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Medicine

초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 G N-글리칸 분석

doi: 10.3791/60104 Published: January 18, 2020
* These authors contributed equally

Summary

면역글로불린 G(IgG) N-글리칸은 친수성 상호작용 UPLC를 사용하는 것을 특징으로 한다. 또한, IgG N-글리칸의 구조는 명확하게 분리된다. 여기에 제시된 이 실험 방법에 대한 소개는 연구 환경에서 널리 사용될 수 있도록 한다.

Abstract

글리코믹스는 오믹스 시스템 연구의 새로운 특수 분야로, 질병 감수성, 약물 표적 발견 및 정밀 의학을 위한 차세대 바이오마커 를 발견하는 데 상당한 잠재력을 제공합니다. 대안 IgG N-glycans는 몇몇 일반적인 만성 질병에서 보고되고 임상 응용 (즉, 질병의 진단 및 예측을 위한 바이오마커)에 있는 중대한 잠재력을 가지고 제안되었습니다. IgG N-글리칸널리 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)의 방법을 사용하여 특징지어진다. UPLC는 재현성이 뛰어나고 상대적 정량이 높은 안정적인 검출 기술입니다. 또한, IgG N-glycan의 구조는 명확하게 분리되고, 혈장내의 글리칸 조성및 상대적 풍부도가 특징지어진다.

Introduction

인간단백질의 N-글리코실화는 일반적이고 필수적인 번역 후 변형1이며 질병의 발생 및 발병을 비교적 정확하게 예측하는 데 도움이 될 수 있다. 그 구조의 복잡성으로 인해 5,000 개 이상의 글리칸 구조가 있을 것으로 예상되며, 질병에 대한 진단 및 예측 바이오 마커로서 큰 잠재력을 제공합니다2. 면역글로불린 G(IgG)에 부착된 N-글리칸들은 IgG의 기능에 필수적인 것으로 나타났으며, IgG N-glycosylation은 프로-및 항염증 시스템 사이의 균형에 참여한다3. 차동 IgG N-glycosylation은 질병 병리학에 관여하는 소인 및 기능적 메커니즘을 모두 나타내는 질병 발달 및 진행에 관여한다. IgG N-glycosylation의 염증성 역할은 노화, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 암4와관련이 있다.

감지 기술의 개발과 함께, 형광 검출 (UPLC-FLR) 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피, 레이저 유도 형광을 이용한 멀티플렉스 모세관 겔 전기 영동등 은 높은 처리량 글리코믹에서 가장 널리 사용됩니다. esccence 검출 (xCGE-LIF), 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 질량 분광법 (MALDI-TOF-MS), 액체 크로마토그래피 전기 분무 질량 분석법 (LC-ESI-MS) . 이러한 방법은 낮은 유속, 불안정한 결과 및 불량 감도 특이성의 이전의단점을 극복했다5,6.

UPLC는 IgG N-glycosylation 및 특정 질병 사이의 연관성을 탐구하는 데 널리 사용됩니다 (즉, 노화7,비만8,이상지질혈증9,타입 II 당뇨병10,고혈압11,허혈성 뇌졸중12,파킨슨 병13). 위에서 언급한 다른 세 가지 방법에 비해 UPLC는다음과같은 장점을 가지고5,14. 첫째, 상대적 정량 분석 방법을 제공하고, 전체 면적 정규화를 수반하는 데이터 분석은 각 샘플의 비교성을 향상시킨다. 둘째, 장비 비용과 필요한 전문 지식이 상대적으로 적기 때문에 글리코실화 바이오마커를 임상 응용 분야로 쉽게 구현하고 변환할 수 있습니다. 여기에 제시된 UPLC에 대한 소개이므로 더 널리 사용될 수 있습니다.

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Protocol

이 의정서에 포함된 모든 과목은 중국 베이징 의과대학의 윤리위원회의 승인을 받았습니다12. 서면 동의는 연구의 시작 부분에 각 과목에서 얻은.

