Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

تحليل الغلوبولين المناعي G-Glycan بواسطة اللوني السائل فائق الأداء

doi: 10.3791/60104 Published: January 18, 2020
* These authors contributed equally

Summary

ويتميز الغلوبولين المناعي G (مفتش) N-glycan باستخدام التفاعل هيدروفيلييك اللوني uplc. الاضافه إلى ذلك ، يتم فصل هيكل مفتش N-glycan بشكل واضح. يقدم هنا مقدمه لهذه الطريقة التجريبية بحيث يمكن استخدامها علي نطاق واسع في إعدادات البحث.

Abstract

غليكوميكس هو تخصص فرعي جديد في البحوث نظام اوميكس التي توفر إمكانات كبيره في اكتشاف الجيل التالي من المؤشرات الحيوية للاصابه بالمرض ، واكتشاف هدف المخدرات ، والطب الدقيق. وقد تم الإبلاغ عن البديلة مفتش ن-غليكانز في العديد من الامراض المزمنة الشائعة ، واقترح ان يكون لها إمكانات كبيره في التطبيقات السريرية (اي ، المؤشرات الحيوية للتشخيص والتنبؤ بالامراض). وتتميز علي نطاق واسع مفتش ن-غليكانز باستخدام طريقه التفاعل هيدروفيلي اللوني (hilic) اللوني السائل فائقه الأداء (uplc). UPLC هو تكنولوجيا الكشف مستقره مع استنساخ جيده وعاليه الدقة الكمية النسبية. الاضافه إلى ذلك ، يتم فصل هيكل مفتش ن-glycan بشكل واضح ، وتتميز تكوين glycan ووفره نسبيه في البلازما.

Introduction

N-glycosylation من البروتينات البشرية هو تعديل المشتركة والاساسيه بعد الانتقالية1 وقد تساعد علي التنبؤ بحدوث وتطور الامراض بشكل دقيق نسبيا. نظرا لتعقيد هيكلها ، فمن المتوقع ان هناك أكثر من 5,000 glycan الهياكل ، وتوفير إمكانات كبيره كما التشخيص والمؤشرات الحيوية التنبؤيه للامراض2. N-غليكانز تعلق علي الغلوبولين المناعي G (مفتش) وقد ثبت ان تكون ضرورية لوظيفة مفتش ، ومفتش ن-glycosylation يشارك في التوازن بين الموالية للانظمه والمضادة للالتهابات3. وتشارك التفاضلية مفتش ن-glycosylation في تطوير الامراض والتقدم ، والتي تمثل كل من الاستعداد واليه الوظيفية المشاركة في امراض المرض. وقد ارتبط الدور التهابي من مفتش ن-glycosylation مع الشيخوخة, الامراض التهابيه, امراض المناعة الذاتية, والسرطان4.

مع تطوير تكنولوجيا الكشف ، وتستخدم الطرق التالية علي نطاق واسع في غليكوميكس عاليه الانتاجيه: اللوني تفاعل هيدروفيلي (HILIC) اللوني السائل فائقه الأداء مع الكشف عن الفلورية (UPLC-FLR) ، متعدد الشعرية هلام الكهربائي مع الليزر التي يسببها الكشف عن الفلورية (Xgggg-ليف) ، مصفوفة بمساعده الليزر/تاين الوقت من الطيران الطيف الكتلي (MALDI-تسوف-MS) ، واللوني السائل الحراري الطيف الكتلي (LC-ESI-MS) . وقد تغلبت هذه الأساليب علي أوجه القصور السابقة للتدفق المنخفض ، والنتائج غير المستقرة ، وخصوصية الحساسية الضعيفة5،6.

