Summary
En detaljerad metod finns här som beskriver rening, refolding, och karakterisering av självassemblerande proteinnanopartiklar (SAPNs) för användning i vaccinutveckling.
Abstract
Självassemblerande proteinnanopartiklar (SAPNs) fungerar som repetitiva antigen skärmar och kan användas för att utveckla ett brett spektrum av vacciner för olika infektionssjukdomar. I denna artikel visar vi en metod för att producera en SAPN kärna som innehåller en sex-Helix bunt (SHB) församling som kan presentera antigener i en trimeric konformation. Vi beskriver uttrycket av SHB-SAPN i ett E. coli -system, liksom de nödvändiga protein reningsstegen. Vi inkluderade en isopropanol tvätta steg för att minska resterande bakteriell lipopolysackarid. Som en indikation på protein identitet och renhet, proteinet reagerade med kända monoklonala antikroppar i västerländska blot analyser. Efter uppfällning, föll storleken på partiklarna i det förväntade intervallet (20 till 100 nm), vilket bekräftades av dynamisk ljusspridning, nanopartiklar spårningsanalys, och transmissionselektronmikroskopi. Den metod som beskrivs här är optimerad för SHB-SAPN, men med endast smärre ändringar kan den tillämpas på andra SAPN konstruktioner. Denna metod är också lätt att överföra till storskalig produktion för GMP-tillverkning för humanvaccin.
Introduction
Medan traditionell vaccinutveckling har fokuserat på inaktiverade eller försvagade patogener, har fokus för moderna vacciner skiftat mot subenhet vacciner1. Detta tillvägagångssätt kan leda till ett mer målinriktat svar och potentiellt mer effektiva vaccinkandidater. Men en av de viktigaste nackdelarna är att subenhet vacciner inte partiklar som hela organismer som kan resultera i minskad immunogenicitet2. En nanopartikel som ett repetitivt antigen visningssystem kan ha fördelarna med både den riktade subenhet-vaccinmetoden samt partikel karaktären hos hela organismen1,3.
Bland de befintliga typerna av nanovaccines, rationellt utformade protein sammansättningar möjliggör utformning och utveckling av vaccinkandidater som kan presentera flera kopior av antigen potentiellt i en infödd-liknandekonformation1,4 ,5,6. Ett exempel på dessa protein sammansättningar är självassemblerande proteinnanopartiklar (SAPNs)7. SAPNs är baserade på coiled-Coil domäner och är traditionellt uttrycks i Escherichia coli8. Sapn-vaccinkandidater har utvecklats för en rad olika sjukdomar som malaria, sars, influensa, toxoplasmos, och hiv-19,10,11,12,13 , fjorton , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. utformningen av varje sapn kandidat är specifik för patogenen av intresse, dock, produktion, rening och omläggning tekniker är i allmänhet i stort sett tillämpliga.
Ett av våra nuvarande intressen är ett effektivt HIV-1-vaccin. I RV144 – den enda kliniska fas III-prövningen av ett hiv-1-vaccin som visade måttlig effekt – var den minskade infektionsrisken korrelerad med IgG-antikroppar mot V1V2-slingan av kuvert proteinet20,21. Den infödda-liknande trimeric presentationen av denna region tros vara viktig för skyddande immunogenicitet22. För att presentera V1V2 loop i så nära infödda-liknande konformation som möjligt, vi utvecklat ett bevis på principen SAPN vaccinkandidat som innehöll HIV-1 kuvert efter fusion Six-Helix Bundle (SHB) att presentera V1V2 slingan i rätt konformation9 . Denna kandidat erkändes av kända monoklonala antikroppar mot HIV-1 kuvert protein. Möss immuniserade med V1V2-SHB-sapn upp V1V2 specifika antikroppar, som, viktigast av allt, bunden till gp70 V1V2, rätt överensstämande epitoper9. SHB-SAPN Core kan ha andra funktioner utöver rollen som bärare för HIV-1 V1V2 loop. Här beskriver vi en detaljerad metodik för uttrycket, rening, refolding, och validering av SHB-SAPN kärna. Sekvensvalet, nanopartiklar-designen, den molekylära kloningen och omvandlingen av E. coli har beskrivits tidigare9.
Protocol
1. uttryck för SHB-SAPN-proteinet i E. coli BL21 (de3)
- Blanda 95 mL av komponenten A och 5 mL av beståndsdelen B i mediet i en 2 L steril glas Erlenmeyer-kolv enligt tillverkarens anvisningar (se material tabellen). Tillsätt ampicillin till en slutlig koncentration på 100 μg/mL.
- Inokulera mediet med E. coli från en tidigare etablerad glycerolbeståndets kultur. Inkubera kulturen vid 30 ° c med skakning vid 200 varv per minut (rpm) för 48 h.
Anmärkning: den begagnade E. coli BL21 (de3) lager innehöll ampicillin resistenta uttryck vektor23 med SHB-sapn genen. Även om det allmänna protokollet av massmedia rekommenderar 24 h av inkubation på 37 ° c, 48 h av inkubation på 30 ° c gav högre avkastning för SHB-SAPN. - Överför kulturen till 2 50 mL koniska rör. Centrifugera rören vid 4 000 x g i 10 min med en fast vinkel rotor vid 4 ° c. Ta bort supernatanten och spara pelleten för att skörda celler.
