Summary
Aşı geliştirmede kullanılmak üzere kendi kendine biraraya gelen protein nano taneciklerinin (SAPN' ler) saflaştırılmasını, yeniden katlanması ve karakterizasyonu nun tanımlanmasını açıklayan ayrıntılı bir yöntem burada verilmiştir.
Abstract
Kendi kendine biraraya gelen protein nano partikülleri (SAPN'ler) tekrarlayan antijen görüntüler olarak işlev görür ve farklı bulaşıcı hastalıklar için çok çeşitli aşılar geliştirmek için kullanılabilir. Bu makalede, trimerik bir konformasyonda antijenleri sunabilen altı sarli stok (SHB) bir montaj içeren bir SAPN çekirdeği üretmek için bir yöntem gösterin. SHB-SAPN ifadesini bir E. coli sisteminde ve gerekli protein arıtma adımlarında tanımlıyoruz. Biz artık bakteriyel lipopolisakkarit azaltmak için bir izopropanol yıkama adımı dahil. Protein kimliğinin ve saflığın bir göstergesi olarak, protein Batı leke analizlerinde bilinen monoklonal antikorlarla reaksiyona girer. Yeniden katlamadan sonra, parçacıkların boyutu beklenen aralıkta (20 ila 100 nm) düştü, dinamik ışık saçılma, nanopartikül izleme analizi ve iletim elektron mikroskopisi ile doğrulandı. Burada açıklanan metodoloji SHB-SAPN için optimize edilse de, diğer SAPN yapıları için yalnızca küçük değişiklikler uygulanabilir. Bu yöntem aynı zamanda kolayca insan aşıları için GMP üretimi için büyük ölçekli üretim aktarılabilir.
Introduction
Geleneksel aşı geliştirme inaktive veya zayıflatılmış patojenler üzerinde duruldu iken, modern aşıların odakalt birim aşılar doğru kaymıştır 1. Bu yaklaşım daha hedefli bir yanıta ve potansiyel olarak daha etkili aşı adaylarına yol açabilir. Ancak, ana dezavantajlarından biri alt birim aşıları azaltılmış immünojenite neden olabilir bütün organizmalar gibi partiküller değildir2. Tekrarlayan bir antijen görüntü sistemi olarak bir nanopartikül hem hedeflenen alt birim aşı yaklaşımının yararları hem de tüm organizmanın partikül doğasıolabilir 1,3.
Nanoaşılar mevcut türleri arasında, rasyonel tasarlanmış protein derlemeleri tasarım ve antijen potansiyel bir yerli gibi konformasyon1,4 içinde antijen birden fazla kopyasını sunabilir aşı adaylarının geliştirilmesi için izin ,5,6. Bu protein derlemelerine bir örnek, kendi kendini biraraya getirenprotein nano tanecikleridir (SAPNs) 7. SAPN'ler bobin etki alanlarını temel alır ve geleneksel olarak Escherichia coli8ile ifade edilir. SAPN aşı adayları sıtma, SARS, grip, toksoplazmoz ve HIV-1 9,10,11,12,13 gibi çeşitli hastalıklar için geliştirilmiştir. , 14.000 , 15.000 , 16.02.20 , 17.000 , 18.000 , 19. Her SAPN adayının tasarımı ilgi patojenine özgüdür, ancak üretim, arınma ve yeniden katlama teknikleri genel olarak uygulanabilir.
Şu anki ilgi alanlarımızdan biri etkili bir HIV-1 aşısı. RV144-mütevazı etkinliğini gösteren bir HIV-1 aşısının sadece Faz III klinik çalışmada-enfeksiyon riskinin azalması igg antikorları ile zarfprotein20V1V2 döngüsü ile ilişkili oldu,21. Bu bölgenin yerli gibi trimerik sunumu koruyucu immünojenite için önemli olduğu düşünülmektedir22. V1V2 döngüyü mümkün olduğunca yerli-benzer konformasyona yakın olarak sunmak için, V1V2 halkasını doğru konformasyona sunmak için HIV-1 zarf füzyon sonrası altı sarlis demeti (SHB) içeren sapn aşı adayının bir kanıtı geliştirdik9 . Bu aday HIV-1 zarf protein bilinen monoklonal antikorlar tarafından kabul edildi. V1V2-SHB-SAPN ile aşılanmış fareler V1V2 spesifik antikorlar kaldırdı, en önemlisi, gp70 V1V2 bağlı,doğru konformasyonel epitops9 . SHB-SAPN çekirdeği, HIV-1 V1V2 döngüsü için taşıyıcı rolün ötesinde başka işlevlere de sahip olabilir. Burada, SHB-SAPN çekirdeğinin ifade edilmesi, saflaştırılması, yeniden katlanması ve doğrulanması için ayrıntılı bir metodoloji açıklıyoruz. Sıra seçimi, nanopartikül tasarımı, moleküler klonlama ve E. coli dönüşümü daha önce9tarif edilmiştir .
Protocol
1. E. coli BL21(DE3) içinde SHB-SAPN Proteininin Ekspresyonu
- Üreticinin talimatlarına göre 2 L steril cam Erlenmeyer şişesinde A bileşeni A ve 5 mL bileşen B karışımını karıştırın (Malzeme Tablosuna bakın). 100 μg/mL'lik son konsantrasyona ampisilin ekleyin.
- Daha önce kurulmuş bir gliserol stok kültüründen E. coli ile medya aşılamak. 30 °C'de kuluçka kültürü ve dakikada 200 dönüş (rpm) 48 saat boyunca sallayarak.
NOT: Kullanılan E. coli BL21 (DE3) stokunda SHB-SAPN geni ile ampisilindirençli ekspresyon vektörü23 bulunuyordu. Medyanın genel protokolü 37 °C'de 24 saat kuluçka önerse de, 30 °C'de 48 saat kuluçka SHB-SAPN için daha yüksek verim vermiştir. - Kültürü iki 50 mL konik tüpe aktarın. Tüpleri 4 °C'de sabit açı rotoru ile 10 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve hasat hücreleri için pelet kaydedin.
