterer hvor mange disulfide obligasjoner som var tilstede i komplekset. Dette tallet er tilpasset fra en tidligere publikasjon39. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: prosentandel av dannelsen av Cu (i), AG (i), Zn (II), ni (II), co (II), MN (II), PB (II), eller fe (II) komplekser av methanobactin. Observert under den enkelte metall ion titreringer av methanobactin. Det bør bemerkes at CU (I) binding resulterte fra tillegg av Cu (II) og fe (II) binding fra tillegg av fe (III). Dette tallet er tilpasset fra en tidligere publikasjon19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: sammenligning av prosentandelen av Cu (i/II), AG (i), Zn (II), ni (II), co (II), MN (II), PB (II), eller fe (II) Chelation av MB-OB3b og AMB7 ved pH = 7. Sammenligningen er for dannelsen av negativt ladet ioner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary File
Tilleggsfil. GaussView-bruk. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trinn: bevaring løsning-fase atferd for undersøkelse via ESI-IM-MS
Native ESI instrumental innstillinger må brukes som bevarer peptider støkiometri, ladetilstand, og conformational struktur. For native forhold, forholdene i ESI kilde som membran spenninger, temperaturer, og gass renn må optimaliseres. Også presset og spenninger i kilde, Trap, ion mobilitet, og overføre reise bølger (spesielt DC felle bias som styrer injeksjon spenning inn i IM-cellen) må sjekkes for sine påvirkninger på charge-stat og Ion mobilitet distribusjoner.

Følgende er de typiske driftsforhold som ble brukt i dette arbeidet. Den vandige peptid prøvene ble injisert ved hjelp av en stump nese 1,0 mL sprøyte med en 10 μL min− 1 strømningshastighet, 2,0 kv kapillær spenning for positive ioner (+) eller − 1,8 KV for negative ioner (-), 130 ° c kilde temperatur, 250 ° c desolvation, 20 V Prøvetakings membran, og 4,0 v med en avtrekks membran. IM-delen ble operert med 6,0 inngangsspenning til felle cellen med en Argon-Trykk på 2,25 x 10− 2 mbar ved hjelp av en 1,5 ml/min strømningshastighet. Spenningen for sprøytebruk ioner (felle DC bias) i IM-cellen ble satt til 12 V for å unngå dissosiasjon av ioner som de i utgangspunktet kolliderte med nitrogen buffer gassen. Det IM cellen adskilt ioner basert på deres avgift og kollisjon krysset-avdeling og anvende en 0,52 mbar nitrogen trykk og 20,0 mL min− 1 flow rate. IM ble operert med ramped 12.0 – 20.0 V (+) eller 8.0 – 30.0 V (−) som reiste bølgehøyder og ramped 800 – 1500 m s− 1 (+) eller 250 – 1000 m s− 1 (−) hastigheter for hvert SVEIP gjennom cellen til im-reise bølgen. Overførings cellen ble operert med det samme Argon-trykket som felle cellen og veiledet IM-løste ioner til den ortogonale masse-til-kostnad-analysator. The ion mobilitet-masse Spectra ble kjøpt opp ved å synkronisere gated Release av ioner i IM celle med tid-av-fly masse-til-lade analysator.

Bruke native ESI forhold, løsning-faseegenskaper som ladetilstand og conformational tilstand er bevart i løpet av IM-MS analyser. For eksempel er lade tilstandene for MB-OB3b og ambs observert under im-MS-analyser20,37 nært knyttet til lade tilstandene som forventes i løsnings fase40. MB-OB3b peptid er tetraprotic og danner bare negativt ladet ioner under IM-MS analyse40, enten Cu (I)-bundet eller Cu (i)-gratis, fordi den inneholder C-Terminus (pka < 1,7), to enethiol Oxazolone grupper (pka = 5,0 og 9,7), og Tyr gruppe (pKa = 11,0)42. Den ambs i sin fullt protonerte form vil ha en samlet kostnad på + 2 på grunn av C-Terminus (pka ≈ 2), to hans (pka = 6,0), to cys (pka = 8,3), og Tyr (pka = 11,0) nettsteder19,41. Dermed danner de vanligvis positivt ladet ioner ved en pH på < 6 og negativt ladet ioner ved en pH på > 6.

Den ambs viste også klart pH-avhengige Cu (I/II) bindende atferd og Redox aktivitet der Cu (I)-binding ved en lav pH gått over til Cu (II) binding på et høyere pH. Den Cu (I/II) reaksjonene inkludert forming av oksidert AMB arter (AMBOx) som inneholdt disulfide obligasjoner og ulike multimers og flere Cu (I/II) binding (figur 5 og figur 6). Disse Redox reaksjonene er tidsavhengige og det ble vist at jo lenger tidsintervallet (opp til 210 min) mellom prøve forberedelser og IM-MS analyserer de mer oksidert produktene ble observert37. Derfor nøye vurdering av reaksjonstid avhengighet av observasjon av produkter er også nødvendig.

Begrensninger: IM-MS og teoretisk kollisjon tverrsnitt identifisere hvilken type koordinering hvert metall ion foretrekker
For å bidra til å tolke IM-MS m/z og CCS data, et omfattende søk ble gjennomført ved hjelp av B3LYP/LanL2DZ nivå av teori. Geometri-optimalisert conformers med ulike koordinering nettsteder ble sammenlignet mellom deres spådd fri energi og avtale med CCS målt ved IM-MS. molekylær modellering av disse peptider og deres komplekser er begrenset av den type elektronisk struktur beregninger som kan brukes på disse relativt store systemene. Andre metoder som har blitt studert eller anbefalt inkluderer arbeid av Truhlar et al.43, som fant at M05-2x var den beste dft funksjonelle og PM7 og MNDO/d var gode NDDO semi-empiriske metoder for ZN (II)-inneholder forbindelser44. Disse peptider har en stor conformational plass og grundige undersøkelser for å finne den laveste energien conformers må inkludere sammenligne de ulike metall chelaterande områder, ulike CIS-og trans-peptid obligasjoner, salt-broer, hydrogen binding, og π-strøm samspillet mellom den aromatiske Tyr sidegruppen og metall kontakt.

Betydning med hensyn til eksisterende metoder: Cu (I/II) og andre utvalgte metal ion binding sammenlignet mellom MB-OB3b og ambs
X-ray crystallography og NMR spektroskopi er de vanligste teknikkene som brukes for å bestemme Atomic oppløsning av peptider tertiær struktur. Men X-ray crystallography studier av metallopeptides er knappe på grunn av problemer med krystallisering av disse komplekser45. NMR er heller ikke egnet for tolkning av en prøve der nært beslektede individuelle oligopeptide arter er tilstede46. Derfor er im-MS og dft molekylær modellering alternative teknikker for å studere peptid reaksjoner spesielt de som følge av komplekse Redox og Cu (I/II)-bindende reaksjoner20,37,40, 47. STYRKEN av im-MS er at den kan løse hver av produktene og identifisere deres molekylære sammensetning ved samtidig å måle sine m/z og ankomsttider som forholder seg til støkiometri, protonation tilstand, og conformational struktur.

For eksempel, det megabyte-OB3b ville chelate en variasjon av metallisk ioner, og dens selektivitet i retning hver ion var vist av det IM-MULTIPLE SCLEROSIS metallisk ion titreringer (skikkelsen 7). Resultatene viste MB-OB3b preferanse for binding Cu (I) og AG (I), mens sammenligne resultatene på en pH av 7 med AMB7. Figur 8 viser AMB7 FORTRINNSVIS Chelates Zn (II) og ni (II). Generelt, den AMB studier viste at å erstatte de to enethiol-oxazolones med 2His-2Cys ikke utelukke Cu (I/II)-bindende, men det resulterte i flere Cu (I)-bindende via lineær-bro koordinering (Figur 3) i motsetning til mononukleære Cu (i) binding av MB-OB3b's tetraedrisk koordinering48. Cu (II) reduksjon ble også formidlet av tiolderivat oksidasjon og disulfide bro formasjon i motsetning til eksisterende disulfide broen i Apo-MB-OB3b og høy reduksjon potensialet for kobber-lastet MB-OB3b, som støtter den sterke preferanse for Cu (I)49 .