ويستخدم علي نطاق واسع UPLC لاستكشاف العلاقة بين مفتش ن-glycosylation وبعض الامراض (اي ، الشيخوخة7، السمنة8، ديسسليبيدميا9، النوع الثاني السكري10، ارتفاع ضغط الدم11، السكتة الدماغية12، ومرض باركنسون13). بالمقارنة مع الطرق الثلاثة المذكورة أعلاه ، uplc لديه المزايا التالية5،14. أولا ، فانه يوفر طريقه التحليل الكمي النسبي ، وتحليل البيانات التي تنطوي علي تطبيع المنطقة الاجماليه يحسن قابليه للمقارنة لكل عينه. ثانيا ، تكلفه المعدات والخبرات المطلوبة منخفضه نسبيا ، مما يجعل من الأسهل لتنفيذ وتحويل العلامات الحيوية الغليكويليشن في التطبيقات السريرية. يقدم هنا مقدمه إلى UPLC بحيث يمكن استخدامها علي نطاق أوسع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تمت الموافقة علي جميع المواضيع المدرجة في البروتوكول من قبل لجنه الأخلاق في جامعه العاصمة الطبية ، بكين ، الصين12. وتم الحصول علي موافقه خطيه مستنيرة من كل موضوع في بداية الدراسة.

1. مفتش العزلة

  1. اعداد المواد الكيميائية بما في ذلك ملزمه العازلة (الفوسفات مخزنه المالحة ، والتلفزيونية): 1x تلفزيوني (pH = 7.4) ، تحييد العازلة: 10x تلفزيوني (pH = 6.6-6.8) ، والeluent: 0.1 M حمض فورميك (pH = 2.5) ، حل تحييد للونت: 1 متر الايثانول + 20 مم تريس + 0.1 M NaCl (pH = 7.4) ، وتنظيف الحل للبروتين ز: 0.1 M NaOH + 30 ٪ propan-2-ol.
    ملاحظه: مستوي الحموضة حرج في هذا البروتوكول. والتملص من مفتش يتطلب درجه الحموضة منخفضه جدا ، وهناك خطر فقدان الأحماض السياليك بسبب التحلل الحمضي. ولذلك ، يحدث التملص في غضون ثوان ، ويتم استعاده الأس الهيدروجيني بسرعة إلى الحياد ، والحفاظ علي سلامه مفتش والأحماض السياليك.
  2. اعداد العينات: ذوبان الجليد عينه البلازما المجمدة ثم الطرد المركزي في 80 x g لمده 10 دقيقه ، وترك لوحه البروتين ز متجانسة والمواد الكيميائية المذكورة أعلاه لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT).
  3. نقل عينه 100 μL (والتي يمكن استخدامها للكشف عن 2x لمنع الفشل الأول) في لوحه جمع 2 مل (هنا ، ما مجموعه سته عينات قياسيه ، عينه تحكم واحده [الترا-المياه النقية] ، و 89 عينات البلازما تم تصميمها ل 96 لوحات جيدا وتعيينها عشوائيا إلى لوحه).
  4. تمييع العينات مع 1x تلفزيوني بواسطة 1:7 (v/v).
  5. تنظيف 0.45 μm البولي بروبيلين هيدروفيلييك (GHP) لوحه فلتر مع 200 μL من المياه النقية جدا (تكرار 2x).
  6. نقل العينات المخففة في لوحه فلتر وتصفيه العينات في لوحه جمع باستخدام مضخة فراغ (السيطرة ضغط فراغ في 266.6-399.9 Pa).
  7. اعداد لوحات البروتين G متجانسة
    1. تجاهل مخزن التخزين المؤقت.
    2. تنظيف لوحات متجانسة مع 2 مل من المياه فائقه نقيه ، 2 مل من برامج تلفزيونيه 1x ، 1 مل من حمض 0.1 M الفورميك ، 2 مل من برامج تلفزيونيه 10x ، 2 مل من برامج تلفزيونيه 1x (بالتعاقب) ، وأزاله السائل المتدفقة باستخدام مضخة فراغ.
  8. نقل العينات المصفاة إلى لوحه البروتين ز متجانسة ل مفتش ملزمه والتنظيف ، ثم تنظيف لوحات متجانسة مع 2 مل من برامج تلفزيونيه 1x (تكرار التنظيف 2x).
  9. Elute مفتش مع 1 مل من 0.1 M حمض الفورميك وتصفيه العينات في لوحه جمع بواسطة مضخة فراغ ، ثم أضافه 170 μl من بيكربونات الأمونيوم 1 M في لوحه جمع.
  10. الكشف عن تركيز مفتش باستخدام مقياس طيفي امتصاص (الطول الموجي الأمثل = 280 نانومتر).
    1. افتح البرنامج وحدد وضع CY3 البروتين.
    2. رسم 2 μL من المياه النقية جدا وتحميله في الشاشة ، ثم انقر فوق فارغه في البرنامج لمسح الشاشة (تكرار 1x).
    3. رسم 2 μL من المياه النقية جدا وتحميله في الشاشة ، ثم انقر فوق نموذج في البرنامج للكشف عن المياه النقية جدا.
    4. رسم 2 μL من عينه مفتش وتحميله في الشاشة ، ثم انقر فوق نموذج في البرنامج للكشف عن العينة.
    5. رسم 2 μL من المياه النقية جدا وتحميله في الشاشة ، ثم انقر فوق فارغه في البرنامج لمسح الشاشة.
    6. اغلق البرنامج.
      ملاحظه: الصيغة لحساب تركيز مفتش علي النحو التالي:

      Cمفتش = امتصاص x معامل الانقراض (13.7) × 1,000 ميكروغرام/مل
  11. وضع مفتش المستخرجة لتجف في فرن في 60 درجه مئوية والحفاظ علي مفتش المستخرجة (300 μL استخراج مفتش ل 4 ح).
    1. أزاله 300 μL من المستخرجة مفتش إذا كان التركيز أكبر من 1,000 ميكروغرام/مل.
    2. أزاله 350 μL من المستخرجة مفتش إذا كان التركيز بين 500-1000 ميكروغرام/مل.
    3. أزاله 400 μL من المستخرجة مفتش إذا كان التركيز بين 200-500 ميكروغرام/مل.
    4. أزاله 600 μL من المستخرجة مفتش إذا كان التركيز أصغر من 200 ميكروغرام/مل.
      ملاحظه: تركيز مفتش يجب ان يكون من الأفضل > 200 ميكروغرام/مل للكشف اللاحقة. وينبغي ان يكون متوسط كميه من مفتش ويفضل > 1200 ميكروغرام ، والتي يمكن اختبارها 2x في حاله فشل الاختبار الأول.
  12. تنظيف لوحه البروتين G متجانسة لأعاده استخدامها
    1. غسل لوحه مع 2 مل من المياه النقية جدا ، 1 مل من 0.1 M NaOH (لأزاله البروتينات عجلت) ، 4 مل من المياه النقية جدا ، و 4 مل من 1x تلفزيوني (بالتعاقب) ، ثم أزاله السائل المتدفقة باستخدام مضخة فراغ.
    2. غسل لوحه مع 2 مل من الماء النقي جدا ، 2 مل من 30 ٪ propan-2-ol (لأزاله البروتينات مسعور المرتبطة) ، 2 مل من المياه النقية جدا ، و 4 مل من 1x تلفزيوني (بالتعاقب) ، ثم أزاله السائل المتدفقة باستخدام مضخة فراغ.
    3. غسل لوحه مع 1 مل من العازلة (20 ٪ الايثانول + 20 مم تريس + 0.1 M NaCl) وأضافه 1 مل من العازلة (20 ٪ الايثانول + 20 ملم تريس + 0.1 M NaCl) إلى لوحه ، ثم ترك اللوحة في 4 درجه مئوية.

2. الإفراج عن غليكان

  1. اعداد مفتش المجففة وتخزين المواد الكيميائية بما في ذلك 1.33 ٪ SDS ، 4 ٪ Igepal (مخزن بعيدا عن الضوء) ، و 5x تلفزيوني في RT.
  2. اعداد PNGase F انزيم عن طريق تمييع 250 U انزيم مع 250 μL من المياه النقية جدا.
  3. التشبع من مفتش
    1. أضافه 30 μL من 1.33 ٪ SDS ومزيج من vortexing ، نقل العينة إلى فرن 65 درجه مئوية لمده 10 دقيقه ، ثم ازالته من الفرن والسماح للراحة لمده 15 دقيقه.
    2. أضافه 10 μL من 4 ٪ Igepal ووضعه علي الحاضنة تهتز لمده 5 دقائق.
  4. أزاله والإفراج عن غليكانز
    1. أضافه 20 μL من 5x تلفزيوني و 30-35 μL من 0.1 mol/L NaOH لتنظيم درجه الحموضة من 8.0 ، ومزيج من vortexing. أضف 4 ميكرولتر من انزيم PNGase F واخلطه بواسطة vortexing. ثم ، احتضان ل 18-20 h في 37 درجه مئوية حمام المياه.
    2. وضع غليكانز المفرج عنهم لتجف في فرن في 60 درجه مئوية ل 2.5-3.0 h.
    3. حفظ غليكانز الإفراج في-80 درجه مئوية حتى مزيد من القياس.
      ملاحظه: هذه الخطوة حرجه. مفتاح الإفراج عن glycan هو تحسين نشاط انزيم PNGase F لتعظيم كفاءتها.

3. غليكان وسم وتنقيه

  1. اعداد 2-أمينوبينزاميدي (2-AB) الوسم كاشف مع 0.70 ملغ من 2-AB ، 10.50 μL من حمض الخليك ، 6 ملغ من سيانوكوبالامين الصوديوم (نابه3CN) ، و 24.50 μl من ثنائي ميثيل سولفوكسيد (dmso) (الحجم الإجمالي = 35 μl). ثم ، أضافه حمض الخليك ، 2-AB ، و نابه3CN في dmso في النظام.
  2. تسميه غليكانز باستخدام 35 μL من 2-AB الوسم كاشف ، ونقل غليكانز المسمي إلى مذبذب لمده 5 دقائق ، ونقل إلى الفرن لمده 3 ح في 65 درجه مئوية ، ثم نقل إلى RT لمده 30 دقيقه.
    ملاحظه: يجب ان يتم تنفيذ الخطوة وضع العلامات glycan بأكمله اثناء الحماية من الضوء.
  3. Pretreat 0.2 ميكرومتر GHP لوحه فلتر مع 200 μL من الايثانول 70 ٪ ، 200 μL من المياه النقية جدا ، و 200 μL من 96 ٪ اسيتلونيتريل (4 درجه مئوية) ، ثم أزاله النفايات باستخدام مضخة فراغ.
  4. تنقيه من 2-AB المسمي glycan
    1. أضافه 700 μL من 100 ٪ اسيتلونيتريل إلى 2-AB المسمي غليكان ونقل إلى حاضنه تهتز لمده 5 دقائق.
    2. الطرد المركزي في 134 x g لمده 5 دقائق (4 درجه مئوية).
    3. نقل العينة إلى لوحه فلتر GHP 0.2 μm لمده 2 دقيقه وأزاله الترشيح (السائل المتدفق) باستخدام مضخة فراغ.
  5. غسل 2-AB المسمي غليكان مع 200 μL من 96 ٪ اسيتلونيتريل (4 °C) وأزاله الترشيح (تدفق السائل) باستخدام مضخة فراغ 5x-6x.
  6. Elute 2-AB المسمي غليكان مع 100 μL من المياه فائقه نقيه 3x.
  7. نقل 2-AB المسمي glycan في فرن لتجف في 60 درجه مئوية ل 3.5 h.
  8. حفظ المسمي N-غليكانز في-80 درجه مئوية حتى مزيد من القياس.

4. اللوني التفاعل هيدروفيلييك وتحليل غليكانز

  1. تكييف أدوات UPLC واعداد المراحل المتنقلة
    1. اعداد مراحل المحمول بما في ذلك المذيبات A: 100 mM فورمات الأمونيوم (pH = 4.4) ، المذيب ب: 100 ٪ اسيتلونيتريل ، المذيبات ج: 90 ٪ المياه النقية جدا (10 ٪ الميثانول) ، والمذيبات د: 50 ٪ الميثانول (المياه النقية جدا).
    2. فتح البرنامج للسيطرة علي مراحل المحمول.
    3. غسل الصكوك UPLC في معدل تدفق 0.2 mL/min (50 ٪ المذيبات B و 50 ٪ المذيبات C) موازنة لمده 30 دقيقه ، ثم في معدل تدفق 0.2 mL/min (25 ٪ المذيبات A و 75 ٪ المذيبات ب) موازنة لمده 20 دقيقه ، ثم معدل تدفق 0.4 mL/min موازنة.
  2. حل المسمي N-غليكانز مع 25 μl من خليط من 100 ٪ اسيتلونيتريل والمياه فائقه النقاء في 2:1 نسبه (v/v). ثم ، جهاز الطرد المركزي في 134 × g لمده 5 دقائق (4 درجه مئوية) وتحميل 10 μl من المسمي ن-غليكانز في الصكوك uplc.
  3. فصل N-غليكانز المسمي في معدل التدفق من 0.4 مل/دقيقه مع التدرج الخطي من 75 ٪ إلى 62 ٪ اسيتلونيتريل لمده 25 دقيقه. ثم ، تنفيذ التحليلية التي تديرها ديدكشان سلم المعايرة/glycopeptide العمود علي UPLC في 60 درجه مئوية (هنا ، تم الاحتفاظ عينات في 4 درجه مئوية قبل الحقن).
  4. كشف N-glycan مضان في أطوال موجه الاثاره والانبعاثات من 330 nm و 420 nm ، علي التوالي.
  5. دمج غليكانز علي أساس موقف الذروة والاحتفاظ بالوقت.
  6. حساب القيمة النسبية لكل غليكان الذروة (GP)/جميع قمم غليكان (GPs) (النسبة المئوية ، ٪) علي النحو التالي: GP1: GP1/GPs * 100 ، GP2: GP2/GPs * 100 ، GP3: GP3/GPs * 100 ، الخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما هو مبين في الشكل 1، تم تحليلها مفتش N-غليكانز إلى 24 الاوليه مفتش القمم غليكان (GPs) علي أساس موقف الذروة والاحتفاظ بالوقت. وتتوفر هياكل N-glycan من خلال الكشف عن الطيف الكتلي وفقا لدراسة سابقه (الجدول 1)15. ولضمان ان تكون النتائج قابله للمقارنة ، تم تطبيق التطبيع الإجمالي للمناطق ، حيث تم التعبير عن كميه الغلجان في كل ذروه كنسبه مئوية من إجمالي المساحة المتكاملة.

لتقييم قابليه التكرار والاستقرار للأسلوب ، تم اختبار العينة القياسية بالتوازي ست مرات. وكما هو مبين في الجدول 2، تراوح معامل التباين (CV) الخاص ب 24 نظام تحديد المواقع بين 1.84 في المائة-16.73 في المائة و 15 (62.50 في المائة) منها اقل من 10%. GPs مع نسب صغيره نسبيا (≤ 1.16 ٪) وأظهرت أخطاء القياس العالية (أكثر من 10 ٪ من السيرة الذاتية). الاضافه إلى ذلك ، فان التشكيلات الجانبية مفتش ن-glycan مجتمعه من 76 الافراد (الشكل 2) وأشار إلى ان موقف gp كان مستقرا ، شكل gp كان مماثلا ، والتكامل للعينات الحفاظ علي نفس الفواصل الزمنيه. تشير النتائج المذكورة أعلاه إلى ان الأسلوب مستقر وقابل للتكرار.

كما هو مبين في الجدول 3، 36 اضافيه السمات المشتقة التي تصف الوفرة النسبية لل galactosylation ، سياليلاتيون ، والانشقاق GlcNAc ، و fucosylation الاساسيه تم حسابها من قبل 24 المتبقية التي تقاس بشكل مباشر. علي سبيل المثال ، G2/G0 (GP12/GP2) يعكس مستوي الغالاكتوسيلاتيون (دي-/a-) دون fucosylation الاساسيه وإخراج GlcNAc. G2/G1 (GP14/[GP8 + GP9]) يعكس مستوي الغالاكتوسيلاتيون (دي-/مونو-) مع fucosylation الاساسيه ودون الانشقاق GlcNAc. وأخيرا ، G1/G0 ([GP10 + GP11]/gp6) يعكس مستوي الغالاكتوسيلاتيون (أحاديه-/a-) مع fucosylation الاساسيه وإخراج GlcNAc. يتبع هذا حسابات من [غليكانز] مشتقه مبدا, ان يري التغير من فقط واحده [غليكوزيلايشن] سمه.