NOT: Hücre peleti kullanıma kadar hemen işlenebilir veya -80 °C'de dondurulabilir.
2. Sonication tarafından E. coli BL21(DE3) lysis
NOT: 250 °C'de en az 30 dakika boyunca pişirilen pirojenik olmayan plastik ve cam yazılımları kullanın. Görüntülenen antijen S-S bağları içeriyorsa, bu protokol sırasında arabelleklerde TCEP gereklidir. Yalnızca SHB-SAPN çekirdeği için arabelleklerde TCEP'in bulunması gerekli değildir.
- Imidazol içermeyen tampon (8 M Üre, 50 mM sodyum fosfat monobasic, 20 mM Tris baz, 5 mM TCEP) pH 8.0 (5 N NaOH ile ayarlanmış) hazırlayın ve 0,22 μm vakum şişe filtrasyon ünitesi kullanarak filtreleyin.
- Bir 50 mL konik tüp te 40 mL imidazol içermeyen tampon ile peletli hücreleri (adım 1.3)'den uzaklaştırın. 150 W'lık bir sonication çıkışıyla 5 dakika (4 s sonication, 6 s istirahat) için buz üzerinde bir sonda ile resuspended hücreleri sonicate.
- 29.000 x g'de hücresel lysate'yi (40 mL) 4 °C'de 25 dakika boyunca sabit açı rotoruile santrifüj edin ve netleştirilmiş supernatant üretin. Supernatant'ı 150 mL steril bir şişeye aktarın ve peleti atın. Imidazol içermeyen tamponu kullanarak supernatant'ı 100 mL'ye seyreltin (daha sonra "örnek" olarak adlandırılan protokolde).
NOT: Bu seyreltme adımı, fplc sistem basıncının kolona lysate yükleme sırasında çok yüksek olmasını önlemek için gereklidir.
3. His-kolon kullanarak protein saflaştırma
NOT: Bu protokol bir FPLC cihazı kullanılarak gerçekleştirilmiştir, ancak yerçekimi akışına adapte edilebilir.
- Aşağıdaki tamponları hazırlayın ve 0,22 μm vakum şişesi filtrasyon ünitesi kullanarak filtreleyin: (i) imidazol içermeyen tampon "Tampon A" (8 M Üre, 50 mM sodyum fosfat monobasic, 20 mM Tris baz, 5 mM TCEP) pH 8.0; (ii) 500 mM imidazol tampon "Tampon B" (8 M Üre, 50 m Sodyum fosfat monobazik, 20 mM Tris baz, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazol) pH 8.0; ve (iii) isopropanol yıkama (20 mM Tris, 60% isopropanol) pH 8.0.
NOT: Her arabellek için pH 5 N NaOH ile ayarlandı. - O'nun sütununu dengeleyin.
NOT: Laboratuvar ölçeğinde üretim için bu protokol 5 mL önceden paketlenmiş His-column kullanır, ancak daha büyük boyutlu bir sütun kullanılabilir.- FPLC yazılımını açın ve Yeni yöntem seçeneğini tıklayın. Yöntem ayarları menüsüne hemen açılır. Sütun konumu için açılır menü altında C1 bağlantı noktası3'ünü seçin.
- Gösterilen teknik açılır menüsünde yakınlıkseçin. Sütun türü açılır menüde başkalarını seçin, Histrap HP, 5 mL. Sütun hacmi ve basınç kutuları otomatik olarak uygun değerlere ayarlanır.
- Yöntem anahat düğmesine tıklayın. Faz kitaplığı açılır menüsünden aşağıdaki düğmeleri sürükleyin: equilibration, örnekuygulama, sütun yıkama, ve elution bu tam sırada ok yanında. Faz kitaplığı menüsünü kapatın.
- Denge düğmesine tıklayın. Tabloda listelenen değerler "ilk arabellek B" (%4), "son arabellek B" (%4) ve "hacim (CV)" 5 olmalıdır.
- Örnek uygulama kutusuna tıklayın. Örnek yükleme kutusunda örnek pompa ile sütunüzerinde örnek enjekteiçin radyo düğmesini tıklatın. Yöntem ayarlarından Kullanım akış hızının yanındaki kutunun, sistem pompa kutusu ile numune enjeksiyonunda işaretli olduğundan emin olun. Ekranın sağ tarafındaki ses kutusunun yanındaki değer 20 mLolarak değiştirin.
- Sütun yıkama düğmesine tıklayın. Tabloda listelenen değerler "ilk arabellek B" (%4), "son arabellek B" (%4) ve "hacim (CV)" 5 olmalıdır. Kesir toplama düzeninin yanında Etkinleştirkutusunun tıklatılmasını kaldırır.
- Elütion düğmesine tıklayın. Tabloda listelenen değerler "ilk arabellek B" %0, "son arabellek B" %100 ve "hacim (CV)" 5 olmalıdır. Kesir toplama düzeninin yanında Etkinleştir kutusunu tıklatın. Yöntem ayarlarından Kesir Kullan boyutunu açın ve aşağıdaki doldurma kutusunda kesir boyutunu 4 mL olarak ayarlayın.
- Yazılımın üst kısmındaki kaydet düğmesini tıklatın. Dosyaya "denge" adını verebedin.
- FPLC'deki ilgili sütun 3'e 5 mL önceden paketlenmiş His-sütunbağlayın. Hem pompa A hem de pompa B borusu ve numune pompası borusu 0,22 m filtreli deiyonize suya yerleştirilmelidir. Denge programını çalıştırın.
- Hem pompa A ve pompa B hem de imidazol içermeyen tampon içine örnek pompa boru yerleştirin (Tampon A) ve tekrar denge protokolü çalıştırın.
- Örneği kolona bağlayın ve proteini arındırın.
- FPLC yazılımını açın ve Yeni yöntem seçeneğini tıklayın. Yöntem ayarları menüsüne hemen açılır. Sütun konumu için açılan menü altında C1 bağlantı noktası3'ünü seçin. Gösterilen teknik açılır menüsünde yakınlıkseçin. Sütun türü açılır menüde başkalarını seçin, Histrap HP, 5 mL. Sütun hacmi ve basınç kutuları otomatik olarak uygun değerlere ayarlanır.
