Summary
백신 개발에 사용하기 위한 자가 조립 단백질 나노입자(SAPN)의 정제, 재접이식 및 특성화를 설명하는 상세한 방법이 여기에 제공된다.
Abstract
자가 조립 단백질 나노 입자 (SAPN) 반복항원 디스플레이로 기능하고 다른 감염성 질환에 대한 백신의 넓은 범위를 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 이 문서에서는 트리메라 형태에서 항원을 제시할 수 있는 6-나선 번들(SHB) 어셈블리를 포함하는 SAPN 코어를 생산하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 대장균 시스템에서 SHB-SAPN의 발현뿐만 아니라 필요한 단백질 정제 단계를 설명합니다. 잔류 세균성 리포폴리사카라이드를 감소시키기 위한 이소프로판올 세척 단계를 포함시켰습니다. 단백질 정체성 및 순도의 표시로서, 단백질은 서양 블롯 분석에서 알려진 단일 클론 항체와 반응했다. 재접이식 후, 입자의 크기는 동적 광 산란, 나노 입자 추적 분석 및 투과 전자 현미경으로 확인된 예상 범위(20~100 nm)로 떨어졌다. 여기서 설명하는 방법은 SHB-SAPN에 최적화되어 있지만 약간의 수정만으로 다른 SAPN 구문에 적용할 수 있습니다. 이 방법은 또한 인간 백신을 위한 GMP 제조를 위한 대규모 생산으로 쉽게 양도할 수 있습니다.
Introduction
전통적인 백신 개발은 불활성화 또는 감쇠된 병원체에 초점을 맞추고 있는 동안, 현대 백신의 초점은하위 단위 백신으로 이동했습니다 1. 이 접근은 더 표적으로 한 반응으로 이끌어 낼 수 있고, 잠재적으로 더 효과적인 백신 후보자. 그러나, 주요 단점 중 하나는 소단위 백신이 감소 된 면역 원성 2를 초래할 수있는 전체유기체와 같은 미립자되지 않는다는 것입니다. 반복적 항원 디스플레이 시스템으로서의 나노입자는 전체 유기체의 미립자 성질뿐만 아니라 표적 소단위 백신 접근법 모두의 이점을 가질 수있다1,3.
기존의 나노백신 중에서 합리적으로 설계된 단백질 어셈블리는 항원의 여러 사본을 네이티브 와 같은 형태에서 잠재적으로 제시할 수 있는백신 후보의 설계 및 개발을 가능하게 합니다 1,4 ,5,6. 이들 단백질 어셈블리의 한 예로는 자가 조립 단백질 나노입자(SAPN)7이있다. SAPN은 코일 코일 도메인을 기반으로 하며 전통적으로 대장균8로표현됩니다. SAPN 백신 후보기는 말라리아, 사스, 인플루엔자, 톡소플라즈마증 및 HIV-1 9,10,11,12,13 과 같은 다양한 질병에 대해 개발되었습니다. , 14세 , 15세 , 16세 , 17세 , 18세 , 19. 각 SAPN 후보의 설계는 관심 있는 병원체에 특정하지만, 생산, 정제 및 재접공 기술은 일반적으로 광범위하게 적용가능하다.
우리의 현재 관심사 중 하나는 효과적인 HIV-1 백신입니다. RV144에서- 적당한 효험을 설명한 HIV-1 백신의 유일한 단계 III 임상 시험은 감염의 감소된 리스크는 봉투 단백질20,21의V1V2 루프에 IgG 항체와 상관되었습니다. 이 지역의 네이티브 유사 트리메라 프리젠 테이션은 보호 면역 원성22에중요하다고 생각됩니다. V1V2 루프를 가능한 한 네이티브 와 같은 형태에 가깝게 제시하기 위해, 우리는 올바른 형태 9로 V1V2 루프를 제시하기 위해 HIV-1 봉투 후 융합 6 나선 번들 (SHB)을 포함하는 원리 SAPN 백신 후보의 증거를 개발했습니다. . 이 후보는 HIV-1 봉투 단백질에 공지된 단일클론 항체에 의해 인식되었다. V1V2-SHB-SAPN으로 면역화된 마우스는 V1V2 특이적 항체를 제기했으며, 가장 중요한 것은, gp70 V1V2에 바인딩되어, 정확한 형태 에피토프9. SHB-SAPN 코어는 HIV-1 V1V2 루프의 캐리어 역할을 넘어서는 다른 기능을 가질 수 있습니다. 여기서는 SHB-SAPN 코어의 발현, 정제, 재접기 및 유효성 검사에 대한 자세한 방법론을 설명합니다. 서열 선택, 나노입자 설계, 분자 복제, 및 대장균의 변형은 이전에9에기술되어 있다.
Protocol
1. 대장균 BL21(DE3)에서 SHB-SAPN 단백질의 발현
- 제조자의 지시에 따라 2L 멸균 유리 에를렌마이어 플라스크에 매체의 성분 A 및 5 mL의 성분 B의 95 mL을 혼합하십시오 (재료 표참조). 100 μg/mL의 최종 농도에 암피실린을 추가합니다.
- 이전에 확립 된 글리세롤 주식 문화에서 대장균으로 미디어를 접종하십시오. 30°C에서 배양하여 48시간 동안 분당 200회 회전(rpm)에서 흔들어.
참고: 사용된 대장균 BL21(DE3) 스톡은 SHB-SAPN 유전자를 이용한 암피실린 내성 발현벡터(23)를 함유하였다. 미디어의 일반적인 프로토콜은 37°C에서 24시간의 배양을 권장하지만, 30°C에서 48시간의 배양량은 SHB-SAPN에 대해 더 높은 수율을 주었다. - 배양을 두 개의 50 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 옮김. 4°C에서 고정각 로터로 10분 동안 4,000 x g의 튜브를 원심분리합니다. 상급체를 제거하고 펠릿을 저장하여 세포를 수확하십시오.