Fremtidige applikasjoner
Videre IM-MS studier av AMB peptider er underveis, der deres primære sekvensen er endret ved å erstatte hans eller cys med Gly eller ASP, mens Tyr rester er erstattet med enten Gly eller Phe. Disse studiene er også utføres i 10,0 mM ammonium acetate, med pH modifisert med ammonium natriumhydroksid (for pH = 7, 8 og 9) for å holde den totale ioniske styrke konstant for hver prøve. Disse resultatene vil bli offentliggjort om kort tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette materialet er basert på arbeid støttet av National Science Foundation under 1764436, støtte for NSF-instrumentet (MRI-0821247), Welch Foundation (T-0014), og databehandling ressurser fra Department of Energy (TX-W-20090427-0004-50) og L3 Communications . Vi takker Bower ' s gruppe University of California-Santa Barbara for deling av Sigma programmet og Ayobami Ilesanmi for å demonstrere teknikken i videoen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dudev, T., Lim, C. Competition among Metal Ions for Protein Binding Sites: Determinants of Metal Ion Selectivity in Proteins. Chemical Reviews. 114 (1), 538-556 (2014).
  2. Sovago, I., Kallay, C., Varnagy, K. Peptides as complexing agents: Factors influencing the structure and thermodynamic stability of peptide complexes. Coordination Chemistry Reviews. 256 (19-20), 2225-2233 (2012).
  3. Sóvágó, I., Várnagy, K., Lihi, N., Grenács, Á Coordinating properties of peptides containing histidyl residues. Coordination Chemistry Reviews. 327, 43-54 (2016).
  4. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. Journal of Inorganic Biochemistry. 107 (1), 129-143 (2012).
  5. Robinson, N. J., Winge, D. R. Copper Metallochaperones . Annual Review of Biochemistry. 79, 537-562 (2010).
  6. Scheiber, I. F., Mercer, J. F. B., Dringen, R. Metabolism and functions of copper in brain. Progress in Neurobiology. 116 (0), 33-57 (2014).
  7. Tisato, F., Marzano, C., Porchia, M., Pellei, M., Santini, C. Copper in Diseases and Treatments, and Copper-Based Anticancer Strategies. Medicinal Research Reviews. 30 (4), 708-749 (2010).
  8. Millhauser, G. L. Copper and the prion protein: Methods, structures, function, and disease. Annual Review of Physical Chemistry. 58, 299-320 (2007).
  9. Arena, G., Pappalardo, G., Sovago, I., Rizzarelli, E. Copper(II) interaction with amyloid-beta: Affinity and speciation. Coordination Chemistry Reviews. 256 (1-2), 3-12 (2012).
  10. Kim, H. J., et al. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. 305 (5690), 1612-1615 (2004).
  11. Di Spirito, A. A., et al. Methanobactin and the link between copper and bacterial methane oxidation. Microbiology Molecular Biology Reviews. 80 (2), 387-409 (2016).
  12. Kenney, G. E., Rosenzweig, A. C. Chemistry and biology of the copper chelator methanobactin. ACS Chemical Biology. 7 (2), 260-268 (2012).
  13. Summer, K. H., et al. The biogenic methanobactin is an effective chelator for copper in a rat model for Wilson disease. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 25 (1), 36-41 (2011).
  14. Hachmoeller, O., et al. Investigating the influence of standard staining procedures on the copper distribution and concentration in Wilson's disease liver samples by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 71-75 (2017).
  15. Hachmoeller, O., et al. Spatial investigation of the elemental distribution in Wilson's disease liver after D-penicillamine treatment by LA-ICP-MS. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 26-31 (2017).
  16. Hachmoeller, O., et al. Element bioimaging of liver needle biopsy specimens from patients with Wilson's disease by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 35, 97-102 (2016).
  17. Mueller, J. C., Lichtmannegger, J., Zischka, H., Sperling, M., Karst, U. High spatial resolution LA-ICP-MS demonstrates massive liver copper depletion in Wilson disease rats upon Methanobactin treatment. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 119-127 (2018).
  18. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of Ag(I), Au(III), Cd(II), Co(II), Fe(III), Hg(II), Mn(II), Ni(II), Pb(II), U(IV), and Zn(II) binding by methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b. Journal of Inorganic Biochemistry. 100, 2150-2161 (2006).
  19. McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Binding Selectivity of Methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b for Copper(I), Silver(I), Zinc(II), Nickel(II), Cobalt(II), Manganese(II), Lead(II), and Iron(II). Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 28, 2588-2601 (2017).
  20. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19 (6), 463-473 (2013).
  21. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility - mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrom. 51 (12), 1120-1129 (2016).