- Yöntem anahat düğmesine tıklayın. Faz kitaplığı açılır menüsünden düğmeleri sürükleyin: denge, örnekuygulama, sütun yıkama (Yıkama 1), sütun yıkama (Yıkama 2), sütun yıkama (Yıkama 3) ve Elution ok yanında tam sipariş. Faz kitaplığı menüsünü kapatın.
- Equilibration düğmesine tıklayın. Tabloda listelenen değerler "ilk arabellek B" %4, "son arabellek B" %4 ve "hacim (CV)" 5 olmalıdır.
- Örnek uygulama kutusuna tıklayın. Örnek yükleme kutusunda örnek pompa ile sütun üzerinde inject örnekiçin radyo düğmesine tıklayın. Yöntem ayarlarından Kullanım akış hızının yanındaki kutunun, sistem pompa kutusu ile numune enjeksiyonunda işaretli olduğundan emin olun.
- Ekranın sağ tarafındaki ses kutusunun yanındaki değer 100 mL olarak değiştirin. Kesir toplama düzeninin yanında Etkinleştir düğmesini tıklatın. Yöntem ayarları kutusundan Kesir Kullan boyutunu açın ve kesir boyutunu 4 mL olarak değiştirin.
- İlk sütun yıkama düğmesine tıklayın (Yıkama 1). Tabloda listelenen değerler "ilk arabellek B" %4, "son arabellek B" %4 ve "hacim (CV)" 10 olmalıdır. Kesir toplama düzeninin yanında Etkinleştir kutusunu tıklatın. Yöntem ayarlarından Kesir Kullan boyutunu açın ve kesir boyutunu 4 mL olarak değiştirin.
- İkinci sütun yıkama düğmesine tıklayın (Yıkama 2). Tabloda listelenen değerler "ilk arabellek B" %0, "son arabellek B" %0 ve "hacim (CV)" 5 olmalıdır. Kesir toplama düzeninin yanında Etkinleştir kutusunu tıklatın. Yöntem ayarlarından Kesir Kullan boyutunu açın ve kesir boyutunu 4 mL olarak değiştirin.
- Üçüncü sütun yıkama düğmesine tıklayın (Yıkama 3). Tabloda listelenen değerler "ilk arabellek B" %0, "son arabellek B" %0 ve "hacim (CV)" 5 olmalıdır. Kesir toplama düzeninin yanında Etkinleştir'i tıklatın. Yöntem ayarları kutusundan Kesir Kullan boyutunu açın ve kesir boyutunu 4 mL olarak değiştirin.
- Elütion düğmesine tıklayın. Tabloda listelenen bilgileri sağ tıklatın ve gelen menüde Sil adımınıtıklatın. İki giriş olacak şekilde izokratik gradyan düğmesini iki kez tabloya sürükleyin.
- İlk girişin değeri "ilk arabellek B" %30, "son arabellek B" %30 ve "Volume (CV)" 10'u okumalıdır. İkinci girişin değeri "ilk arabellek B" %100, "son arabellek B" %100 ve "hacim (CV)" 10'u okumalıdır. Kesir toplama düzeninin yanında Etkinleştir düğmesini tıklatın. Yöntem ayarlarından kesir boyutunu kullanyanındaki kutuyu tıklatın.
- Yazılımın üst kısmındaki Kaydet düğmesini tıklatın. Dosyaya "arınma" adını verebedin. Pompa FPLC bir tüp imidazol içermeyen yıkama tampon içine yerleştirilmelidir pompa boru 500 mM imidazol tampon içine yerleştirilmelidir. Numune pompası borusu 100 mL numuneye yerleştirilmelidir.
- "Arınma" programını çalıştırın ve %60 izopropanol'ün ihtiyaç duyulduğu zamanı bekleyin (Yıkama 2). Programı duraklatın, %60 izopropanol yıkama içine imidazol içermeyen yıkama bir tüp hareket ettirin. Programı yeniden başlatın.
- Izopropanol adımı tamamlandıktan sonra, programı tekrar duraklatın ve pompayı imidazoliçermeyen yıkama tamponuna geri taşıyın. Arınma programını yeniden başlatın (çalıştırmanın geri kalanı otomatiktir).
4. SDS-PAGE ile saflık değerlendirmesi ve protein tanımlama
- (i) akış yoluyla (O'nun sütununa bağlanmayan hücre lisate), (ii) Yıkama 1, (iii) Yıkama 3 (%60 izopropanol yıkama) ve (iv) Ayrı 50 mL konik tüplerde 3 yıkayın karşılık gelen tüm kesirleri birleştirin. Elütion adımlarından 2 mL kesirleri birleştirmeyin.
- Havuzlanmış kesirlerin her birinden 15 μL'yi ve elüsasyon adımlarından tüm fraksiyonları 0,5 mL mikrosantrifüj tüpte 2x Laemmli numune tamponu ile karıştırın ve 10 dk boyunca 95 °C'de ayrıştırın.
- Protein denatüre ederken, 1x Tris-glisin SDS-PAGE çalışan tampon 3 lekesiz 4-20% prekast poliakrilamid jelleri ile jel çalışan cihaz kurmak.
- İlk kuyuya 8 μL moleküler ağırlık belirteci ve jelin diğer kuyularına 30°L denatüre numune yükleyin. Boya ön jel (yaklaşık 30 dakika) alt vurur kadar 200 V jeller çalıştırın. Jelleri cihazdan çıkarın ve deiyonize suyla kısa bir süre durulayın. Lekesiz görüntüleme sistemini kullanarak jeli hemen görüntüleyin.
- Doğru boyutta (18,07 kDa) protein bantları içeren kesirleri tanımlayın. Tüm bu kesirleri birleştirin.
5. Batı lekeile protein tanımlama
- Saflaştırılmış tam uzunluktaki proteini kimlikolarak His-spesifik antikor (anti-6x HisTag) ve SHB'ye özgü antikor (167-D-IV) kullanarak batıda bir leke çalıştırın. Anti-6x HisTag antikor proteinin N terminusunu tanır ve 167-D-IV antikor c terminusunu tanır ve tam uzunlukta proteinin varlığını gösterir.
- (i) akış yoluyla protein konsantrasyonu belirleyin, (ii) Yıkama 1, (iii) Yıkama 2 (%60 isopropanol yıkama), (iv) Yıkama 3, ve 280 nm bir emicilik spektrometre aleti ile elüsyon adımlarından tüm fraksiyonları. Bu grupların her biri için 15 μL imidazol içermeyen tamponda 100 ng protein içeren seyreltmeler oluşturun.
- Numunelerin her 15 μL'sine 15 μL'lik 2x Laemmli numune tamponu ekleyin ve 4.1 adımda olduğu gibi denatüre edin. Denaturing tamamlandıktan sonra tüm protein transfer edilebilir sağlamak için tüpler aşağı spin.
- Yük örnekleri ve önceden lekeli marker lekesiz bir içine 4-20% prekast poliakrilamid jel. Boya ön jelin altına ulaşana kadar elektroforezi 200 V'da çalıştırın.
- Jel çalışırken, TBS-T'de 1 L TBS-T (20 mM Tris, 150 mM NaCl ve %0.1 Tween 20) ve 200 mL yağsız süt yapın.
- Bir nitroselüloz membran üzerine protein aktarmak için bir batı leke transfer sistemi kullanın. Önceden monte edilmiş bir aktarım yığını kullanın ve jeli üzerine yerleştirin. Sistemi 7 dk için 25 V'de çalışacak şekilde ayarlayın. Nitroselüloz membranüzerinde tam bir aktarım gösteren önceden lekeli markerin varlığını kontrol edin.
NOT: Sonraki tüm adımlar oda sıcaklığında (RT) 100 rpm olarak ayarlanmış bir orbital shaker üzerinde gerçekleştirilir. - Transfer tamamlandıktan sonra, her biri 10 dk boyunca TBS-T ile iki kez lekeleri yıkayın.
- Nitroselüloz membranları (leke) tbs-T'de %5 yağsız sütle en az 1 saat boyunca bloke edin.
- Primer 167-D-IV ve anti-6x HisTag antikorlarını TBS-T'de 1 mg/mL'ye seyreltin (stok Ab). 167-D-IV 10.000 kat ve anti-6x HisTag 5.000 kat stok 167-D-IV ve 4 μL stok anti-6x HisTag antikorları 20 mL TBS-T içeren iki farklı tüpler ekleyerek stok Abs seyreltmek. Primer antikorların toplam 20 mL hacmini, her bir lekeye bir tane ve 1 saat boyunca kuluçka lekelerini 10 dakika boyunca TBS-T ile iki kez yıkayın.
- TBS-T'nin 20 mL'sinde alkali fosfataz ile konjuge edilen fare anti-insan sekonder antikorunun 1 mg/mL'lik seyreltilmesi (1:5,000 seyreltme). TBS-T'nin 20 mL'sinde alkali fosfataz ile konjuge edilen keçi anti-fare sekonder antikorunun 1 mg/mL seyreltilmesi (1:5,000 seyreltme). Karşılık gelen lekelere ikincil antikorlar ekleyin.
NOT: Anti-insan ikincil antikor 167-D ve anti-fare anti-6x HisTag bağlanır bağlanır. 10 dakika tbs-T ile iki kez lekeleryı yıkayın. - Lekeleri kapsayacak kadar BCIP/NBT alkali fosfataz substratı ekleyin. Bantlar görünene kadar yaklaşık 10 dakika boyunca lekeleri geliştirin. Lekeleri soğuk musluk suyuyla durulayın ve düz yataklı bir tarayıcıyla taramadan önce kurumasına izin verin.
6. SHB-SAPN'nin Yeniden Katlanması
- Havuzlanmış proteini (10\u201220 mL toplam) 10 kDa moleküler ağırlıkdiyaliz kasetini kesip 8 M üre, 20 mM Tris, %5 gliserol, 5 mM TCEP pH 8.5 rt (18\u201226 °C) içine ekleyin.
- Diyaliz tamponundaki üre konsantrasyonunu adım adım 2 m her 2 saatte bir azaltarak üreyi numuneden yavaşça uzaklaştırın. 2 M üre konsantrasyonunda diyaliz cihazını 4 °C'ye taşıyın (bu adımdan itibaren diyaliz tamponunda TCEP kullanmayın). Numuneyi 120 mM üre, 20 mM Tris, %5 gliserol, pH 8,5'i 4 °C'de bir gecede diyalize sokarak yeniden katlamayı tamamlayın.
- Yeniden katlanmış proteini (SHB-SAPN) diyaliz kasetinden çıkarın. SHB-SAPN'yi 0,22 m poliviniliden florür (PVDF) şırınga filer kullanarak filtreleyin. Aliquot SHB-SAPN steril tüpler içine ve -80 °C'de dondurarak, sonraki analizler için RT'de en az 100 μL bırakarak.
7. Parçacıkların boyut ve görünüme göre doğrulanması
- Dinamik ışık saçılımı (DLS)
- SHB-SAPN'nin ortalama partikül boyutunu aşağıdaki parametrelere göre ölçün: malzeme olarak proteini seçin, 120 mM üre için karmaşık bir tampon oluşturun, 20 mM Tris, sıcaklık için %5 gliserol 25 °C, analiz için tek kullanımlık cuvettes seçin, otomatik ölçüm, 5 çalışır için ayarlayın.
- Tek kullanımlık bir cuvette'ye 45 μL SHB-SAPN ekleyin ve yeşil oka tıklayarak yazılımı çalıştırın. Okuma için yüzde hacmini seçin.
- Nanopartikül izleme analizi (NTA)
- Yeniden kat tamponunda numuneyi 1:20'ye kadar seyreltin. Seyreltilmiş numune10 mL olun.
- 3 mL şırınga kullanarak, NTA cihazını yeniden katlanan tamponla yıkayın ve cihazı dengelemek için yaklaşık 1,5 mL numune yükleyin. Analiz için numunenin geri kalanını kullanın.
- SOP sekmesine tıklayarak NTA yazılımında yeni bir SOP oluşturun. Sekme altında yakalama sayısını 3 olarak değiştirin ve yakalama süresini 30 s. Örneği odaklamak için ekranın sol tarafındaki otofokus düğmesine basın. Odak noktasının ince ayarını yapmak için makinenin yan tarafındaki manuel odaklama tonlarını kullanın.
- Sistem şırınga ile küçük bir numune hacmi yüklemek ister, oluşturulan SOP çalıştırın. Sistem tüm yakalamaları aldıktan sonra otomatik olarak analiz ekranını açacaktır. Algılama sınırı çubuğunu, tüm gerçek parçacıkların kırmızı haçlarla işaretlenebilecek şekilde kaydırın. Çalıştır çözümlemesi düğmesine bastığında çözümleme otomatik olarak başlayacaktır.
- İletim elektron mikroskobu (TEM)
- Glow deşarj formvar/karbon 400 örgü bakır TEM destek filmleri.
- Bir filtre kağıdı kullanarak sıvı kapalı 30 s. Wick için ızgara 0.075 mg / mL konsantrasyonunda örnek 3 μL ekleyin.
- Izgarayı her seferinde filtre kağıdıyla suyla kaplayarak 3°L deiyonize su ile üç kez yıkayın.
- Destek filmine %0,5 uranyl asetat ekleyin ve uranyl asetat'ın çoğunda 30 s. Wick'e oturmasını bekleyin ama yüzeyde ince bir film bırakın. İletim elektron mikroskobunda görüntülemeden önce numunelerin kurumasını bekleyin.
- Bir TEM'de 80 kV'da görüntü örnekleri.
8. Kinetik limulus amiposit lysate (LAL) tayini kullanılarak numunelerde endotoksin düzeylerinin belirlenmesi
- Kiti ve numuneleri buzdolabından çıkarın ve RT'ye dengede bekleyin.
- Bu titreyi gerçekleştirmek için, ısı bloğu olan bir plaka okuyucuve 37 °C'de 405 nm dalga boyunda 40 okuma için numuneleri okuyabilme gereklidir. Kuyuların başlangıç zaman noktasını belirlemek için her 150'de bir okunacak şekilde bir program şablonu yazın (OD ilk okumayla karşılaştırıldığında 0,2 artırıldı).
- PBS bağışıklama doz konsantrasyonu için örnek seyreltin.
NOT: Yeniden katarabelleğin inpH'si LAL tsanın aralığının dışındadır. PBS'de numunenin seyreltilmesi pH'ı kabul edilebilir aralıkta ayarlar. - 50 AB/mL üretmek için analiz sertifikası ile belirlenen endotoksiniçermeyen LAL su uygun hacimde kontrol endotoksin yeniden askıya. Endotoksinin tamamen yeniden uzaklaştırılmasını sağlamak için şişeyi 15 dakika boyunca şiddetle girdaplayın.
- 50 AB ile 0,005 EU/mL aralığında cam şişelerde 10 kat seri seyreltme önceden bildirerek endotoksin standart eğrisini oluşturun. Her seyreltme için, 0,9 mL LAL suya önceki seyreltmenin 0,1 mL'sini ekleyin. Girdap şiddetle 1 dakika kombinasyon sonra.
- 96 kuyulu bir plakaya yinelenen standart eğri seyreltmeleri ve SHB-SAPN örnekleri ekleyin. Yinelenen bir negatif kontrol olarak da LAL su kullanın. 15 dakika boyunca 37 °C'de plakayı önceden pişirin.
- Kuluçka süresinin sonuna doğru, 2,6 mL LAL su ile istinat reaktif ivisini yeniden askıya alın. İçeriği serolojik pipetle hafifçe karıştırın.
- 96 kuyulu plakanın her kuyusuna 100 μL'lik bir istinat reaktifi ekleyin. Plakayı hızlıca plaka okuyucuya taşıyın ve adım 8.2'de yazılan program şablonuna çalıştırın.
- Program tamamlandıktan sonra, denetimlerin günlük değerini ve başlangıç süresinin günlük değerini kullanarak standart bir eğri oluşturun. Örneklerdeki endotoksin konsantrasyonu hesaplamak için bu eğriden oluşturulan formülü kullanın.
Representative Results
Burada tam olarak birleştirilmiş SHB-SAPN, monomerin 60 kopyasını içeren bir parçacık halinde katlanması öngörülen protein dizileri (Şekil1A)üzerine inşa edilmiştir (Şekil 1B). Şekil 2, SHB-SAPN çekirdeğinin üretimi, saflaştırılması ve tanımlanması için yöntemin ana hatlarını sağlar. SHB-SAPN çekirdeğinin gen dizilimi olan bir gliserol stoğundan e. coli BL21 (DE3) E. coli indüklendi. Bakteri hücreleri başarılı bir şekilde büyütüldü ve denatüre ve azaltıcı koşullar altında lized edildi.
SHB-SAPN monomerlerinin Ni2+ kolon (Şekil3A)kullanılarak FPLC ile arındırMak için toplam hücre lisate kullanılmıştır. FPLC kromatografisi proteinin hem 150 mM hem de 500 mM imidazol (Şekil3A)olarak eluted olduğunu göstermektedir. Kromatogram da sırasıyla, isopropanol yıkama ve imidazol içermeyen yıkama karşılık gelen 185 mL ve 210 mL toplam hacmi diğer iki zirveleri gösterir. Rekombinant proteinin fraksiyonları ve saflığı gradyan SDS-PAGE jelleri ile tanımlanmıştir (Şekil3B). İlgi proteini öncelikle 68\u201279 (278\u2012300 mL toplam hacim) kesirlerinde yer aldı. Bu kesirler daha fazla analiz için birleştirildi. Antik-His antikor (N-terminal) ve 167-D-IV antikor (C-terminus) ile Batı leke biraraya kesirler gerçekten ilgi proteini olduğunu belirtti (Şekil4A,B). Bu lekeler aynı zamanda SHB-SAPN multimerlerinin varlığını da göstermiştir. Daha önceki yıkar ve elüsyon fraksiyonları çok merized protein daha yüksek bir konsantrasyon içeren eğilimindedir ve bu nedenle dışlandı.
İlgi protein monomerleri içeren örnekler diyaliz ile tam olarak monte edilmiş SHB-SAPN içine katlandı. Partikül boyutu dağılımı DLS ve nanopartikül izleme analizi (Şekil5A,B)ile belirlendi. DLS, Z ortalama hidrodinamik çapı 67 nm iken NTA sistemi ortalama 81 nm boyutu ölçülen parçacıkları tanımladı. Hafif boyut farklılıkları parçacık boyutlandırma teknikleri nedeniyle, ancak her iki analizden boyutu 20\u2012100 nm8,24,25beklenen aralığında idi . SHB-SAPN'ler TEM tarafından görselleştirildi ve iki parçacık boyutlandırma tekniğinden elde edilen boyut dağılımı ile iyi biçimlendirilmiş bireysel parçacıklar görüldü (Şekil5C).
Proteinin saflaştırılması sırasında, son SHB-SAPN ürünündeki LPS kontaminasyonunu azaltmak için kolon izopropanol ile yıkandı. Endotoksin düzeyinin bağışıklama için kabul edilebilir olup olmadığını doğrulamak için, shb-SAPN örneklerinde LPS konsantrasyonu isopropanol yıkama adımı ile veya olmadan saflaştırılmış bir kinetik LAL tözü ile belirlendi. Sonuçlar, isopropanol yıkamanın endotoksin düzeylerini >0.25 AB/μg'den 0.010 EU/μg'ye düşürttettiğini göstermiştir (Tablo1).
Şekil 1: SHB-SAPN protein dizisi ve yapısı. (A) SHB-SAPN monomeramino asit dizisi. (B) 60 protein monomerden oluşan tam birleştirilmiş SHB-SAPN çekirdeğinin yapısının bilgisayar modeli. Amino asit dizileri için renk düzeni: Gri = HisTag; Yeşil = pentamer; Koyu mavi = de novo tasarlanmış düzeltici; Açık mavi = altı sarlis demeti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akış şeması SHB-SAPN üretimi içinprotokol. Renk düzeni: Siyah = E. coliprotein monomer ifadesi ; Koyu gri = monomer arınma; Orta gri = monomer tanımlama; Açık gri = yeniden katlama ve karakterizasyon; White = tam olarak monte edilmiş SHB-SAPN ürünü. Koyu ve orta gri ile etiketlenmiş adımlarda, protein denatüre ve azaltıcı koşullar altındadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: SHB-SAPN monomerlerinin protein saflaştırılması. (A) FPLC arıtma kromatograf. Kromatogramın üzerindeki yeşil çizgi arınma adımlarını gösterir. Kromatogramdaki mavi çizgi, 280 nm dalga boyundakların optik yoğunluğunu temsil eder. Siyah çizgi, arınmanın her aşamasında kullanılan tampon B (8 M üre, 20 mM Tris, 50 mM sodyum fosfat monobasic, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazol, pH 8.5) yüzde sinin kullanıldığını gösterir. (B) Lysate (L), flow through (FT), first wash (W1), isopropanol yıkama (W2), üçüncü yıkama (W3) ve 150 mM imidazol (E150) ve 500 mM imidazol (E500) elüsi basamaklarından ayrı kesirlerden oluşan SDS-PAGE jelleri Arıtma. Birinci şeritteki (M) moleküler belirteçler 10 ile 250 kDa arasındaki bantları tanımlar. Hedef protein siyah bir ok ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Proteinin batı lekesi ile tanımlanması. Tüm şeritler 100 ng proteinle dolu. (A) Anti-6x HisTag ile batı leke sonuçları. (B) 167-D-IV HIV-1 monoklonal antikor ile batı leke sonuçları. Şeritler şöyle etiketlenir: M = molekül ağırlık belirteci; 1 = lysate; 2 = Akış yoluyla; 3 = ilk yıkama; 4 = isopropanol yıkama (ikinci yıkama); 5 = üçüncü yıkama; 6 = havuzlu hacim kesirleri 56\u201261 (ilk elution peak), 7 = havuzlu hacim hizipleri 62\u201267 (iki tepe arasında), 8 = havuza hacim kesirleri 68\u201278 (ikinci elution tepe). Monomerik SHB-SAPN bandı olarak beklenen bant boyutu 18.07 kDa olan hedef protein siyah bir ok ile gösterilir. 7 ve 8 şeritli ekstra bantlama, SHB-SAPN'nin (kırmızı ok) dimers' i ve çok merhemleridir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Katlanmış SHB-SAPN'nin karakterizasyonu. (A). DLS tarafından belirlenen parçacık boyutu dağılımı. (B) Parçacık boyutu nanopartikül izleme (sistem) tarafından belirlenir. (C) SHB-SAPN partiküllerinin TEM tarafından görüntülenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnek | Endotoksin (AB/mL) | Endotoksin (AB/protein) |
| Isopropanol Yıkama ile SAPN | 2.02 | 0.01 |
| İzopropanol Yıkama olmadan SAPN | >50 | >0,25 |
| Negatif Kontrol | Algılama seviyesinin altında | Yok |
Tablo 1: Katlanmış SHB-SAPN'lerin endotoksin düzeyleri. İzopropanol yıkama lı veya onsuz saflaştırılan SHB-SAPN örneklerinde endotoksin düzeyleri hem endotoksin üniteleri/mL hem de SHB-SAPN proteininin endotoksin üniteleri/μg'si olarak sunulmuştur.