참고: 세포 펠릿은 즉시 처리하거나 -80°C에서 사용할 때까지 냉동될 수 있습니다.
2. 초음파 처리에 의한 대장균 BL21(DE3)의 라이시스
참고: 250°C에서 구운 비파이로겐 플라스틱 제품과 유리 제품을 최소 30분 동안 사용합니다. 표시된 항원S-S 결합을 포함하는 경우 TCEP는 이 프로토콜 동안 완충제에 필요하다. SHB-SAPN 코어만의 경우 버퍼에 TCEP가 있는 것은 필수적이지 않습니다.
- 이미다졸 프리 버퍼(8M 우레아, 50 mM 인산나트륨 모노베이직, 20 mM 트리스 베이스, 5 mM TCEP) pH 8.0(5 N NaOH로 조정)을 준비하고 0.22μm 진공 병 여과 장치를 사용하여 여과합니다.
- 하나의 50 mL 원뿔 튜브에 40 mL의 imidazole-free 버퍼로 펠릿 된 세포 (1.3 단계에서)를 다시 일시 중단하십시오. 150 W의 초음파 출력으로 5 분 (초음파 4 초, 나머지 6 초)의 얼음에 프로브로 재 정지 된 세포를 초음파 처리하십시오.
- 세포 용해물(40 mL)을 4°C에서 29,000 x g에서 25분 동안 고정각 로터에서 25분 동안 원심분리하여 정제된 상상류를 생성한다. 상급체를 150 mL 멸균 플라스크로 옮기고 펠릿을 폐기합니다. 이미다졸 프리 버퍼를 사용하여 상급체를 100 mL로 희석한다(나중에 "샘플"이라 하는 프로토콜의 말).
참고: 이 희석 단계는 FPLC 시스템 압력이 컬럼에 용해로 딩하는 동안 너무 높아지는 것을 방지하기 위해 필요합니다.
3. 그의 열을 이용한 단백질 정제
참고: 이 프로토콜은 FPLC 계측기를 사용하여 수행되었지만 중력 흐름에 맞게 조정할 수 있습니다.
- 다음 버퍼를 준비하고 0.22 μm 진공 병 여과 장치를 사용하여 그들을 필터링: (i) imidazole 없는 버퍼 "버퍼 A"(8 M 우레아, 50 mM 인산 나트륨 모노베이직, 20 mM Tris base, 5 mM TCEP) pH 8.0; (ii) 500 mM imidazole 버퍼 "버퍼 B"(8 M 우레아, 50 mM 나트륨 인산염 모노베이직, 20 mM Tris 염기, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazole) pH 8.0; 및 (iii) 이소프로판올 세척(20 mM 트리스, 60% 이소프로판올) pH 8.0.
참고: 각 버퍼에 대한 pH를 5 N NaOH로 조정했습니다. - 그분의 칼럼을 평형화한다.
참고: 랩 스케일 프로덕션의 경우 이 프로토콜은 미리 압축된 5mL의 His-column을 사용하지만 더 큰 크기의 열을 사용할 수 있습니다.- FPLC 소프트웨어를 열고 새 메서드 옵션을 클릭합니다. 메서드 설정 메뉴에서 즉시 열립니다. 열 위치에 대한 드롭다운 메뉴에서 C1 포트3을 선택합니다.
- 기술 드롭 다운 메뉴에 의해 표시에 선호도를선택합니다. 열 형 드롭 다운 메뉴에서 다른 사람을 선택, Histrap HP, 5 mL. 열 체적과 압력 상자가 자동으로 적절한 값으로 설정됩니다.
- 방법 개요 단추를 클릭합니다. 위상 라이브러리 팝업 메뉴에서 다음 단추를 드래그합니다: 평형,샘플 응용프로그램, 열 세척및 해당 순서의 화살표 옆에 용출. 위상 라이브러리 메뉴를 닫습니다.
- 평형 버튼을 클릭합니다. 테이블에 나열된 값은 "초기 버퍼 B"(4%), "최종 버퍼 B"(4%), "볼륨(CV)" 5이어야 합니다.
- 샘플 응용 프로그램 상자를 클릭합니다. 샘플 로딩 상자에서 샘플 펌프가 있는 열에 샘플주입을 위한 라디오 버튼을 클릭합니다. 방법 설정에서 사용 유량 옆에 있는 상자가 시스템 펌프 상자로 샘플 주입에서 체크되어 있는지 확인합니다. 화면 오른쪽의 볼륨 상자 옆에 값을 20mL로변경합니다.
- 열 세척 버튼을 클릭합니다. 테이블에 나열된 값은 "초기 버퍼 B"(4%), "최종 버퍼 B"(4%), "볼륨(CV)" 5이어야 합니다. 분수 수집 구성표 옆에 있는 활성화 상자를클릭 취소합니다.
- 용출 버튼을 클릭합니다. 테이블에 나열된 값은 "초기 버퍼 B" 0%, "최종 버퍼 B" 100%, "볼륨(CV)" 5이어야 합니다. 분수 수집 구성표 옆에 있는 활성화 상자를 클릭합니다. 방법 설정에서 분수 크기 사용을 클릭 해제하고 아래 채우기 상자에서 분수 크기를 4mL로 조정합니다.
- 소프트웨어 상단의 단추로 저장을 클릭합니다. 파일의 이름을 "평형"으로 지정합니다.
- FPLC의 해당 열 포트 3에 미리 포장된 5mL의 해당 열 포트를 연결합니다. 펌프 A와 펌프 B 튜브뿐만 아니라 샘플 펌프 튜브는 0.22 μm 여과 된 탈이온수에 배치해야합니다. 평형 프로그램을 실행합니다.
- 펌프 A와 펌프 B뿐만 아니라 샘플 펌프 튜브를 이미다졸 프리 버퍼(Buffer A)에 넣고 평형 프로토콜을 다시 실행합니다.
- 샘플을 컬럼에 묶고 단백질을 정제합니다.
- FPLC 소프트웨어를 열고 새 메서드 옵션을 클릭합니다. 메서드 설정 메뉴에서 즉시 열립니다. 열 위치에 대한 드롭다운 메뉴에서 C1 포트3을 선택합니다. 기술 드롭 다운 메뉴에 의해 표시에 선호도를선택합니다. 열 형 드롭 다운 메뉴에서 다른 사람을 선택, Histrap HP, 5 mL. 열 체적과 압력 상자가 자동으로 적절한 값으로 설정됩니다.
- 방법 개요 단추를 클릭합니다. 위상 라이브러리 팝업 메뉴에서 버튼을 드래그 : 평형,샘플 응용프로그램, 열 세척 (세척 1), 열 세척 (세척 2), 열 세척 (세척 3), 그리고 그 화살표 옆에 용출 정확한 순서. 위상 라이브러리 메뉴를 닫습니다.
- 평형 버튼을 클릭합니다. 테이블에 나열된 값은 "초기 버퍼 B" 4%, "최종 버퍼 B" 4%, "볼륨(CV)" 5여야 합니다.
- 샘플 응용 프로그램 상자를 클릭합니다. 샘플 로딩 상자에서샘플 펌프가있는 열에서 샘플을 nject에대한 라디오 버튼을 클릭합니다. 방법 설정에서 사용 유량 옆에 있는 상자가 시스템 펌프 상자로 샘플 주입에서 체크되어 있는지 확인합니다.
- 화면 오른쪽의 볼륨 상자 옆에 있는 값이 100mL로 변경됩니다. 분수 수집 구성표 옆에 있는 활성화 단추를 클릭합니다. 메서드 설정 상자에서 분수 크기 사용을 클릭 한 다음 분수 크기를 4mL로 변경합니다.
- 첫 번째 열 세척 버튼 (세탁 1)을 클릭 합니다. 테이블에 나열된 값은 "초기 버퍼 B" 4%, "최종 버퍼 B" 4%, "볼륨(CV)" 10이어야 합니다. 분수 수집 구성표 옆에 있는 활성화 상자를 클릭합니다. 메서드 설정에서 분수 크기 사용을 클릭 해제한 다음 분수 크기를 4mL로 변경합니다.
- 두 번째 열 세척 버튼 (세탁 2)를 클릭 합니다. 테이블에 나열된 값은 "초기 버퍼 B" 0%, "최종 버퍼 B" 0%, "볼륨(CV)" 5이어야 합니다. 분수 수집 구성표 옆에 있는 활성화 상자를 클릭합니다. 메서드 설정에서 분수 크기 사용을 클릭 해제한 다음 분수 크기를 4mL로 변경합니다.
- 세 번째 열 세척 버튼 (세척 3)을 클릭 합니다. 테이블에 나열된 값은 "초기 버퍼 B" 0%, "최종 버퍼 B" 0%, "볼륨(CV)" 5이어야 합니다. 분수 수집 스키마 옆에 있는 활성화를 클릭합니다. 메서드 설정 상자에서 분수 크기 사용을 클릭 한 다음 분수 크기를 4mL로 변경합니다.
- 용출 버튼을 클릭합니다. 테이블에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭 한 정보를 클릭 하 고, 등장 하는 메뉴에서, [삭제단계]를 클릭 합니다. 등가그라디언트 버튼을 테이블에 두 번 드래그하여 두 개의 항목이 있습니다.
- 첫 번째 항목에 대한 값은 "초기 버퍼 B" 30%, "최종 버퍼 B" 30%, "볼륨(CV)" 10을 읽어야 합니다. 두 번째 항목에 대한 값은 "초기 버퍼 B" 100%, "최종 버퍼 B" 100%, "볼륨(CV)" 10을 읽어야 합니다. 분수 수집 구성표 옆에 있는 활성화 단추를 클릭합니다. 방법 설정에서 분수 크기 사용옆의 상자를 클릭합니다.
- 소프트웨어 상단의 단추로 저장을 클릭합니다. 파일의 이름을 "정화"합니다. 펌프 B 튜브는 500 mM imidazole 버퍼에 배치해야하는 동안 FPLC의 튜브는 imidazole없는 세척 버퍼에 배치해야합니다. 샘플 펌프 튜브는 100 mL 샘플에 배치해야합니다.
- "정제" 프로그램을 실행하고 60% 이소프로판올이 필요한 시간을 기다린다(세척 2). 프로그램을 일시 중지하고 펌프 A 튜브를 이미다졸 프리 워시에서 60 % 이소 프로판 올 워시로 옮기. 프로그램을 다시 시작합니다.
- 이소프로판올 단계가 완료되면 프로그램을 다시 일시 중지하고 펌프 A 튜브를 imidazole 없는 세척 버퍼로 다시 옮습니다. 정화 프로그램을 다시 시작합니다(나머지 실행은 자동화됩니다).
4. SDS-PAGE에 의한 순도 평가 및 단백질 식별
- (i) 유동관통(그의 컬럼에 결합하지 않은 세포 용해물), (ii) 워시 1, (iii) 워시 3(60% 이소프로판올 워시) 및 (iv) 별도의 50 mL 원엽 튜브에서 3을 세척하는 모든 분획을 결합한다. 용출 단계에서 2 mL 분획을 결합하지 마십시오.
- 풀링된 각 분획과 용출 단계의 모든 분획을 0.5 mL 미세원원지 튜브에 2x Laemmli 샘플 버퍼로 혼합하고 95°C에서 10분 동안 변성합니다.
- 단백질이 변성하는 동안, 1x 트리스 글리신 SDS-PAGE 러닝 버퍼에 3개의 얼룩이 없는 4-20% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 젤로 젤 러닝 장치를 설정한다.
- 분자량 마커의 8 μL을 겔의 다른 웰에 첫 번째 우물 및 30 μL의 변성 시료를 로드한다. 염료 전면이 젤의 바닥에 닿을 때까지 200V에서 젤을 실행합니다 (약 30 분). 장치에서 젤을 제거하고 탈이온수로 간단히 헹구어 보입니다. 얼룩이 없는 이미징 시스템을 사용하여 즉시 젤을 이미지화합니다.
- 올바른 크기(18.07 kDa)를 가진 단백질 밴드를 포함하는 분획을 확인합니다. 이러한 모든 분수를 풀합니다.
5. 서쪽 얼룩에 의한 단백질 식별
- 정제된 전신 단백질을 정체성화하기 위해 그의 특이적 항체(anti-6x HisTag)와 SHB 특이적 항체(167-D-IV)를 사용하여 웨스턴 블롯을 실행한다. 항-6x HisTag 항체는 단백질의 N말단을 인식하고 167-D-IV 항체는 전신 단백질의 존재를 입증하는 C 종단을 인식한다.
- (i) 유동-통과, (ii) 워시 1, (iii) 워시 2(60% 이소프로판올 워시), (iv) 세척 3, 및 280 nm의 흡광도에서 분광계 계측기와 용출 단계로부터의 모든 분획의 단백질 농도를 결정한다. 이 각 그룹에 대해 15 μL의 이미다졸 불함유 완충제에 100 ng의 단백질을 포함하는 희석을 생성합니다.
- 시료의 각 15 μL에 2x Laemmli 샘플 버퍼 15 μL을 추가하고 4.1 단계에서와 같이 변성하십시오. 일단 변이가 완료되면 모든 단백질이 전달될 수 있도록 튜브를 스핀다운합니다.
- 시료와 미리 염색된 마커를 얼룩이 없는 4-20% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔에 로드합니다. 염료 전면이 젤의 바닥에 도달 할 때까지 200V에서 전기 동거의 실행.
- 젤이 실행되는 동안, TBS-T (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 % 트웬 20)의 1 L과 TBS-T에서 5 % 무지방 우유의 200 mL을 만듭니다.
- 니트로셀룰로오스 막에 단백질을 전달하기 위해 서쪽 얼룩 전달 시스템을 사용하십시오. 미리 조립된 전사 스택을 사용하여 젤을 위에 놓습니다. 시스템을 25V에서 7분 동안 실행하도록 설정합니다.
참고: 모든 후속 단계는 실온(RT)에서 100rpm으로 설정된 궤도 셰이커에서 수행됩니다. - 이송이 완료되면, 각각 10분 동안 TBS-T로 두 번 블롯을 세척하십시오.
- 적어도 1 시간 동안 TBS-T에 5 % 무지방 우유로 니트로 셀룰로오스 멤브레인 (얼룩)을 차단하십시오.
- 1차 167-D-IV 및 항-6x 히스타그 항체를 TBS-T(스톡 Ab)에서 1 mg/mL로 희석한다. 167-D-IV 10,000배의 스톡 복근을 희석하고, 20mL의 TBS-T를 함유하는 2개의 다른 튜브에 스톡 안티6x 히스타그 항체의 2 μL및 4 μL의 스톡을 추가하여 5,000배의 히스타그(HisTag)를 5,000배 로 희석한다. 1차 항체의 총 20 mL 부피를 각 블롯에 추가하고, 1시간 동안 배양 블롯을 10분 동안 TBS-T로 2회 세척한다.
- TBS-T의 20 mL에서 알칼리성 인산염과 공액된 마우스 항인간 이차 항체의 1 mg/mL의 4 μL을 희석(1:5,000 희석). 20 mL의 TBS-T (1:5,000 희석)에서 알칼리성 인산염과 공액된 염소 항 마우스 보조 항체의 1 mg/mL의 4 μL을 희석한다. 해당 블롯에 보조 항체를 추가합니다.
참고: 항-인간 이차 항체는 167-D에 결합하고 반대로 마우스는 반대로 6x HisTag에 묶습니다. 10 분 동안 TBS-T로 두 번 블롯을 씻으하십시오. - BCIP/NBT 알칼리성 인산염 기판을 충분히 첨가하여 블롯을 덮습니다. 밴드가 나타날 때까지 약 10 분 동안 블롯을 개발하십시오. 차가운 수돗물로 얼룩을 헹구고 평판 스캐너로 스캔하기 전에 말리십시오.
6. SHB-SAPN 의 재접기
- 풀된 단백질(총 10\u201220 mL)을 투석 카세트 10kDa에 넣고 투석 카세트 8M 우레아, 20 mM 트리스, 5% 글리세롤, 5 mM TCEP pH 8.5를 RT(18\u201226 °C)에서 하룻밤 사이에 투석합니다.
- 투석 완충액에서 우레아 농도를 단계적으로 2M마다 2M씩 감소시킴으로써 시료에서 우레아를 천천히 투석한다. 2M의 우레아 농도에서 투석 장치를 4°C로 이동합니다(이 단계에서 투석 완충액에서 TCEP를 사용하지 마십시오). 샘플을 120 mM 우레아, 20 mM Tris, 5% 글리세롤, pH 8.5를 밤새 4°C로 투석하여 재접을 마칩니다.
- 투석 카세트에서 다시 접힌 단백질(SHB-SAPN)을 제거합니다. 0.22 μm 폴리비닐리덴 불소(PVDF) 주사기 파일러를 사용하여 SHB-SAPN을 걸러낸다. Aliquot SHB-SAPN을 멸균 튜브에 넣고 -80°C에서 동결시키고 후속 분석을 위해 RT에서 최소 100 μL을 남깁니다.
7. 크기와 모양에 의한 입자의 검증
- 동적 광 산란(DLS)
- 다음 매개 변수에 의해 SHB-SAPN의 평균 입자 크기를 측정: 재료로 단백질을 선택, 120 mM 우레아에 대한 복잡한 버퍼를 생성, 20 mM 트리, 온도 5 % 글리세롤 25 °C, 분석을위한 일회용 큐벳을 선택, 자동 을 선택 측정, 5 실행에 대 한 설정.
- 일회용 큐벳에 SHB-SAPN 45 μL을 추가하고 녹색 화살표를 클릭하여 소프트웨어를 실행합니다. 판독에 대한 백분율 볼륨을 선택합니다.
- 나노 입자 추적 분석 (NTA)
- 재접기 버퍼에서 샘플을 1:20으로 희석합니다. 희석된 시료 10 mL을 만듭니다.
- 3mL 주사기를 사용하여 NTA 계측기를 재접이식 버퍼로 세척하고 약 1.5mL의 시료를 로드하여 계측기를 평형화합니다. 나머지 샘플을 분석에 사용합니다.
- SOP 탭을 클릭하여 NTA 소프트웨어에서 새 SOP를 만듭니다. 탭에서 캡처 수를 3으로 변경하고 캡처 시간을 30s로 변경합니다. 화면 왼쪽의 자동 초점 버튼을 눌러 샘플을 초점으로 가져옵니다. 기계 측면의 수동 초점 노브를 사용하여 초점을 미세 조정합니다.
- 시스템에서 주사기로 소량의 샘플을 로드하라는 메시지가 표시되면 생성된 SOP를 실행합니다. 시스템이 모든 캡처를 촬영한 후 자동으로 분석 화면이 나타납니다. 모든 실제 파티클이 빨간색 십자가로 표시되도록 감지 제한 막대를 밉니다. 실행 분석 버튼을 누르면 분석이 자동으로 시작됩니다.
- 투과 전자 현미경 검사법 (TEM)
- 글로우 방전 폼바르/카본 400 메쉬 구리 TEM 지원 필름.
- 0.075 mg/mL 농도로 3 μL의 시료를 그리드에 추가하여 30s. 필터 페이퍼를 사용하여 액체를 꺼내보입니다.
- 3 μL의 탈이온수로 그리드를 세 번 세척하고, 매번 필터 페이퍼로 물을 배출합니다.
- 지지 필름에 0.5 % uranyl 아세테이트 3 μL을 추가하고 30 s. 우라날 아세테이트의 대부분을 떨어져 심지 하지만 표면에 얇은 필름을 둡니다. 견본이 전송 전자 현미경에 그(것)들을 화상 진찰하기 전에 건조하는 것을 허용하십시오.
- TEM에서 80 kV의 이미지 샘플.
8. 운동 리말루스 아메보세포 용해 (LAL) 분석기를 사용하여 샘플에서 내독소 수준의 결정
- 냉장고에서 키트와 샘플을 제거하고 RT와 평형화할 수 있습니다.
- 이러한 분석방법을 수행하기 위해서는, 37°C에서 405 nm의 파장에서 40개의 판독에 대한 열 블록 및 시료를 판독하는 능력을 가진 플레이트 리더가 요구된다. 시작 시점(첫 번째 읽기와 비교하여 OD가 0.2 증가)을 식별하기 위해 150초마다 웰을 읽을 수 있도록 프로그램 템플릿을 작성합니다.
- 샘플을 PBS에서 면역 용량 농도로 희석한다.
참고: 재접기 버퍼의 pH는 LAL 분석법의 범위를 벗어난다. PBS에서 샘플의 희석은 pH를 허용 가능한 범위로 설정합니다. - 50 EU/mL를 생성하기 위해 분석 인증서에 의해 결정된 바와 같이 내독소가 없는 LAL 물의 적절한 부피에서 제어 내독소를 다시 중단한다. 내독소의 완전한 재서스펜션을 보장하기 위해 15 분 동안 유리병을 힘차게 소용돌이치게합니다.
- 50 EU ~ 0.005 EU/mL 범위의 유리 바이알에서 10배 직렬 희석을 미리 형성하여 내독소 표준 곡선을 생성합니다. 각 희석에 대해 이전 희석의 0.1 mL를 LAL 물의 0.9 mL에 추가합니다. 소용돌이는 1 분 동안 조합 후 힘차게.
- 표준 곡선 희석및 SHB-SAPN 샘플을 96웰 플레이트에 복제하여 추가합니다. LAL 물을 복제물에서도 음의 대조군으로 사용하십시오. 플레이트를 37°C에서 15분 동안 미리 인큐베이팅합니다.
- 인큐베이션이 끝나갈 무렵, 2.6 mL의 LAL 물로 분석 시약 바이알을 다시 중단한다. 내용물과 혈청학적 파이펫을 부드럽게 섞으세요.
- 96웰 플레이트의 각 웰에 100 μL의 분석 시약을 첨가한다. 플레이트를 플레이트 판독기로 빠르게 이동하고 8.2단계에 기록된 프로그램 템플릿을 실행합니다.
- 프로그램이 완료되면 컨트롤의 로그 값과 시작 시간의 로그 값을 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 이 곡선에서 생성된 수식을 사용하여 샘플의 내독소 농도를 계산합니다.
Representative Results
여기서 도시된 완전히 조립된 SHB-SAPN은단량체 60부를 포함하는 입자로 접을 것으로 예상되는 단백질 서열(그림 1A)에 기초한다(도1B). 도 2는 SHB-SAPN 코어의 제조, 정제 및 식별방법에 대한 개요를 제공한다. 대장균은 SHB-SAPN 코어의 유전자 서열을 가진 pPep-T 발현 벡터를 함유한 글리세롤 스톡으로부터 BL21(DE3) 대장균에서 유도되었다. 세균성 세포는 성공적으로 성장하고 변성 및 감소 조건 하에서 lysed했다.
총 세포 용해액은Ni2+ 컬럼을 사용하여 FPLC에 의해 SHB-SAPN 단량체를 정제하는 데 사용되었다(도3A). FPLC 크로마토그래프는 단백질이 150 mM 및 500 mM 이미다졸(그림3A)에서모두 용출되었다는 것을 보여준다. 크로마토그램은 또한 이소프로판올 세척 및 이미다졸 프리 워시에 해당하는 185 mL 및 210 mL 총 부피에서 두 개의 다른 피크를 각각 나타낸다. 재조합 단백질의 분획 및 순도는 그라데이션 SDS-PAGE겔에 의해 확인되었다(도 3B). 관심 단백질은 주로 분획 68\u201279 (278\u2012300 mL 총 부피)에 위치하였다. 이러한 분획은 추가 분석을 위해 결합되었습니다. 항-그의 항체(N-말단) 및 167-D-IV 항체(C-종말)를 가진 웨스턴 블롯은 풀된 분획이 실제로 관심의 단백질임을 나타냈다(도4A,B). 이러한 블롯은 또한 SHB-SAPN 멀티머의 존재를 입증했다. 이전 의 세차 및 용출 분획은 다중 결합 된 단백질의 높은 농도를 포함하는 경향이 따라서 배제되었다.
관심 있는 단백질 단량체를 함유한 샘플을 투석에 의해 완전히 조립된 SHB-SAPN 내로 접혀하였다. 입자 크기 분포는 DLS 및 나노 입자 추적 분석(도5A,B)에 의해 결정되었다. DLS는 67 nm의 Z 평균 유체 역학 직경을 가진 입자를 확인했으며 NTA 시스템은 평균 크기81 nm를 측정했습니다. 약간의 크기 차이는 입자 크기 조정 기술로 인해 있었지만 두 분석의 크기는 20\u2012100nm 8,24,25의예상 범위에 있었습니다. SHB-SAPNs는 TEM에 의해 시각화되었고, 이미지는 두 개의 입자 크기 배분 기술로부터 얻어진 크기 분포를 가진 잘 형성된 개별 입자를 보였다(도5C).
단백질의 정제 동안, 컬럼은 최종 SHB-SAPN 제품에서 LPS 오염을 감소시키기 위해 이소프로판올로 세척하였다. 내독소 수준이 면역에 허용되는지 확인하기 위해, 이소프로판올 세척 단계유무에 관계없이 정제된 SHB-SAPN 샘플에서 LPS의 농도를 운동LAL 분석방식으로 결정하였다. 결과는 이소프로판올 세척이 내독소 수치를 SHB-SAPN 단백질의 0.010 EU/μg로 >0.25 EU/μg로 감소시키는 것으로 나타났다(표 1).
도 1: SHB-SAPN 단백질 서열 및 구조. (A) SHB-SAPN 단량체의 아미노산 서열. (B) 60개의 단백질 단량체로 구성된 완전히 조립된 SHB-SAPN 코어의 구조의 컴퓨터 모델. 아미노산 서열에 대한 색 구성표: 회색 = HisTag; 녹색 = 펜타머; 다크 블루 = 데 노보 디자인 트리머; 라이트 블루 = 6-나선 번들. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: SHB-SAPN 생산을 위한프로토콜. 색 구성표: 흑색 = 대장균에서단백질 단량체의 발현; 다크 그레이 = 단량체 정제; 중간 회색 = 단량체 식별; 연한 회색 = 다시 접기 및 특성화; 흰색 = 완전히 조립된 SHB-SAPN 제품. 어둡고 중간 회색으로 표지 된 단계에서, 단백질은 변성 및 감소 조건. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: SHB-SAPN 단량체의 단백질정제. (A) FPLC 정제로부터의 크로마토그래프. 크로마토그램 위의 녹색 선은 정제 단계를 나타낸다. 크로마토그램의 청색선은 280 nm 파장에서 분획의 광학 밀도를 나타낸다. 블랙 라인은 정제의 각 단계에서 사용된 완충B(8M 우레아, 20 mM Tris, 50 mM 인산나트륨 모노베이직, 5 mM TCEP, 500 mM 이미다졸, pH 8.5)의 백분율을 나타낸다. (B) 용해물 (L), 유동 (FT), 첫 번째 세척 (W1), 이소 프로판 올 워시 (W2), 세 번째 세척 (W3) 및 150 mM imidazole (E150) 및 500 mM 이미다졸 (E500) elution에서 개별 분획에서 풀화 된 분획의 SDS-PAGE 겔 정화. 첫 번째 레인(M)의 분자 마커는 10~250kDa 사이의 대역을 식별합니다. 표적 단백질은 검은 색 화살표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 서쪽 얼룩에 의한 단백질의 식별. 모든 레인에는 100 ng의 단백질이 들어 있습니다. (A) 안티 6x HisTag와 서쪽 얼룩의 결과. (B) 167-D-IV HIV-1 단일클론 항체를 가진 서쪽 얼룩의 결과. 차선은 다음과 같이 표기됩니다: M = 분자량 마커; 1 = 포세이트; 2 = 흐름을 통해; 3 = 첫 번째 세척; 4 = 이소프로판올 세척(두 번째 세척); 5 = 세 번째 세척; 6 = 풀풀된 볼륨 분수 56\u201261(첫 번째 용출 피크), 7 = 풀풀된 볼륨 파벌 62\u201267(두 피크 사이), 8 = 풀풀된 볼륨 분수 68\u201278(두 번째 용출 피크) 단모성 SHB-SAPN 대역으로서 18.07 kDa의 예상 대역 크기를 가진 표적 단백질은 검은 색 화살표로 지시된다. 7번 과 8번 차선의 추가 밴딩은 SHB-SAPN(빨간색 화살표)의 디머, 트리머 및 멀티머입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 재접힌 SHB-SAPN의 특성화. (A). DLS에 의해 결정된 입자 크기 분포. (B) 나노 입자 추적 (시스템)에 의해 결정 된 입자 크기. (C) TEM에 의한 SHB-SAPN 입자의 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 샘플 | 내독소 (EU/mL) | 내독소 (단백질의 EU / μg) |
| 이소프로판올 워시를 곁들인 SAPN | 2.02 | 0.01 |
| 이소프로판 올 워시가 없는 SAPN | >50 | >0.25 |
| 네거티브 컨트롤 | 아래 검출 수준 | 해당/A |
표 1: 다시 접힌 SHB-SAPNs의 내독소 수준. SHB-SAPN 단백질의 내독소 단위/mL 및 내독소 단위/μg로 제시된 이소프로판 세척유무에 관계없이 정제된 SHB-SAPN 샘플의 내독소 수치.
Discussion
나노 기술은 하위 단위 백신 개발을위한 많은 장점과 솔루션을 제공합니다. 나노백신은 항원을 숙주 면역계통에 미립자로 반복적으로 제시하여 면역원성을 증가시키는26. 나노 백신의 많은 다른 모형이 있는 동안, 우리는 de novo 디자인한 단백질로 구성된그들 백신 발달을 위한 강한 접근이 될 것 같다는 것을 믿습니다 1. 그(것)들은 호스트 단백질에 어떤 순서 상동성도 없이 설계되고 낮은 생산 비용 및 높은 제품 수율을 제공하면서 네이티브 같이 형성에 가까운 관심의 항원을 제시할 수 있습니다. 이 접근법의 대표적인 예는 여러 전염병에 대한 백신에 적용한 SAPN 기술 7입니다. HIV-1 백신 개발의 어려움을 해결하기 위해, 우리는 효과적으로 네이티브 같은 트리메라 형태 9에서 V1V2 항원을제시하기 위해 독특한 SHB-SAPN 코어를 설계했다. 많은 백신 표적, 특히 바이러스 성 질환에 대한, 트리머 (27)로 존재한다. 이 현상은 우리의 SAPN 설계가 하위 단위 백신의 개발에 광범위한 영향을 미친다는 것을 나타냅니다.
이 방법에서는 대장균 발현 시스템에서 SHB-SAPNS를 생성하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 단백질의 높은 수율을 표현 (약 6 mg/100 배양의 mL). 단백질은 10개의 히스티딘을 함유하고Ni2+ 컬럼을 이용한 고정화 금속 친화도 크로마토그래피를 사용하여 쉽게 정제되었다. His-Tag의 이 길이는 가장 높은 단백질 수율에 최적인 것으로 나타났습니다. 정제된 단백질은 N-말단 HisTag 및 C 말단 heptad 반복의 존재에 의해 지시된 바와 같이 설계된 단백질의 전체 길이를 함유하였다. 우리는 널리 인정되는 기술을 활용하고 SHB-SAPN 코어의 표현, 생산 및 특성화에 최적화했습니다. 새로운 단백질 에피토프를 함유하는 SAPN의 개발 동안 전신 단백질의 생산부족은 숙주 세포에서 유전자의 발현 문제를 나타낼 수 있었다. 이 경우 유전자 및 발현 시스템은 기재된 프로토콜에 맞게 재설계및 조정되어야 합니다. 초음파 처리 시간 또는 강도의 변형은 또한 예측된 전체 길이 단백질의 농도를 증가시킬 수 있다.
재접립된 입자는 DLS 및 나노입자 추적 분석에 의해 결정된 바와 같이예상크기 범위(20~ 100 nm) 8,24,25였다. 이러한 결과는 TEM을 사용하여 추가로 확인되었다. 이 단계에서 문제가 있는 경우, 일반적으로 재접이식 버퍼의 pH 또는 이온 강도에 대한 문제 때문입니다. 입자 크기 조정 기술에서 큰 크기의 입자가 감지되면 재접이식 버퍼의 pH를 증가시켜 피할 수 있는 집계를 나타냅니다. 입자가 DLS에 의해 검출되지 않으면 단백질의 농도를 확인하고 버퍼의 pH를 확인하십시오. DLS에 대한 최종 단백질 농도는 적어도 100 μg/mL이어야 합니다. 농도가 문제가되지 않는 경우, 그것은 그 농도가 pH를 감소시킴으로써 감소 될 수있는 작고 불완전하게 형성 된 입자의 풍부를 나타냅니다. 대안적으로, 염화나트륨 농도는 원치 않는 크기의 입자의 존재를 최소화하기 위해 최적의 범위로 조절될 수 있다.
마지막으로, 정화 중에 이소프로판올 세척 단계를 사용하여 주사용 제품에 대한 체중 5 EU/kg의 미국 식품의약국(FDA) 한도 미만인 SAPN의 호스트 대장균에서 오염되는 LPS를 0.01 EU/μg로 줄일 수 있었습니다. 28. 이 레벨은 Q 열이라고도 하는 음이온 교환 열을 사용하여 더 줄일 수 있습니다. 높은 수준의 내독소가 여전히 존재하는 경우 버퍼 준비에 사용 된 모든 재료를 확인하십시오. 이 방법은 depyrogenated 유리 제품 및 내독소 무료 플라스틱 제품을 사용하는 것을 기억하십시오.
이러한 결과는 전임상 예방 접종 연구에 사용될 수 있는 SHB-SAPN 코어를 생산하는 방법을 성공적으로 개발했음을 나타냅니다. 이 방법은 약간의 변형만으로, 만약 있는 경우, 관심 있는 항원이 첨가될 때 SHB-SAPN의 정제에 적용될 수 있다. 이 방법을 시작점으로 사용하는 것은 용출 단계에 있습니다. 다른 단백질은 실험적으로 결정되어야 하는 다른 imidazole 농도에서 용해됩니다. 다른 주요 차이점은 다시 접는 버퍼의 구성일 수 있습니다. 최적화를 위해서는 이온 강도뿐만 아니라 다양한 pH 조건을 테스트해야 합니다.
향후 작업을 고려하여 SHB-SAPN을 인간으로 적용하려면 두 가지 약간의 수정만 필요합니다. 첫 번째는 인간29의암피실린 알레르기로 인해 발현 벡터가 카나마이신 저항성 선택 가능한 마커로 변경될 필요가 있다는 것이다. 인간 사용을 위한 단백질 제조의 다른 주요 요구 사항은 동물성 제품 없는 매체에서 SHB-SAPN을 생산하는 것입니다. 소규모 연구는 이미 식물 기반 매체에서 단백질의 합리적인 수율을 나타냈다. 여기에 제시된 일은 말라리아 백신 후보, FMP01416으로입증된 바와 같이 궁극적인 GMP 생산을 위해 쉽게 확장가능합니다. 이 대규모 FMP014-SAPN 생산에는 음이온 교환 및 양이온 교환 단계가 모두 포함되어 있어 최종 제품에서 LPS 및 Ni2+ 함량을 더욱 감소시켰습니다. 이 세균 성 발현 SAPN은 이미 곧 단계 1/2a 임상 시험을 위해 확장되었습니다.
Disclosures
표현된 견해는 저자의 견해이며 미육군이나 국방부의 입장을 대변하는 것으로 해석되어서는 안 됩니다. 피터 버크하르트는 알파-O 펩타이드 AG라는 회사에 관심을 가지고 있으며 이 기술에 대한 특허를 보유하고 있습니다. 다른 저자는 이 백서에 제시된 주제에 대해 재정적 이해관계가 있는 회사와 어떠한 제휴 나 재정적 관여도 하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 군사 의학의 발전을위한 헨리 M 잭슨 재단 사이의 협력 협정 (W81XWH-11-2-0174)에 의해 지원되었다, Inc., 미국 국방부. 항 HIV-1 gp41 mAb 167-D IV 항체는 NIH 에이즈 시약 프로그램을 통해 수잔 졸라-파스너 박사로부터 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris/Glycine/SDS | BioRad | 1610732 | 1 L |
| 2-Mercaptoethanol | BioRad | 1610710 | 25 mL |
| 2-propanol | Fisher | BP26181 | 4 L |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610737 | 30 mL |
| 40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers | Malvern Panalytical | ZEN0040 | 100 pack |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | BioRad | 4561093 | 10 pack |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | 25 g |
| Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] | AbCam | ab18184 | 100 mg |
| Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) | AIDS Reagent Repository | 11681 | 100 mg |
| BCIP/NBT Substrate, Solution | Southern Biotech | 0302-01 | 100 mL |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-108 | A variety of sizes |
| Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm | Ted Pella, Inc | 01754-F | 25 pack |
| GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns | GE HealthCare | 45-000-325 | 5 pack |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | 4 L |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) | ABCam | ab97020 | 1 mg |
| Imidazole | Fisher | O3196-500 | 500 g |
| Instant NonFat Dry Milk | Quality Biological | A614-1003 | 10 pack |
| Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay | Lonza Walkersville | 50650U | 192 Test Kit |
| LAL Reagent Grade Multi-well Plates | Lonza Walkersville | 25-340 | 1 plate |
| Magic Media E. coli Expression Medium | ThermoFisher | K6803 | 1 L |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters | Millipore | SLGV033RB | 250 pack |
| Mouse Anti-Human IgG Fc-AP | Southern Biotech | 9040-04 | 1.0 mL |
| One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli | ThermoFisher | C601003 | 20 vials |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, | BioRad | 1610363 | 1 mL |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL | ThermoFisher | 66810 | 8 pack |
| Sodium Chloride | Fisher | BP358-212 | 2.5 kg |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | BP329-500 | 500 g |
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | 1 kg |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Biosynth International | C-1818 | 100 g |
| Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S | Electron Micoscopy Services | 541-09-3 | 25 g |
| Urea | Fisher | BP169-500 | 2.5 kg |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma Aldrich | WHA10010155 | pack of 500 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| ChromLab Software ver 4 | BioRad | 12009390 | Software |
| Epoch 2 Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2 | Plate Reader |
| Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor | ThermoFisher | 096-145075 | Rotor |
| Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Gel Imager for Stain free Gels |
| JEOL TEM | JEOL | 1400 | Transmission Electron Microscope |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BioRad | 1658004 | To run gels |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | For Protein Concentration |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| NanoSight NTA software NTA | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| New Brunswick Innova 44/44R | Eppendorf | M1282-0000 | Incubator/Shaker |
| NGC Quest 10 Chromatography System | BioRad | 7880001 | FPLC to aid in protein purification |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella, INC | 91000S | To clean grids |
| PowerPac Universal Power Supply | BioRad | 1645070 | To run gels |
| Rocker Shaker | Daigger | EF5536A | For Western |
| Sonifer 450 | Branson | also known as 096-145075 | Sonicator |
| Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher | 75-006-580 | Centrifuge |
| Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs | BioRad | 1704158 | For Western |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 | For Western |
| Vortex-Genie 2 | Daigger | EF3030A | Vortex |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| Zetasizer Software | Malvern Panalytical | Particle Sizing |
References
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