Anmärkning: cellpelleten kan antingen bearbetas omedelbart eller frysas vid-80 ° c fram till användning.
2. lys av E. coli BL21 (de3) av ultraljudsbehandling
Anmärkning: Använd icke-pyrogena plasticware och glasvaror bakade vid 250 ° c i minst 30 min. tris (2-karboxyethyl) fosfin (TCEP) som reduktionsmedel bryter disulfidbindningar inom och mellan proteiner. TCEP är nödvändigt i buffertarna under detta protokoll om det visade antigenet innehåller S-S-bindningar. Endast för SHB-SAPN kärna, förekomst av TCEP i buffertarna är inte nödvändigt.
- Förbered Imidazol-fri buffert (8 M urea, 50 mM natriumfosfat monobasic, 20 mM Tris bas, 5 mM TCEP) pH 8,0 (justerat med 5 N NaOH) och filtrera den med hjälp av en 0,22 μm vakuumflaska filtreringsenhet.
- Omsuspendera de pelleterade cellerna (från steg 1,3) med 40 mL Imidazol-fri buffert i 1 50 mL koniskt rör. Sonikera de återsuspenderade cellerna med en sond på is för 5 min (4 s av ultraljudsbehandling, 6 s av vila) med en ultraljudsbehandling utgång 150 W.
- Centrifugera det cellulära lysatet (40 mL) vid 29 000 x g vid 4 ° c i 25 minuter i en fast vinkel rotor för att generera klarlagd supernatant. Överför supernatanten till en 150 mL steril kolv och kassera pelleten. Späd supernatanten till 100 mL med hjälp av den Imidazol-fria bufferten (senare i det protokoll som kallas "prov").
Anmärkning: detta utspädningssteg behövs för att förhindra att FPLC-systemets tryck blir för högt under lysatbelastning på kolonnen.
3. Proteinrening med hjälp av en his-kolonn
Anmärkning: detta protokoll utfördes med hjälp av ett FPLC-instrument, men det kan anpassas till gravitationens flöde.
- Förbered följande buffertar och filtrera dem med en 0,22 μm vakuumflaska filtreringsenhet: (i) Imidazol-fri buffert "buffert A" (8 M urea, 50 mM natriumfosfat monobasic, 20 mM Tris bas, 5 mM TCEP) pH 8,0; II) 500 mM imidazolbuffert "buffert B" (8 M urea, 50 mM natriumfosfat monobasic, 20 mM Tris bas, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazol) pH 8,0; och (III) isopropanoltvätt (20 mM Tris, 60% isopropanol) pH 8,0.
Anmärkning: pH för varje buffert justerades med 5 N NaOH. - Equilibrate his-kolonnen.
Anmärkning: för Lab skala produktion använder detta protokoll en 5 mL färdigförpackade sin kolumn, men alla större storlek kolumn kan användas.- Öppna FPLC-programvaran och klicka på alternativet ny metod . Den öppnas omedelbart till menyn Metodinställningar . Under rullgardinsmenyn för KolumnPosition väljer du C1-Port 3.
- Välj tillhörighetpå rullgardinsmenyn som visas med teknik . På rullgardinsmenyn kolumntyp väljer du andra, histrap HP, 5 ml. Kolumn volymen och tryck rutorna ställs automatiskt in på lämpliga värden.
- Klicka på knappen metod disposition . Dra följande knappar från popup-menyn för fas biblioteket : jämvikts, prov applikation, kolumn tvättoch eluering bredvid pilen i den exakta ordningen. Stäng menyn för fas bibliotek .
- Klicka på knappen jämvikts . Värdena som anges i tabellen ska vara "initial buffert B" (4%), "Final buffer B" (4%) och "Volume (CV)" 5.
- Klicka på rutan exempel program . I rutan prov lastning klickar du på alternativknappen för att injicera provet på kolumn med prov pumpen. Se till att rutan bredvid Använd flödeshastighet från Metodinställningar kontrolleras i provet injektion med system pump box. Bredvid volym rutan på skärmens högra sida ändrar du värdet till 20 ml.
- Klicka på knappen kolumn tvätt . Värdena som anges i tabellen ska vara "initial buffert B" (4%), "Final buffer B" (4%) och "Volume (CV)" 5. Bredvid insamlings schema för bråk, avmarkera kryssrutan Aktivera.
- Klicka på elueringsknappen. Värdena som anges i tabellen ska vara "initial buffert B" 0%, "Final buffer B" 100% och "Volume (CV)" 5. Klicka på rutan Aktivera bredvid insamlings schema för bråk. Klicka på Använd bråk tals storlek från Metodinställningar och justera bråk storleken till 4 ml i rutan Fyll i nedan.
- Klicka på knappen Spara som överst i programvaran. Namnge filen "equilibration".
- Anslut en 5 mL färdigförpackad his-kolonn till motsvarande kolumn Port 3 på FPLC. Både pump A och pump B slangar samt provet pumpslangar bör placeras i 0,22 μm filtreras avjoniserat vatten. Kör jämvikts programmet.
- Placera både pump a och pump B samt provtagnings pumpens slangar i den Imidazol-fria bufferten (buffert a) och kör jämvikts-protokollet igen.
- Bind provet till kolonnen och rena proteinet.
- Öppna FPLC-programvaran och klicka på alternativet ny metod . Den öppnas omedelbart till menyn Metodinställningar . Under rullgardinsmenyn för kolumnposition väljer du C1-Port 3. Välj tillhörighetpå rullgardinsmenyn som visas med teknik . På rullgardinsmenyn kolumntyp väljer du andra, Histrap HP, 5 ml. Kolumn volymen och tryck rutorna ställs automatiskt in på lämpliga värden.
- Klicka på knappen metod disposition . Dra knapparna från popup-menyn för fas biblioteket : jämvikt, prov applicering, kolumn tvätt (tvätt 1), spalt tvätt (tvätt 2), spalt tvätt (tvätt 3) och eluering bredvid pilen i den exakt ordning. Stäng menyn för fas bibliotek .
- Klicka på knappen Equilibration . Värdena som anges i tabellen ska vara "initial buffert B" 4%, "Final buffer B" 4% och "Volume (CV)" 5.
- Klicka på rutan exempel program . Klicka på alternativknappen för inject prov på kolumn med prov pumpi rutan prov lastning. Se till att rutan bredvid Använd flödeshastighet från Metodinställningar kontrolleras i provet injektion med system pump box.
- Bredvid volym rutan till höger på skärmen ändrar du värdet till 100 mL. Bredvid insamlings schema för bråk Klicka på knappen Aktivera . Avmarkera rutan Använd bråk storlek från Metodinställningar och ändra sedan bråk storleken till 4 ml.
- Klicka på den första kolumnen tvätta knappen (tvätta 1). Värdena som anges i tabellen ska vara "initial buffert B" 4%, "Final buffer B" 4% och "Volume (CV)" 10. Klicka på rutan Aktivera bredvid insamlings schema för bråk. Unclick den använda fraktion storlek från metod infattningarna och då ändra den bråk storlek till 4 ml.
- Klicka på den andra kolumnen tvätta knappen (tvätta 2). Värdena som anges i tabellen ska vara "initial buffert B" 0%, "Final buffer B" 0% och "Volume (CV)" 5. Klicka på rutan Aktivera bredvid insamlings schema för bråk. Unclick den använda fraktion storlek från metod infattningarna och då ändra den bråk storlek till 4 ml.
- Klicka på den tredje kolumnen tvätta knappen (tvätta 3). Värdena som anges i tabellen ska vara "initial buffert B" 0%, "Final buffer B" 0% och "Volume (CV)" 5. Klicka på Aktiverabredvid insamlings schema för bråk. Avmarkera rutan Använd bråk storlek från Metodinställningar och ändra sedan bråk storleken till 4 ml.
- Klicka på Elueringsknappen. I tabellen högerklickar du på informationen som visas och klickar på ta bort stegpå menyn som kommer upp. Dra den isokratiska övertoningsknappen till tabellen två gånger, så att det finns två poster.
- Värdet för den första posten ska läsa "initial buffert B" 30%, "Final buffer B" 30% och "Volume (CV)" 10. Värdet för den andra posten ska läsa "initial buffert B" 100%, "Final buffer B" 100% och "Volume (CV)" 10. Bredvid insamlings schema för bråk Klicka på knappen Aktivera . Klicka på rutan bredvid Använd bråk tals storlek från Metodinställningar.
- Klicka på knappen Spara som överst i programvaran. Namnge filen "rening". Pumpa en slang av FPLC bör placeras i Imidazol-fri tvättbuffert medan pumpen B slangen bör placeras i 500 mM Imidazol buffert. Provtagnings pumpens slangar ska placeras i 100 mL-provet.
- Kör "rening" programmet och vänta på den tid då 60% isopropanol behövs (tvätta 2). Pausa programmet, flytta pumpen en slang från Imidazol-fri tvätt i 60% isopropanol tvätta. Starta om programmet.
- När isopropanol steg är klar, pausa programmet igen och flytta pumpen en slang tillbaka till Imidazol-fri tvättbuffert. Starta om Reningsprogrammet (resten av körningen är automatiserad).
4. bedömning av renhet och protein identifiering genom SDS-PAGE
- Kombinera alla fraktioner som motsvarar (i) genomflöde (cellen lysate som inte binder till hans kolumn), (II) tvätta 1, (III) tvätta 3 (60% isopropanol tvätt), och (IV) tvätta 3 i separata 50 mL koniska rör. Kombinera inte 2 mL-fraktionerna från elueringstegen.
- Blanda 15 μL från var och en av de sammanslagna fraktionerna och alla fraktioner från elutionssteg med 2x Laemmli provbuffert i ett 0,5 mL microcentrifugerör och denaturera dem vid 95 ° c i 10 min.
- Medan proteinhalten denaturerar, Ställ in gel Running apparaturen med 3 fläck fria 4 – 20% prefabricerade polyakrylamidgeler i 1x Tris-Glycine SDS-PAGE löpbuffert.
- Ladda 8 μL molekylvikt markör till den första brunnen och 30 μL denaturerat prov till de andra brunnarna i gelen. Kör gelen vid 200 V tills Dye fronten träffar botten av gelen (ca 30 min). Ta bort gelen från apparaten och skölj snabbt med avjoniserat vatten. Avbilda gelen omedelbart med hjälp av det fläck fria avbildnings systemet.
- Identifiera fraktioner som innehåller protein band med rätt storlek (18,07 kDa). Pool alla dessa fraktioner.
5. protein identifiering genom Western blot
- Kör en Western blot med en hans-specifik antikropp (anti-6x HisTag) och en SHB-specifik antikropp (167-D-IV) för att identiteten det renade fullängds proteinet. Anti-6x HisTag antikroppen erkänner N ändstationen av proteinet och 167-D-IV antikroppen erkänner C terminus visar närvaron av fullängds proteinet.
- Bestäm protein koncentrationen av (i) genomströmning, (II) tvätta 1, (III) tvätta 2 (60% isopropanoltvätt), (IV) tvätta 3, och alla fraktioner från elutionsstegen med spektrometerinstrumentet vid en absorbans på 280 nm. Generera utspädningar som innehåller 100 ng av protein i 15 μL av Imidazol-fri buffert för var och en av dessa grupper.
- Tillsätt 15 μL 2x Laemmli-provbuffert till varje 15 μL av proverna och denaturera dem som i steg 4,1. När denatureringen är avslutad snurra rören för att säkerställa att allt protein kan överföras.
- Lastprover och den förfärgade markören i en fläck fri 4 – 20% prefabricerad polyakrylamidgel. Kör elektrofores vid 200 V tills färgen framsidan når botten av gelen.
- Medan gelen går, gör 1 L av TBS-T (20 mM Tris, 150 mM NaCl, och 0,1% Tween 20) och 200 mL 5% fettfri mjölk i TBS-T.
- Använd ett Western blot-överföringssystem för att överföra protein till ett nitrocellulosamembran. Använd en förmonterad överförings stack och placera gelen på den. Ställ in systemet så att det körs vid 25 V i 7 min. Kontrollera om den förfärgade markören på nitrocellulosa membranet visar en fullständig överföring.
Obs: alla efterföljande steg utförs på en orbitalshaker inställd på 100 rpm vid rumstemperatur (RT). - När överföringen är klar, tvätta blotting två gånger med TBS-T för 10 min vardera.
- Blockera nitrocellulosa membran (blot) med 5% fettfri mjölk i TBS-T för minst 1 h. Tvätta blotting två gånger med TBS-T för 10 min vardera.
- Späd de primära 167-D-IV-och anti-6x-HisTag-antikropparna till 1 mg/mL i TBS-T (Stock AB). Späd beståndet ABS av 167-D-IV 10 000-faldigt och anti-6x HisTag 5 000-faldigt genom att tillsätta 2 μL av beståndet 167-D-IV och 4 μL av beståndet anti-6x HisTag antikroppar mot två olika rör som innehåller 20 mL TBS-T. Tillsätt den totala 20 ml-volymen av primära antikroppar, en till varje blot, och inkubera blotting för 1 h. Tvätta blotting två gånger med TBS-T för 10 min.
- Späd 4 μL av 1 mg/mL av musens anti-humana sekundära antikropp konjugerat med alkaliskt fosfatas i 20 mL TBS-T (1:5000 spädning). Späd ut 4 μL av 1 mg/mL av sekundär antikropp med Get-antimus som konjugerat med alkaliskt fosfatas i 20 mL TBS-T (1:5000 spädning). Lägg till sekundära antikroppar till motsvarande blots.
Anmärkning: anti-human sekundär antikropp binder till 167-D och anti-mus binder till anti-6x HisTag. Tvätta blotting två gånger med TBS-T i 10 min. - Tillsätt tillräckligt med BCIP/NBT alkaliskt fosfatassubstrat för att täcka blots. Utveckla blotting i ca 10 min tills banden visas. Skölj blotting med kallt kranvatten och låt dem torka innan du skannar med en flatbäddsskanner.
6. uppfällning av SHB-SAPN
- Tillsätt det poolade proteinet (10 \ u201220 mL totalt) till en 10 kDa molekylvikt cut off dialys kassett och dialyze det till 8 M urea, 20 mM Tris, 5% glycerol, 5 mM TCEP pH 8,5 vid RT (18 \ u201226 ° c) över natten.
- Långsamt dialyze urea av provet genom att minska urea koncentrationen i dialys buffert stegvis med 2 M varje 2 h. Vid en urea koncentration på 2 M, flytta dialys apparaten till 4 ° c (Använd inte TCEP i dialys bufferten från detta steg). Avsluta omveckningen genom att dialysera provet i 120 mM urea, 20 mM Tris, 5% glycerol, pH 8,5 vid 4 ° c över natten.
- Ta bort det omvikta proteinet (SHB-SAPN) från dialys kassetten. Filtrera SHB-sapn med ett 0,22 μm av polyvinylidenklorid fluorid (PVDF) spruta filer. Till sterila rör och frysa dem vid-80 ° c och lämna minst 100 μL vid RT för efterföljande analyser.
7. validering av partiklar efter storlek och utseende
- Dynamisk ljusspridning (DLS)
- Mät den genomsnittliga partikelstorleken för SHB-SAPN med följande parametrar: Välj protein som material, skapa en komplex buffert för 120 mM urea, 20 mM Tris, 5% glycerol 25 ° c för temperatur, Välj engångscuvettes för analysen, Välj automatisk mätning, inställd för 5 körningar.
- Tillsätt 45 μL SHB-SAPN till en disponibel kuvette och kör programvaran genom att klicka på den gröna pilen. Välj procent volym för avläsning.
- Analys av nanopartikel-spårning (NTA)
- Späd provet med 1:20 i uppfällningsbufferten. Gör 10 mL utspätt prov.
- Använd 3 mL sprutor, spola NTA-instrumentet med den återfällbara bufferten och fyll på ca 1,5 mL prov för att jämtera instrumentet. Använd resten av provet för analysen.
- Skapa en ny SOP i NTA-programvaran genom att klicka på fliken SOP . Under fliken ändra antalet fångar till 3 och ändra inspelningstiden till 30 s. Tryck på autofokusknappen på skärmens vänstra sida för att ta provet i fokus. Använd den manuella fokuseringsratten på maskinens sida för att finjustera skärpan.
- Kör den skapade SOP, när systemet frågar Ladda en liten volym av provet med sprutan. När systemet har tagit alla fångar det kommer automatiskt att ta upp analys skärmen. Skjut detektionsgräns fältet så att alla riktiga partiklar är markerade med röda kors. Tryck på knappen Kör analys så startar analysen automatiskt.
- Transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- Glöd urladdning formvar/Carbon 400 mesh koppar TEM stöd filmer.
- Tillsätt 3 μL prov i koncentrationen 0,075 mg/mL till rutnätet i 30 s. veken av vätskan med hjälp av ett filtrerpapper.
- Tvätta rutnätet med 3 μL avjoniserat vatten tre gånger, varje gång du transporterar bort vattnet med filtrerpapper.
- Tillsätt 3 μL av 0,5% uranylacetat till stöd filmen och låt den sitta i 30 s. Wick av de flesta av uranyl acetat men lämna en tunn film på ytan. Låt proverna torka innan du avbildar dem på transmissions elektronmikroskopet.
- Bild prov vid 80 kV på ett TEM.
8. bestämning av endotoxinhalter i proverna med hjälp av en kinetisk Limulus immobiliserat lysate (LAL)-analys
- Ta bort satsen och proverna från kylskåpet och låt den jämbrera till RT.
- För att utföra denna analys krävs en Plattläsare med ett värmeblock och möjligheten att läsa proverna för 40 vid en våglängd på 405 nm vid 37 ° c. Skriv en Programmall så att brunnar läses varje 150 s för att identifiera uppkomsten tid punkt (OD ökade med 0,2 i jämförelse med den första läsa).
- Späd provet till immuniseringsdoskoncentrationen i PBS.
Anmärkning: pH i vika buffert är utanför intervallet för Lal-analysen. Utspädningen av provet i PBS kommer att ställa in pH till det godtagbara intervallet. - Omsuspendera kontrollendotoxinet i lämplig volym av det endotoxin-fria LAL-vatten som bestäms av analys intyget för att generera 50 EU/mL. Skaka flaskan kraftigt i 15 minuter för att säkerställa fullständig resuspension av endotoxinet.
- Generera endotoxin standardkurvan genom att formning en 10-faldig seriell utspädning i glasflaskor i intervallet 50 EU till 0,005 EU/ml. För varje spädning, tillsätt 0,1 mL av den tidigare spädningen till 0,9 mL LAL-vatten. Vortex kraftigt efter kombination i 1 min.
- Lägg till standardkurva utspädningar och SHB-SAPN prover i två exemplar till en 96-bra tallrik. Använd LAL vatten som en negativ kontroll i dubbla också. Förinkubera plattan vid 37 ° c i 15 min.
- Mot slutet av inkubationen, Omsuspendera analysreagensflaskan med 2,6 mL LAL-vatten. Blanda försiktigt innehållet med en serologisk pipett.
- Tillsätt 100 μL av analysreagens till varje brunn på 96-brunnen plattan. Snabbt flytta plattan till plattan läsaren och kör programmallen skriven i steg 8,2.
- När programmet har slutförts, generera en standardkurva med hjälp av loggvärdet för kontrollerna kontra loggvärdet för debut tiden. Använd formeln som genereras från denna kurva för att beräkna endotoxkoncentrationen i proverna.
Representative Results
Den färdigmonterade SHB-SAPN som visas här bygger på proteinsekvenser (figur 1a) som förutspås vika in i en partikel som innehåller 60 exemplar av monomeren (figur 1b). I figur 2 finns en beskrivning av metoden för produktion, rening och identifiering av SHB-sapn-kärnan. E. coli från ett glycerolbestånd som innehöll en Ppep-T-uttrycksvektor med gensekvens av SHB-sapn-kärnan INDUCERADES i BL21 (de3) E. coli. Bakterieceller framgångsrikt odlas och lyseras under denaturering och minska villkor.
Total cell lysate användes för att rena SHB-SAPN monomerer av FPLC med en ni2 + kolonn (figur 3a). FPLC-kromatografen visar att proteinet eluerat både vid 150 mM och 500 mM Imidazol (figur 3a). Kromatogrammet visar också två andra toppar vid 185 mL och 210 mL total volym motsvarande isopropanoltvätt respektive Imidazol-fri tvätt. Fraktionerna och renheten hos det rekombinanta proteinet identifierades med hjälp av gradientbaserade SDS-PAGE Gels (figur 3b). Proteinet av intressera var i första hand lokaliserat i fraktioner 68 \ u201279 (278 \ u2012300 mL räkna samman volym). Dessa fraktioner kombinerades för ytterligare analyser. Western blot med anti-his antikropp (N-Terminal) och 167-D-IV antikropp (C-terminus) indikerade att de poolade fraktionerna verkligen var proteinet av intresse (figur 4a, B). Dessa blotting visade också närvaron av SHB-sapn multimers. Tidigare tvättningar och elutionsfraktioner tenderade att innehålla en högre koncentration av multimeriserat protein och exkluderades därför.
Proverna som innehöll proteinmonomerer av intresse var vikt i den färdigmonterade SHB-SAPN genom dialys. Partikelstorleksfördelningen fastställdes med hjälp av DLS-och nanopartikelspårningsanalys (figur 5a, B). DLS identifierade partiklar med en Z-genomsnittlig hydrodynamisk diameter på 67 nm medan NTA-systemet mätte en medelstorlek på 81 nm. Den lilla storleksskillnader berodde på partikel dimensionering tekniker, men storleken från båda analyserna var i det förväntade intervallet 20 \ u2012100 nm8,24,25. SHB-SAPNs visualiserades genom TEM och bilderna visade välformade enskilda partiklar med den storleksfördelning som erhålls från de två partikel storleks teknikerna (figur 5c).
Vid rening av proteinet tvättades kolonnen med isopropanol för att minska LPS-föroreningen i den slutliga SHB-SAPN-produkten. För att kontrollera om endotoxinhalten var godtagbar för immunisering bestämdes koncentrationen av LP-skivor i SHB-SAPN-prover som renats med eller utan isopropanoltvättsteg av en kinetisk LAL-analys. Resultaten visade att isopropanoltvätten minskade endotoxinhalten från > 0,25 EU/μg till 0,010 EU/μg SHB-SAPN-protein (tabell 1).
Figur 1: SHB-SAPN proteinsekvens och struktur. Aaminosyresekvensen i SHB-sapn-monomeren. Bdatormodell av strukturen hos den FÄRDIGMONTERADE SHB-sapn-kärnan bestående av 60 proteinmonomerer. Färgschema för aminosyresekvenser: Grey = HisTag; Grön = pentamer; Mörkblå = de Novo konstruerade Trimer; Ljusblå = sex-Helix bunt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: flödesschemat för protokoll för SHB-SAPN produktion. Färgschema: svart = uttryck av proteinet monomer i E. coli; Mörkgrå = monomerrening; Medium Grey = monomeridentifiering; Ljusgrå = vika och karaktärisering; Vit = färdigmonterad SHB-SAPN produkt. I steg märkta med mörk och medium grå, är proteinet under denaturering och minska förhållanden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Proteinrening av SHB-SAPN monomerer. Akromatograf från FPLC-rening. Gröna linjen ovanför kromatogrammet indikerar reningsstegen. Blå linje i kromatogrammet representerar den optiska densiteten av fraktioner vid 280 nm våglängd. Den svarta linjen visar vilken procent av buffert B (8 M urea, 20 mM Tris, 50 mM natriumfosfat monobasic, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazol, pH 8,5) som användes i varje skede av rening. B) geler av de poolade fraktionerna från lysat (L), flöde genom (ft), första tvättningen (W1), isopropanoltvätt (W2), tredje tvätten (W3) och enskilda fraktioner från 150 mm Imidazol (E150) och 500 mm Imidazol (E500) elueringsteg i Rening. Molekyl markörer i den första körfältet (M) identifiera band mellan 10 och 250 kDa. Målproteinet indikeras med en svart pil. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: identifiering av proteinet genom Western blot. Alla körfält är laddade med 100 ng av protein. (A) resultat av en västerländsk blot med anti-6X histag. B) resultat av en västerländsk blot med en 167-D-IV hiv-1 monoklonal antikropp. Körfält är märkta som: M = molekylvikt markör; 1 = lysate; 2 = flöde genom; 3 = första tvätten; 4 = isopropanoltvätt (andra tvätten); 5 = tredje tvätten; 6 = poolade volymfraktioner 56 \ u201261 (första elutionstoppen), 7 = poolade volymfraktioner 62 \ u201267 (mellan de två topparna), 8 = poolade volymfraktioner 68 \ u201278 (andra elutionstoppen). Målprotein med den förväntade band storleken 18,07 kDa som monomer SHB-sapn band indikeras av en svart pil. Extra ränder i körfält 7 och 8 är dimers, trimers och multimers av SHB-SAPN (röd pil). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: karaktärisering av den omvikta SHB-SAPN. A) partikelstorleksfördelning enligt DLS. Bpartikelstorlek som bestäms av nanopartikelspårning (system). Cvisualisering av SHB-sapn-partiklarna genom tem. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Prov | Endotoxin (EU/mL) | Endotoxin (EU/μg protein) |
| SAPN med Isopropanoltvätt | 2,02 | 0,01 |
| SAPN utan Isopropanoltvätt | > 50 | > 0,25 |
| Negativ kontroll | Under detekterings nivå | N/A |
Tabell 1: Endotoxinhalter av revikta SHB-SAPNs. Endotoxinhalten i SHB-SAPN-prover som renats med eller utan en isopropanoltvätt presenteras både som endotoxin enheter/mL och endotoxin enheter/μg SHB-SAPN protein.
