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Bioengineering

टीके के लिए ई. कोलाई-एक्सप्रेस्ड स्व-एसम्बेलिंग प्रोटीन नैनोकणों का उत्पादन, ट्राइमेरिक एपिटोप प्रस्तुति की आवश्यकता होती है

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60103
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 1,2
1U.S. Military HIV Research Program, Walter Reed Army Institute of Research, 2Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, 3Alpha-O Peptides AG

Summary

एक विस्तृत विधि यहाँ टीका विकास में उपयोग के लिए आत्म इकट्ठा प्रोटीन नैनोकणों (SAPNs) के शुद्धि, refolding, और विशेषता का वर्णन प्रदान की जाती है।

Abstract

स्व-एसेंबलिंग प्रोटीन नैनोकणों (SAPNs) दोहराए एंटीजन प्रदर्शित करता है के रूप में कार्य और विभिन्न संक्रामक रोगों के लिए टीकों की एक विस्तृत श्रृंखला विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस लेख में हम एक छह-हेलिक्स बंडल (SHB) विधानसभा है कि एक trimeric conformation में प्रतिजनों को पेश करने में सक्षम है युक्त एक SAPN कोर का उत्पादन करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन. हम एक ई. कोलाई प्रणाली में SHB-SAPN की अभिव्यक्ति का वर्णन है, साथ ही आवश्यक प्रोटीन शुद्धि कदम. हम अवशिष्ट जीवाणु lipopolysaccharide को कम करने के लिए एक आइसोप्रोपेनोल धोने कदम शामिल थे। प्रोटीन पहचान और शुद्धता का एक संकेत के रूप में, प्रोटीन पश्चिमी धब्बा विश्लेषण में ज्ञात monoclonal एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की. refolding के बाद, कणों का आकार अपेक्षित रेंज में गिर गया (20 से 100 एनएम), जो गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन, नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण, और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की गई थी। यहाँ वर्णित पद्धति SHB-SAPN के लिए अनुकूलित है, हालांकि, केवल मामूली संशोधनों के साथ यह अन्य SAPN constructs पर लागू किया जा सकता है। इस विधि को भी आसानी से मानव टीकों के लिए जीएमपी विनिर्माण के लिए बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए हस्तांतरणीय है.

Introduction

जबकि पारंपरिक वैक्सीन विकास निष्क्रिय या क्षीण रोगजनकों पर ध्यान केंद्रित किया है, आधुनिक टीकों का ध्यान सबयूनिट टीकों1की ओर स्थानांतरित कर दिया गया है। इस दृष्टिकोण एक और अधिक लक्षित प्रतिक्रिया करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और संभावित रूप से अधिक प्रभावशाली टीका उम्मीदवारों. तथापि, मुख्य कमियों में से एक यह है कि सबयूनिट टीके पूरे जीवों की तरह कण नहीं होते हैं जिसके परिणामस्वरूप इम्यूनोजेनिकिटी2कम हो सकती है। दोहराव वाले प्रतिजन प्रदर्शन प्रणाली के रूप में एक नैनोकण में लक्षित सबयूनिट वैक्सीन दृष्टिकोण के साथ - साथ पूरे जीव की कणिक प्रकृति1,3दोनों के लाभ हो सकते हैं .

Nanovaccines के मौजूदा प्रकार के अलावा, तर्कसंगत रूप से डिजाइन प्रोटीन विधानसभाओं डिजाइन और टीका उम्मीदवारों के विकास के लिए अनुमति देते हैं कि एक देशी की तरह रचना1,4 में संभावित प्रतिजन के कई प्रतियां पेश कर सकते हैं ,5,6. इन प्रोटीन विधानसभाओं का एक उदाहरण स्व-समुच्चय प्रोटीन नैनोकणों (एसएएन)7हैं। SAPNs coiled-coil डोमेन पर आधारित हैं और पारंपरिक रूप से Escherichia कोलाई8में व्यक्त कर रहे हैं. एसएपीएन वैक्सीन उम्मीदवारों को मलेरिया, सार्स, इन्फ्लूएंजा, टोक्सोपलोसिस, और एचआईवी-1 9,10,11,12,13 जैसे विभिन्न रोगों के लिए विकसित किया गया है , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. प्रत्येक एसएपिन उम्मीदवार का डिजाइन ब्याज के रोगज़नक़ के लिए विशिष्ट है, तथापि, उत्पादन, शोधन, और refolding तकनीक आम तौर पर मोटे तौर पर लागू होते हैं.

हमारे वर्तमान हितों में से एक एक प्रभावी एचआईवी-1 टीका है. RV144 में - एक एचआईवी-1 टीके का एकमात्र चरण III नैदानिक परीक्षण जो मामूली प्रभावकारिता का प्रदर्शन करता था-संक्रमण का कम जोखिम लिफाफा प्रोटीन20,21के V1V2 लूप से आईजीजी एंटीबॉडी के साथ संबंधित था . इस क्षेत्र की देशी-समान त्रिमकी प्रस्तुति को सुरक्षात्मक इम्यूनोजेनिकता22के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है। संभव के रूप में देशी की तरह रचना के करीब के रूप में V1V2 पाश पेश करने के लिए, हम सिद्धांत SAPN टीका उम्मीदवार है कि एचआईवी-1 लिफाफा पोस्ट-फ्यूजन छह-हेलिक्स बंडल (SHB) शामिल का एक सबूत विकसित करने के लिए सही अनुरूपता 9 में V1V2 पाश पेश . इस उम्मीदवार एचआईवी-1 लिफाफा प्रोटीन के लिए जाना जाता मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त किया गया था। चूहे V1V2-SHB-SAPN के साथ प्रतिरक्षित V1V2 विशिष्ट एंटीबॉडी उठाया, कि, सबसे महत्वपूर्ण बात, gp70 V1V2 के लिए बाध्य, सही conformational epitopes9. SHB-SAPN कोर एचआईवी-1 V1V2 पाश के लिए एक वाहक के रूप में भूमिका से परे अन्य कार्य हो सकता है. यहाँ हम अभिव्यक्ति, शुद्धि, refolding, और SHB-SAPN कोर के सत्यापन के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन. अनुक्रम चयन, नैनोकण डिजाइन, आणविक क्लोनिंग, और ई. कोलाई के परिवर्तन पहले9वर्णित किया गया है.