  22. Bandow, N. L., et al. Isolation of methanobactin from the spent media of methane-oxidizing bacteria. Methods in Enzymology. 495, 259-269 (2011).
  23. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of methanobactin from γ-proteobacterial methane oxidizing bacteria: a case for copper competition on a molecular level. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1240-1247 (2010).
  24. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261 (1), 1-12 (2007).
  25. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 14 (20), 6853-6861 (2015).
  26. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141 (3), 884-891 (2016).
  27. Bush, M. F., Campuzano, I. D. G., Robinson, C. V. Ion Mobility Mass Spectrometry of Peptide Ions: Effects of Drift Gas and Calibration Strategies. Analytical Chemistry. 84 (16), 7124-7130 (2012).
  28. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  29. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 113-130 (2009).
  30. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98 (7), 5648-5652 (1993).
  31. Dunning, T. H., Hay, P. J. Gaussian basis sets for molecular calculations. Modern Theoretical Chemistry. 3, 1-27 (1977).
  32. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for potassium to gold including the outermost core orbitals. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 299-310 (1985).
  33. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for the transition metal atoms scandium to mercury. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 270-283 (1985).
  34. Wadt, W. R., Hay, P. J. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for main group elements sodium to bismuth. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 284-298 (1985).
  35. Gaussian 09, Revision C.01. Gaussian, Inc. , Wallingford CT. (2012).
  36. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8 (3), 275-282 (1997).
  37. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50 (2), 316-325 (2015).
  38. Rigo, A., et al. Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (9), 1495-1501 (2004).
  39. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Explicitly Identifying the Products of Cu(II) Reactions of 2His-2Cys Motif Peptides. Analytical Chemistry. 88 (22), 10925-10932 (2016).
  40. Choi, D., Sesham, R., Kim, Y., Angel, L. A. Analysis of methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b via ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 18 (6), 509-520 (2012).
  41. Martell, A. E., Motekaitis, R. J. NIST Standard Reference Database 46. Institute of Standards and Technology. , Gaithersburg, MD. (2001).
  42. Pesch, M. L., Christl, I., Hoffmann, M., Kraemer, S. M., Kretzschmar, R. Copper complexation of methanobactin isolated from Methylosinus trichosporium OB3b: pH-dependent speciation and modeling. Journal of Inorganic Biochemistry. 116, 55-62 (2012).
  43. Amin, E. A., Truhlar, D. G. Zn Coordination Chemistry: Development of Benchmark Suites for Geometries, Dipole Moments, and Bond Dissociation Energies and Their Use To Test and Validate Density Functionals and Molecular Orbital Theory. Journal of Chemical Theory and Computation. 4 (1), 75-85 (2008).
  44. Sorkin, A., Truhlar, D. G., Amin, E. A. Energies, Geometries, and Charge Distributions of Zn Molecules, Clusters, and Biocenters from Coupled Cluster, Density Functional, and Neglect of Diatomic Differential Overlap Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 5 (5), 1254-1265 (2009).
  45. Lillo, V., Galan-Mascaros, J. R. Transition metal complexes with oligopeptides: single crystals and crystal structures. Dalton Transactions. 43 (26), 9821-9833 (2014).
  46. Choutko, A., van Gunsteren, W. F. Conformational Preferences of a beta-Octapeptide as Function of Solvent and Force-Field Parameters. Helvetica Chimica Acta. 96 (2), 189-200 (2013).
  47. Angel, L. A. Study of metal ion labeling of the conformational and charge states of lysozyme by ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 17 (3), 207-215 (2011).
  48. Kelso, C., Rojas, J. D., Furlan, R. L. A., Padilla, G., Beck, J. L. Characterisation of anthracyclines from a cosmomycin D-producing species of Streptomyces by collisionally-activated dissociation and ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 73-81 (2009).
  49. El Ghazouani, A., et al. Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorganic Chemistry. 50 (4), 1378-1391 (2011).

Tags

Kjemi 2His-2Cys motiv methanobactin peptid tertiær struktur histidin ladetilstand cystein ladetilstand salt-bro B3LYP/LanL2DZ ion størrelse skalert Lennard-Jones kollisjon tverrsnitt
Ion Mobility-Mass massespektrometri teknikker for fastsettelse av struktur og mekanismer for metal ion Recognition og Redox aktivitet av metall bindende Oligopeptides
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe,… More

Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter