Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

إنتاج E.القولونية - أعرب الذاتي تجميع البروتين الجسيمات النانوية لللقاحات التي تتطلب عرض الإبإبيلة الانتهازية

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60103
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 1,2
1U.S. Military HIV Research Program, Walter Reed Army Institute of Research, 2Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, 3Alpha-O Peptides AG

Summary

وترد هنا طريقة مفصلة تصف تنقية الجسيمات النانوية البروتينية ذاتية التجميع (SAPNs) وإعادة طيها وتوصيفها لاستخدامها في تطوير اللقاحات.

Abstract

تعمل جسيمات البروتين النانوية ذاتية التجميع (SAPNs) كشاشات مستضد متكررة ويمكن استخدامها لتطوير مجموعة واسعة من اللقاحات لمختلف الأمراض المعدية. في هذه المقالة نقوم بتوضيح طريقة لإنتاج نواة SAPN تحتوي على تجميع حزمة سداسية الحلزون (SHB) قادرة على تقديم مستضدات في مطابقة تريفيريك. نحن نصف التعبير عن SHB-SAPN في نظام القولونية E. ، فضلا عن خطوات تنقية البروتين اللازمة. أدرجنا خطوة غسل إيزوبروبانول للحد من الليبوبوليساكاريد البكتيري المتبقية. وكمؤشر على هوية البروتين ونقاءه، تفاعل البروتين مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المعروفة في تحليلات اللطخة الغربية. وبعد إعادة الطي، انخفض حجم الجسيمات في النطاق المتوقع (20 إلى 100 نانومتر)، وهو ما تأكد من خلال تشتت الضوء الديناميكي، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية، والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. ومع ذلك، فإن المنهجية الموصوفة هنا هي الأمثل بالنسبة لـ SHB-SAPN، مع إدخال تعديلات طفيفة فقط عليها. كما يمكن نقل هذه الطريقة بسهولة إلى الإنتاج على نطاق واسع لتصنيع GMP لللقاحات البشرية.

Introduction

وفي حين أن تطوير اللقاحات التقليدية قد ركز على مسببات الأمراض المعطلة أو المخففة، فقد تحول تركيز اللقاحات الحديثة نحو لقاحات الوحدات الفرعية1. ويمكن أن يؤدي هذا النهج إلى استجابة أكثر استهدافاً، وربما إلى مرشحين أكثر فعالية للقاحات. ومع ذلك، فإن أحد العيوب الرئيسية هو أن لقاحات الوحدات الفرعية ليست جسيمات مثل الكائنات الحية الكاملة التي يمكن أن تؤدي إلى انخفاض المناعة2. يمكن أن يكون للجسيمات النانوية كنظام عرض مستضد متكرر فوائد كل من نهج لقاحالوحدة الفرعية المستهدفة وكذلك الطبيعة الجسيمية للكائن الحي بأكمله 1،3.

من بين الأنواع الموجودة من اللقاحات النانوية، تسمح مجموعات البروتين المصممة بشكل رشيد بتصميم وتطوير المرشحين للقاحات التي يمكن أن تقدم نسخ متعددة من المستضد المحتمل في مطابقة مثل السكان الأصليين1،4 ،5،6. ومن الأمثلة على هذه التجمعات البروتينية الجسيمات النانوية البروتينية ذاتية التجميع (SAPNs)7. وتستند SAPNs على المجالات لفائف لفائف ويتم التعبير عنها تقليديا في الإشريكية القولونية8. تم تطوير المرشحين للقاح SAPN لمجموعة متنوعة من الأمراض مثل الملاريا والسارس والأنفلونزا وداء المقوسات وفيروس نقص المناعة البشرية-19و10و11و12و13 , 14 سنة , 15 , 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19-وتصميم كل مرشح من مرشحي شبكة سابن خاص بمسببات الأمراض ذات الأهمية، غير أن تقنيات الإنتاج والتنقية وإعادة الطي قابلة للتطبيق عموماً على نطاق واسع.

وأحد مصالحنا الحالية هو لقاح فعال لفيروس نقص المناعة البشرية-1. في RV144 - المرحلة الثالثة الوحيدة من التجارب السريرية للقاح فيروس نقص المناعة البشرية-1 التي أظهرت فعالية متواضعة - كان يرتبط انخفاض خطر العدوى مع الأجسام المضادة IgG إلى حلقة V1V2 من البروتين المغلف20،21. ويعتقد أن العرض الذي يشبه العرض التريمريك الأصلي لهذه المنطقة مهم للمناعة الوقائية22. لتقديم حلقة V1V2 في أقرب ما يمكن إلى المطابقة مثل السكان الأصليين، وضعنا دليلا على مبدأ SAPN مرشح لقاح التي تحتوي على فيروس نقص المناعة البشرية-1 مغلف ما بعد الانصهار حزمة ستة الحلزون (SHB) لتقديم حلقة V1V2 في المطابقة الصحيحة9 . تم التعرف على هذا المرشح من قبل الأجسام المضادة أحادية النسيلة المعروفة لبروتين المغلف HIV-1. الفئران المحصنة مع V1V2-SHB-SAPN أثار V1V2 الأجسام المضادة المحددة، وهذا الأهم من ذلك، ملزمة لgp70 V1V2، epitopes المطابقة الصحيح9. ويمكن أن يكون لجوهر SHB-SAPN وظائف أخرى تتجاوز الدور كناقل لحلقة فيروس نقص المناعة البشرية-1 V1V2. هنا نقوم بوصف منهجية مفصلة للتعبير، وتنقية، وإعادة طي، والتحقق من صحة الأساسية SHB-SAPN. وقد تم وصف اختيار تسلسل، وتصميم الجسيمات النانوية، والاستنساخ الجزيئي، وتحويل E. القولونية سابقا9.