Discussion
Nanoteknoloji, alt ünite aşısı gelişimi için birçok avantaj ve çözüm sağlar. Nanoaşılar art arda immünjenite artan konak bağışıklık sistemine partiküller olarak antijenler sunabilir26. Nanoaşılar birçok farklı türleri olmakla birlikte, biz de novo tasarlanmış protein oluşan olanlar aşıgelişimi1 için güçlü bir yaklaşım gibi görünüyor inanıyoruz. Onlar ev sahibi proteinler için herhangi bir dizi homoloji olmadan tasarlanmış olabilir ve düşük üretim maliyeti ve yüksek ürün verimleri sağlarken yerli gibi konformasyon yakın ilgi antijeni mevcut. Bu yaklaşımın en önemli örneklerinden biri, birden fazla bulaşıcı hastalığakarşı aşılara uyguladığımız SAPN teknolojisidir 7. HIV-1 aşı gelişimindeki güçlükleri ele almakiçin, V1V2 antijenini yerli benzeri trimerik konformasyon 9'da etkilibir şekilde sunmak için benzersiz bir SHB-SAPN çekirdeği tasarladık. Birçok aşı hedefleri, özellikle viral hastalıklar için, trimers27olarak mevcuttur. Bu fenomen, SAPN tasarımımızın alt birim aşılarının geliştirilmesi nde geniş etkileri olduğunu göstermektedir.
Bu yöntemde, E. coli ifade sisteminde SHB-SAPN'lerin nasıl üretilebildiğini gösteriyoruz. Biz protein yüksek verim (kültür yaklaşık 6 mg/100 mL) ifade etti. Protein 10 histidin içeriyordu ve Ni2+ sütunlu immobilize metal afinite kromatografisi kullanılarak kolayca saflaştırılmıştı. His-Tag bu uzunluğu en yüksek protein verimi için en uygun olduğu bulunmuştur. Saflaştırılmış protein, hem N-terminal HisTag hem de C terminali heptad tekrarının varlığıyla belirtildiği gibi tasarlanmış proteinin tam uzunlukta içeriyordu. Yaygın olarak kabul edilen tekniklerden yararlandık ve Bunları SHB-SAPN çekirdeğinin ifade, üretim ve karakterizasyonu için optimize ettik. Yeni bir protein epitopu içeren bir SAPN gelişimi sırasında tam uzunlukta protein üretimi eksikliği konak hücrede genin bir ekspresyon sorunu gösterebilir. Bu durumda, gen ve ifade sistemi yeniden tasarlanmalı ve açıklanan protokole uyarlanmalıdır. Sonication zaman veya yoğunluk modifikasyonu da öngörülen tam uzunlukta protein konsantrasyonu artırabilir.
Katlanmış parçacıklar dls ve nanopartikül izleme analizi tarafındanbelirlenen beklenen boyut aralığında (20 ila 100 nm) 8,24,25 idi. Bu sonuçlar TEM kullanılarak da teyit edilerek doğrulandı. Bu adımda sorunlar varsa, normalde yeniden katlanır arabelleğin pH veya iyonik gücü ile ilgili bir sorun nedeniyle. Parçacık boyutlandırma tekniklerinde büyük boyutlu parçacıklar tespit edildiğinde, yeniden katlanan arabelleğin pH'ını artırarak önlenebilecek bir toplamayı gösterir. Parçacıklar DLS tarafından tespit edilmezse, protein konsantrasyonu doğrulamak ve tampon pH kontrol edin. DLS için son protein konsantrasyonu en az 100 μg/mL olmalıdır. Konsantrasyon sorun değilse, pH azaltarak konsantrasyonu azaltılabilir küçük, eksik oluşan parçacıkların bolluğunu gösterir. Alternatif olarak, sodyum klorür konsantrasyonu istenmeyen boyutu ile parçacıkların varlığını en aza indirmek için optimum aralığına ayarlanabilir.
Son olarak, arınma sırasında bir izopropanol yıkama adımı kullanarak, enjektabl ürünler için 5 AB/kg vücut ağırlığı sınırının altında olan ev sahibi E. coli'den 0,01 AB/μg SAPN'e kadar kontamine LPS'yi azaltmayı başardık. 28. Bu düzey, Q sütunu olarak da bilinen bir aniyon değişim sütunu kullanılarak daha da azaltılabilir. Yüksek düzeyde endotoksin hala mevcutsa, tampon hazırlama için kullanılan tüm malzemeleri kontrol edin. Bu yöntemde sadece depyrogenated cam ve endotoksin ücretsiz plastik kullanmayı unutmayın.
Bu sonuçlar, klinik öncesi bağışıklama çalışmaları için kullanılabilecek SHB-SAPN çekirdeğini üretmek için başarılı bir yöntem geliştirdiğimizi göstermektedir. Sadece küçük değişiklikler ile bu yöntem, varsa, ilgi bir antijen eklendiğinde SHB-SAPNs saflaştırma uygulanabilir. Başlangıç noktası olarak bu yöntemi kullanarak önemli değişikliklerden biri elüsyon adımındadır. Farklı proteinler deneysel olarak belirlenmelidir farklı imidazol konsantrasyonlarında elute. Diğer önemli fark, yeniden katarabelleğin bileşimi olabilir. Optimizasyon farklı pH koşullarının yanı sıra iyonik güçlü yönlerini test gerektirir.
Gelecekteki çalışmalar göz önüne alındığında, SHB-SAPN'nin insan tarafından uygulanmasına izin vermek için yalnızca iki küçük değişiklik gereklidir. Birincisi, ekspresyon vektörü insanlarda ampisilin alerjisi nedeniyle bir kanamisin direnci seçilebilir marker değiştirilmesi gerekiyor29. İnsan kullanımı için protein üretiminin bir diğer önemli gereksinimi hayvansal ürün içermeyen ortamda SHB-SAPN üretmektir. Küçük ölçekli bir çalışma zaten bir bitki tabanlı medya protein makul bir verim gösterdi. Burada sunulan çalışma kolayca bir sıtma aşısı adayı, FMP01416ile gösterildiği gibi nihai GMP üretimi için ölçeklenebilir. Bu büyük ölçekli FMP014-SAPN üretimi, son üründeki LPS ve Ni2+ içeriğini daha da azaltmak için hem anyon değişimini hem de katyon değişim adımlarını içeriyordu. Bu bakteriyel ifade SAPN zaten yaklaşan bir Faz 1/2a klinik çalışma için ölçeklendirildi.
Disclosures
İfade edilen görüşler yazarların görüşleridir ve ABD Ordusu veya Savunma Bakanlığı'nın konumlarını temsil edecek şekilde yorumlanmamalıdır. Peter Burkhard Alpha-O Peptidler AG adlı şirket bir ilgi ve teknoloji patentleri vardır. Diğer yazarların bu yazıda sunulan konuyla ilgili mali çıkarları olan herhangi bir şirketle herhangi bir ilişkisi veya mali ilişkisi yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Henry M Jackson Askeri Tıbbın İlerlemesi Vakfı, Inc. ve ABD Savunma Bakanlığı arasında yapılan bir işbirliği anlaşması (W81XWH-11-2-0174) tarafından desteklenmiştir. Anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV antikor NIH AIDS Reaktif Programı ile Dr Susan Zolla-Pazner alındı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris/Glycine/SDS | BioRad | 1610732 | 1 L |
| 2-Mercaptoethanol | BioRad | 1610710 | 25 mL |
| 2-propanol | Fisher | BP26181 | 4 L |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610737 | 30 mL |
| 40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers | Malvern Panalytical | ZEN0040 | 100 pack |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | BioRad | 4561093 | 10 pack |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | 25 g |
| Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] | AbCam | ab18184 | 100 mg |
| Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) | AIDS Reagent Repository | 11681 | 100 mg |
| BCIP/NBT Substrate, Solution | Southern Biotech | 0302-01 | 100 mL |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-108 | A variety of sizes |
| Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm | Ted Pella, Inc | 01754-F | 25 pack |
| GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns | GE HealthCare | 45-000-325 | 5 pack |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | 4 L |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) | ABCam | ab97020 | 1 mg |
| Imidazole | Fisher | O3196-500 | 500 g |
| Instant NonFat Dry Milk | Quality Biological | A614-1003 | 10 pack |
| Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay | Lonza Walkersville | 50650U | 192 Test Kit |
| LAL Reagent Grade Multi-well Plates | Lonza Walkersville | 25-340 | 1 plate |
| Magic Media E. coli Expression Medium | ThermoFisher | K6803 | 1 L |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters | Millipore | SLGV033RB | 250 pack |
| Mouse Anti-Human IgG Fc-AP | Southern Biotech | 9040-04 | 1.0 mL |
| One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli | ThermoFisher | C601003 | 20 vials |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, | BioRad | 1610363 | 1 mL |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL | ThermoFisher | 66810 | 8 pack |
| Sodium Chloride | Fisher | BP358-212 | 2.5 kg |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | BP329-500 | 500 g |
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | 1 kg |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Biosynth International | C-1818 | 100 g |
| Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S | Electron Micoscopy Services | 541-09-3 | 25 g |
| Urea | Fisher | BP169-500 | 2.5 kg |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma Aldrich | WHA10010155 | pack of 500 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| ChromLab Software ver 4 | BioRad | 12009390 | Software |
| Epoch 2 Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2 | Plate Reader |
| Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor | ThermoFisher | 096-145075 | Rotor |
| Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Gel Imager for Stain free Gels |
| JEOL TEM | JEOL | 1400 | Transmission Electron Microscope |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BioRad | 1658004 | To run gels |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | For Protein Concentration |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| NanoSight NTA software NTA | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| New Brunswick Innova 44/44R | Eppendorf | M1282-0000 | Incubator/Shaker |
| NGC Quest 10 Chromatography System | BioRad | 7880001 | FPLC to aid in protein purification |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella, INC | 91000S | To clean grids |
| PowerPac Universal Power Supply | BioRad | 1645070 | To run gels |
| Rocker Shaker | Daigger | EF5536A | For Western |
| Sonifer 450 | Branson | also known as 096-145075 | Sonicator |
| Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher | 75-006-580 | Centrifuge |
| Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs | BioRad | 1704158 | For Western |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 | For Western |
| Vortex-Genie 2 | Daigger | EF3030A | Vortex |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| Zetasizer Software | Malvern Panalytical | Particle Sizing |
References
- Karch, C. P., Burkhard, P. Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies. Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).
- Snapper, C. M. Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens. Frontiers in Immunology. 9, 598 (2018).
- Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines. Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).
- Yeates, T. O. Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials. Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).
- Marcandalli, J., et al. Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus. Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).
- Ross, J. F., et al. Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins. ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).
- Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development. Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).
- Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles). Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).
- Karch, C. P., et al. Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen. Nanomedicine. , (2018).
- Karch, C. P., et al. The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62 (2017).
- Li, J., et al. A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus. PLoS One. 13 (9), e0203771 (2018).
- Wahome, N., et al. Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine. Chemical Biology & Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).
- El Bissati, K., et al. Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice. Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).
- Kaba, S. A., et al. A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria. Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).
- Kaba, S. A., et al. Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine. PLoS One. 7 (10), e48304 (2012).
- Seth, L., et al. Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants. Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).
- Kaba, S. A., et al. Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine. Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).
- El Bissati, K., et al. Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma. NPJ Vaccines. 2, 24 (2017).
- Karch, C. P., et al. Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge. Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).
- Haynes, B. F., et al. Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial. New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).
- O' Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development. Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).
- Babapoor, S., et al. A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection. Influenza Research and Treatment. 2011, 126794 (2011).
- Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design. Royal Society Open Science. 4 (4), 161092 (2017).
- Indelicato, G., et al. Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles. Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).
- Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. Nanoscale assemblies and their biomedical applications. Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740 (2013).
- Rey, F. A., Lok, S. M. Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines. Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).
- Bacterial Endotoxins. United States Pharmacopeia (USP). , Ch. 85 (2011).
- Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals. , Food and Drug Adminstration. Maryland. Available from: https://www.fda.gov/media/76255/download (1993).