1. IgG 격리

  1. 결합 완충제 (인산완충식염수, PBS): 1x PBS (pH = 7.4), 중화 버퍼 : 10x PBS (pH = 6.6-6.8), 용리액 : 0.1 M 포름산 (pH = 2.5), 용리액용 중화 액: 1 M 암모늄 중탄산염, 저장 버퍼 를 포함한 화학 물질을 준비하십시오. 에탄올 + 20 mM 트리스 + 0.1 M NaCl (pH = 7.4), 단백질 G용 세정 용액 : 0.1 M NaOH + 30 % 프로판 -2-올.
    참고: 이 프로토콜에서는 pH 수준이 매우 중요합니다. IgG의 용출은 매우 낮은 pH를 필요로하며, 산 가수 분해로 인한 시실산의 손실 위험이 있다. 따라서 용출은 몇 초 내에 발생하고 pH는 IgG 및 시실산의 무결성을 보존하여 중성으로 신속하게 복원됩니다.
  2. 시료 를 준비 : 냉동 플라즈마 샘플을 해동 한 다음 10 분 동안 80 x g에서 원심 분리를 하고, 실온 (RT)에서 30 분 동안 단백질 G 모놀리식 플레이트와 상기 화학 물질을 둡니다.
  3. 100 μL 샘플(첫 번째 실패를 방지하기 위해 2x를 검출하는 데 사용할 수 있음)을 2mL 수집 플레이트(총 6개의 표준 샘플, 1개의 제어 샘플 [초순수]) 및 89개의 플라즈마 샘플을 96개의 웰 플레이트에 대해 설계하고 무작위로 할당했습니다. 접시에)를 제공합니다.
  4. 샘플을 1x PBS로 1:7(v/v)로 희석합니다.
  5. 0.45 μm 친수성 폴리프로필렌(GHP) 필터 플레이트를 200 μL의 초순수(반복 2x)로 청소합니다.
  6. 희석된 샘플을 필터 플레이트로 옮기고 진공 펌프(266.6-399.9Pa에서 진공 압력 제어)를 사용하여 샘플을 수집 플레이트로 필터링합니다.
  7. 단백질 G 모놀리식 플레이트의 제조
    1. 저장소 버퍼를 삭제합니다.
    2. 초순수 2mL, PBS 1mL 2mL, 0.1M 포름산 1mL, 10x PBS 2 mL, 1x PBS 2 mL(순차적으로) 모놀리식 플레이트를 청소하고 진공 펌프를 사용하여 흐르는 액체를 제거합니다.
  8. 여과된 샘플을 IgG 결합 및 세척을 위해 단백질 G 모놀리식 플레이트로 옮긴 다음, 1x PBS 2 mL로 모놀리식 플레이트를 세척합니다(청소 2x 반복).
  9. 0.1 M 포르믹산 1 mL로 IgG를 호루라기 하고 진공 펌프로 샘플을 수집 플레이트에 걸러낸 다음 1M 암모늄 중탄산염 170 μL을 수집 플레이트에 추가합니다.
  10. 흡수 분광광도계(최적 파장 = 280 nm)를 사용하여 IgG 농도를 검출합니다.
    1. 소프트웨어를 열고 단백질 CY3 모드를 선택합니다.
    2. 2 μL의 초순수물을 그린 다음 화면에 로드한 다음 소프트웨어의 공백을 클릭하여 화면을 지우고(1x 반복).
    3. 초순수 2μL을 그린 다음 화면에 로드한 다음 소프트웨어의 샘플을 클릭하여 초순수를 감지합니다.
    4. IgG 샘플 2 μL을 그려 서 화면에 로드 한 다음 소프트웨어의 샘플을 클릭하여 샘플을 감지합니다.
    5. 2 μL의 초순수물을 그린 다음 화면에 로드한 다음 소프트웨어의 공백을 클릭하여 화면을 지웁습니다.
    6. 소프트웨어를 닫습니다.
      참고: IgG 농도를 계산하는 공식은 다음과 같습니다.