Discussion
Nanoteknik ger många fördelar och lösningar för subenhet vaccinutveckling. Nanovaccines kan upprepade gånger presentera antigener som partiklar till värd immunsystemet ökar immunogeniciteten26. Även om det finns många olika typer av nanovaccines, tror vi att de som består av de Novo utformat protein verkar vara den starkaste metoden för vaccinutveckling1. De kan vara konstruerade utan någon sekvens homologi till värden proteiner och presentera antigen av intresse i nära infödda-liknande konformation samtidigt som låg produktionskostnad och hög produkt avkastning. Ett utmärkt exempel på detta tillvägagångssätt är SAPN teknik, som vi har tillämpat på vacciner mot flera infektionssjukdomar7. Ta itu med svårigheterna i HIV-1 vaccinutveckling, har vi konstruerat en unik SHB-SAPN kärna för att effektivt presentera V1V2 antigen i en infödd-liknande trimeric konformation9. Många vaccin mål, särskilt för virussjukdomar, är närvarande som trimerer27. Detta fenomen indikerar att vår sapn design har stora konsekvenser för utvecklingen av subenhet vacciner.
I den här metoden visar vi hur man producerar SHB-SAPNs i ett E. coli -uttryckssystem. Vi uttryckte hög avkastning av protein (om 6 mg/100 mL kultur). Proteinet innehöll 10 histidines och var lättrenat med hjälp av en immobiliserad metallaffinitetskromatografi med ni2 + kolonn. Denna längd av hans-taggen konstaterades vara den optimala för den högsta protein avkastningen. Det renade proteinet innehöll full längd av det designade proteinet, vilket indikeras av närvaron av både N-terminalen HisTag och C-terminalen heptad REPEAT. Vi utnyttjade allmänt accepterade tekniker och optimerade dem för uttryck, produktion och karakterisering av SHB-SAPN kärna. Brist av produktionen av det hellångt protein under utvecklingen av en sapn som innehåller ett nytt protein epitop kunde indikera ett uttrycks problem av genen i den värdcellen. Om det händer måste genen och uttrycks systemet omformas och anpassas till det beskrivna protokollet. Modifiering av ultraljudsbehandling tid eller intensitet kan också öka koncentrationen av det förutspådda fullängds proteinet.
Omvikta partiklar var i det förväntade storleksintervallet (20 till 100 nm)8,24,25 som bestäms av DLS och nanopartiklar spårningsanalys. Dessa resultat bekräftades ytterligare med hjälp av TEM. Om det finns problem i detta steg, är det normalt på grund av ett problem med pH eller jonisk styrka av vika buffert. När stor storlek partiklar upptäcks på partikel dimensionering tekniker, det indikerar aggregering, som kan undvikas genom att öka pH i vika buffert. Om partiklarna inte upptäcks av DLS, kontrollera koncentrationen av proteinet och kontrollera pH i bufferten. Den slutliga protein koncentrationen för DLS bör vara minst 100 μg/mL. Om koncentrationen inte är problemet, indikerar det överflödet av små, ofullständigt bildade partiklar, vars koncentration kan reduceras genom att minska pH. Alternativt kan natriumkloridkoncentrationen justeras till det optimala intervallet för att minimera närvaron av partiklar med oönskad storlek.
Slutligen, genom att använda en isopropanol tvätta steg under rening vi kunde minska kontaminerande LPS från värden E. coli till 0,01 EU/μg av sapn som är under Food and Drug Administration (FDA) gräns på 5 EU/kg kroppsvikt för injicerbara produkter 28. denna nivå kan minskas ytterligare genom att använda en anjonväxling kolumn även känd som Q kolumn. Om höga halter av endotoxin fortfarande finns, kontrollera alla material som användes för att förbereda buffert. Kom ihåg att endast använda depyrogenated glas och endotoxin fri plasticware i denna metod.
Dessa resultat indikerar att vi framgångsrikt har utvecklat en metod för att producera SHB-SAPN kärna som kan användas för prekliniska immuniseringsstudier. Denna metod med endast smärre ändringar, om någon, kan tillämpas på rening av SHB-SAPNs när ett antigen av intresse tillsätts. Med den här metoden som utgångspunkt är en av de stora förändringarna i elutionssteget. Olika proteiner eluera vid olika imidazolkoncentrationer som måste bestämmas experimentellt. Den andra stora skillnaden kan vara sammansättningen av vika buffert. Optimering skulle kräva att testa olika pH-förhållanden samt Joniska styrkor.
Med tanke på det framtida arbetet behövs endast två smärre modifieringar för att möjliggöra mänsklig tillämpning av SHB-SAPN. Den första är att uttrycket vektorn måste ändras till ett kanamycin motstånd valbar markör på grund av ampicillin allergi hos människor29. Det andra stora kravet på proteintillverkning för humant bruk är att producera SHB-SAPN i animaliska produkter-fria medier. En småskalig studie indikerade redan en rimlig avkastning av protein i en växtbaserad media. Det arbete som presenteras här är lätt skalbar för ultimat GMP produktion som demonstreras med en malariavaccin kandidat, FMP01416. Denna storskaliga FMP014-SAPN produktion ingår både anjonbyte och cation Exchange steg för att ytterligare minska LPS och ni2 + innehåll från slutprodukten. Denna bakterie-uttryckt SAPN har redan skalats upp för en kommande fas 1/2a klinisk prövning.
Disclosures
De synpunkter som uttrycks är de av författarna och bör inte tolkas som representerar ståndpunkter den amerikanska armén eller försvarsdepartementet. Peter Burkhard har ett intresse för företaget som heter alpha-O peptider AG och har patent på tekniken. De andra författarna har ingen anknytning eller ekonomiskt engagemang med något företag med ett ekonomiskt intresse i ämnet som presenteras i detta dokument.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett samarbetsavtal (W81XWH-11-2-0174) mellan Henry M Jackson Foundation för befordran av militär medicin, Inc., och det amerikanska försvarsdepartementet. Anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV antikropp mottogs från Dr Susan Zolla-Pazner genom NIH AIDS reagens program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris/Glycine/SDS | BioRad | 1610732 | 1 L |
| 2-Mercaptoethanol | BioRad | 1610710 | 25 mL |
| 2-propanol | Fisher | BP26181 | 4 L |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610737 | 30 mL |
| 40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers | Malvern Panalytical | ZEN0040 | 100 pack |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | BioRad | 4561093 | 10 pack |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | 25 g |
| Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] | AbCam | ab18184 | 100 mg |
| Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) | AIDS Reagent Repository | 11681 | 100 mg |
| BCIP/NBT Substrate, Solution | Southern Biotech | 0302-01 | 100 mL |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-108 | A variety of sizes |
| Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm | Ted Pella, Inc | 01754-F | 25 pack |
| GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns | GE HealthCare | 45-000-325 | 5 pack |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | 4 L |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) | ABCam | ab97020 | 1 mg |
| Imidazole | Fisher | O3196-500 | 500 g |
| Instant NonFat Dry Milk | Quality Biological | A614-1003 | 10 pack |
| Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay | Lonza Walkersville | 50650U | 192 Test Kit |
| LAL Reagent Grade Multi-well Plates | Lonza Walkersville | 25-340 | 1 plate |
| Magic Media E. coli Expression Medium | ThermoFisher | K6803 | 1 L |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters | Millipore | SLGV033RB | 250 pack |
| Mouse Anti-Human IgG Fc-AP | Southern Biotech | 9040-04 | 1.0 mL |
| One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli | ThermoFisher | C601003 | 20 vials |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, | BioRad | 1610363 | 1 mL |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL | ThermoFisher | 66810 | 8 pack |
| Sodium Chloride | Fisher | BP358-212 | 2.5 kg |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | BP329-500 | 500 g |
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | 1 kg |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Biosynth International | C-1818 | 100 g |
| Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S | Electron Micoscopy Services | 541-09-3 | 25 g |
| Urea | Fisher | BP169-500 | 2.5 kg |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma Aldrich | WHA10010155 | pack of 500 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| ChromLab Software ver 4 | BioRad | 12009390 | Software |
| Epoch 2 Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2 | Plate Reader |
| Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor | ThermoFisher | 096-145075 | Rotor |
| Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Gel Imager for Stain free Gels |
| JEOL TEM | JEOL | 1400 | Transmission Electron Microscope |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BioRad | 1658004 | To run gels |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | For Protein Concentration |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| NanoSight NTA software NTA | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| New Brunswick Innova 44/44R | Eppendorf | M1282-0000 | Incubator/Shaker |
| NGC Quest 10 Chromatography System | BioRad | 7880001 | FPLC to aid in protein purification |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella, INC | 91000S | To clean grids |
| PowerPac Universal Power Supply | BioRad | 1645070 | To run gels |
| Rocker Shaker | Daigger | EF5536A | For Western |
| Sonifer 450 | Branson | also known as 096-145075 | Sonicator |
| Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher | 75-006-580 | Centrifuge |
| Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs | BioRad | 1704158 | For Western |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 | For Western |
| Vortex-Genie 2 | Daigger | EF3030A | Vortex |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
| Zetasizer Software | Malvern Panalytical | Particle Sizing |
References
- Karch, C. P., Burkhard, P. Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies. Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).
- Snapper, C. M. Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens. Frontiers in Immunology. 9, 598 (2018).
- Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines. Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).
- Yeates, T. O. Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials. Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).
- Marcandalli, J., et al. Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus. Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).
- Ross, J. F., et al. Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins. ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).
- Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development. Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).
- Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles). Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).
- Karch, C. P., et al. Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen. Nanomedicine. , (2018).
- Karch, C. P., et al. The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62 (2017).
- Li, J., et al. A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus. PLoS One. 13 (9), e0203771 (2018).
- Wahome, N., et al. Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine. Chemical Biology & Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).
- El Bissati, K., et al. Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice. Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).
- Kaba, S. A., et al. A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria. Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).
- Kaba, S. A., et al. Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine. PLoS One. 7 (10), e48304 (2012).
- Seth, L., et al. Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants. Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).
- Kaba, S. A., et al. Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine. Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).
- El Bissati, K., et al. Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma. NPJ Vaccines. 2, 24 (2017).
- Karch, C. P., et al. Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge. Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).
- Haynes, B. F., et al. Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial. New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).
- O' Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development. Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).
- Babapoor, S., et al. A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection. Influenza Research and Treatment. 2011, 126794 (2011).
- Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design. Royal Society Open Science. 4 (4), 161092 (2017).
- Indelicato, G., et al. Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles. Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).
- Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. Nanoscale assemblies and their biomedical applications. Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740 (2013).
- Rey, F. A., Lok, S. M. Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines. Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).
- Bacterial Endotoxins. United States Pharmacopeia (USP). , Ch. 85 (2011).
- Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals. , Food and Drug Adminstration. Maryland. Available from: https://www.fda.gov/media/76255/download (1993).