Protocol

1. التعبير عن بروتين SHB-SAPN في E. القولونية BL21 (DE3)

  1. مزيج 95 مل من المكون A و 5 مل من المكون B من وسائل الإعلام في 2 L قارورة Erlenmeyer الزجاج المعقم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). إضافة أمبيسيلين إلى تركيز نهائي من 100 ميكروغرام / مل.
  2. تلقيح وسائل الإعلام مع E. القولونية من ثقافة الأسهم الجلسرين التي أنشئت سابقا. احتضان الثقافة في 30 درجة مئوية مع هز في 200 تناوب في الدقيقة الواحدة (دورة في الدقيقة) لمدة 48 ساعة.
    ملاحظة: يحتوي المخزون المستخدم E. coli BL21 (DE3) على متجه التعبير المقاوم للأمبيسيلين23 مع جين SHB-SAPN. على الرغم من أن البروتوكول العام لوسائل الإعلام يوصي 24 ساعة من الحضانة في 37 درجة مئوية، 48 ساعة من الحضانة في 30 درجة مئوية أعطى إنتاجية أعلى لSHB-SAPN.
  3. نقل الثقافة إلى اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل. طرد مركزي الأنابيب في 4000 × ز لمدة 10 دقيقة مع الدوار زاوية ثابتة في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant وحفظ بيليه لحصاد الخلايا.
    ملاحظة: يمكن معالجة بيليه الخلية إما على الفور أو تجميدها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. تحلل E. القولونية BL21 (DE3) عن طريق سونيكيشن

ملاحظة: استخدام الأواني البلاستيكية غير البيروجينية والأواني الزجاجية المخبوزة في 250 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. TCEP ضروري في المخازن المؤقتة أثناء هذا البروتوكول إذا كان المستضد المعروض يحتوي على سندات S.S. بالنسبة لجوهر SHB-SAPN فقط، ليس وجود TCEP في المخازن المؤقتة أمرًا أساسيًا.

  1. إعداد imidazole خالية العازلة (8 M اليوريا، 50 MM فوسفات الصوديوم أحادية القاعدة، 20 mM تريس قاعدة، 5 MM TCEP) درجة الحموضة 8.0 (تعديلها مع 5 N هيدروكسيد) وتصفيته باستخدام 0.22 ميكرومتر فراغ زجاجة وحدة الترشيح.
  2. إعادة تعليق الخلايا الكريات (من الخطوة 1.3) مع 40 مل من العازلة خالية من imidazole في أنبوب مخروطي 50 مل. Sonicate الخلايا التي تم تعليقها مع مسبار على الجليد لمدة 5 دقائق (4 ق من سونيكيشن، 6 ق من بقية) مع إخراج سونيكيشن من 150 W.
  3. طرد مركزي للليسات الخلوية (40 مل) في 29،000 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة في الدوار زاوية ثابتة لتوليد supernatant أوضح. نقل supernatant إلى قارورة معقمة 150 مل وتجاهل بيليه. تمييع supernatant إلى 100 مل باستخدام المخزن المؤقت خالية من imidazole (في وقت لاحق في البروتوكول المشار إليه باسم "عينة").
    ملاحظة: هذه الخطوة تخفيف مطلوبة لمنع ضغط النظام FPLC من أن تصبح عالية جداً أثناء تحميل lysate على العمود.

3. تنقية البروتين باستخدام عموده

ملاحظة: تم تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام أداة FPLC، ولكن يمكن تكييفه مع تدفق الجاذبية.

  1. إعداد المخازن المؤقتة التالية وتصفيتها باستخدام 0.22 ميكرومتر فراغ زجاجة وحدة الترشيح: '1' خالية من imidazole العازلة "العازلة A" (8 M اليوريا، 50 MM فوسفات الصوديوم أحادي ة، 20 mM تريس قاعدة، 5 MM TCEP) درجة الحموضة 8.0؛ '2' 500 مليون متر من الإيميدازول العازلة "Buffer B" (8 M اليوريا، 50 مليون متر من فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة، قاعدة تريس 20 م، 5 مليون متر مربع، 500 مليون متر مربع) درجة الحموضة 8.0؛ و (3) غسل إيزوبروبانول (20 MM تريس، 60٪ إيزوبروبانول) درجة الحموضة 8.0.
    ملاحظة: تم ضبط pH لكل المخزن المؤقت مع 5 N هيدروكسيد الصوديوم.
  2. معادلة عموده.
    ملاحظة: لإنتاج مقياس المعمل يستخدم هذا البروتوكول 5 مل prepacked عموده ولكن يمكن استخدام أي عمود أكبر حجم.
    1. افتح برنامج FPLC وانقر على الخيار أسلوب جديد. سيتم فتحه على الفور إلى قائمة إعدادات الأسلوب. ضمن القائمة المنسدلة لموضع العمود اختر منفذ C1 3.
    2. في القائمة المنسدلة المعروضة بواسطة تقنية اختر التقارب. في القائمة المنسدلة نوع العمود اختيار الآخرين، Histrap HP، 5 مل. سيتم تعيين حجم العمود ومربعات الضغط تلقائيًا إلى القيم المناسبة.
    3. انقر فوق الزر مخطط تفصيلي للأسلوب. اسحب الأزرار التالية من القائمة المنبثقة لمكتبة المرحلة: التوازن، ونموذجالتطبيق، وغسلالعمود، وelution بجوار السهم بهذا الترتيب الدقيق. أغلق قائمة مكتبة المرحلة.
    4. انقر على زر التكافؤ. يجب أن تكون القيم المسرودة في الجدول "المخزن المؤقت الأولي B" (4٪) ، "المخزن المؤقت النهائي B" (4٪ ) و "وحدة التخزين (CV)" 5.
    5. انقر فوق المربع نموذج التطبيق. في مربع تحميل عينة انقر فوق زر الاختيار لحقن عينة على العمود مع مضخة عينة. تأكد من فحص المربع الموجود بجوار معدل تدفق الاستخدام من إعدادات الأسلوب في حقن العينة مع مربع مضخة النظام. بجوار مربع وحدة التخزين على الجانب الأيمن من الشاشة تغيير القيمة إلى 20 مل.
    6. انقر على زر غسل العمود. يجب أن تكون القيم المسرودة في الجدول "المخزن المؤقت الأولي B" (4٪) ، "المخزن المؤقت النهائي B" (4٪ ) و "وحدة التخزين (CV)" 5. بجوار نظام مجموعة الكسور قم بإلغاء النقر فوق المربع تمكين.
    7. انقر على زر elution. يجب أن تكون القيم المسرودة في الجدول "المخزن المؤقت الأولي B" 0%، "المخزن المؤقت النهائي B" 100%، و "وحدة التخزين (CV)" 5. بجوار نظام مجموعة الكسور انقر فوق المربع تمكين. قم بإلغاء النقر فوق استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب وضبط حجم الكسر إلى 4 مل في مربع التعبئة أدناه.
    8. انقر فوق الزر حفظ كزر في الجزء العلوي من البرنامج. اسم الملف "التوازن".
    9. قم بتوصيل عموده المعبأة مسبقاً بـ 5 مل بمنفذ العمود المطابق 3 على FPLC. وينبغي وضع كل من مضخة A ومضخة B الأنابيب وكذلك أنبوب مضخة عينة في 0.22 ميكرومتر المياه منزوعة الأيونات. قم بتشغيل برنامج المعادلات.
    10. ضع كل من المضخة A ومضخة B وكذلك أنبوب مضخة العينة في المخزن المؤقت الخالي من imidazole (المخزن المؤقت A) وتشغيل بروتوكول المعادلات مرة أخرى.
  3. ربط العينة إلى العمود وتنقية البروتين.
    1. افتح برنامج FPLC وانقر على الخيار أسلوب جديد. سيتم فتحه على الفور إلى قائمة إعدادات الأسلوب. ضمن القائمة المنسدلة لموضع العمود اختر منفذ C1 3. في القائمة المنسدلة المعروضة بواسطة تقنية اختر التقارب. في القائمة المنسدلة نوع العمود اختيار الآخرين، Histrap HP، 5 مل. سيتم تعيين حجم العمود ومربعات الضغط تلقائيًا إلى القيم المناسبة.
    2. انقر فوق الزر مخطط تفصيلي للأسلوب. اسحب الأزرار من القائمة المنبثقة لمكتبة المرحلة: التوازن، تطبيق العينة، غسل العمود (غسل 1)، غسل العمود (غسل 2)، غسل العمود (غسل 3)، وElution بجوار السهم في ذلك النظام الدقيق. أغلق قائمة مكتبة المرحلة.
    3. انقر على زر معادلة. يجب أن تكون القيم المسرودة في الجدول "المخزن المؤقت الأولي B" 4%، "المخزن المؤقت النهائي B" 4%، و "وحدة التخزين (CV)" 5.
    4. انقر فوق المربع نموذج التطبيق. في مربع تحميل عينة انقر فوق زر الراديو لinject عينة على العمود مع مضخة عينة. تأكد من فحص المربع الموجود بجوار معدل تدفق الاستخدام من إعدادات الأسلوب في حقن العينة مع مربع مضخة النظام.
    5. بجوار مربع وحدة التخزين على الجانب الأيمن من الشاشة تغيير القيمة إلى 100 مل. بجوار نظام مجموعة الكسور انقر فوق الزر تمكين. قم بإلغاء النقر فوق المربع استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب ثم قم بتغيير حجم الكسر إلى 4 مل.
    6. انقر على زر غسل العمود الأول (غسل 1). يجب أن تكون القيم المسرودة في الجدول "المخزن المؤقت الأولي B" 4%، "المخزن المؤقت النهائي B" 4%، و "وحدة التخزين (CV)" 10. بجوار نظام مجموعة الكسور انقر فوق المربع تمكين. قم بإلغاء النقر فوق استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب ثم قم بتغيير حجم الكسر إلى 4 مل.
    7. انقر على زر غسل العمود الثاني (غسل 2). يجب أن تكون القيم المسرودة في الجدول "المخزن المؤقت الأولي B" 0%، "المخزن المؤقت النهائي B" 0%، و "وحدة التخزين (CV)" 5. بجوار نظام مجموعة الكسور انقر فوق المربع تمكين. قم بإلغاء النقر فوق استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب ثم قم بتغيير حجم الكسر إلى 4 مل.
    8. انقر على زر غسل العمود الثالث (غسل 3). يجب أن تكون القيم المسرودة في الجدول "المخزن المؤقت الأولي B" 0%، "المخزن المؤقت النهائي B" 0%، و "وحدة التخزين (CV)" 5. بجوار نظام مجموعة الكسور انقر فوق تمكين. قم بإلغاء النقر فوق المربع استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب ثم قم بتغيير حجم الكسر إلى 4 مل.
    9. انقر على زر Elution. في الجدول انقر بزر الماوس الأيمن فوق المعلومات المسرودة، وفي القائمة التي تظهر، انقر فوق حذف الخطوة. اسحب زر التدرج النظائري إلى الجدول مرتين، بحيث يكون هناك إدخالان.
    10. يجب أن تقرأ قيمة الإدخال الأول "المخزن المؤقت الأولي B" 30%، "المخزن المؤقت النهائي B" 30%، و "وحدة التخزين (CV)" 10. يجب أن تقرأ قيمة الإدخال الثاني "المخزن المؤقت الأولي B" 100%، "المخزن المؤقت النهائي B" 100%، و "وحدة التخزين (CV)" 10. بجوار نظام مجموعة الكسور انقر فوق الزر تمكين. انقر فوق المربع الموجود بجوار استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب.
    11. انقر فوق الزر حفظ باسم في الجزء العلوي من البرنامج. اسم ملف "تنقية". مضخة وأنابيب FPLC ينبغي أن توضع في العازلة غسل خالية من imidazole في حين ينبغي وضع مضخة B الأنابيب في المخزن المؤقت imidazole 500 mM. وينبغي وضع أنبوب مضخة عينة في عينة 100 مل.
    12. تشغيل برنامج "تنقية" والانتظار للوقت عندما تكون هناك حاجة إلى isopropanol 60٪ (غسل 2). وقفة البرنامج، ونقل مضخة A الأنابيب من غسل خالية من إيميدازول في غسل isopropanol 60٪. أعد تشغيل البرنامج.
    13. بمجرد الانتهاء من خطوة isopropanol، وقفة البرنامج مرة أخرى ونقل مضخة A الأنابيب مرة أخرى إلى المخزن المؤقت غسل خالية من imidazole. إعادة تشغيل برنامج التنقية (بقية التشغيل مؤتمتة).

4- تقييم النقاء وتحديد البروتين بواسطة SDS-PAGE

  1. الجمع بين جميع الكسور المقابلة ل '1) تدفق من خلال (الخلية lysate التي لم تربط عموده)، '2' غسل 1، '3' غسل 3 (60٪ غسل isopropanol)، و (4) غسل 3 في أنابيب مخروطية منفصلة 50 مل. لا تجمع بين الكسور 2 مل من خطوات elution.
  2. مزيج 15 درجة مئوية من كل من الكسور المجمعة وجميع الكسور من خطوات elution مع 2X Laemmli عينة العازلة في أنبوب الطرد المركزي الصغير 0.5 مل وتشوه لهم في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. في حين أن البروتين تشوه، وإعداد جهاز تشغيل هلام مع 3 خالية من البقع 4-20٪ من المواد الهلامية الجاهزة polyacrylamide في 1X تريس-غليسين SDS-PAGE تشغيل العازلة.
  4. تحميل 8 ميكرولتر من علامة الوزن الجزيئي إلى البئر الأول و 30 ميكرولتر من عينة مشوهة إلى الآبار الأخرى من هلام. تشغيل المواد الهلامية في 200 V حتى الجبهة صبغ يضرب الجزء السفلي من هلام (حوالي 30 دقيقة). إزالة المواد الهلامية من الجهاز وشطف لفترة وجيزة مع الماء منزوع الأيونات. صورة الجل على الفور باستخدام نظام التصوير خالية من البقع.
  5. حدد الكسور التي تحتوي على نطاقات البروتين بالحجم الصحيح (18.07 كيلوداً). تجمع كل هذه الكسور.