Protocol

1. ई. कोलाई BL21(DE3) में SHB-SAPN प्रोटीन की अभिव्यक्ति

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 2 एल बाँझ ग्लास Erlenmeyer फ्लास्क में मीडिया के घटक ए और 5 एमएल घटक का 95 एमएल मिलाएं (सामग्री की तालिकादेखें)। 100 ग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता में एम्पसिलिन जोड़ें।
  2. एक पहले से स्थापित ग्लिसरोल स्टॉक संस्कृति से ई. कोलाई के साथ मीडिया टीका. 48 एच के लिए 200 rotations प्रति मिनट (rpm) पर मिलाते हुए के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट संस्कृति।
    नोट: इस्तेमाल किया ई. कोलाई BL21 (DE3) शेयर Ampicillin प्रतिरोधी अभिव्यक्ति वेक्टर23 SHB-SAPN जीन के साथ निहित. यद्यपि मीडिया के सामान्य प्रोटोकॉल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच ऊष्मायन की सिफारिश की गई है, 30 डिग्री सेल्सियस पर 48 एच ऊष्मायन ने SHB-SAPN के लिए अधिक उपज दी है।
  3. दो 50 एमएल शंकु ट्यूबों के लिए संस्कृति स्थानांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निश्चित कोण रोटर के साथ 10 मिनट के लिए 4,000 x ग्राम पर ट्यूब ों को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant निकालें और फसल कोशिकाओं के लिए गोली बचाने के लिए।
    नोट: सेल गोली या तो तुरंत संसाधित या उपयोग जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है।

2. sonication द्वारा ई. कोलाई BL21 (DE3) के Lysis

नोट: कम से कम 30 मिनट के लिए 250 डिग्री सेल्सियस पर बेक किए गए नॉनपाइरोजेनिक प्लास्टिक के बर्तनों और कांच के बर्तनों का उपयोग करें। ट्रिस (2-कार्बोक्सीएथिल) फॉस्फिन (टीसीईपी) को कम करने वाले एजेंट के रूप में प्रोटीन के भीतर और बीच में डिसल्फाइड बांड टूट जाता है। TCEP इस प्रोटोकॉल के दौरान बफ़र्स में आवश्यक है यदि प्रदर्शित प्रतिजन एस एस बांड शामिल हैं. केवल SHB-SAPN कोर के लिए, बफ़र्स में TCEP की उपस्थिति आवश्यक नहीं है।

  1. imidazole मुक्त बफर (8 एम यूरिया, 50 एम सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक, 20 एमएम Tris आधार, 5 एमएम TCEP) पीएच 8.0 (5 N NaOH के साथ समायोजित) तैयार करें और इसे 0.22 डिग्री वैक्यूम बोतल निस्पंदन इकाई का उपयोग करके फ़िल्टर करें।
  2. एक 50 एमएल शंकु नली में imidazole मुक्त बफर के 40 एमएल के साथ गोलीमार कोशिकाओं (चरण 1.3 से) को पुन: निलंबित करें। Sonicate 5 मिनट के लिए बर्फ पर एक जांच के साथ resuspended कोशिकाओं (4 sonication के एस, आराम के 6 एस) 150 डब्ल्यू के एक sonication उत्पादन के साथ.
  3. एक निश्चित कोण रोटर में 25 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 29,000 x g पर सेलुलर lysate (40 एमएल) सेंट्रीफ्यूज स्पष्ट supernatant उत्पन्न करने के लिए। एक 150 एमएल बाँझ फ्लास्क के लिए supernatant स्थानांतरण और गोली त्यागदें. imidazole मुक्त बफर का उपयोग कर 100 एमएल करने के लिए supernatant को शांत (बाद में प्रोटोकॉल में "नमूना" के रूप में संदर्भित).
    नोट: इस कमजोर पड़ने कदम स्तंभ पर lysate लोड हो रहा है के दौरान बहुत अधिक बनने से FPLC प्रणाली के दबाव को रोकने के लिए आवश्यक है.