Figure 1
الشكل 1: الكروم UPLC من فرد واحد. وقد تم تحليلها في gggggon 24 الاوليه مفتشالقمم غليكان (GPs) استنادا إلى موقف الذروة والاحتفاظ بالوقت. GP8 يمثل مجموع 8a GP و GP 8a. GP16 يمثل مجموع gp 16 الف-و gp 16 الف-. ويرد في الجدول 1 والجدول 2هيكل غليكانز في كل ذروه الكروماتوغرافيه ومتوسط النسبة المئوية للهياكل الفردية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: UPLC كروماتوجرام من 76 الافراد. تم الجمع بين ملفات التعريف مفتش ن-glycan من 76 الافراد لإثبات التكرار والاستقرار في الأسلوب. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Table 1
الجدول 1: هيكل غليكانز الاوليه 24 مفتش. GP: الذروة غليكان; F: fucose; A: عدد من الهوائي المرفقة إلى التسلسل الأساسي (القائمة من اثنين من اسيتيل الجلوكوزامين (GlcNAc) وثلاثه بقايا منانف) ؛ B: إخراج GlcNac; G: الغالاكتوز ؛ S: حمض السياليك. وتعرف المخططات الهيكلية علي النحو التالي: المربع الأزرق: GlcNac; الدائرة الخضراء: منانف. المثلث الأحمر: الاساسيه fucose/هوائيه fucose ؛ الدائرة الصفراء: الغالاكتوز ؛ المعين الأرجواني: حمض السياليك.

ذروه غليكان المتوسط (SD) السيرة الذاتية (%) ذروه غليكان المتوسط (SD) السيرة الذاتية (%)
GP1 0.23 (0.017) 7.28 GP13 0.50 (0.043) 8.64
GP2 0.24 (0.034) 13.97 GP14 19.54 (0.36) 1.84
GP3 0.96 (0.16) 16.73 GP15 1.16 (0.14) 11.63
GP4 19.52 (0.58) 2.98 GP16 2.79 (0.19) 6.93
GP5 0.17 (0.024) 13.86 GP17 1.29 (0.13) 9.78
GP6 3.19 (0.26) 8.22 GP18 13.16 (0.51) 3.85
GP7 0.29 (0.033) 11.51 GP19 2.12 (0.21) 9.76
GP8 16.45 (0.62) 3.77 GP20 0.12 (0.018) 14.91
GP9 8.97 (0.52) 5.74 GP21 1.05 (0.17) 16.09
GP10 2.97 (0.22) 7.34 GP22 0.18 (0.025) 14.16
GP11 0.30 (0.041) 13.82 GP23 2.14 (0.14) 6.45
GP12 1.27 (0.026) 2.08 GP24 1.43 (0.13) 9.12

الجدول 2: دقه الأسلوب. يتم اختبار العينة القياسية بالتوازي ست مرات لتقييم قابليه التكرار والاستقرار للأسلوب. السيرة الذاتية: معامل الاختلاف ؛ GP: غليكان الذروة; SD: الانحراف المعياري.

غليكانز المشتقة الصيغ غليكانز المشتقة الصيغ
جلاكتوسيشن الجنس الداعر
G2/G0 GP12/GP2 F1/F0 GP4/GP2
GP14/GP4 GP6/GP3
GP15/GP6 (GP8 + GP9)/GP7
G2/G1 GP12/GP7 GP14/FGP12
GP14/(GP8 + GP9) GP15/GP13
GP15/(GP10 + GP11) GP18/GP17
G1/G0 GP7/GP2 GP23/GP21
(GP8 + GP9)/GP4 GP24/GP22
(GP10 + GP11)/GP6
سياليلاتيون الإخراج GlcNAc
S2/S0 GP21/GP12 B1/B0 GP3/GP2
GP22/GP13 GP6/GP4
GP23/GP14 (GP10 + GP11)/(GP8 + GP9)
GP24/GP15 GP13/GP12
S2/S1 GP21/GP17 GP15/GP14
GP23/GP18 GP19/GP18
GP24/GP19 GP22/GP21
S1/S0 GP17/GP12 GP24/GP23
GP18/GP13
GP16/GP14
GP19/GP15

الجدول 3: حساب غليكانز المشتقة. GP: الذروة غليكان; F: fucose; B: إخراج GlcNac; G: الغالاكتوز ؛ S: حمض السياليك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Uplc بمثابه التحليل الكمي النسبي طريقه5،15. وتشير النتائج إلى ان UPLC هو تكنولوجيا الكشف مستقره مع استنساخ جيده والدقة الكمية النسبية. يتم التعبير عن كميه غليكانز في كل ذروه كنسبه مئوية من إجمالي المنطقة المتكاملة باستخدام UPLC ، وهي القيمة النسبية. ويؤدي القياس الكمي النسبي إلى تحسين قابليه عينات الاختبار للمقارنة. الاضافه إلى ذلك ، 96 البروتين جيدا وتستخدم لوحات G لتنقيه مفتش مع 96 عينات في وقت واحد للكشف عن الانتاجيه العالية. قدره البروتين ز لربط مفتش أكبر من ذلك من البروتين ا ، كما هو موضح في الدراسات السابقة15،16.

الاضافه إلى ذلك ، يتم فصل هياكل المفتشين N-glycan بشكل واضح. المشتقة مفتش جليكانز وصف مستوي galactosylation ، سياليليشن ، الانشقاق GlcNAc ، و fucosylation الاساسيه ، والتي تحسب من قبل الاوليه مفتش ن-غليكانز. في دراسة سابقه ، بعض غليكانز المشتقة (FBn،FBG0 n /G0 n، fbn /Fntotal، Bn /(Fn + FBn) ، FBG2n /FG2n،FG2 n /(BG2 n + FBG2n) ،BG2 n /(FG2 n + FBG2n)) يمكن ان تعكس التغيير في مستويات glycosylation متعددة ولكن لم تعكس مستوي glycosylation15.

في الاونه الاخيره ، أظهرت دراسة واسعه النطاق ان مفتش جاكتوسيليشن (المشار اليها باسم غال-نسبه) يمكن ان تكون بمثابه البيولوجية واعده للكشف عن السرطان في أنواع السرطان متعددة17. يتم قياس توزيع جاكتوسيلاتيون مفتش عن طريق حساب الكثافة النسبية لل agalactosylated (G0) مقابل مونوجالاكتوسيلاتيد (G1) و Digalactosylated (G2) N-غليكانز وفقا للصيغة (G0/[G1 + G2 x 2]). النسبة غال يعكس مستوي galactosylation مع fucosylation الاساسيه ودون الانشقاق GlcNAc. ولذلك ، تم الجمع بين عده الاوليه مفتش ن-غليكانز مع غليكان المشتقة ، والتي تمثل مستوي سمه glycosylation محدده. حسابات غليكانز المشتقة تتبع مبدا ان يستكشف التغييرات في سمه واحده فقط glycosylation ثابته علي سمه glycosylation الأخرى.

في هذا البروتوكول ، والرقم الهيدروجيني مهم للحفاظ علي استقرار مفتش والهياكل glycan ، وخاصه لتحقيق الاستقرار سياليلاتيون المحطة الطرفية. ولذلك ، يجب ان يتم التحكم بدقه قيمه الأس الهيدروجيني للحل ، ويجب استعاده درجه الحموضة من المحلول المعرضة لمفتش وكذلك غليكانز الاحتفاظ بها علي مستوي الحموضة محايده. بالاضافه إلى ذلك ، فان الخطوة الإفراج عن glycan حرجه في هذا البروتوكول. مفتاح الإفراج عن glycan هو تحسين نشاط انزيم PNGase F لتعظيم كفاءتها. علي سبيل المثال ، تم العثور علي ان 18-20 h هو الأمثل للهضم PNGaseF. وهذه الخطوة بحاجه إلى رد فعل كامل.

هناك بعض القيود علي هذه التقنية. الطريقة المستخدمة لا يمكن التفريق غليكانز المفرج عنهم من فأب وأجزاء Fc من مفتش. ومن المعروف ان غليكانز من فأب ونادي لتكون مختلفه. مع التطورات في غليكوبروتيميكس ، يمكن لتقنيات الكشف قياس مستويات مفتش الجمع بين n-غليكانز لاستكشاف دور مفتش ن-غليكانز و n-glycosylation في الامراض. وتكلفه المعدات منخفضه نسبيا ؛ ومع ذلك ، تكلفه لكل عينه مرتفعه نوعا ما.

وباختصار ، يقدم هذا البروتوكول UPLC بحيث يمكن استخدامه علي نطاق واسع. ويلزم اجراء تقييم شامل للأساليب التحليلية وتوحيدها قبل ان تستثمر كميات كبيره من الوقت والموارد في الدراسات الواسعة النطاق. كما UPLC يصبح أكثر استخداما ، وأثار مفتش ن-غليكانز و n-glycosylation علي بعض الامراض يمكن تحديد أكثر دقه ، ويمكن استخدام العلامات الحيوية glycosylation للتطبيقات السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل بمنح مقدمه من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81673247 & 81872682) والمنحة التعاونية الاستراليه الصينية (NH & APP1112767-NSFC 81561128020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-aminobenzamide, 2-AB Sigma, China
96-well collection plate AXYGEN
96-well filter plate Pol 0.45 um GHP
96-well monolithic plate BIA Separations
96-well plate rotor Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Acetic acid Sigma, China
Acetonitrile Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formate Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rocker Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China ZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column Watts technology Co., Ltd, China BEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma, China
Disodium phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovens Tester instruments Co., Ltd 202-2AB
Empower 3.0 Waters technology Co., Ltd, America
Ethanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acid Sigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kit Sigma, China
HCl Junrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany 5430
Igepal Sigma, China
Low temperature centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigerator Qingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plate Watts technology Co., Ltd, China 186001831
Methanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meter Millipore Co., Ltd, America Advantage A10
NaOH Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH tester Sartorius Co., Ltd, Germany PB-10
Phosphate buffered saline, PBS Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Pipette Eppendorf Co., Ltd, Germany 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzyme Sigma, China
Potassium dihydrogen phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-ol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDS Sigma, China
Sodium chloride Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma, China
Spectrophotometer Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd B-500
Transfer liquid gun Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China 4672100
Tris Amresco, America
Ultra-low temperature refrigerator Thermo Co., Ltd, America MLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatography Watts technology Co., Ltd, China Acquity MLtraPerformance LC
Vacuum Pump Watts technology Co., Ltd, China 725000604
Volatilizing machine/Dryer Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Vortex Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China NP-30S
Water-bath Tester instruments Co., Ltd DK-98-IIA
Weighing balance Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. MP200B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
  2. Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21, (1), (2014).
  3. Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392 (2013).
  4. Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
  5. Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
  6. Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
  7. Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
  8. Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
  9. Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
  10. Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
  11. Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
  12. Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
  13. Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
  14. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
  15. Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
  16. Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
  17. Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).
تحليل الغلوبولين المناعي G-Glycan بواسطة اللوني السائل فائق الأداء
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Liu, D., Xu, X., Li, Y., Zhang, J., Zhang, X., Li, Q., Hou, H., Li, D., Wang, W., Wang, Y. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60104, doi:10.3791/60104 (2020).More

Liu, D., Xu, X., Li, Y., Zhang, J., Zhang, X., Li, Q., Hou, H., Li, D., Wang, W., Wang, Y. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60104, doi:10.3791/60104 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter