Summary
La inmunoglobulina G (IgG) N-glicano se caracteriza mediante cromatografía de interacción hidrófila UPLC. Además, la estructura de IgG N-glicano está claramente separada. Presentado aquí es una introducción a este método experimental para que pueda ser ampliamente utilizado en entornos de investigación.
Abstract
Glycomics es una nueva subespecialidad en investigación de sistemas omics que ofrece un potencial significativo en el descubrimiento de biomarcadores de próxima generación para la susceptibilidad a enfermedades, el descubrimiento de objetivos de fármacos y la medicina de precisión. Se han notificado igG N-glicanos alternativos en varias enfermedades crónicas comunes y se ha sugerido que tienen un gran potencial en aplicaciones clínicas (es decir, biomarcadores para el diagnóstico y la predicción de enfermedades). Los IgG N-glicanos se caracterizan ampliamente utilizando el método de cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) cromatografía líquida de ultrarendimiento (UPLC). UPLC es una tecnología de detección estable con buena reproducibilidad y alta precisión cuantitativa relativa. Además, la estructura de IgG N-glicano está claramente separada, y la composición de glicanos y la abundancia relativa en plasma se caracterizan.
Introduction
N-glicosilación de proteínas humanas es una modificación post-traduccional común y esencial1 y puede ayudar a predecir la aparición y el desarrollo de enfermedades con relativa precisión. Debido a la complejidad de su estructura, se espera que haya más de 5.000 estructuras glicanas, proporcionando un gran potencial como biomarcadores diagnósticos y predictivos para enfermedades2. Se ha demostrado que los Nglicanos unidos a la inmunoglobulina G (IgG) son esenciales para la función de IgG, y IgG N-glicosilación participa en el equilibrio entre los sistemas pro yantiinflamatorio3. La IgG Ndiferencial-glicosilación participa en el desarrollo y la progresión de la enfermedad, representando tanto una predisposición como un mecanismo funcional implicado en la patología de la enfermedad. El papel inflamatorio de IgG N-glicosilación se ha asociado con el envejecimiento, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, y el cáncer4.
Con el desarrollo de la tecnología de detección, los siguientes métodos se utilizan más ampliamente en glicómics de alto rendimiento: cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) cromatografía líquida de ultra rendimiento con detección de fluorescencia (UPLC-FLR), electroforesis de gel capilar multiplex con fluores inducidos por láser Detección de cence (xCGE-LIF), espectrometría de masas de tiempo de tiempo de desorción/ionización asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) y espectrometría de masas electrospray por cromatografía líquida (LC-ESI-MS) . Estos métodos han superado las deficiencias anteriores de bajo flujo, resultados inestables y especificidad de sensibilidad deficiente5,6.
UPLC es ampliamente utilizado para explorar la asociación entre IgG N-glicosilación y ciertas enfermedades (es decir, envejecimiento7, obesidad8, dislipidemia9, tipo II diabetes10, hipertensión11, accidente cerebrovascular isquémico12, y la enfermedad de Parkinson13). En comparación con los otros tres métodos antes mencionados, UPLC tiene las siguientes ventajas5,14. En primer lugar, proporciona un método de análisis cuantitativo relativo, y el análisis de datos que implica la normalización total del área mejora la comparabilidad de cada muestra. En segundo lugar, el costo de los equipos y la experiencia requerida son relativamente bajos, lo que facilita la implementación y transformación de biomarcadores de glicosilación en aplicaciones clínicas. Aquí se presenta una introducción a UPLC para que pueda ser más ampliamente utilizado.
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Protocol
Todos los temas incluidos en el protocolo han sido aprobados por el Comité de ética de la Universidad Médica Capital, Beijing, China12. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada tema al comienzo del estudio.
1. Aislamiento IgG
- Preparar los productos químicos incluyendo tampón de unión (sina tamponada de fosfato, PBS): 1x PBS (pH a 7,4), tampón neutralizante: 10x PBS (pH a 6,6-6,8), eluyente: 0,1 M de ácido fórmico (pH a 2,5), solución neutralizante para eluyente: 1 M de bimonio de amonio, tampón de carbonato almacenado: 20% de ácido fórmico (pH a 2,5), solución neutralizante para eluyán: 1 M de bimonio de amonio, tampán almacenado: 20% de ácido fórmico (pH a 2,5), solución neutralizante para eluyán: 1 M de bimonio de amonio, tampán almacenado: 20% de ácido fórmico etanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH a 7,4), solución limpiadora para proteína G: 0,1 M NaOH + 30% propan-2-ol.
NOTA: El nivel de pH es crítico en este protocolo. La elución de IgG requiere un pH muy bajo, y existe el riesgo de pérdida de ácidos siálicos debido a la hidrólisis ácida. Por lo tanto, la elución se produce en cuestión de segundos, y el pH se restaura rápidamente a la neutralidad, preservando la integridad de IgG y los ácidos siálicos. - Preparar las muestras: descongelar la muestra de plasma congelado y luego centrifugar a 80 x g durante 10 min, y dejar la placa monolítica de proteína G y los productos químicos antes mencionados durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Transferir una muestra de 100 l (que se puede utilizar para detectar 2 veces para evitar la primera falla) en una placa de recogida de 2 ml (aquí, un total de seis muestras estándar, una muestra de control [agua ultrapura] y 89 muestras de plasma fueron diseñadas para 96 placas de pozos y asignadas aleatoriamente al plato).
- Diluir las muestras con 1pbS por 1:7 (v/v).
- Limpie una placa de filtro de polipropileno hidrófilo (GHP) de 0,45 m con 200 ml de agua ultrapura (repetir 2x).
- Transfiera las muestras diluidas a la placa de filtro y filtre las muestras en la placa de recogida utilizando una bomba de vacío (controle la presión de vacío a 266.6-399.9 Pa).
- Preparación de las placas monolíticas de proteína G
- Deseche el búfer de almacenamiento.
- Limpie las placas monolíticas con 2 ml de agua ultrapura, 2 ml de 1x PBS, 1 ml de ácido fórmico de 0,1 M, 2 ml de 10 pbS 10 x, 2 ml de 1 x PBS (secuencialmente) y retire el líquido que fluye con una bomba de vacío.
- Transfiera las muestras filtradas a la placa monolítica de proteína G para la unión y limpieza de IgG, luego limpie las placas monolíticas con 2 ml de 1x PBS (repetir la limpieza 2x).
- Eluir IgG con 1 ml de ácido fórmico de 0,1 M y filtrar las muestras en la placa de recogida mediante bomba de vacío, a continuación, añadir 170 ol de 1 M de bicarbonato de amonio en la placa de recogida.
- Detectar la concentración de IgG utilizando un espectrofotómetro de absorción (longitud de onda óptima de 280 nm).
- Abra el software y seleccione el modo proteína-CY3.
- Dibuja 2 s de agua ultrapura y cárguelo en la pantalla, luego haz clic en Blanco en el software para borrar la pantalla (repetir 1x).
- Dibuja 2 ml de agua ultrapura y cárguelo en la pantalla y, a continuación, haz clic en Muestra en el software para detectar el agua ultrapura.
- Dibuje 2 s de la muestra de IgG y cárguelo en la pantalla, luego haga clic en Muestra en el software para detectar la muestra.
- Dibuja 2 s de agua ultrapura y cárguelo en la pantalla, luego haz clic en Blanco en el software para borrar la pantalla.
- Cierre el software.
NOTA: La fórmula para calcular la concentración de IgG es la siguiente:
CIgG - coeficiente de absorción/extinción (13,7) x 1.000 g/ml
- Poner el IgG extraído para secar en un horno a 60 oC y conservar el IgG extraído (300 l de IgG extraído durante 4 h).
- Retirar 300 s de IgG extraído si la concentración es superior a 1.000 g/ml.
- Retirar 350 s de IgG extraído si la concentración está entre 500-1.000 g/ml.
- Retirar 400 s de IgG extraído si la concentración se encuentra entre 200-500 g/ml.
- Retirar 600 ml de IgG extraído si la concentración es inferior a 200 g/ml.
NOTA: La concentración de IgG debe ser preferiblemente de >200 g/ml para su posterior detección. La cantidad media de IgG debe ser preferiblemente >1.200 g, que se puede probar 2 veces en caso de que falle la primera prueba.
- Limpieza de la placa monolítica de proteína G para su reutilización
- Lave la placa con 2 ml de agua ultrapura, 1 ml de 0,1 M NaOH (para eliminar proteínas precipitadas), 4 ml de agua ultrapura y 4 ml de 1 x PBS (secuencialmente), luego retire el líquido que fluye con una bomba de vacío.
- Lave la placa con 2 ml de agua ultrapura, 2 ml de 30% de propan-2-ol (para eliminar proteínas hidrófobas unidas), 2 ml de agua ultrapura y 4 ml de 1pbS (secuencialmente), luego retire el líquido que fluye con una bomba de vacío.
- Lavar la placa con 1 ml de tampón (20% etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) y añadir 1 ml de tampón (20% etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) a la placa, luego dejar la placa a 4 oC.
2. Lanzamiento de Glycan
- Preparar el IgG seco y almacenar los productos químicos incluyendo 1.33% SDS, 4% Igepal (almacenar lejos de la luz), y 5x PBS en RT.
- Preparar la enzima PNGase F diluyendo la enzima 250 U con 250 ml de agua ultrapura.
- Desnaturalización de IgG
- Añadir 30 sl de 1,33% de SDS y mezclar por vórtice, transferir la muestra a un horno de 65 oC durante 10 minutos, luego retirarla del horno y dejar reposar durante 15 minutos.
- Añadir 10 s de 4% Igepal y colocarlo en la incubadora de agitación durante 5 min.
- Eliminación y liberación de glicanos
- Añadir 20 s de 5x PBS y 30-35 l de 0,1 mol/L NaOH para regular un pH de 8,0, y mezclar por vórtice. Añadir 4 l de enzima PNGase F y mezclar por vórtice. A continuación, incubar durante 18-20 h en un baño de agua de 37oC.
- Poner los glicanos liberados a secar en un horno a 60 oC durante 2,5-3,0 h.
- Guarde los glicanos liberados a -80 oC hasta que se mmeasuremente más.
NOTA: Este paso es crítico. La clave para la liberación de glicano es mejorar la actividad de la enzima PNGase F para maximizar su eficiencia.
3. Etiquetado y purificación de glicanos
- Preparar el reactivo de etiquetado 2-aminobenzamida (2-AB) con 0,70 mg de 2-AB, 10,50 l de ácido acético, 6 mg de cianoborohídrido sódico (NaBH3CN) y 24,50 l de sulfóxido de dimetil (DMSO) (volumen total a 35 ol). A continuación, agregue ácido acético, 2-AB, y NaBH3CN en el DMSO en orden.
- Etiquetar los glicanos utilizando 35 l de reactivo de etiquetado de 2-AB, transferir los glicanos etiquetados al oscilador durante 5 minutos, transferir al horno durante 3 h a 65 oC, luego transferir a RT durante 30 minutos.
NOTA: Todo el paso de etiquetado de glicano debe realizarse mientras está protegido de la luz. - Prerretíe una placa de filtro De0m de 0,2 m con 200 ml de etanol al 70%, 200 ml de agua ultrapura y 200 ml de acetonitrilo al 96% (4 oC) y, a continuación, retire los residuos con una bomba de vacío.
- Purificación de glicano 2-AB etiquetado
- Añadir 700 l de acetonitrilo al glicano etiquetado 2-AB y transferira a una incubadora de agitación durante 5 min.
- Centrífuga a 134 x g durante 5 min (4oC).
- Transfiera la muestra a una placa de filtro GHP de 0,2 m durante 2 minutos y retire el filtrado (líquido de flujo) utilizando una bomba de vacío.
- Lavar el glicano etiquetado 2-AB con 200 ml de acetonitrilo al 96% (4 oC) y retirar el filtrado (líquido que fluye) con una bomba de vacío 5x-6x.
- Elute 2-AB glicano etiquetado con 100 l de agua ultrapura 3x.
- Transfiera el glicano 2-AB a un horno para secara a 60oC durante 3,5 h.
- Guarde los N-glicanos etiquetados a -80 oC hasta que se manda más.
4. Cromatografía de interacción hidrófila y análisis de glicanos
- Acondicionamiento de instrumentos UPLC y preparación de fases móviles
- Preparar fases móviles incluyendo disolvente A: 100 mM de formato de amonio (pH a 4,4), disolvente B: 100% acetonitrilo, disolvente C: 90% agua ultrapura (10% metanol) y disolvente D: 50% metanol (agua ultrapura).
- Abra el software para controlar las fases móviles.
- Lave los instrumentos UPLC a un caudal de equilibrio de 0,2 ml/min (50% disolvente B y 50% disolvente C) durante 30 minutos, luego a un caudal de 0,2 ml/min (25% disolvente A y 75% disolvente B) equilibrado durante 20 minutos y, a continuación, un caudal de equilibrio de 0,4 ml/min.
- Disolver los Nglicanos etiquetados con 25 ml de una mezcla de acetonitrilo al 100% y agua ultrapura en una proporción de 2:1 (v/v). A continuación, centrifugar a 134 og durante 5 min (4 oC) y cargar 10 sL de los N-glicanos etiquetados en los instrumentos UPLC.
- Separe los N-glicanos etiquetados a un caudal de 0,4 ml/min con un gradiente lineal de 75% a 62% de acetonitrilo durante 25 min. A continuación, realice una ejecución analítica por la escalera de calibración de dextran/columna de glucopéptido en una UPLC a 60 oC (aquí, las muestras se mantuvieron a 4 oC antes de la inyección).
- Detectar fluorescencia De N-glicano a longitudes de onda de excitación y emisión de 330 nm y 420 nm, respectivamente.
- Integre los glicanos en función de la posición máxima y el tiempo de retención.
- Calcular el valor relativo de cada pico de Glycan (GP)/todos los picos de Glican (GP) (porcentaje, %) de la siguiente manera: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100, etc.
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Representative Results
Como se muestra en la Figura 1,los IgG N-glicanos se analizaron en 24 picos iniciales de IgG glicano (GPs) basados en la posición máxima y el tiempo de retención. Las estructuras N-glicano están disponibles a través de la detección de espectrometría de masas según un estudio anterior (Tabla 1)15. Para garantizar que los resultados fueran comparables, se aplicó la normalización total de la superficie, en la que la cantidad de glicanos en cada pico se expresaba como un porcentaje del área integrada total.
Para evaluar la repetibilidad y estabilidad del método, la muestra estándar se probó en paralelo seis veces. Como se muestra en el Cuadro 2, el coeficiente de variación (CV) de 24 GP osciló entre 1,84%-16,73%, 15 (62,50%) de los cuales estaban por debajo del 10%. GP con proporciones relativamente pequeñas (1,16%) mostraron altos errores de medición (más del 10% del CV). Además, los perfiles IgG N-glicanos combinados de 76 individuos(Figura 2) indicaron que la posición de GP era estable, la forma de GP era similar, y la integración para las muestras mantenía los mismos intervalos. Los resultados anteriores indican que el método es estable y repetible.
Como se muestra en el Cuadro 3, otros 36 rasgos derivados que describen las abundancias relativas de galactosilación, sialilación, Bisección GlcNAc y fucosilación central fueron calculados por los 24 glicanos restantes medidos directamente. Por ejemplo, G2/G0 (GP12/GP2) reflejaba el nivel de galactosylation (di-/a-) sin fusilación central y bisección GlcNAc. G2/G1 (GP14/[GP8 + GP9]) reflejaba el nivel de galactosilación (di-/mono-) con fusilación central y sin bisecar GlcNAc. Por último, G1/G0 ([GP10 + GP11]/GP6) reflejaba el nivel de galactosilación (mono-/a-) con fusilación central y Bisecting GlcNAc. Estos cálculos de glicanos derivados siguen un principio, para ver el cambio de un solo rasgo de glicosilación.
Figura 1: Cromatograma UPLC de un individuo. Los IgG N-glicanos se analizaron en 24 picos iniciales de IgG glicano (GPs) basados en la posición máxima y el tiempo de retención. GP8 representa la suma de GP 8a y GP 8b. GP16 representa la suma de GP 16a y GP 16b. La estructura de los glicanos en cada pico cromatográfico y el porcentaje medio de estructuras individuales se muestran en la Tabla 1 y la Tabla 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cromatograma UPLC de 76 individuos. Los perfiles IgG N-glicanse combinaron a partir de 76 individuos para demostrar la repetibilidad y estabilidad del método. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Estructura de los 24 glicanos IgG iniciales. GP: pico de glicano; F: fucosa; A: número de antenas conectadas a la secuencia central (existente de dos NAcetiloglucosamina (GlcNAc) y tres residuos de nariz); B: bisección GlcNac; G: galactosa; S: ácido siálico. Los esquemas estructurales se definen de la siguiente manera: cuadrado azul: GlcNac; círculo verde: nariz; triángulo rojo: fucosa central / fucosa de antenas; círculo amarillo: galactosa; púrpura rhomb: ácido siálico.
| Pico de Glican | Media (SD) | CV (%) | Pico de Glican | Media (SD) | CV (%) |
| GP1 | 0.23 (0.017) | 7.28 | GP13 | 0.50 (0.043) | 8.64 |
| GP2 | 0.24 (0.034) | 13.97 | GP14 | 19.54 (0.36) | 1.84 |
| GP3 | 0.96 (0.16) | 16.73 | GP15 | 1.16 (0.14) | 11.63 |
| GP4 | 19.52 (0.58) | 2.98 | GP16 | 2.79 (0.19) | 6.93 |
| GP5 | 0.17 (0.024) | 13.86 | GP17 | 1.29 (0.13) | 9.78 |
| GP6 | 3.19 (0.26) | 8.22 | GP18 | 13.16 (0.51) | 3.85 |
| GP7 | 0.29 (0.033) | 11.51 | GP19 | 2.12 (0.21) | 9.76 |
| GP8 | 16.45 (0.62) | 3.77 | GP20 | 0.12 (0.018) | 14.91 |
| GP9 | 8.97 (0.52) | 5.74 | GP21 | 1.05 (0.17) | 16.09 |
| GP10 | 2.97 (0.22) | 7.34 | GP22 | 0.18 (0.025) | 14.16 |
| GP11 | 0.30 (0.041) | 13.82 | GP23 | 2.14 (0.14) | 6.45 |
| GP12 | 1.27 (0.026) | 2.08 | GP24 | 1.43 (0.13) | 9.12 |
Tabla 2: Precisión del método. La muestra estándar se prueba en paralelo seis veces para evaluar la repetibilidad y estabilidad del método. CV: Coeficiente de Variación; GP: Pico de Glicano; SD: Desviación estándar.
| Glicanos derivados | Fórmulas | Glicanos derivados | Fórmulas |
| Galactosilation | Fusilación | ||
| G2/G0 | GP12/GP2 | F1/F0 | GP4/GP2 |
| GP14/GP4 | GP6/GP3 | ||
| GP15/GP6 | (GP8+ GP9)/GP7 | ||
| G2/G1 | GP12/GP7 | GP14/FGP12 | |
| GP14/(GP8+ GP9) | GP15/GP13 | ||
| GP15/(GP10+ GP11) | GP18/GP17 | ||
| G1/G0 | GP7/GP2 | GP23/GP21 | |
| (GP8+ GP9)/GP4 | GP24/GP22 | ||
| (GP10+ GP11)/GP6 | |||
| Sialilación | Bisecting GlcNAc | ||
| S2/S0 | GP21/GP12 | B1/B0 | GP3/GP2 |
| GP22/GP13 | GP6/GP4 | ||
| GP23/GP14 | (GP10+GP11)/ (GP8+ GP9) | ||
| GP24/GP15 | GP13/GP12 | ||
| S2/S1 | GP21/GP17 | GP15/GP14 | |
| GP23/GP18 | GP19/GP18 | ||
| GP24/GP19 | GP22/GP21 | ||
| S1/S0 | GP17/GP12 | GP24/GP23 | |
| GP18/GP13 | |||
| GP16/GP14 | |||
| GP19/GP15 | |||
Tabla 3: Cálculo de los glicanos derivados. GP: pico de glicano; F: fucosa; B: bisección GlcNac; G: galactosa; S: ácido siálico.
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Discussion
UPLC sirve como método de análisis cuantitativo relativo5,15. Los resultados indican que UPLC es una tecnología de detección estable con buena reproducibilidad y precisión cuantitativa relativa. La cantidad de glicanos en cada pico se expresa como un porcentaje del área integrada total utilizando UPLC, que es el valor relativo. La cuantificación relativa mejora la comparabilidad de las muestras de prueba. Además, 96 placas de proteína G de pozo se utilizan para purificar IgG con 96 muestras a la vez para la detección de alto rendimiento. La capacidad de la proteína G para unir IgG es mayor que la de la proteína A, como se describe en estudios anteriores15,16.
Además, las estructuras de IgG N-glicanestán están claramente separadas. Los glicanos IgG derivados describen el nivel de galactosilación, sialilación, bisecado de GlcNAc y fucosilación central, que se calculan mediante los IgG N-glicanos iniciales. En un estudio anterior, algunos glicanos derivados (FBn, FBG0n / G0n, FBn / Fntotal, Bn / (Fn + FBn), FBG2n / FG2n, FG2n / (BG2n + FBG2n), BG2n / (FG2n + FBG2n)) podrían reflejar el cambio en múltiples niveles de glicosilación, pero no reflejaban el nivel de glylación
Recientemente, un estudio a gran escala demostró que la galactosilación igG (conocida como Gal-ratio) puede servir como un biomarcador prometedor para la detección del cáncer en múltiples tipos de cáncer17. La distribución de la galactosilación IgG se mide calculando las intensidades relativas de los agalactosylated (G0) frente a monogalactosylated (G1) y digalactosylated (G2) N-glicanos según la fórmula (G0/[G1 + G2 x 2]). La relación Gal refleja el nivel de galactosilación con fucosilación central y sin bisecar GlcNAc. Por lo tanto, varios IgG N-glicanos iniciales se combinaron con un glicano derivado, representando el nivel de un rasgo de glicosilación específico. Los cálculos de los glicanos derivados siguen un principio que explora los cambios en un solo rasgo de glicosilación fijado sobre otro rasgo de glicosilación.
En el presente protocolo, el pH es importante para mantener la estabilidad de las estructuras IgG y glicanos, especialmente para estabilizar la sialilación terminal. Por lo tanto, el valor de pH de la solución debe estar estrictamente controlado, y el pH de la solución expuesta a IgG debe ser restaurado, así como glicanos mantenido en un nivel de pH neutro. Además, el paso de liberación de glican es crítico en este protocolo. La clave para la liberación de glicano es mejorar la actividad de la enzima PNGase F para maximizar su eficiencia. Por ejemplo, se encontró que 18-20 h es óptimo para la digestión PNGaseF. Este paso debe reaccionarse completamente.
Hay algunas limitaciones de esta técnica. El método utilizado no puede diferenciar los glicanos liberados de las partes Fab y Fc de IgG. Se sabe que los glicanos de Fab y Fc son diferentes. Con los desarrollos en glucoproteómica, las técnicas de detección pueden medir los niveles de IgG combinando N-glicanos para explorar el papel de IgG N-glicanos y N-glicosilación en enfermedades. El costo del equipo es relativamente bajo; sin embargo, el costo por muestra es bastante alto.
En resumen, este protocolo introduce UPLC para que pueda ser ampliamente utilizado. Se necesita una valoración integral y la estandarización de los métodos analíticos antes de invertir cantidades significativas de tiempo y recursos en estudios a gran escala. A medida que la UPLC se utiliza más ampliamente, los efectos de IgG N-glicanos y N-glicosilación en ciertas enfermedades se pueden determinar con mayor precisión, y los biomarcadores de glicosilación se pueden utilizar para aplicaciones clínicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la National Natural Science Foundation of China (81673247 y 81872682) y Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
References
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