      CIgG = 흡광도 x 소멸 계수 (13.7) x 1,000 μg/mL
  11. 추출된 IgG를 60°C에서 오븐에서 건조시키고 추출된 IgG(300 μL 추출된 IgG 4시간)를 보존한다.
    1. 농도가 1,000 μg/mL보다 큰 경우 추출된 IgG의 300 μL을 제거합니다.
    2. 농도가 500-1,000 μg/mL 인 경우 추출된 IgG의 350 μL을 제거합니다.
    3. 농도가 200-500 μg/mL 인 경우 추출 된 IgG의 400 μL을 제거하십시오.
    4. 농도가 200 μg/mL보다 작은 경우 추출된 IgG의 600 μL을 제거합니다.
      참고: IgG의 농도는 후속 검출을 위해 바람직하게는 >200 μg/mL이어야 합니다. IgG의 평균 양은 바람직하게는 >1,200 μg이어야하며, 첫 번째 테스트가 실패할 경우 2배 테스트할 수 있습니다.
  12. 재사용을 위해 단백질 G 모놀리식 플레이트 청소
    1. 초순수 2mL, 0.1M NaOH 1 mL(침전된 단백질 제거용), 초순수 4mL, 1x PBS 4mL(순차적으로)로 플레이트를 세척한 다음 진공 펌프를 사용하여 흐르는 액체를 제거합니다.
    2. 초순수 2mL, 프로판-2-ol 2mL(결합 소수성 단백질 제거용), 초순수 2mL, 1x PBS 4mL(순차적으로) 2mL로 플레이트를 세척한 다음 진공 펌프를 사용하여 흐르는 액체를 제거합니다.
    3. 완충액 1 mL (20 % 에탄올 + 20 Mm Tris + 0.1 M NaCl)으로 플레이트를 씻고 완충액 1 mL (20 % 에탄올 + 20 mm Tris + 0.1 M NaCl)을 접시에 추가한 다음 플레이트를 4 °C에서 둡니다.

2. 글리칸 방출

  1. 건조 된 IgG를 준비하고 1.33 % SDS, 4 % Igepal (빛에서 멀리 저장) 및 RT에서 5 x PBS를 포함한 화학 물질을 저장합니다.
  2. 250 U 효소를 250 μL의 초순수로 희석하여 PNGase F 효소를 준비합니다.
  3. IgG의 변성
    1. 30 μL의 1.33% SDS를 넣고 소용돌이에 의해 혼합하고 샘플을 65 °C 오븐으로 10 분 동안 옮은 다음 오븐에서 제거한 다음 15 분 동안 놓습니다.
    2. 4% 이게팔 10 μL을 넣고 5분 동안 흔들리는 인큐베이터에 놓습니다.
  4. 글리칸 제거 및 방출
    1. 5x PBS 20 μL과 0.1 mol/L NaOH의 30-35 μL을 추가하여 8.0의 pH를 조절하고 소용돌이로 혼합합니다. PNGase F 효소 4 μL을 넣고 와르싱하여 섞습니다. 이어서, 37°C 수조에서 18-20시간 동안 배양한다.
    2. 방출된 글리칸을 2.5-3.0시간 동안 60°C에서 오븐에서 건조시다.
    3. 방출된 글리칸을 추가 측정이 될 때까지 -80°C에서 저장합니다.
      참고: 이 단계는 매우 중요합니다. 글리칸 방출의 핵심은 PNGase F 효소의 활성을 개선하여 효율성을 극대화하는 것입니다.

3. 글리칸 라벨링 및 정제

  1. 2-아미노벤자미드(2-AB) 라벨링 시약을 0.70 mg의 2-AB, 10.50 μL의 아세트산, 6 mg의 시아노보로하이드라이드 나트륨(NaBH3CN), 그리고 24.50 μL의 디메틸 설산화물(DMSO) (총 부피 = 35μL)을 준비한다. 이어서, 아세트산, 2-AB 및 NaBH3CN을 순서대로 DMSO에 첨가한다.
  2. 2-AB 라벨 시약 35 μL을 사용하여 글리칸에 라벨을 붙인 후 5 분 동안 발진기로 옮기고 65 °C에서 3 시간 동안 오븐으로 옮은 다음 30 분 동안 RT로 옮김하십시오.
    참고: 전체 글리칸 라벨링 단계는 빛으로부터 보호하면서 수행해야 합니다.
  3. 0.2 μm GHP 필터 플레이트를 70% 에탄올 200 μL, 초순수 200 μL, 96% 아세토니트릴(4°C)의 200 μL로 처리한 다음 진공 펌프를 사용하여 폐기물을 제거합니다.
  4. 2-AB 표지 글리칸의 정화
    1. 2-AB 표지 글리칸에 100% 아세토니트릴 700 μL을 넣고 5분 동안 흔들리는 인큐베이터로 옮김을 옮김을 넣습니다.
    2. 134 x g에서 5 분 (4 °C)의 원심 분리기.
    3. 샘플을 0.2 μm GHP 필터 플레이트로 2분 동안 옮기고 진공 펌프를 사용하여 여과액(흐르는 액체)을 제거합니다.
  5. 2-AB 표지 글리칸을 96% 아세토니트릴(4°C)의 200 μL로 세척하고 진공 펌프5x-6x를 사용하여 여과액(흐르는 액체)을 제거합니다.
  6. 100 μL의 초순수 3x로 2-AB 라벨이 붙은 글리칸.
  7. 2-AB 라벨이 붙은 글리칸을 오븐에 옮겨 60°C에서 3.5시간 동안 건조시다.
  8. 라벨이 붙은 N-글리칸을 추가 측정이 될 때까지 -80°C에서 저장합니다.

4. 친수성 상호 작용 크로마토그래피 및 글리칸 분석

  1. UPLC 계측기의 컨디셔닝 및 이월 상 준비
    1. 용매 A: 100 mM 암모늄 포메이트 (pH = 4.4), 용매 B : 100 % 아세토니트릴, 용매 C : 90 % 초순수 (10 % 메탄올), 및 용매 D : 50 % 메탄올 (초순수)을 포함한 이상을 준비합니다.
    2. 소프트웨어를 열어 모바일 단계를 제어합니다.
    3. UPLC 계측기는 0.2 mL/min(50% 용매 B 및 50% 용매 C)의 유량으로 30분 동안 밸런싱한 다음 0.2 mL/min(25% 용매 A 및 75% 용매 B)의 유량속도로 20분 동안 밸런싱한 다음 0.4 mL/min 밸런싱의 유량으로 세척합니다.
  2. 라벨이 붙은 N-글리칸을 100% 아세토니트릴과 초순수의 혼합물25 μL로 2:1 비율(v/v)으로 용해시다. 이어서, 134×g에서 5분(4°C)의 원심분리기를 UPLC 계측기에 라벨이 붙은 N-글리칸의 10 μL을 적재한다.
  3. 25 분 동안 75 % ~ 62 %의 아세토니트릴의 선형 구배와 0.4 mL / min의 유량으로 라벨이 붙은 N-글리칸을 분리하십시오. 이어서, 60°C에서 UPLC상에서 덱스트란 교정 사다리/글리코펩타이드 컬럼에 의한 분석 실행을 수행하였다(여기서, 시료는 주입 전에 4°C에서 보관하였다).
  4. N-글리칸 형광을 각각 330 nm 및 420 nm의 여기 및 방출 파장에서 검출합니다.
  5. 피크 위치 및 유지 시간에 따라 글리칸을 통합합니다.
  6. 각 글리칸 피크(GP)/모든 글리칸 피크(GP)의 상대값 계산(백분율, %) 다음과 같이: GP1: GP1/GP*100, GP2: GP2/GP*100, GP3: GP3/GP*100, 기타

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Representative Results

도 1에나타낸 바와 같이, IgG N-글리칸스는 피크 위치 및 유지 시간에 기초하여 24개의 초기 IgG 글리칸 피크(GPs)로 분석되었다. N-글리칸구조는 이전 연구(표1)15에따른 질량 분석 검출을 통해 사용할 수 있다. 결과를 비교하기 위해, 각 피크의 글리칸 양을 총 통합 영역의 백분율로 표현한 총 면적 정규화가 적용되었습니다.

방법의 반복성 및 안정성을 평가하기 위해, 표준 샘플을 6회 병렬로 시험하였다. 표 2에나타낸 바와 같이, 24GPs의 변동계수(CV)는 1.84%-16.73%, 15(62.50%)의 범위범위 그 중 10% 미만이었습니다. 상대적으로 작은 비율을 가진 GP (≤1.16%) 높은 측정 오차(CV의 10% 이상)를 보였습니다. 또한, 76명의 개인으로부터 결합된 IgG N-glycan 프로파일(도2)은GP의 위치가 안정적이고, GP의 형상이 유사하며, 샘플에 대한 통합이 동일한 간격을 유지한다는 것을 나타냈다. 위의 결과는 방법이 안정적이고 반복 가능함을 나타냅니다.

표 3에나타낸 바와 같이, 갈락토실화, 시알릴화, 이등분 GlcNAc, 및 코어 푸코실레이션의 상대적 풍부도를 설명하는 추가36개의 유도형 특성을 나머지 24개의 직접 측정된 글리칸에 의해 계산되었다. 예를 들어, G2/G0(GP12/GP2)은 코어 퍼코실레이션및 이등분 GlcNAc 없이 갈락토실화(di-/a-)의 수준을 반영하였다. G2/G1(GP14/[GP8 + GP9])은 골락토실화(디/모노-)의 수준을 코어 푸코실레이션과 GlcNAc를 이분화하지 않고 반영했습니다. 마지막으로, G1/G0([GP10 + GP11]/GP6)은 코어 푸코실레이션및 이등분 GlcNAc를 사용하여 갈락토실화(모노/a-)의 수준을 반영했습니다. 이러한 유래 글리칸의 계산은 하나의 글리코실화 특성의 변화를 보기 위해 원리를 따른다.

Figure 1
그림 1: 한 개인의 UPLC 크로마토그램. IgG N-글리칸을 피크 위치 및 유지 시간에 기초하여 24개의 초기 IgG 글리칸 피크(GPs)로 분석하였다. GP8은 GP 8a 및 GP 8b의 합계를 나타냅니다. GP16은 GP 16a 및 GP 16b의 합계를 나타낸다. 각 크로마토그래피에서 글리칸의 구조와 개별 구조의 평균 백분율은 표 1표 2에나타내고 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 76명의 개인의 UPLC 크로마토그램. IgG N-글리칸프로파일은 76명의 개인으로부터 결합되어 방법의 반복성 및 안정성을 입증하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Table 1
표 1: 24개의 초기 IgG 글리칸의 구조. GP: 글리칸 피크; F: 푸코세; A: 코어 서열에 부착된 안테나의 수(2개의 NAcetylglucosamine(GlcNAc) 및 3개의 만노세 잔기의 존재); B: 글락을 이분화; G: 갈락토제; S: 시알레산. 구조 구성표는 다음과 같이 정의됩니다: 파란색 사각형: GlcNac; 녹색 원: 만노스; 빨간색 삼각형 : 코어 푸코스 / 안테나 푸코스; 노란색 원: 갈락토제; 보라색 목자 : 시실산.

글리칸 피크 평균(SD) 이력서 (%) 글리칸 피크 평균(SD) 이력서 (%)
GP1 0.23 (0.017) 7.28 GP13 0.50 (0.043) 8.64
Gp2 0.24 (0.034) 13.97 GP14 19.54 (0.36) 1.84
GP3 0.96 (0.16) 16.73 GP15 1.16 (0.14) 11.63
GP4 19.52 (0.58) 2.98 GP16 2.79 (0.19) 6.93
GP5 0.17 (0.024) 13.86 GP17 1.29 (0.13) 9.78
GP6 3.19 (0.26) 8.22 GP18 13.16 (0.51) 3.85
GP7 0.29 (0.033) 11.51 GP19 2.12 (0.21) 9.76
GP8 16.45 (0.62) 3.77 GP20 0.12 (0.018) 14.91
GP9 8.97 (0.52) 5.74 GP21 1.05 (0.17) 16.09
GP10 2.97 (0.22) 7.34 GP22 0.18 (0.025) 14.16
GP11 0.30 (0.041) 13.82 GP23 2.14 (0.14) 6.45
GP12 1.27 (0.026) 2.08 GP24 1.43 (0.13) 9.12

표 2: 방법의 정밀도입니다. 표준 샘플은 방법의 반복성과 안정성을 평가하기 위해 6회 병렬로 테스트됩니다. CV: 변형 계수; GP: 글리칸 피크; SD: 표준 편차.

유래 글리칸 수식 유래 글리칸 수식
갈락토실레이션 푸코실화
G2/G0 GP12/GP2 F1/F0 GP4/GP2
GP14/GP4 GP6/GP3
GP15/GP6 (GP8+ GP9)/GP7
G2/G1 GP12/GP7 GP14/FGP12
GP14/(GP8+ GP9) GP15/GP13
GP15/(GP10+ GP11) GP18/GP17
G1/G0 GP7/GP2 GP23/GP21
(GP8+ GP9)/GP4 GP24/GP22
(GP10+ GP11)/GP6
시알레이션 (동음이의) 이분질 GlcNAc
S2/S0 GP21/GP12 B1/B0 GP3/GP2
GP22/GP13 GP6/GP4
GP23/GP14 (GP10+ GP11)/ (GP8+ GP9)
GP24/GP15 GP13/GP12
S2/S1 GP21/GP17 GP15/GP14
GP23/GP18 GP19/GP18
GP24/GP19 GP22/GP21
S1/S0 GP17/GP12 GP24/GP23
GP18/GP13
GP16/GP14
GP19/GP15

표 3: 유래 글리칸의 계산. GP: 글리칸 피크; F: 푸코세; B: 글락을 이분화; G: 갈락토제; S: 시알레산.

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Discussion

UPLC는 상대정량분석방법5,15. 결과는 UPLC가 좋은 재현성과 상대적인 정량적 정확도를 갖춘 안정적인 검출 기술임을 나타냅니다. 각 피크의 글리칸 양은 상대값인 UPLC를 사용하여 총 통합 영역의 백분율로 표현됩니다. 상대 정량화는 시험 샘플의 비교 가능성을 향상시킵니다. 또한, 96웰 프로틴 G 플레이트는 높은 처리량 검출을 위해 한 번에 96개의 샘플로 IgG를 정화하는 데 사용됩니다. IgG를 결합하는 단백질 G의 능력은 이전 연구15,16에기재된 바와 같이 단백질 A보다 크다.

또한, IgG N-글리칸의 구조는 명확하게 분리된다. 유래 IgG 글리칸은 초기 IgG N-글리칸에 의해 계산되는 갈락토실화, 시알릴레이션, 이등분 GlcNAc 및 코어 푸코실레이션의 수준을 설명합니다. 이전 연구에서는 일부 유래 글리칸 (FBn, FBG0n / G0n, FB n /Fn,Bn / Fn / FBn),FBG2n / FG2n, FG2n / (BG2n + FBG2n),BG2n / (FG2n + FBG2n))은여러 글리시오의 변화를 반영할 수 있었지만 1개의 글리코화 수준을 반영하지 는 않았지만 1개의 글리시오 레벨의 변화를 반영할 수 없었습니다.

최근, 대규모 연구는 IgG 갈락토실화(Gal-ratio라고 도함)가 다중 암 유형17에서암 스크리닝을 위한 유망한 바이오마커로서 작용할 수 있음을 보여주었다. IgG 갈락토실화의 분포는 수식에 따른 아갈락토실화(G0) 모노갈락토실화(G1) 및 디갈락토실화(G2) N-글리칸의 상대적 강도를 계산하여 측정된다(G0/[G1 + G2 x 2]). Gal 비율은 GlcNAc를 이분화하지 않고 코어 푸코실레이션으로 갈락토실화 수준을 반영합니다. 따라서, 다중 초기 IgG N-글리칸을 유래 글리칸과 결합하였고, 특정 글리코실화 특성의 수준을 나타낸다. 파생 된 글리칸의 계산은 다른 글리코실화 특성에 고정 된 하나의 글리코실화 특성의 변화를 탐구하는 원리를 따릅니다.

본 프로토콜에서, pH는 IgG 및 글리칸 구조의 안정성을 유지하는 데 중요하며, 특히 말단 시알레이션을 안정화시키는 데 중요하다. 따라서 용액의 pH 값을 엄격하게 제어해야 하며 IgG에 노출된 용액의 pH는 중성 pH 수준으로 유지되는 글리칸뿐만 아니라 복원되어야 합니다. 또한, 글리칸 방출 단계는 이 프로토콜에서 중요하다. 글리칸 방출의 핵심은 PNGase F 효소의 활성을 개선하여 효율성을 극대화하는 것입니다. 예를 들어, 18-20h가 PNGaseF 소화에 최적이라는 것을 발견했습니다. 이 단계는 완전히 반응해야 합니다.

이 기술의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 사용되는 방법은 Fab 및 IgG의 Fc 부분에서 방출된 글리칸을 구별할 수 없습니다. 팹과 Fc의 글리칸들은 다른 것으로 알려져 있다. 글리코프로테오믹스의 발달과 함께, 검출 기술은 질병에서 IgG N-glycans 및 N-glycosylation의 역할을 탐구하기 위하여 N-글리칸을결합하는 IgG의수준을 측정할 수 있습니다. 장비의 비용은 상대적으로 낮다; 그러나 샘플당 비용은 다소 높습니다.

요약하면, 이 프로토콜은 UPLC를 도입하여 널리 사용될 수 있습니다. 대규모 연구에 상당한 시간과 자원을 투자하기 전에 분석 방법의 포괄적인 평가 및 표준화가 필요합니다. UPLC가 더 널리 사용됨에 따라 특정 질병에 대한 IgG N-glycans 및 N-glycosylation의 효과를 보다 정확하게 결정할 수 있으며 글리코실화 바이오마커를 임상 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81673247 및 81872682)과 호주 - 중국 협력 보조금 (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020)의 보조금으로 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-aminobenzamide, 2-AB Sigma, China
96-well collection plate AXYGEN
96-well filter plate Pol 0.45 um GHP
96-well monolithic plate BIA Separations
96-well plate rotor Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Acetic acid Sigma, China
Acetonitrile Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formate Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rocker Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China ZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column Watts technology Co., Ltd, China BEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma, China
Disodium phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovens Tester instruments Co., Ltd 202-2AB
Empower 3.0 Waters technology Co., Ltd, America
Ethanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acid Sigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kit Sigma, China
HCl Junrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany 5430
Igepal Sigma, China
Low temperature centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigerator Qingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plate Watts technology Co., Ltd, China 186001831
Methanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meter Millipore Co., Ltd, America Advantage A10
NaOH Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH tester Sartorius Co., Ltd, Germany PB-10
Phosphate buffered saline, PBS Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Pipette Eppendorf Co., Ltd, Germany 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzyme Sigma, China
Potassium dihydrogen phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-ol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDS Sigma, China
Sodium chloride Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma, China
Spectrophotometer Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd B-500
Transfer liquid gun Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China 4672100
Tris Amresco, America
Ultra-low temperature refrigerator Thermo Co., Ltd, America MLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatography Watts technology Co., Ltd, China Acquity MLtraPerformance LC
Vacuum Pump Watts technology Co., Ltd, China 725000604
Volatilizing machine/Dryer Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Vortex Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China NP-30S
Water-bath Tester instruments Co., Ltd DK-98-IIA
Weighing balance Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. MP200B

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References

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초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 G N-글리칸 분석
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Liu, D., Xu, X., Li, Y., Zhang, J., Zhang, X., Li, Q., Hou, H., Li, D., Wang, W., Wang, Y. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60104, doi:10.3791/60104 (2020).More

Liu, D., Xu, X., Li, Y., Zhang, J., Zhang, X., Li, Q., Hou, H., Li, D., Wang, W., Wang, Y. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60104, doi:10.3791/60104 (2020).

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