5. تحديد البروتين من قبل وصمة عار الغربية

  1. قم بتشغيل لطخة غربية باستخدام جسم مضاد خاص به (مضاد 6x HisTag) وجسم مضاد خاص بـ SHB (167-D-IV) لتحديد هوية البروتين النقي الكامل الطول. المضادة-6X HisTag المضادة تعترف النمل الأقصى للبروتين والجسم المضاد 167-D-IV يعترف المدى C مما يدل على وجود البروتين كامل الطول.
  2. تحديد تركيز البروتين من (ط) تدفق من خلال، '2) غسل 1، '3' غسل 2 (60٪ isopropanol غسل)، '4) غسل 3، وجميع الكسور من خطوات الإلوتيون مع أداة مطياف في امتصاص 280 نانومتر. توليد التخفيفات التي تحتوي على 100 نانوغرام من البروتين في 15 ميكرولتر من العازلة خالية من إيميدازول لكل من هذه المجموعات.
  3. إضافة 15 μL من 2X Laemmli عينة المخزن المؤقت لكل 15 μL من العينات وتشوه لهم كما هو الحال في الخطوة 4.1. بمجرد الانتهاء من denaturing تدور أسفل الأنابيب لضمان جميع البروتين يمكن نقلها.
  4. تحميل العينات وعلامة ما قبل ملطخة في 4-20٪ هلام polyacrylamide مسبقة الصب خالية من البقع. تشغيل الكهربائي في 200 V حتى الجبهة صبغ يصل إلى الجزء السفلي من هلام.
  5. في حين أن هلام يعمل، وجعل 1 لتر من TBS-T (20 MM تريس، 150 مل NaCl، و 0.1٪ توين 20) و 200 مل من 5٪ الحليب غير الدسم في TBS-T.
  6. استخدام نظام نقل وصمة عار الغربية لنقل البروتين على غشاء النيتروسيلولوز. استخدام كومة نقل تجميعها مسبقا ووضع هلام على ذلك. إعداد النظام لتشغيل في 25 V لمدة 7 دقائق.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة على شاكر المدارية تعيين في 100 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  7. بمجرد الانتهاء من النقل، يغسل البقع مرتين مع TBS-T لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  8. سد أغشية النيتروسيلولوز (وصمة عار) مع 5٪ الحليب غير الدهون في TBS-T لمدة 1 ساعة على الأقل.
  9. تخفيف الأولية 167-D-IV والأجسام المضادة لمكافحة الهستاغ 6X إلى 1 ملغ / مل في TBS-T (الأسهم Ab). تخفيف الأسهم عبس من 167-D-IV 10,000 أضعاف والمضادة-6x HisTag 5,000 أضعاف عن طريق إضافة 2 € L من المخزون 167-D-IV و 4 € L من المخزون المضادة -6X الهيست الأجسام المضادة إلى اثنين من أنابيب مختلفة تحتوي على 20 مل من TBS-T. إضافة إجمالي حجم 20 مل من الأجسام المضادة الأولية، واحد إلى كل وصمة عار، والبقع الحضانة لمدة 1 ح. غسل البقع مرتين مع TBS-T لمدة 10 دقائق.
  10. تمييع 4 ميكرولتر من 1 ملغ / مل من الأجسام المضادة للماوس المضادة للإنسان الثانوية المترافقة مع الفوسفاتيز القلوية في 20 مل من TBS-T (1:5,000 تخفيف). تمييع 4 ميكرولتر من 1 ملغ / مل من الماعز المضادة للماوس الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع الفوسفاتيز القلوية في 20 مل من TBS-T (1:5,000 تخفيف). إضافة الأجسام المضادة الثانوية إلى البقع المقابلة.
    ملاحظة: يرتبط الأجسام المضادة الثانوية المضادة للإنسان إلى 167-D ويربط المضادة للماوس إلى HisTag المضادة 6x. غسل البقع مرتين مع TBS-T لمدة 10 دقائق.
  11. إضافة ما يكفي من BCIP / NBT الركيزة الفوسفاتيز القلوية لتغطية البقع. تطوير البقع لمدة 10 دقائق حتى تظهر العصابات. شطف البقع مع مياه الصنبور الباردة والسماح لها تجف قبل المسح الضوئي مع الماسح الضوئي مسطحة.

6. إعادة طي SHB-SAPN

  1. إضافة البروتين المجمع (10\u201220 مل المجموع) إلى 10 كيلودا الوزن الجزيئي قطع كاسيت غسيل الكلى وdialyze في 8 M اليوريا، 20 MM Tris، 5٪ الجلسرين، 5 مليون متر TCEP درجة الحموضة 8.5 في RT (18\u201226 °C) بين عشية وضحاها.
  2. ببطء dialyze اليوريا قبالة العينة عن طريق تقليل تركيز اليوريا في العازلة غسيل الكلى تدريجيا من 2 M كل 2 ساعة. في تركيز اليوريا من 2 M، نقل جهاز غسيل الكلى إلى 4 درجة مئوية (لا تستخدم TCEP في المخزن المؤقت غسيل الكلى من هذه الخطوة). الانتهاء من إعادة طي عن طريق dialyzing العينة في اليوريا 120 mM، 20 MM تريس، 5٪ الجلسرين، درجة الحموضة 8.5 في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. قم بإزالة البروتين المعاد طيه (SHB-SAPN) من كاسيت غسيل الكلى. قم بتصفية SHB-SAPN باستخدام م 0.22 م فلوريد بولي فينيل يدين (PVDF) محاقن filer. Aliquot SHB-SAPN في أنابيب معقمة وتجميدها عند -80 درجة مئوية، وترك ما لا يقل عن 100 درجة مئوية في RT للتحليلات اللاحقة.

7. التحقق من صحة الجسيمات حسب الحجم والمظهر

  1. تشتت الضوء الديناميكي (DLS)
    1. قياس متوسط حجم الجسيمات من SHB-SAPN من خلال المعلمات التالية: حدد البروتين كمادة، إنشاء عازلة معقدة ل120 mM اليوريا، 20 MM تريس، 5٪ الجلسرين 25 درجة مئوية لدرجة الحرارة، حدد cuvettes المتاح للتحليل، حدد التلقائي القياس، تعيين لمدة 5 أشواط.
    2. إضافة 45 درجة مئوية من SHB-SAPN إلى cuvette المتاح وتشغيل البرنامج عن طريق النقر على السهم الأخضر. حدد النسبة المئوية لوحدة التخزين للقراءة.
  2. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)
    1. تمييع العينة بمقدار 1:20 في المخزن المؤقت لإعادة الطي. جعل 10 مل من عينة مخففة.
    2. باستخدام 3 محاقن مل، امسح أداة NTA مع المخزن المؤقت القابل لإعادة الطي وتحميل حوالي 1.5 مل من العينة لموازنة الأداة. استخدام بقية العينة للتحليل.
    3. إنشاء SOP جديد في برنامج NTA بالنقر فوق علامة التبويب SOP. ضمن علامة التبويب تغيير عدد الالتقاطات إلى 3 وتغيير وقت الالتقاط إلى 30 s. اضغط على زر التركيز التلقائي على الجانب الأيسر من الشاشة لجعل العينة في التركيز. استخدم مقبض التركيز اليدوي على جانب الماكينة لضبط التركيز البؤري.
    4. تشغيل SOP التي تم إنشاؤها، عندما يطالب النظام بتحميل حجم صغير من العينة مع المحاقن. بعد أن أخذ النظام جميع الالتقاطات فإنه سيتم تلقائيا إحضار شاشة التحليل. حرك شريط حد الكشف بحيث يتم وضع علامة على جميع الجسيمات الحقيقية مع الصلبان الحمراء. اضغط على زر تحليل التشغيل وسيبدأ التحليل تلقائيًا.
  3. الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM)
    1. توهج التفريغ formvar / الكربون 400 شبكة النحاس TEM دعم الأفلام.
    2. إضافة 3 ميكرولتر من العينة عند تركيز 0.075 ملغم/مل إلى الشبكة لمدة 30 ثانية.
    3. غسل الشبكة مع 3 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات ثلاث مرات، في كل مرة فتل قبالة الماء مع ورقة فلتر.
    4. إضافة 3 ميكرولتر من خلات أورانيل 0.5٪ إلى فيلم الدعم والسماح لها بالجلوس لمدة 30 ق. ويك قبالة معظم خلات أورانيل ولكن ترك فيلم رقيقة على السطح. السماح للعينات لتجف قبل تصويرها على المجهر الإلكتروني انتقال.
    5. عينات الصورة في 80 كيلو فولت على TEM.

8. تحديد مستويات الإندوتوكسين في العينات باستخدام فحص الليموس الأميبسيت الحركي (LAL)

  1. إزالة عدة وعينات من الثلاجة والسماح لequilibrate إلى RT.
  2. لإجراء هذا القول، مطلوب قارئ لوحة مع كتلة الحرارة والقدرة على قراءة العينات لمدة 40 يقرأ في الطول الموجي من 405 نانومتر عند 37 درجة مئوية. كتابة قالب برنامج بحيث يتم قراءة الآبار كل 150 ق لتحديد نقطة زمنية بداية (OD زيادة بنسبة 0.2 بالمقارنة مع القراءة الأولى).
  3. تخفيف العينة إلى تركيز جرعة التحصين في PBS.
    ملاحظة: رقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت إعادة طي خارج نطاق "التصاق LAL". والتخفيف من العينة في PBS تعيين الحموضة إلى نطاق مقبول.
  4. إعادة تعليق الإندوتوكسين التحكم في الحجم المناسب من مياه LAL الخالية من الإندوتوكسين على النحو المحدد في شهادة التحليل لتوليد 50 EU/mL. دوامة قوية القارورة لمدة 15 دقيقة لضمان إعادة تعليق كامل من endotoxin.
  5. توليد منحنى معيار endotoxin عن طريق preforming تخفيف تسلسلي 10 أضعاف في قارورة زجاجية في نطاق 50 الاتحاد الأوروبي إلى 0.005 الاتحاد الأوروبي / مل. لكل تخفيف، إضافة 0.1 مل من التخفيف السابق إلى 0.9 مل من مياه لال. دوامة بقوة بعد الجمع لمدة 1 دقيقة.
  6. أضف تخفيفات المنحنى القياسية وعينات SHB-SAPN في نسخة مكررة إلى لوحة 96 بئرًا. استخدام المياه LAL كتحكم سلبي في تكرار كذلك. Preincubate لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  7. قرب نهاية الحضانة، إعادة تعليق قارورة كاشف ة مع 2.6 مل من مياه لال. امزج المحتوى برفق مع ماصة مصلية.
  8. أضف 100 ميكرو لتر من كاشف التوكيل إلى كل بئر من طبق 96 بئر. نقل لوحة بسرعة إلى قارئ لوحة وتشغيل قالب البرنامج مكتوب في الخطوة 8.2.
  9. بمجرد اكتمال البرنامج، قم بإنشاء منحنى قياسي باستخدام قيمة السجل لعناصر التحكم مقابل قيمة السجل لوقت بداية التشغيل. استخدم الصيغة التي تم إنشاؤها من هذا المنحنى لحساب تركيز الإندوتوكسين في العينات.

Representative Results

تم بناء SHB-SAPN المجمعة بالكامل الموضحة هنا على تسلسلات البروتين (الشكل1A)التي من المتوقع أن تطوي إلى جسيمات تحتوي على 60 نسخة من المونومر (الشكل1B). ويقدم الشكل 2 الخطوط العريضة لطريقة إنتاج وتنقية وتحديد نواة SHB-SAPN. E. القولونية من مخزون الجلسرين التي تحتوي على ناقلات التعبير pPep-T مع تسلسل جيني من جوهر SHB-SAPN تم حثها في BL21 (DE3) E. القولونية. نمت الخلايا البكتيرية بنجاح وتحلل تحت denaturing والحد من الظروف.

تم استخدام مجموع خلايا lysate لتنقية مونومرات SHB-SAPN من قبل FPLC باستخدام عمود Ni2+ (الشكل3A). وكروماتوغراف FPLC يوضح أن البروتين eluted على حد سواء في 150 mM و 500 mM إيميدازول (الشكل3A). كما يظهر الكروماتوغرام قمتين آخرين في 185 مل و 210 مل الحجم الإجمالي المقابل لغسل isopropanol وغسل خالية من إيميدازول، على التوالي. تم تحديد الكسور ونقاء البروتين المؤتلف بواسطة المواد الهلامية SDS-PAGE المتدرجة (الشكل3B). وكان البروتين موضع الاهتمام يقع في المقام الأول في الكسور 68\u201279 (278\u2012300 حجم إجمالي مل). وقد تم الجمع بين هذه الكسور لإجراء مزيد من التحليلات. اللطخة الغربية مع الأجسام المضادة له (N-المحطة الطرفية) و 167-D-IV الأجسام المضادة (C-تيرمينوس) أشار إلى أن الكسور المجمعة كانت في الواقع البروتين من الفائدة (الشكل4A، B). كما أظهرت هذه البقع وجود متعددات الـ SHB-SAPN. كانت الإذاة المنقالة السابقة وكسور الإنعلاث تميل إلى احتواء تركيز أعلى من البروتين متعدد المُميّز، وبالتالي تم استبعادها.