3. प्रोटीन शुद्धि एक अपने स्तंभ का उपयोग कर

नोट: इस प्रोटोकॉल एक FPLC साधन का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था, लेकिन यह गुरुत्वाकर्षण प्रवाह के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. निम्नलिखित बफ़र्स तैयार करें और उन्हें 0.22 डिग्री वैक्यूम बोतल निस्पंदन इकाई का उपयोग करके फ़िल्टर करें: (i) imidazole मुक्त बफर "बफर ए" (8 एम यूरिया, 50 एम एम सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक, 20 एमएम ट्रिस बेस, 5 एमएम टीसीईपी) पीएच 8.0; (ii) 500 एमएम इमिडाज़ोल बफर "बफर बी" (8 एम यूरिया, 50 एमएम सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक, 20 एमएम ट्राइस बेस, 5 एमएम टीसीपी, 500 एमएम इमिडाज़ोल) पीएच 8.0; और (iii) आइसोप्रोपेनोल वॉश (20 एमएम ट्रिस, 60% आइसोप्रोपेनोल) पीएच 8.0।
    नोट: pH प्रत्येक बफ़र के लिए 5 N NaOH के साथ समायोजित किया गया था।
  2. उनके स्तंभ को बराबर कर दें।
    नोट: प्रयोगशाला पैमाने पर उत्पादन के लिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है एक 5 एमएल prepacked अपने स्तंभ, लेकिन किसी भी बड़े आकार स्तंभ इस्तेमाल किया जा सकता है.
    1. FPLC सॉफ्टवेयर खोलें और नई विधि विकल्प पर क्लिक करें. यह तुरंत विधि सेटिंग्स मेनू के लिए खुल जाएगा. स्तंभ स्थिति के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू के अंतर्गत C1 पोर्ट 3चुनें.
    2. तकनीक ड्रॉप डाउन मेनू द्वारा दिखाए गए पर आत्मीयताका चयन करें | स्तंभ प्रकार ड्रॉप-डाउन मेनू पर दूसरों का चयन करें, Histrap HP, 5 एमएल| स्तंभ वॉल्यूम और दबाव बॉक्स स्वचालित रूप से उपयुक्त मानों पर सेट हो जाएँगे.
    3. विधि बाह्यरेखा बटन पर क्लिक करें. निम्नलिखित बटन को चरण लाइब्रेरी पॉपअप मेनू से खींचें: समानता, नमूनाअनुप्रयोग, स्तंभ धोने,और उस सटीक क्रम में तीर के बगल में elution. चरण लायब्रेरी मेनू बंद करें.
    4. साम्य बटन पर क्लिक करें. तालिका में सूचीबद्ध मान होना चाहिए "प्रारंभिक बफ़र B" (4%), "अंतिम बफ़र B" (4%), और "मात्रा (CV)" 5.
    5. नमूना अनुप्रयोग बॉक्स पर क्लिक करें. नमूना लोडिंग बॉक्स में नमूना पंप के साथ कॉलम पर इंजेक्शन नमूनाके लिए रेडियो बटन पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि विधि सेटिंग्स से प्रवाह दर का उपयोग करें करने के लिए अगले बॉक्स सिस्टम पंप बॉक्स के साथ नमूना इंजेक्शन में जाँच की है. स्क्रीन के दाईं ओर वॉल्यूम बॉक्स के आगे मान को 20 एमएलमें परिवर्तित करें।
    6. स्तंभ धोने बटन पर क्लिक करें. तालिका में सूचीबद्ध मान होना चाहिए "प्रारंभिक बफ़र B" (4%), "अंतिम बफ़र B" (4%), और "मात्रा (CV)" 5. भिन्न संग्रह योजना के आगे सक्षम करें बॉक्सअनक्लिक करें.
    7. elution बटन पर क्लिक करें. तालिका में सूचीबद्ध मान होना चाहिए "प्रारंभिक बफ़र B" 0%, "अंतिम बफ़र B" 100%, और "मात्रा (CV)" 5. भिन्न संग्रह योजना के आगे सक्षम करें बॉक्स पर क्लिक करें. विधि सेटिंग्स से भिन्न आकार का उपयोग करें अनक्लिक करें और नीचे दिए गए भरण बॉक्स में 4 एमएल में भिन्न आकार समायोजित करें.
    8. सॉफ़्टवेयर के शीर्ष पर इस रूप में सहेजें बटन क्लिक करें. फ़ाइल को "समानता" नाम दें.
    9. FPLC पर संबंधित स्तंभ पोर्ट 3 के लिए एक 5 एमएल prepacked उनके स्तंभ से कनेक्ट करें। दोनों पंप ए और पंप बी ट्यूबिंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूना पंप टयूबिंग 0.22 मीटर फ़िल्टर्ड deionized पानी में रखा जाना चाहिए. साम्यीकरण प्रोग्राम चलाएँ.
    10. दोनों पंप ए और पंप बी के साथ-साथ imidazole मुक्त बफर (बफर ए) में नमूना पंप टयूबिंग रखें और फिर से संतुलन प्रोटोकॉल चलाते हैं।
  3. नमूने को स्तंभ से बांधें और प्रोटीन को शुद्ध करें।
    1. FPLC सॉफ्टवेयर खोलें और नई विधि विकल्प पर क्लिक करें. यह तुरंत विधि सेटिंग्स मेनू के लिए खुल जाएगा. स्तंभ स्थिति के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू के अंतर्गत C1 पोर्ट 3चुनें. तकनीक ड्रॉप डाउन मेनू द्वारा दिखाए गए पर आत्मीयताका चयन करें | स्तंभ प्रकार ड्रॉप-डाउन मेनू पर दूसरों का चयन करें, Histrap HP, 5 एमएल| स्तंभ वॉल्यूम और दबाव बॉक्स स्वचालित रूप से उपयुक्त मानों पर सेट हो जाएँगे.
    2. विधि बाह्यरेखा बटन पर क्लिक करें. चरण पुस्तकालय पॉपअप मेनू से बटन खींचें: तुल्यता, नमूनाआवेदन, स्तंभ धोने (वॉश 1), स्तंभ धोने (वॉश 2), स्तंभ धोने (वॉश 3), और उस में तीर के बगल में Elution सही आदेश. चरण लायब्रेरी मेनू बंद करें.
    3. तुल्यता बटन पर क्लिक करें. तालिका में सूचीबद्ध मान होना चाहिए "प्रारंभिक बफ़र B" 4%, "अंतिम बफ़र B" 4%, और "मात्रा (CV)" 5.
    4. नमूना अनुप्रयोग बॉक्स पर क्लिक करें. नमूना लोड हो रहा है बॉक्स में नमूना पंप के साथ कॉलम पर मैंnect नमूनाके लिए रेडियो बटन पर क्लिक करें. सुनिश्चित करें कि विधि सेटिंग्स से प्रवाह दर का उपयोग करें करने के लिए अगले बॉक्स सिस्टम पंप बॉक्स के साथ नमूना इंजेक्शन में जाँच की है.
    5. स्क्रीन के दाईं ओर वॉल्यूम बॉक्स के आगे मान 100 mL करने के लिए परिवर्तित करें। भिन्न संग्रह योजना के आगे सक्षम करें बटन क्लिक करें. विधि सेटिंग्स से भिन्न आकार का उपयोग करें बॉक्स को अनक्लिक करें और तब भिन्न आकार को 4 एमएल में परिवर्तित करें.
    6. पहले कॉलम वॉश बटन पर क्लिक करें (वॉश 1). तालिका में सूचीबद्ध मान होना चाहिए "प्रारंभिक बफ़र B" 4%, "अंतिम बफ़र B" 4%, और "मात्रा (CV)" 10. भिन्न संग्रह योजना के आगे सक्षम करें बॉक्स क्लिक करें. विधि सेटिंग्स से भिन्न आकार का उपयोग करें अनक्लिक करें और तब भिन्न आकार को 4 एमएल में परिवर्तित करें.
    7. दूसरे कॉलम वॉश बटन पर क्लिक करें (वॉश 2). तालिका में सूचीबद्ध मान होना चाहिए "प्रारंभिक बफ़र B" 0%, "अंतिम बफ़र B" 0%, और "मात्रा (CV)" 5. भिन्न संग्रह योजना के आगे सक्षम करें बॉक्स क्लिक करें. विधि सेटिंग्स से भिन्न आकार का उपयोग करें अनक्लिक करें और तब भिन्न आकार को 4 एमएल में परिवर्तित करें.
    8. तीसरे कॉलम वॉश बटन पर क्लिक करें (वॉश 3). तालिका में सूचीबद्ध मान होना चाहिए "प्रारंभिक बफ़र B" 0%, "अंतिम बफ़र B" 0%, और "मात्रा (CV)" 5. भिन्न संग्रह योजना के आगे सक्षम करेंक्लिक करें. विधि सेटिंग्स से भिन्न आकार का उपयोग करें बॉक्स को अनक्लिक करें और तब भिन्न आकार को 4 एमएल में परिवर्तित करें.
    9. Elution बटन पर क्लिक करें. तालिका में दाएँ सूचीबद्ध जानकारी क्लिक करें, ऊपर आने वाले मेनू पर, चरण हटाएँक्लिक करें. आइसोक्रेटिक ग्रेडिएंट बटन को दो बार तालिका पर खींचें, ताकि दो प्रविष्टियाँ हों।
    10. पहली प्रविष्टि के लिए मान "प्रारंभिक बफ़र B" 30%, "अंतिम बफ़र B" 30%, और "Volume (CV)" 10 पढ़ना चाहिए। दूसरी प्रविष्टि के लिए मान "प्रारंभिक बफ़र B" 100%, "अंतिम बफ़र B" 100%, और "मात्रा (CV)" 10 पढ़ना चाहिए। भिन्न संग्रह योजना के आगे सक्षम करें बटन क्लिक करें. विधि सेटिंग्स से भिन्न आकार का उपयोग करेंके आगे वाले बॉक्स पर क्लिक करें.
    11. सॉफ़्टवेयर के शीर्ष पर इस रूप में सहेजें बटन क्लिक करें. फ़ाइल को "शुद्धि" नाम दें. FPLC के एक ट्यूबिंग imidazole मुक्त धोने बफर में रखा जाना चाहिए, जबकि पंप बी ट्यूबिंग 500 एमएम imidazole बफर में रखा जाना चाहिए. नमूना पंप ट्यूबिंग 100 एमएल नमूने में रखा जाना चाहिए.
    12. "शुद्धि" कार्यक्रम चलाने के लिए और समय के लिए प्रतीक्षा करें जब 60% आइसोप्रोपेनोल की जरूरत है (वॉश 2). कार्यक्रम रोकें, 60% आइसोप्रोपेनॉल धोने में imidazole मुक्त धोने से पंप एक ट्यूबिंग ले जाएँ। प्रोग्राम को पुनरारंभ करें।
    13. एक बार isopropanol कदम पूरा हो गया है, कार्यक्रम फिर से रोकें और पंप एक ट्यूबिंग वापस imidazole मुक्त धोने बफर में ले जाएँ. शुद्धि कार्यक्रम को पुनरारंभ करें (शेष रन स्वचालित है).

4. एसडीएस-पेज द्वारा शुद्धता मूल्यांकन और प्रोटीन पहचान

  1. (i) प्रवाह-थ्रू (सेल lysate जो उसके स्तंभ से बाँधा नहीं गया था) के संगत सभी भिन्नों को संयोजित करें, (ii) धोएं 1, (iii) धो3 (60% आइसोप्रोपेनॉल वॉश), और (पप) अलग-अलग 50 एमएल शंकु-ट्यूबों में 3 धोएं। एल्यूशन चरणों से 2 एमएल भिन्नों को संयोजित न करें।
  2. प्रत्येक पूलित भिन्नसे से 15 डिग्री सेल्सियस मिलाएं तथा एल्यूशन स्टेप्स से सभी अंशों को 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 2x लेमली नमूना बफर के साथ मिलाएं और उन्हें 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृत करें।
  3. जबकि प्रोटीन denatures, 3 दाग मुक्त 4-20% precast polyacrylamide जैल के साथ जेल चल उपकरण की स्थापना की 1x Tris-glycine एसडीएस-पेज बफर चल रहा है.
  4. पहले अच्छी तरह से आणविक वजन मार्कर के 8 डिग्री एल लोड और जेल के अन्य कुओं के लिए विकृत नमूना के 30 डिग्री एल. 200 वी पर जैल चलाने के लिए जब तक डाई सामने जेल के नीचे हिट (के बारे में 30 मिनट). उपकरण से जैल निकालें और थोड़ा deionized पानी के साथ कुल्ला. छवि जेल तुरंत दाग मुक्त इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर.
  5. सही आकार (18.07 kDa) के साथ प्रोटीन बैंड होते हैं कि भिन्नों की पहचान. इन सभी भागों को पूल करें।

5. पश्चिमी धब्बा द्वारा प्रोटीन पहचान

  1. शुद्ध पूर्ण लंबाई प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक उसके विशिष्ट एंटीबॉडी (एंटी-6x HisTag) और एक SHB-विशिष्ट एंटीबॉडी (167-डी-4) का उपयोग कर एक पश्चिमी धब्बा चलाएँ। विरोधी 6x HisTag एंटीबॉडी प्रोटीन के एन टर्मिनस पहचानता है और 167-डी-4 एंटीबॉडी पूर्ण लंबाई प्रोटीन की उपस्थिति का प्रदर्शन सी टर्मिनस पहचानता है।
  2. प्रोटीन सांद्रता का निर्धारण (प) प्रवाह-थ्रू, (पप) धोएं 1, (पपप) धो2 (60% आइसोप्रोपेनोल वॉश), (पअ) धो3, तथा 280 एनएम की अवशोषण में स्पेक्ट्रोमीटर उपकरण के साथ एल्यूशन चरणों से सभी अंश। इन समूहों में से प्रत्येक के लिए imidazole मुक्त बफर के 15 डिग्री एल में प्रोटीन के 100 एनजी होते हैं कि कमजोर पड़ने उत्पन्न.
  3. नमूनों के प्रत्येक 15 डिग्री सेल्सियस के लिए 2x Laemli नमूना बफर के 15 डिग्री एल जोड़ें और उन्हें चरण 4.1 में के रूप में विकृत. एक बार denaturing पूरा हो गया है ट्यूब नीचे स्पिन सुनिश्चित करने के लिए सभी प्रोटीन स्थानांतरित किया जा सकता है.
  4. लोड नमूने और एक दाग मुक्त 4-20% precast polyacrylamide जेल में पूर्व दाग मार्कर. डाई सामने जेल के नीचे तक पहुँच जाता है जब तक 200 V पर electrophoresis चलाते हैं।
  5. जबकि जेल चलाता है, टीबीएस-टी के 1 एल (20 एमएम Tris, 150 m NaCl, और 0.1% Tween 20) और टीबीएस-टी में 5% गैर वसा वाले दूध के 200 एमएल बनाते हैं।
  6. एक नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली पर प्रोटीन स्थानांतरित करने के लिए एक पश्चिमी धब्बा हस्तांतरण प्रणाली का उपयोग करें। एक पूर्व इकट्ठे हस्तांतरण ढेर का प्रयोग करें और उस पर जेल जगह है. सिस्टम को 7 मिनट के लिए 25 V पर चलाने के लिए सेट करें। नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली पर पूर्व-सना हुआ मार्कर की उपस्थिति के लिए जाँच करें जो पूर्ण स्थानांतरण का संकेत देता है।
    नोट: सभी बाद के चरणों कमरे के तापमान (आरटी) पर 100 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर सेट पर प्रदर्शन कर रहे हैं।
  7. स्थानांतरण पूरा हो जाने के बाद, टीबीएस-टी के साथ दो बार 10 मिनट प्रत्येक के लिए धो लें।
  8. टीबीएस-टी में 5% गैर वसा वाले दूध के साथ नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली (ब्लॉट) को कम से कम 1 ज के लिए ब्लॉक करें। टीबीएस-टी के साथ दो बार 10 मिनट के लिए धोएं।
  9. टीबीएस-टी (स्टॉक एबी) में प्राथमिक 167-डी-IV और एंटी-6x हिस्टाग एंटीबॉडी को 1 मिलीग्राम/ 167-डी-IV 10,000 गुना और एंटी-6x HisTag 5,000 गुना स्टॉक 167-डी-IV के 2 $L और स्टॉक एंटी-6x HisTag एंटीबॉडी के 4 डिग्री एल को जोड़कर टीबीएस-टी के 20 एमएल वाले दो अलग-अलग ट्यूबों के लिए स्टॉक एब्स को कम करें। प्राथमिक एंटीबॉडी की कुल 20 एमएल मात्रा जोड़ें, प्रत्येक दाग के लिए एक, और 1 ज के लिए इनक्यूबेट दाग 1 मिनट के लिए टीबीएस-टी के साथ दो बार धोएं।
  10. टीबीएस-टी (1:5,000 कमजोर पड़ने) के 20 एमएल में क्षारीय फॉस्फेट के साथ संयोजित माउस एंटी-मानव माध्यमिक एंटीबॉडी के 1 मिलीग्राम/एमएल का पतला 4 डिग्री सेल्सियस। टीबीएस-टी (1:5,000 कमजोर पड़ने) के 20 एमएल में क्षारीय फॉस्फेट के साथ क्षारीय फॉस्फेट के साथ 1 मिलीग्राम/एमएल का 1 मिलीग्राम/एमएल को कम करना। इसी धब्बा के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें.
    नोट: विरोधी मानव माध्यमिक एंटीबॉडी 167-डी करने के लिए बांधता है और विरोधी माउस विरोधी 6x HisTag करने के लिए बांधता है। 10 मिनट के लिए टीबीएस-टी के साथ दो बार धो लें।
  11. bCIP/NBT क्षारीय फॉस्फेट सबस्ट्रेट जोड़ें blots को कवर करने के लिए. बैंड दिखाई देते हैं जब तक के बारे में 10 मिनट के लिए blots का विकास करना. ठंडे नल के पानी के साथ धब्बा कुल्ला और उन्हें एक flatbed स्कैनर के साथ स्कैनिंग से पहले सूखी.

6. SHB-SAPN को फिर से लगाना

  1. एक 10 केडीए आणविक वजन में जमा प्रोटीन जोड़ें डायलिसिस कैसेट काट दिया और यह 8 एम यूरिया, 20 एम एम Tris, 5% ग्लिसरोल, 5 एमएम टीसीईपी पीएच 8.5 पर आरटी (18 u201226 डिग्री सेल्सियस) में डायलीज.
  2. धीरे-धीरे डायलिसिस बफर चरण वार में यूरिया की सांद्रता को कम करके प्रतिक से यूरिया को 2 एम हर 2 ज तक कम करके डायलीज करें। 2 एम की यूरिया सांद्रता में, डायलिसिस उपकरण को 4 डिग्री सेल्सियस पर ले जाएं (इस चरण से डायलिसिस बफर में टीसीईपी का उपयोग न करें)। नमूने को 120 एमएम यूरिया, 20 एमएम ट्राइस, 5% ग्लिसरोल, पीएच 8.5 में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस में डायलकरने से रीफोल्डिंग समाप्त करें।
  3. डायलिसिस कैसेट से फिर से मुड़ा प्रोटीन (SHB-SAPN) निकालें. 0.22 डिग्री सेल्सियस पॉलीवाइनिलाइड फ्लोराइड (पीवीडीएफ) सिरिंज फाइलर का उपयोग करके SHB-SAPN फ़िल्टर करें। अलीकोट एसएचबी-एसएएन बाँझ ट्यूबों में और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज, बाद में विश्लेषण के लिए आरटी पर कम से कम 100 डिग्री सेल्सियस छोड़ने।

7. आकार और उपस्थिति से कणों का सत्यापन

  1. डायनेमिक लाइट प्रकीर्णन (डीएलएस)
    1. निम्नलिखित मापदंडों द्वारा SHB-SAPN के मतलब कण आकार को मापने: सामग्री के रूप में प्रोटीन का चयन करें, 120 एम एम यूरिया, 20 एमएम Tris, तापमान के लिए 5% ग्लिसरोल 25 डिग्री सेल्सियस के लिए एक जटिल बफर बनाने के लिए, विश्लेषण के लिए डिस्पोजेबल cuvettes का चयन करें, स्वत: का चयन करें माप, 5 रन के लिए सेट.
    2. एक डिस्पोजेबल cuvette करने के लिए SHB-SAPN के 45 $L जोड़ें और हरे तीर पर क्लिक करके सॉफ्टवेयर चलाते हैं। रीडआउट के लिए प्रतिशत मात्रा का चयन करें.
  2. नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA)
    1. refolding बफर में 1:20 द्वारा नमूना पतला. पतला नमूना के 10 एमएल बनाओ.
    2. 3 एमएल सिरिंजों का उपयोग करते हुए, NTA साधन को रीफोल्डिंग बफर के साथ फ्लश करें और उपकरण को बराबर करने के लिए लगभग 1.5 एमएल नमूने लोड करें। विश्लेषण के लिए नमूने के बाकी का उपयोग करें.
    3. SOP टैब पर क्लिक करके NTA सॉफ़्टवेयर में कोई नया SOP बनाएँ। टैब के अंतर्गत कैप्चर की संख्या को 3 में बदलना और कैप्चर समय को 30 s में बदलना. नमूना को फ़ोकस में लाने के लिए स्क्रीन के बाईं ओर ऑटोफोकस बटन दबाएं. ठीक धुन ध्यान देने के लिए मशीन के पक्ष पर मैनुअल फोकस घुंडी का प्रयोग करें.
    4. बनाया SOP चलाएँ, जब सिस्टम संकेत देता है सिरिंज के साथ नमूना की एक छोटी मात्रा लोड. प्रणाली के बाद सभी कब्जा ले लिया है यह स्वचालित रूप से विश्लेषण स्क्रीन लाएगा. सभी वास्तविक कणों लाल पार के साथ चिह्नित कर रहे हैं ताकि पता लगाने की सीमा पट्टी स्लाइड। रन विश्लेषण बटन दबाएँ और विश्लेषण स्वचालित रूप से शुरू हो जाएगा.
  3. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)
    1. ग्लो डिस्चार्ज फॉर्मवर/कार्बन 400 मेश कॉपर टीईएम सपोर्ट फिल्म्स।
    2. एक फिल्टर पेपर का उपयोग कर तरल बंद 30 s. के लिए ग्रिड के लिए एक 0.075 मिलीग्राम/एमएल एकाग्रता पर नमूना के 3 डिग्री एल जोड़ें।
    3. तीन बार deionized पानी के 3 डिग्री एल के साथ ग्रिड धो लें, हर बार फिल्टर कागज के साथ पानी से wicking.
    4. समर्थन फिल्म के लिए 0.5% यूरेनिल एसीटेट के 3 $L जोड़ें और यह 30 एस के लिए बैठने के लिए अनुमति देते हैं यूरेनिल एसीटेट के अधिकांश बंद लेकिन सतह पर एक पतली फिल्म छोड़ दें। नमूनों को संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी पर इमेजिंग करने से पहले सूखने दें।
    5. एक TEM पर 80 केवी पर छवि के नमूने.

8. एक गतिज limulus अमीबोसाइट lysate (LAL) परख का उपयोग कर नमूनों में endotoxin स्तर का निर्धारण

  1. किट और रेफ्रिजरेटर से नमूने निकालें और आरटी के लिए समतुल्य करने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. इस परख प्रदर्शन करने के लिए, एक गर्मी ब्लॉक और 40 के लिए नमूने को पढ़ने की क्षमता के साथ एक प्लेट रीडर 37 डिग्री सेल्सियस पर 405 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर पढ़ता है की आवश्यकता है। एक प्रोग्राम टेम्पलेट लिखें ताकि कुओं को हर 150 s पढ़ रहे हैं शुरुआत समय बिंदु की पहचान करने के लिए (ओडी पहले पढ़ने के साथ तुलना में 0.2 की वृद्धि हुई).
  3. पीबीएस में प्रतिरक्षण खुराक एकाग्रता के लिए नमूना पतला.
    नोट: refolding बफर का पीएच LAL परख की सीमा के बाहर है. पीबीएस में नमूने के कमजोर पड़ने स्वीकार्य सीमा के लिए पीएच सेट करेगा.
  4. एंडोटॉक्सिन मुक्त लाल पानी की उचित मात्रा में नियंत्रण एंडोटॉक्सिन को पुन: असाइन करें जैसा कि विश्लेषण के प्रमाण पत्र द्वारा निर्धारित 50 EU/mL उत्पन्न करने के लिए निर्धारित किया गया है। endotoxin की पूरी तरह से resuspension सुनिश्चित करने के लिए 15 मिनट के लिए vial जोरदार भंवर.
  5. 50 यूरोपीय संघ की सीमा में कांच शीशियों में एक 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने preforming द्वारा endotoxin मानक वक्र उत्पन्न 0.005 यूरोपीय संघ / प्रत्येक तनुता के लिए, लाल पानी के 0.9 एमएल करने के लिए पिछले कमजोर पड़ने के 0.1 एमएल जोड़ें। 1 मिनट के लिए संयोजन के बाद भंवर जोरदार.
  6. एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए डुप्लिकेट में मानक वक्र कमजोर पड़ने और SHB-SAPN नमूने जोड़ें. के रूप में अच्छी तरह से डुप्लिकेट में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में लाल पानी का प्रयोग करें. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को प्रीइनक्यूबेट करें।
  7. ऊष्मायन के अंत में, लाल पानी के 2.6 एमएल के साथ परख अभिकर्मक शीशी को पुन: असाइन करें। धीरे से एक serological पिपेट के साथ सामग्री मिश्रण.
  8. 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में परख अभिकर्मक का 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। जल्दी से प्लेट रीडर के लिए थाली ले जाएँ और कार्यक्रम 8.2 में लिखा टेम्पलेट चलाते हैं.
  9. एक बार प्रोग्राम पूरा हो गया है, एक मानक वक्र प्रारंभ समय बनाम नियंत्रण के लॉग मान का उपयोग कर उत्पन्न करते हैं। नमूनों में एंडोटॉक्सिन एकाग्रता की गणना करने के लिए इस वक्र से उत्पन्न सूत्र का उपयोग करें।

Representative Results

यहाँ दिखाया गया पूर्ण रूप से इकट्ठा SHB-SAPN प्रोटीन अनुक्रमों पर बनाया गया है (चित्र 1A) जो एक कण में गुना करने की भविष्यवाणी की जाती है जिसमें मोनोमर की 60 प्रतियां होती हैं (चित्र 1ख) । चित्र 2 SHB-SAPN कोर के उत्पादन, शुद्धिकरण, और पहचान के लिए विधि की एक रूपरेखा प्रदान करता है। ई. कालाई एक ग्लिसरोल स्टॉक है कि SHB-SAPN कोर के जीन अनुक्रम के साथ एक pPep-T अभिव्यक्ति वेक्टर शामिल से BL21 (DE3) ई. कोलाई में प्रेरित किया गया. बैक्टीरियल कोशिकाओं को सफलतापूर्वक विकसित किया गया और denaturing और शर्तों को कम करने के तहत lysed.

कुल सेल lysate एक Ni2 + कॉलम का उपयोग कर FPLC द्वारा SHB-SAPN monomers शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (चित्र 3A) . एफपीएलसी क्रोमैटोग्राफ दर्शाता है कि प्रोटीन 150 एमएम और 500 एमएम इमिडाज़ोल (चित्र 3क) दोनों पर किया जाता है। क्रोमैटोग्राम भी 185 एमएल और 210 एमएल कुल मात्रा isopropanol धोने और imidazole मुक्त धोने के लिए इसी पर दो अन्य चोटियों से पता चलता है, क्रमशः. पुनः संयोजक प्रोटीन के अंश और शुद्धता की पहचान ग्रेडिएंट एसडीएस-पेज जैल द्वारा की गई थी (चित्र 3ख)। ब्याज की प्रोटीन मुख्य रूप से भिन्न में स्थित था 68]u2201279 (278$u2012300 एमएल कुल मात्रा). इन अंशों को आगे के विश्लेषण ों के लिए संयोजित किया गया। पश्चिमी दाग-विरोधी-हिस एंटीबॉडी (एन-टर्मिनल) और 167-डी-IV एंटीबॉडी (सी-टर्मिनस) के साथ पश्चिमी दाग ने संकेत दिया कि जमा हुए भिन्न वास्तव में ब्याज का प्रोटीन थे (चित्र 4क, बी)। इन धब्बों ने एसएचबी-एसएपिन मल्टीमर्स की उपस्थिति का भी प्रदर्शन किया। पहले washes और elution भिन्न बहुmerized प्रोटीन की एक उच्च एकाग्रता होते थे और इसलिए बाहर रखा गया.

ब्याज की प्रोटीन monomers निहित नमूने डायलिसिस द्वारा पूरी तरह से इकट्ठे SHB-SAPN में जोड़ रहे थे. कण आकार वितरण डीएलएस और नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था (चित्र 5ए, बी)। डीएलएस 67 एनएम की एक $ औसत ऊष्मागतिक व्यास के साथ कणों की पहचान की, जबकि NTA प्रणाली 81 एनएम का एक मतलब आकार मापा. मामूली आकार अंतर कण आकार तकनीक के कारण थे, लेकिन दोनों विश्लेषण से आकार की उम्मीद की सीमा में थे 20u2012100 एनएम8,24,25. SHB-SAPNs TEM द्वारा कल्पना की गई और छवियों को दो कण आकार तकनीकों से प्राप्त आकार वितरण के साथ अच्छी तरह से तैयार व्यक्तिगत कणों से पता चला (चित्र 5C)।

प्रोटीन की शुद्धि के दौरान, स्तंभ अंतिम SHB-SAPN उत्पाद में एलपीएस संदूषण को कम करने के लिए आइसोप्रोपेनोल के साथ धोया गया था। यदि endotoxin स्तर प्रतिरक्षण के लिए स्वीकार्य था सत्यापित करने के लिए, SHB-SAPN नमूनों में एलपीएस की एकाग्रता के साथ या isopropanol धोने कदम के बिना शुद्ध एक गतिज लाल परख द्वारा निर्धारित किया गया था. परिणामों से संकेत मिलता है कि आइसोप्रोपेनॉल वॉश ने एंडोटॉक्सिन के स्तर को कम कर दिया है।

Figure 1
चित्र 1: SHB-SAPN प्रोटीन अनुक्रम और संरचना. (ए) एसएचबी-एसएएन मोनोमर का एमिनो एसिड अनुक्रम। (बी) पूरी तरह से इकट्ठे एसएचबी-एसएपीएन कोर की संरचना का कंप्यूटर मॉडल जिसमें 60 प्रोटीन मोनोमर होते हैं। एमिनो एसिड दृश्यों के लिए रंग योजना: ग्रे ] HisTag; ग्रीन ] पेंटामर; गहरे नीले रंग की जेड डे नोवो डिजाइन ट्रिमर; हल्के नीले रंग - छह हेलिक्स बंडल. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: फ़्लोचार्ट का SHB-SAPN उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल| रंग योजना: ई. कोलाईमें प्रोटीन मोनोमर की ब्लैक एक्सप्रेशन ; डार्क ग्रे ] मोनोमर शुद्धिकरण; मध्यम ग्रे ] मोनोमर पहचान; हल्का ग्रे ] refolding और विशेषता; व्हाइट - पूरी तरह से इकट्ठे SHB-SAPN उत्पाद. अंधेरे और मध्यम ग्रे के साथ लेबल चरणों में, प्रोटीन denaturing और शर्तों को कम करने के तहत है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: SHB-SAPN monomers के प्रोटीन शुद्धि| (ए) FPLC शुद्धि से Chromatograph. क्रोमैटोग्राम के ऊपर हरी रेखा शुद्धि चरणों को इंगित करती है। वर्णलेख में नीली रेखा 280 एनएम तरंगदैर्ध्य पर भिन्नों के ऑप्टिकल घनत्व का प्रतिनिधित्व करती है। काली रेखा से पता चलता है कि शुद्धीकरण के प्रत्येक चरण में उपयोग किए गए बफर बी (8 एम यूरिया, 20 एमएम ट्राइस, 50 एमएम सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक, 5 एमएम टीसीपी, 500 एमएम इमिडाज़ोल, पीएच 8.5) का प्रतिशत क्या है। (B) एसडीएस-पेज जैल से जमा भिन्नों के lysate (L), प्रवाह के माध्यम से (एफटी), पहले धोने (W1), isopropanol धोने (W2), तीसरे धोने (W3), और 150 m imidazole (E150) और 500 m imidazole (Elution) elution के elution से अलग-अलग अंश शोधन. पहली लेन (एम) में आण्विक मार्कर 10 और 250 केडीए के बीच बैंड की पहचान करते हैं। लक्ष्य प्रोटीन एक काले तीर से संकेत दिया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: पश्चिमी धब्बा द्वारा प्रोटीन की पहचान। सभी गलियों में 100 एनजी प्रोटीन भरा हुआ है। (ए) एंटी-6x हिस्टैग के साथ एक पश्चिमी दाग का परिणाम। (ख) 167-डी-IV एचआईवी-1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एक पश्चिमी दाग के परिणाम। लेन के रूप में चिह्नित कर रहे हैं: एम $ आणविक वजन मार्कर; 1 ] lysate; 2 के माध्यम से प्रवाह; 3 - पहले धोने; 4 ] आइसोप्रोपेनॉल वॉश (दूसरा धोने); 5 ] तीसरा धोने; 6 [पूल्ड मात्रा भिन्न 56]u201261 (पहली elution चोटी), 7 ] जमा मात्रा गुटों 62]u201267 (दो चोटियों के बीच), 8 ] जमा मात्रा भिन्न 68 ]u201278 (दूसरी elution चोटी). एक काले तीर द्वारा संकेत दिया है के रूप में 18.07 kDa की उम्मीद बैंड आकार के साथ लक्ष्य प्रोटीन. गलियों में अतिरिक्त बैंडिंग 7 और 8 dimers, trimers, और SHB-SAPN (लाल तीर) के multimers हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: पुन: फ़ोल्ड SHB-SAPN का वर्णीकरण. (ए) कण आकार वितरण के रूप में डीएलएस द्वारा निर्धारित. (बी) कण आकार के रूप में नैनोकण ट्रैकिंग (सिस्टम) द्वारा निर्धारित. (ग) टीईएम द्वारा एसएचबी-एसएएन कणों का दृश्य। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नमूना एंडोटॉक्सिन (ईयू/ एंडोटॉक्सिन (ईयू/
इसोप्रोपेनॉल वॉश के साथ एसएपीएन 2.02 0.01
इसोप्रोपेनॉल वॉश के बिना एसएपीएन और 50 ०.२९
नकारात्मक नियंत्रण पता लगाने के स्तर के नीचे एन/ए

तालिका 1: refolded SHB-SAPNs के Endotoxin स्तर. एसएचबी-एसएपीएन नमूनों में एंडोटॉक्सिन स्तर एक आइसोप्रोपेनोल वॉश के साथ या बिना शुद्ध, एंडोटॉक्सिन इकाइयों/एमएल और एंडोटॉक्सिन इकाइयों/जेडजी ऑफ एसएचबी-एसएपीएन प्रोटीन के रूप में प्रस्तुत किया गया है।

Discussion

Nanotechnology subunit टीका विकास के लिए कई फायदे और समाधान प्रदान करता है. नैनोवैक्सीन बार-बार एंटीजन को मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए कण के रूप में पेश कर सकता है जो इम्यूनोजेनिकिटी26को बढ़ाता है . जबकि वहाँ नैनोटीकेक के कई अलग अलग प्रकार के होते हैं, हम मानते हैं कि डे नोवो डिजाइन प्रोटीन से बना लोगों को टीका विकास1के लिए सबसे मजबूत दृष्टिकोण लग रहे हो . वे मेजबान प्रोटीन के लिए किसी भी अनुक्रम homology के बिना इंजीनियर किया जा सकता है और कम उत्पादन लागत और उच्च उत्पाद पैदावार प्रदान करते हुए देशी की तरह रचना के करीब में ब्याज की प्रतिजन पेश करते हैं. इस दृष्टिकोण का एक प्रमुख उदाहरण SAPN प्रौद्योगिकी है, जो हम कई संक्रामक रोगों के खिलाफ टीकों के लिए आवेदन किया है7. एचआईवी-1 वैक्सीन के विकास में कठिनाइयों को संबोधित करते हुए, हमने एक अद्वितीय एसएचबी-एसएएन कोर तैयार किया है ताकि वी1वी2 प्रतिजन को देशी-जैसे ट्रिमरिक कॉन्फॉर्मेशन9में प्रभावी ढंग से पेश किया जा सके। कई टीका लक्ष्य, विशेष रूप से वायरल रोगों के लिए, trimers27के रूप में मौजूद हैं. इस घटना से पता चलता है कि हमारे SAPN डिजाइन subunit टीकों के विकास के लिए व्यापक प्रभाव पड़ता है.

इस विधि में, हम एक ई. कोलाई अभिव्यक्ति प्रणाली में SHB-SAPNs का उत्पादन करने के लिए कैसे प्रदर्शित करते हैं। हम प्रोटीन की उच्च पैदावार व्यक्त (के बारे में 6 मिलीग्राम /100 संस्कृति के एमएल). प्रोटीन में 10 हिस्टोडिन होते थे और नी2+ कॉलम के साथ एक स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके आसानी से शुद्ध किया गया था। उनके टैग की यह लंबाई उच्चतम प्रोटीन उपज के लिए इष्टतम पाया गया. शुद्ध प्रोटीन डिजाइन प्रोटीन की पूर्ण लंबाई के रूप में दोनों एन-टर्मिनल HisTag और सी टर्मिनल heptad दोहराने की उपस्थिति से संकेत निहित. हम व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं तकनीक का उपयोग किया और उन्हें अभिव्यक्ति, उत्पादन, और SHB-SAPN कोर की विशेषता के लिए अनुकूलित. एक नया प्रोटीन एपिटोप युक्त एक SAPN के विकास के दौरान पूर्ण लंबाई प्रोटीन के उत्पादन की कमी मेजबान सेल में जीन की अभिव्यक्ति की समस्या का संकेत हो सकता है. यदि ऐसा होता है, जीन और अभिव्यक्ति प्रणाली बदल दिया और वर्णित प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. sonication समय या तीव्रता के संशोधन भी भविष्यवाणी की पूर्ण लंबाई प्रोटीन की एकाग्रता में वृद्धि हो सकती है.

Refolded कणों की उम्मीद आकार रेंज में थे (20 से 100 एनएम)8,24,25 के रूप में डीएलएस और नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा निर्धारित. इन परिणामों को आगे TEM का उपयोग करके पुष्टि की गई. यदि इस चरण में समस्याएं हैं, यह सामान्य रूप से पीएच या refolding बफर के आयनिक शक्ति के साथ एक समस्या के कारण है. जब कण आकार तकनीक पर बड़े आकार के कणों का पता लगाया जाता है, तो यह एकत्रीकरण को इंगित करता है, जिसे रीफोल्ड बफर के पीएच को बढ़ाकर बचा या जा सकता है। यदि कणों डीएलएस द्वारा पता नहीं कर रहे हैं, प्रोटीन की एकाग्रता की पुष्टि करें और बफर के पीएच की जाँच करें। डीएलएस के लिए अंतिम प्रोटीन एकाग्रता कम से कम 100 g/ यदि एकाग्रता समस्या नहीं है, यह छोटे, अपूर्ण रूप से गठित कणों की बहुतायत को इंगित करता है, जिनकी एकाग्रता पीएच को कम करके कम की जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, सोडियम क्लोराइड एकाग्रता इष्टतम रेंज के लिए समायोजित किया जा सकता है अवांछित आकार के साथ कणों की उपस्थिति को कम करने के लिए.

अंत में, शुद्धि के दौरान एक आइसोप्रोपेनोल धोने के कदम का उपयोग करके हम मेजबान ई. कोलाई से 0.01 यूरोपीय संघ / 28. इस स्तर को एक आयन विनिमय स्तंभ का उपयोग करके और भी कम किया जा सकता है Q स्तंभ के रूप में जाना जाता है। यदि endotoxin के उच्च स्तर अभी भी मौजूद हैं, सभी सामग्री है कि बफर तैयारी के लिए इस्तेमाल किया गया जाँच करें. इस विधि में केवल depyrogenated ग्लासवेयर और endotoxin मुक्त प्लास्टिक के बर्तन का उपयोग करने के लिए याद रखें.

इन परिणामों से संकेत मिलता है कि हम सफलतापूर्वक SHB-SAPN कोर है कि पूर्व नैदानिक प्रतिरक्षण अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का उत्पादन करने के लिए एक विधि विकसित की है. केवल मामूली संशोधनों के साथ इस विधि, यदि कोई हो, SHB-SAPNs के शुद्धिकरण के लिए लागू किया जा सकता है जब ब्याज की एक प्रतिजन जोड़ा जाता है. एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस विधि का उपयोग प्रमुख परिवर्तनों में से एक elution कदम में है. विभिन्न इमिडाज़ोल सांद्रता में विभिन्न प्रोटीन एल्यूट जो प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किए जाने चाहिए। अन्य प्रमुख अंतर refolding बफर की संरचना हो सकती है. अनुकूलन विभिन्न पीएच शर्तों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आयनिक शक्तियों के परीक्षण की आवश्यकता होगी.

भविष्य के काम को ध्यान में रखते हुए, SHB-SAPN के मानव आवेदन की अनुमति देने के लिए केवल दो मामूली संशोधनों की आवश्यकता है। पहला यह है किमनुष्योंमें एम्पसिलिन एलर्जी के कारण अभिव्यक्ति वेक्टर को कानामाइसिन प्रतिरोध चयन मार्कर में बदलने की आवश्यकता है . मानव उपयोग के लिए प्रोटीन विनिर्माण की अन्य प्रमुख आवश्यकता पशु उत्पाद मुक्त मीडिया में SHB-SAPN का उत्पादन करने के लिए है। एक छोटे पैमाने पर अध्ययन पहले से ही एक संयंत्र आधारित मीडिया में प्रोटीन की उचित उपज का संकेत दिया. यहाँ प्रस्तुत काम आसानी से परम जीएमपी उत्पादन के लिए स्केलेबल के रूप में एक मलेरिया टीका उम्मीदवार, FMP01416के साथ प्रदर्शन किया है. इस बड़े पैमाने पर FMP014-SAPN उत्पादन दोनों anion विनिमय और अंतिम उत्पाद से LPS और Ni2 + सामग्री को कम करने के लिए धन विनिमय कदम शामिल थे। यह जीवाणु-एक्सप्रेस्ड एसएपीएन को आगामी चरण 1/2a नैदानिक परीक्षण के लिए पहले ही बढ़ाया जा चुका है।

Disclosures

व्यक्त विचार लेखकों के उन हैं और अमेरिकी सेना या रक्षा विभाग के पदों का प्रतिनिधित्व करने के लिए नहीं लगाया जाना चाहिए. पीटर Burkhard अल्फा-ओ पेप्टाइड्स एजी नामक कंपनी में रुचि है और प्रौद्योगिकी पर पेटेंट है. अन्य लेखकों इस पत्र में प्रस्तुत विषय पर एक वित्तीय ब्याज के साथ किसी भी कंपनी के साथ कोई संबद्धता या वित्तीय भागीदारी है.

Acknowledgments

यह काम सैन्य चिकित्सा, इंक, और अमेरिकी रक्षा विभाग की उन्नति के लिए हेनरी एम जैक्सन फाउंडेशन के बीच एक सहकारी समझौते (W81XWH-11-2-0174) द्वारा समर्थित किया गया था। विरोधी HIV-1 gp41 mAb 167-डी चतुर्थ एंटीबॉडी NIH एड्स अभिकर्मक कार्यक्रम के माध्यम से डॉ सुसान ज़ोला-Pazner से प्राप्त किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine/SDS BioRad 1610732 1 L
2-Mercaptoethanol BioRad 1610710 25 mL
2-propanol Fisher BP26181 4 L
2x Laemmli Sample Buffer BioRad 1610737 30 mL
40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers Malvern Panalytical ZEN0040 100 pack
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl BioRad 4561093 10 pack
Ampicillin Fisher BP1760-25 25 g
Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] AbCam ab18184 100 mg
Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) AIDS Reagent Repository 11681 100 mg
BCIP/NBT Substrate, Solution Southern Biotech 0302-01   100 mL
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems Fisher 09-761-108 A variety of sizes
Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm Ted Pella, Inc 01754-F 25 pack
GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns GE HealthCare 45-000-325 5 pack
Glycerol Fisher BP229-4 4 L
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) ABCam ab97020 1 mg
Imidazole Fisher O3196-500 500 g
Instant NonFat Dry Milk Quality Biological A614-1003 10 pack
Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay Lonza Walkersville 50650U 192 Test Kit
LAL Reagent Grade Multi-well Plates Lonza Walkersville 25-340 1 plate
Magic Media E. coli Expression Medium ThermoFisher K6803 1 L
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters Millipore SLGV033RB 250 pack
Mouse Anti-Human IgG Fc-AP Southern Biotech 9040-04   1.0 mL
One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli ThermoFisher C601003 20 vials
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, BioRad 1610363 1 mL
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL ThermoFisher 66810 8 pack
Sodium Chloride Fisher BP358-212 2.5 kg
Sodium Phosphate Monobasic Fisher BP329-500 500 g
Tris Base Fisher BP152-1 1 kg
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Biosynth International C-1818 100 g
Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S Electron Micoscopy Services 541-09-3 25 g
Urea Fisher BP169-500 2.5 kg
Whatman qualitative filter paper Sigma Aldrich WHA10010155 pack of 500
Name Company Catalog Number Comments
 Equipment
ChromLab Software ver 4 BioRad 12009390 Software
Epoch 2 Microplate Spectrophotometer BioTek EPOCH2 Plate Reader
Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor ThermoFisher 096-145075 Rotor
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Gel Imager for Stain free Gels
JEOL TEM JEOL 1400 Transmission Electron Microscope
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels BioRad 1658004 To run gels
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer ThermoFisher ND-ONE-W For Protein Concentration
NanoSight NS300 Malvern Panalytical Particle Sizing
NanoSight NTA software NTA Malvern Panalytical Particle Sizing
New Brunswick Innova 44/44R Eppendorf M1282-0000 Incubator/Shaker
NGC Quest 10 Chromatography System BioRad 7880001 FPLC to aid in protein purification
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella, INC 91000S To clean grids
PowerPac Universal Power Supply BioRad 1645070 To run gels
Rocker Shaker Daigger EF5536A For Western
Sonifer 450 Branson also known as 096-145075  Sonicator
Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge ThermoFisher 75-006-580 Centrifuge
Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs BioRad 1704158 For Western
Trans-Blot Turbo Transfer System BioRad 1704150 For Western
Vortex-Genie 2 Daigger EF3030A Vortex
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Particle Sizing
Zetasizer Software Malvern Panalytical Particle Sizing

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 150 सबयूनिट टीका नैनोवैक्सीन आत्म-संबल प्रोटीन नैनोकण सैप प्रतिजन प्रस्तुति ट्रिमरिक प्रतिजन देशी की तरह संरचना
टीके के लिए <em>ई. कोलाई</em>-एक्सप्रेस्ड स्व-एसम्बेलिंग प्रोटीन नैनोकणों का उत्पादन, ट्राइमेरिक एपिटोप प्रस्तुति की आवश्यकता होती है
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Karch, C. P., Burkhard, P., Matyas, G. R., Beck, Z. Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation. J. Vis. Exp. (150), e60103, doi:10.3791/60103 (2019).

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