تم طي العينات التي تحتوي على مونومرات البروتين ذات الاهتمام في SHB-SAPN تجميعها بالكامل عن طريق غسيل الكلى. تم تحديد توزيع حجم الجسيمات من قبل DLS وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (الشكل5A،B). وحدد DLS الجسيمات التي يبلغ قطرها الهيدروديناميكي Z-المتوسط 67 نانومتر، بينما يقيس نظام NTA متوسط حجم 81 نانومتر. وكانت الاختلافات طفيفة في الحجم بسبب تقنيات تغيير حجم الجسيمات، ولكن حجم من كلا التحليلين كانت فيالنطاق المتوقع من 20\u2012100 نانومتر 8،24،25. وقد تصورت الشبكات الصحية المضادة للتلوث SHB-SAP من قبل TEM وأظهرت الصور جزيئات فردية جيدة التشكيل مع توزيع الحجم الذي تم الحصول عليه من تقنيات تغيير حجم الجسيمات اثنين (الشكل5C).

أثناء تنقية البروتين، تم غسل العمود مع إيزوبروبانول لتقليل التلوث LPS في المنتج النهائي SHB-SAPN. وللتحقق مما إذا كان مستوى الإندوتوكسين مقبولاً للتحصين، فإن تركيز LPS في عينات SHB-SAPN المنقية مع أو بدون خطوة غسل الإيزوبروبانول تم تحديده من خلال فحص لال حركي. وأشارت النتائج إلى أن غسل الإيزوبروبانول خفض مستويات الإندوتوكسين من > 0.25 EU/μg إلى0.010 EU/μg من بروتين SHB-SAPN (الجدول 1).

Figure 1
الشكل 1: تسلسل البروتين وبنيته. (أ) تسلسل الأحماض الأمينية من مونومر SHB-SAPN. (ب) نموذج الكمبيوتر لهيكل الأساسية SHB-SAPN تجميعها بالكامل تتكون من 60 مونومرات البروتين. نظام الألوان لتسلسل الأحماض الأمينية: رمادي = HisTag; الأخضر = خماسي؛ الأزرق الداكن = دي نوفو مصممة الانتهازي؛ أزرق فاتح = حزمة سداسية الحلزون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: المخطط الانسيابي لـ بروتوكول لإنتاج SHB-SAPN. نظام الألوان: أسود = تعبير مونومر البروتين في E. القولونية; الرمادي الداكن = تنقية مونومر؛ رمادي متوسط = تحديد مونومر؛ الرمادي الفاتح = إعادة الطي والتوصيف؛ أبيض = مجمعة بالكامل SHB-SAPN المنتج. في الخطوات المسماة مع الرمادي الداكن والمتوسط، والبروتين هو تحت denaturing والحد من الظروف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تنقية البروتين من مونومرات SHB-SAPN. (أ) كروماتوغراف من تنقية FPLC. يشير الخط الأخضر فوق الرسم البياني اللوني إلى خطوات التنقية. يمثل الخط الأزرق في الرسم البياني اللوني الكثافة البصرية للكسور عند الطول الموجي 280 نانومتر. يظهر الخط الأسود ما في المئة من العازلة B (8 M اليوريا، 20 MM تريس، 50 مل فوسفات الصوديوم أحادي ة، 5 MM TCEP، 500 MM إيميدازول، درجة الحموضة 8.5) التي استخدمت في كل مرحلة من مراحل التنقية. (B) SDS-PAGE هلام من الكسور المجمعة من lysate (L)، وتدفق من خلال (FT)، وغسل الأولى (W1)، غسل isopropanol (W2)، وغسل الثالث (W3)، والكسور الفردية من 150 mM imidazole (E150) و 500 mM imidazole (E500) خطوات الإلتاءب من تنقيه. العلامات الجزيئية في الممر الأول (M) تحديد العصابات بين 10 و 250 كيلودا. يشار إلى البروتين الهدف بواسطة سهم أسود. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحديد البروتين بواسطة اللطخة الغربية. يتم تحميل جميع الممرات مع 100 نانوغرام من البروتين. (أ) نتائج وصمة عار الغربية مع المضادة ل6X HisTag. (ب) نتائج وصمة عار الغربية مع 167-D-IV فيروس نقص المناعة البشرية-1 الأجسام المضادة أحادية النسيلة. وتوصف الممرات على النحو: M = علامة الوزن الجزيئي; 1 = lysate; 2 = تدفق من خلال; 3 = غسل الأول؛ 4 = غسل إيزوبروبانول (غسل الثاني)؛ 5 = غسل الثالث؛ 6 = كسور حجم مجمعة 56\u201261 (ذروة الإلتبيلة الأولى)، 7 = فصائل وحدة التخزين المجمعة 62\u201267 (بين القمتين)، 8 = كسور حجم مجمعة 68\u201278 (ذروة الإلتبيلة الثانية). البروتين المستهدف مع حجم النطاق المتوقع من 18.07 كيلودا كما يشار إلى الفرقة SHB-SAPN أحادية اللون بواسطة سهم أسود. النطاقات الإضافية في الممرات 7 و 8 هي الخافتة، والانتهازي، ومتعددة من SHB-SAPN (السهم الأحمر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: توصيف SHB-SAPN المعاد طيه. (A). توزيع حجم الجسيمات على النحو الذي تحدده DLS. (ب) حجم الجسيمات كما يحددها تتبع الجسيمات النانوية (النظام). (C) التصور من جزيئات SHB-SAPN من قبل TEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عينه إندوتوكسين (الاتحاد الأوروبي / مل) إندوتوكسين (الاتحاد الأوروبي / ميكروغرام من البروتين)
سابن مع غسول إيزوبروبانول 2.02 0.01
سابن بدون غسول إيزوبروبانول > 50 >0.25
التحكم السلبي تحت مستوى الكشف غير مأبو

الجدول 1: مستويات التكسينات الإندوتكسمنة من شبكات SHB-SAPN المعاد طيها. مستويات الإندوتوكسين في عينات SHB-SAPN المنقية مع أو بدون غسل إيزوبروبانول المقدمة على حد سواء كوحدات endotoxin / وحدات الإندوتوكسين / ميكروغرام من بروتين SHB-SAPN.

Discussion

توفر تقنية النانو العديد من المزايا والحلول لتطوير اللقاحات الفرعية. اللقاحات النانوية يمكن أن تقدم مرارا وتكرارا مستضدات كجسيمات إلى الجهاز المناعي المضيف زيادة المناعة26. في حين أن هناك العديد من أنواع مختلفة من اللقاحات النانوية، ونحن نعتقد أن تلك التي تتألف من البروتين دي نوفو مصممة يبدو أن أقوى نهج لتطوير اللقاحات1. ويمكن هندستها دون أي تسلسل homology إلى البروتينات المضيفة وتقديم مستضد من الاهتمام في مقربة من المطابقة مثل السكان الأصليين مع توفير تكلفة الإنتاج منخفضة وارتفاع غلة المنتج. ومن الأمثلة الرئيسية على هذا النهج تكنولوجيا SAPN، التي طبقناها على اللقاحات ضد الأمراض المعدية المتعددة7. معالجة الصعوبات في تطوير لقاح فيروس نقص المناعة البشرية-1، قمنا بهندسة نواة فريدة من نوعها SHB-SAPN لتقديم فعال مستضد V1V2 في مطابقة تقليم الأصليمثل 9. العديد من أهداف اللقاحات، وخاصة بالنسبة للأمراض الفيروسية، موجودة كأجهزة تشذيب27. وتشير هذه الظاهرة إلى أن تصميمنا في شبكة سابن له آثار واسعة النطاق على تطوير لقاحات الوحدات الفرعية.

في هذه الطريقة، نقوم بتوضيح كيفية إنتاج SHB-SAPNs في نظام التعبير القولونية E. عبرنا عن غلة عالية من البروتين (حوالي 6 ملغ / 100 مل من الثقافة). يحتوي البروتين على 10 هيستيدينات وتم تنقيته بسهولة باستخدام الكروماتوغرافيا المعدنية المعطلة مع عمود Ni2+. تم العثور على هذا الطول من العلامة له ليكون الأمثل لأعلى عائد البروتين. يحتوي البروتين المنقى على طول كامل للبروتين المصمم كما يتضح من وجود كل من محطة N HisTag وتكرار heptad محطة C. لقد استخدمنا تقنيات مقبولة على نطاق واسع وقمنا بتحسينها للتعبير عن جوهر SHB-SAPN وإنتاجه وتوصيفه. عدم إنتاج البروتين كامل الطول أثناء تطوير SAPN التي تحتوي على epitope البروتين الجديد يمكن أن تشير إلى مشكلة التعبير عن الجين في الخلية المضيفة. وفي حالة حدوث ذلك، يجب إعادة تصميم الجين ونظام التعبير وتكييفه مع البروتوكول الموصوف. تعديل وقت sonication أو كثافة قد تزيد أيضا من تركيز البروتين الكامل طول المتوقعة.

وكانت الجسيمات المعاد طيها في نطاق الحجم المتوقع (20 إلى 100 نانومتر)8و24و25 على النحو الذي يحدده تحليل DLS وتتبع الجسيمات النانوية. وقد تأكدت هذه النتائج كذلك باستخدام TEM. إذا كانت هناك مشاكل في هذه الخطوة، عادة ما يرجع ذلك إلى مشكلة في درجة الحموضة أو قوة الأيونية من المخزن المؤقت إعادة طي. عندما يتم الكشف عن جزيئات كبيرة الحجم على تقنيات تغيير حجم الجسيمات، فإنه يشير إلى التجميع، والتي يمكن تجنبها عن طريق زيادة الحموضة من المخزن المؤقت إعادة طي. إذا لم يتم الكشف عن الجسيمات بواسطة DLS، تحقق من تركيز البروتين وتحقق من الحموضة في المخزن المؤقت. يجب أن يكون تركيز البروتين النهائي لـ DLS 100 ميكروغرام/مل على الأقل. إذا لم يكن التركيز هو المشكلة، فإنه يشير إلى وفرة الجسيمات الصغيرة، شكلت بشكل غير كامل، والتي يمكن تقليل تركيزها عن طريق خفض درجة الحموضة. بدلا من ذلك، يمكن تعديل تركيز كلوريد الصوديوم إلى النطاق الأمثل لتقليل وجود الجسيمات ذات الحجم غير المرغوب فيه.

وأخيرا، باستخدام خطوة غسل isopropanol خلال تنقية كنا قادرين على الحد من تلوث LPS من المضيف E. القولونية إلى 0.01 الاتحاد الأوروبي / ميكروغرام من SAPN الذي هو أقل من الحد الأقصى لإدارة الغذاء والدواء (FDA) من 5 الاتحاد الأوروبي / كجم من وزن الجسم للمنتجات عن طريق الحقن 28.ويمكن تخفيض هذا المستوى مرة أخرى باستخدام عمود تبادل anion المعروف أيضا باسم عمود Q. إذا كانت مستويات عالية من endotoxin لا تزال موجودة، تحقق من جميع المواد التي تم استخدامها لإعداد العازلة. تذكر أن تستخدم فقط الأواني الزجاجية depyrogenated والأواني البلاستيكية المبطنة الحرة في هذه الطريقة.

وتشير هذه النتائج إلى أننا نجحنا في تطوير طريقة لإنتاج نواة SHB-SAPN التي يمكن استخدامها في دراسات التحصين قبل السريرية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة مع تعديلات طفيفة فقط، إن وجدت، على تنقية SHB-SAPNs عند إضافة مستضد للاهتمام. استخدام هذا الأسلوب كنقطة بداية أحد التغييرات الرئيسية في خطوة elution. البروتينات المختلفة elute في تركيزات إيميدازول مختلفة التي يجب تحديدها تجريبيا. قد يكون الفرق الرئيسي الآخر تكوين المخزن المؤقت إعادة طي. وسيتطلب التحسين اختبار ظروف مختلفة من الحموضة فضلا عن نقاط القوة الأيونية.

وبالنظر إلى الأعمال المقبلة، لا يلزم سوى تعديلين طفيفين للسماح بالتطبيق البشري للخطة. الأول هو أن ناقلات التعبير يحتاج إلى تغيير إلى مقاومة كاناماسين علامة اختيار بسبب حساسية أمبيسلين في البشر29. والشرط الرئيسي الآخر لتصنيع البروتين للاستخدام البشري هو إنتاج SHB-SAPN في وسائل الإعلام الخالية من المنتجات الحيوانية. وقد أشارت دراسة صغيرة النطاق بالفعل إلى وجود عائد معقول من البروتين في وسائط الإعلام النباتية. العمل المعروض هنا قابل للتطوير بسهولة لإنتاج GMP النهائي كما هو موضح مع مرشح لقاح الملاريا، FMP01416. هذا الإنتاج FMP014-SAPN على نطاق واسع شملت كل من تبادل الأنيون وخطوات تبادل الموجبة لزيادة خفض LPS و Ni2+ المحتوى من المنتج النهائي. وقد تم بالفعل توسيع هذه SAPN التي تعبر عنها البكتيرية للمرحلة القادمة 1/2a التجربة السريرية.

Disclosures

والآراء المعرب عنها هي آراء المؤلفين ولا ينبغي تفسيرها على أنها تمثل مواقف الجيش الأمريكي أو وزارة الدفاع. بيتر Burkhard لديه مصلحة في الشركة تسمى ألفا-O الببتيدات AG ولديه براءات الاختراع على التكنولوجيا. وليس للمؤلفين الآخرين أي انتماء أو مشاركة مالية مع أي شركة لها مصلحة مالية في الموضوع المعروض في هذه الورقة.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من خلال اتفاقية تعاونية (W81XWH-11-2-0174) بين مؤسسة هنري إم جاكسون للنهوض بالطب العسكري، ووزارة الدفاع الأمريكية. تم تلقي الأجسام المضادة لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 gp41 mAb 167-D IV من الدكتورة سوزان زوللا-بازنر من خلال برنامج الكاشف للإيدز في المعاهد القومية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine/SDS BioRad 1610732 1 L
2-Mercaptoethanol BioRad 1610710 25 mL
2-propanol Fisher BP26181 4 L
2x Laemmli Sample Buffer BioRad 1610737 30 mL
40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers Malvern Panalytical ZEN0040 100 pack
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl BioRad 4561093 10 pack
Ampicillin Fisher BP1760-25 25 g
Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] AbCam ab18184 100 mg
Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) AIDS Reagent Repository 11681 100 mg
BCIP/NBT Substrate, Solution Southern Biotech 0302-01   100 mL
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems Fisher 09-761-108 A variety of sizes
Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm Ted Pella, Inc 01754-F 25 pack
GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns GE HealthCare 45-000-325 5 pack
Glycerol Fisher BP229-4 4 L
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) ABCam ab97020 1 mg
Imidazole Fisher O3196-500 500 g
Instant NonFat Dry Milk Quality Biological A614-1003 10 pack
Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay Lonza Walkersville 50650U 192 Test Kit
LAL Reagent Grade Multi-well Plates Lonza Walkersville 25-340 1 plate
Magic Media E. coli Expression Medium ThermoFisher K6803 1 L
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters Millipore SLGV033RB 250 pack
Mouse Anti-Human IgG Fc-AP Southern Biotech 9040-04   1.0 mL
One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli ThermoFisher C601003 20 vials
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, BioRad 1610363 1 mL
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL ThermoFisher 66810 8 pack
Sodium Chloride Fisher BP358-212 2.5 kg
Sodium Phosphate Monobasic Fisher BP329-500 500 g
Tris Base Fisher BP152-1 1 kg
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Biosynth International C-1818 100 g
Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S Electron Micoscopy Services 541-09-3 25 g
Urea Fisher BP169-500 2.5 kg
Whatman qualitative filter paper Sigma Aldrich WHA10010155 pack of 500
Name Company Catalog Number Comments
 Equipment
ChromLab Software ver 4 BioRad 12009390 Software
Epoch 2 Microplate Spectrophotometer BioTek EPOCH2 Plate Reader
Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor ThermoFisher 096-145075 Rotor
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Gel Imager for Stain free Gels
JEOL TEM JEOL 1400 Transmission Electron Microscope
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels BioRad 1658004 To run gels
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer ThermoFisher ND-ONE-W For Protein Concentration
NanoSight NS300 Malvern Panalytical Particle Sizing
NanoSight NTA software NTA Malvern Panalytical Particle Sizing
New Brunswick Innova 44/44R Eppendorf M1282-0000 Incubator/Shaker
NGC Quest 10 Chromatography System BioRad 7880001 FPLC to aid in protein purification
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella, INC 91000S To clean grids
PowerPac Universal Power Supply BioRad 1645070 To run gels
Rocker Shaker Daigger EF5536A For Western
Sonifer 450 Branson also known as 096-145075  Sonicator
Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge ThermoFisher 75-006-580 Centrifuge
Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs BioRad 1704158 For Western
Trans-Blot Turbo Transfer System BioRad 1704150 For Western
Vortex-Genie 2 Daigger EF3030A Vortex
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Particle Sizing
Zetasizer Software Malvern Panalytical Particle Sizing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karch, C. P., Burkhard, P. Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies. Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).
  2. Snapper, C. M. Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens. Frontiers in Immunology. 9, 598 (2018).
  3. Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines. Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).
  4. Yeates, T. O. Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials. Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).
  5. Marcandalli, J., et al. Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus. Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).
  6. Ross, J. F., et al. Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins. ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).
  7. Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development. Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).
  8. Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles). Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).
  9. Karch, C. P., et al. Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen. Nanomedicine. , (2018).
  10. Karch, C. P., et al. The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62 (2017).
  11. Li, J., et al. A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus. PLoS One. 13 (9), e0203771 (2018).
  12. Wahome, N., et al. Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine. Chemical Biology & Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).
  13. El Bissati, K., et al. Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice. Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).
  14. Kaba, S. A., et al. A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria. Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).
  15. Kaba, S. A., et al. Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine. PLoS One. 7 (10), e48304 (2012).
  16. Seth, L., et al. Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants. Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).
  17. Kaba, S. A., et al. Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine. Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).
  18. El Bissati, K., et al. Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma. NPJ Vaccines. 2, 24 (2017).
  19. Karch, C. P., et al. Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge. Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).
  20. Haynes, B. F., et al. Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial. New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).
  21. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).
  22. O' Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development. Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).
  23. Babapoor, S., et al. A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection. Influenza Research and Treatment. 2011, 126794 (2011).
  24. Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design. Royal Society Open Science. 4 (4), 161092 (2017).
  25. Indelicato, G., et al. Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles. Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).
  26. Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. Nanoscale assemblies and their biomedical applications. Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740 (2013).
  27. Rey, F. A., Lok, S. M. Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines. Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).
  28. Bacterial Endotoxins. United States Pharmacopeia (USP). , Ch. 85 (2011).
  29. Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals. , Food and Drug Adminstration. Maryland. Available from: https://www.fda.gov/media/76255/download (1993).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 150، لقاح الوحدة الفرعية، لقاح نانوي، الجسيمات النانوية البروتينية ذاتية التجميع، السابن، عرض مستضد، مستضد التيريريك، بنية تشبه الأصل
إنتاج <em>E.</em>القولونية - أعرب الذاتي تجميع البروتين الجسيمات النانوية لللقاحات التي تتطلب عرض الإبإبيلة الانتهازية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karch, C. P., Burkhard, P., Matyas,… More

Karch, C. P., Burkhard, P., Matyas, G. R., Beck, Z. Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation. J. Vis. Exp. (150), e60103, doi:10.3791/60103 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter