Summary
면역글로불린 G(IgG) N-글리칸은 친수성 상호작용 UPLC를 사용하는 것을 특징으로 한다. 또한, IgG N-글리칸의 구조는 명확하게 분리된다. 여기에 제시된 이 실험 방법에 대한 소개는 연구 환경에서 널리 사용될 수 있도록 한다.
Abstract
글리코믹스는 오믹스 시스템 연구의 새로운 특수 분야로, 질병 감수성, 약물 표적 발견 및 정밀 의학을 위한 차세대 바이오마커 를 발견하는 데 상당한 잠재력을 제공합니다. 대안 IgG N-glycans는 몇몇 일반적인 만성 질병에서 보고되고 임상 응용 (즉, 질병의 진단 및 예측을 위한 바이오마커)에 있는 중대한 잠재력을 가지고 제안되었습니다. IgG N-글리칸널리 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)의 방법을 사용하여 특징지어진다. UPLC는 재현성이 뛰어나고 상대적 정량이 높은 안정적인 검출 기술입니다. 또한, IgG N-glycan의 구조는 명확하게 분리되고, 혈장내의 글리칸 조성및 상대적 풍부도가 특징지어진다.
Introduction
인간단백질의 N-글리코실화는 일반적이고 필수적인 번역 후 변형1이며 질병의 발생 및 발병을 비교적 정확하게 예측하는 데 도움이 될 수 있다. 그 구조의 복잡성으로 인해 5,000 개 이상의 글리칸 구조가 있을 것으로 예상되며, 질병에 대한 진단 및 예측 바이오 마커로서 큰 잠재력을 제공합니다2. 면역글로불린 G(IgG)에 부착된 N-글리칸들은 IgG의 기능에 필수적인 것으로 나타났으며, IgG N-glycosylation은 프로-및 항염증 시스템 사이의 균형에 참여한다3. 차동 IgG N-glycosylation은 질병 병리학에 관여하는 소인 및 기능적 메커니즘을 모두 나타내는 질병 발달 및 진행에 관여한다. IgG N-glycosylation의 염증성 역할은 노화, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 암4와관련이 있다.
감지 기술의 개발과 함께, 형광 검출 (UPLC-FLR) 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피, 레이저 유도 형광을 이용한 멀티플렉스 모세관 겔 전기 영동등 은 높은 처리량 글리코믹에서 가장 널리 사용됩니다. esccence 검출 (xCGE-LIF), 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 질량 분광법 (MALDI-TOF-MS), 액체 크로마토그래피 전기 분무 질량 분석법 (LC-ESI-MS) . 이러한 방법은 낮은 유속, 불안정한 결과 및 불량 감도 특이성의 이전의단점을 극복했다5,6.
UPLC는 IgG N-glycosylation 및 특정 질병 사이의 연관성을 탐구하는 데 널리 사용됩니다 (즉, 노화7,비만8,이상지질혈증9,타입 II 당뇨병10,고혈압11,허혈성 뇌졸중12,파킨슨 병13). 위에서 언급한 다른 세 가지 방법에 비해 UPLC는다음과같은 장점을 가지고5,14. 첫째, 상대적 정량 분석 방법을 제공하고, 전체 면적 정규화를 수반하는 데이터 분석은 각 샘플의 비교성을 향상시킨다. 둘째, 장비 비용과 필요한 전문 지식이 상대적으로 적기 때문에 글리코실화 바이오마커를 임상 응용 분야로 쉽게 구현하고 변환할 수 있습니다. 여기에 제시된 UPLC에 대한 소개이므로 더 널리 사용될 수 있습니다.
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Protocol
이 의정서에 포함된 모든 과목은 중국 베이징 의과대학의 윤리위원회의 승인을 받았습니다12. 서면 동의는 연구의 시작 부분에 각 과목에서 얻은.
1. IgG 격리
- 결합 완충제 (인산완충식염수, PBS): 1x PBS (pH = 7.4), 중화 버퍼 : 10x PBS (pH = 6.6-6.8), 용리액 : 0.1 M 포름산 (pH = 2.5), 용리액용 중화 액: 1 M 암모늄 중탄산염, 저장 버퍼 를 포함한 화학 물질을 준비하십시오. 에탄올 + 20 mM 트리스 + 0.1 M NaCl (pH = 7.4), 단백질 G용 세정 용액 : 0.1 M NaOH + 30 % 프로판 -2-올.
참고: 이 프로토콜에서는 pH 수준이 매우 중요합니다. IgG의 용출은 매우 낮은 pH를 필요로하며, 산 가수 분해로 인한 시실산의 손실 위험이 있다. 따라서 용출은 몇 초 내에 발생하고 pH는 IgG 및 시실산의 무결성을 보존하여 중성으로 신속하게 복원됩니다. - 시료 를 준비 : 냉동 플라즈마 샘플을 해동 한 다음 10 분 동안 80 x g에서 원심 분리를 하고, 실온 (RT)에서 30 분 동안 단백질 G 모놀리식 플레이트와 상기 화학 물질을 둡니다.
- 100 μL 샘플(첫 번째 실패를 방지하기 위해 2x를 검출하는 데 사용할 수 있음)을 2mL 수집 플레이트(총 6개의 표준 샘플, 1개의 제어 샘플 [초순수]) 및 89개의 플라즈마 샘플을 96개의 웰 플레이트에 대해 설계하고 무작위로 할당했습니다. 접시에)를 제공합니다.
- 샘플을 1x PBS로 1:7(v/v)로 희석합니다.
- 0.45 μm 친수성 폴리프로필렌(GHP) 필터 플레이트를 200 μL의 초순수(반복 2x)로 청소합니다.
- 희석된 샘플을 필터 플레이트로 옮기고 진공 펌프(266.6-399.9Pa에서 진공 압력 제어)를 사용하여 샘플을 수집 플레이트로 필터링합니다.
- 단백질 G 모놀리식 플레이트의 제조
- 저장소 버퍼를 삭제합니다.
- 초순수 2mL, PBS 1mL 2mL, 0.1M 포름산 1mL, 10x PBS 2 mL, 1x PBS 2 mL(순차적으로) 모놀리식 플레이트를 청소하고 진공 펌프를 사용하여 흐르는 액체를 제거합니다.
- 여과된 샘플을 IgG 결합 및 세척을 위해 단백질 G 모놀리식 플레이트로 옮긴 다음, 1x PBS 2 mL로 모놀리식 플레이트를 세척합니다(청소 2x 반복).
- 0.1 M 포르믹산 1 mL로 IgG를 호루라기 하고 진공 펌프로 샘플을 수집 플레이트에 걸러낸 다음 1M 암모늄 중탄산염 170 μL을 수집 플레이트에 추가합니다.
- 흡수 분광광도계(최적 파장 = 280 nm)를 사용하여 IgG 농도를 검출합니다.
- 소프트웨어를 열고 단백질 CY3 모드를 선택합니다.
- 2 μL의 초순수물을 그린 다음 화면에 로드한 다음 소프트웨어의 공백을 클릭하여 화면을 지우고(1x 반복).
- 초순수 2μL을 그린 다음 화면에 로드한 다음 소프트웨어의 샘플을 클릭하여 초순수를 감지합니다.
- IgG 샘플 2 μL을 그려 서 화면에 로드 한 다음 소프트웨어의 샘플을 클릭하여 샘플을 감지합니다.
- 2 μL의 초순수물을 그린 다음 화면에 로드한 다음 소프트웨어의 공백을 클릭하여 화면을 지웁습니다.
- 소프트웨어를 닫습니다.
참고: IgG 농도를 계산하는 공식은 다음과 같습니다.
CIgG = 흡광도 x 소멸 계수 (13.7) x 1,000 μg/mL
- 추출된 IgG를 60°C에서 오븐에서 건조시키고 추출된 IgG(300 μL 추출된 IgG 4시간)를 보존한다.
- 농도가 1,000 μg/mL보다 큰 경우 추출된 IgG의 300 μL을 제거합니다.
- 농도가 500-1,000 μg/mL 인 경우 추출된 IgG의 350 μL을 제거합니다.
- 농도가 200-500 μg/mL 인 경우 추출 된 IgG의 400 μL을 제거하십시오.
- 농도가 200 μg/mL보다 작은 경우 추출된 IgG의 600 μL을 제거합니다.
참고: IgG의 농도는 후속 검출을 위해 바람직하게는 >200 μg/mL이어야 합니다. IgG의 평균 양은 바람직하게는 >1,200 μg이어야하며, 첫 번째 테스트가 실패할 경우 2배 테스트할 수 있습니다.
- 재사용을 위해 단백질 G 모놀리식 플레이트 청소
- 초순수 2mL, 0.1M NaOH 1 mL(침전된 단백질 제거용), 초순수 4mL, 1x PBS 4mL(순차적으로)로 플레이트를 세척한 다음 진공 펌프를 사용하여 흐르는 액체를 제거합니다.
- 초순수 2mL, 프로판-2-ol 2mL(결합 소수성 단백질 제거용), 초순수 2mL, 1x PBS 4mL(순차적으로) 2mL로 플레이트를 세척한 다음 진공 펌프를 사용하여 흐르는 액체를 제거합니다.
- 완충액 1 mL (20 % 에탄올 + 20 Mm Tris + 0.1 M NaCl)으로 플레이트를 씻고 완충액 1 mL (20 % 에탄올 + 20 mm Tris + 0.1 M NaCl)을 접시에 추가한 다음 플레이트를 4 °C에서 둡니다.
2. 글리칸 방출
- 건조 된 IgG를 준비하고 1.33 % SDS, 4 % Igepal (빛에서 멀리 저장) 및 RT에서 5 x PBS를 포함한 화학 물질을 저장합니다.
- 250 U 효소를 250 μL의 초순수로 희석하여 PNGase F 효소를 준비합니다.
- IgG의 변성
- 30 μL의 1.33% SDS를 넣고 소용돌이에 의해 혼합하고 샘플을 65 °C 오븐으로 10 분 동안 옮은 다음 오븐에서 제거한 다음 15 분 동안 놓습니다.
- 4% 이게팔 10 μL을 넣고 5분 동안 흔들리는 인큐베이터에 놓습니다.
- 글리칸 제거 및 방출
- 5x PBS 20 μL과 0.1 mol/L NaOH의 30-35 μL을 추가하여 8.0의 pH를 조절하고 소용돌이로 혼합합니다. PNGase F 효소 4 μL을 넣고 와르싱하여 섞습니다. 이어서, 37°C 수조에서 18-20시간 동안 배양한다.
- 방출된 글리칸을 2.5-3.0시간 동안 60°C에서 오븐에서 건조시다.
- 방출된 글리칸을 추가 측정이 될 때까지 -80°C에서 저장합니다.
참고: 이 단계는 매우 중요합니다. 글리칸 방출의 핵심은 PNGase F 효소의 활성을 개선하여 효율성을 극대화하는 것입니다.
3. 글리칸 라벨링 및 정제
- 2-아미노벤자미드(2-AB) 라벨링 시약을 0.70 mg의 2-AB, 10.50 μL의 아세트산, 6 mg의 시아노보로하이드라이드 나트륨(NaBH3CN), 그리고 24.50 μL의 디메틸 설산화물(DMSO) (총 부피 = 35μL)을 준비한다. 이어서, 아세트산, 2-AB 및 NaBH3CN을 순서대로 DMSO에 첨가한다.
- 2-AB 라벨 시약 35 μL을 사용하여 글리칸에 라벨을 붙인 후 5 분 동안 발진기로 옮기고 65 °C에서 3 시간 동안 오븐으로 옮은 다음 30 분 동안 RT로 옮김하십시오.
참고: 전체 글리칸 라벨링 단계는 빛으로부터 보호하면서 수행해야 합니다. - 0.2 μm GHP 필터 플레이트를 70% 에탄올 200 μL, 초순수 200 μL, 96% 아세토니트릴(4°C)의 200 μL로 처리한 다음 진공 펌프를 사용하여 폐기물을 제거합니다.
- 2-AB 표지 글리칸의 정화
- 2-AB 표지 글리칸에 100% 아세토니트릴 700 μL을 넣고 5분 동안 흔들리는 인큐베이터로 옮김을 옮김을 넣습니다.
- 134 x g에서 5 분 (4 °C)의 원심 분리기.
- 샘플을 0.2 μm GHP 필터 플레이트로 2분 동안 옮기고 진공 펌프를 사용하여 여과액(흐르는 액체)을 제거합니다.
- 2-AB 표지 글리칸을 96% 아세토니트릴(4°C)의 200 μL로 세척하고 진공 펌프5x-6x를 사용하여 여과액(흐르는 액체)을 제거합니다.
- 100 μL의 초순수 3x로 2-AB 라벨이 붙은 글리칸.
- 2-AB 라벨이 붙은 글리칸을 오븐에 옮겨 60°C에서 3.5시간 동안 건조시다.
- 라벨이 붙은 N-글리칸을 추가 측정이 될 때까지 -80°C에서 저장합니다.
4. 친수성 상호 작용 크로마토그래피 및 글리칸 분석
- UPLC 계측기의 컨디셔닝 및 이월 상 준비
- 용매 A: 100 mM 암모늄 포메이트 (pH = 4.4), 용매 B : 100 % 아세토니트릴, 용매 C : 90 % 초순수 (10 % 메탄올), 및 용매 D : 50 % 메탄올 (초순수)을 포함한 이상을 준비합니다.
- 소프트웨어를 열어 모바일 단계를 제어합니다.
- UPLC 계측기는 0.2 mL/min(50% 용매 B 및 50% 용매 C)의 유량으로 30분 동안 밸런싱한 다음 0.2 mL/min(25% 용매 A 및 75% 용매 B)의 유량속도로 20분 동안 밸런싱한 다음 0.4 mL/min 밸런싱의 유량으로 세척합니다.
- 라벨이 붙은 N-글리칸을 100% 아세토니트릴과 초순수의 혼합물25 μL로 2:1 비율(v/v)으로 용해시다. 이어서, 134×g에서 5분(4°C)의 원심분리기를 UPLC 계측기에 라벨이 붙은 N-글리칸의 10 μL을 적재한다.
- 25 분 동안 75 % ~ 62 %의 아세토니트릴의 선형 구배와 0.4 mL / min의 유량으로 라벨이 붙은 N-글리칸을 분리하십시오. 이어서, 60°C에서 UPLC상에서 덱스트란 교정 사다리/글리코펩타이드 컬럼에 의한 분석 실행을 수행하였다(여기서, 시료는 주입 전에 4°C에서 보관하였다).
- N-글리칸 형광을 각각 330 nm 및 420 nm의 여기 및 방출 파장에서 검출합니다.
- 피크 위치 및 유지 시간에 따라 글리칸을 통합합니다.
- 각 글리칸 피크(GP)/모든 글리칸 피크(GP)의 상대값 계산(백분율, %) 다음과 같이: GP1: GP1/GP*100, GP2: GP2/GP*100, GP3: GP3/GP*100, 기타
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Representative Results
도 1에나타낸 바와 같이, IgG N-글리칸스는 피크 위치 및 유지 시간에 기초하여 24개의 초기 IgG 글리칸 피크(GPs)로 분석되었다. N-글리칸구조는 이전 연구(표1)15에따른 질량 분석 검출을 통해 사용할 수 있다. 결과를 비교하기 위해, 각 피크의 글리칸 양을 총 통합 영역의 백분율로 표현한 총 면적 정규화가 적용되었습니다.
방법의 반복성 및 안정성을 평가하기 위해, 표준 샘플을 6회 병렬로 시험하였다. 표 2에나타낸 바와 같이, 24GPs의 변동계수(CV)는 1.84%-16.73%, 15(62.50%)의 범위범위 그 중 10% 미만이었습니다. 상대적으로 작은 비율을 가진 GP (≤1.16%) 높은 측정 오차(CV의 10% 이상)를 보였습니다. 또한, 76명의 개인으로부터 결합된 IgG N-glycan 프로파일(도2)은GP의 위치가 안정적이고, GP의 형상이 유사하며, 샘플에 대한 통합이 동일한 간격을 유지한다는 것을 나타냈다. 위의 결과는 방법이 안정적이고 반복 가능함을 나타냅니다.
표 3에나타낸 바와 같이, 갈락토실화, 시알릴화, 이등분 GlcNAc, 및 코어 푸코실레이션의 상대적 풍부도를 설명하는 추가36개의 유도형 특성을 나머지 24개의 직접 측정된 글리칸에 의해 계산되었다. 예를 들어, G2/G0(GP12/GP2)은 코어 퍼코실레이션및 이등분 GlcNAc 없이 갈락토실화(di-/a-)의 수준을 반영하였다. G2/G1(GP14/[GP8 + GP9])은 골락토실화(디/모노-)의 수준을 코어 푸코실레이션과 GlcNAc를 이분화하지 않고 반영했습니다. 마지막으로, G1/G0([GP10 + GP11]/GP6)은 코어 푸코실레이션및 이등분 GlcNAc를 사용하여 갈락토실화(모노/a-)의 수준을 반영했습니다. 이러한 유래 글리칸의 계산은 하나의 글리코실화 특성의 변화를 보기 위해 원리를 따른다.
그림 1: 한 개인의 UPLC 크로마토그램. IgG N-글리칸을 피크 위치 및 유지 시간에 기초하여 24개의 초기 IgG 글리칸 피크(GPs)로 분석하였다. GP8은 GP 8a 및 GP 8b의 합계를 나타냅니다. GP16은 GP 16a 및 GP 16b의 합계를 나타낸다. 각 크로마토그래피에서 글리칸의 구조와 개별 구조의 평균 백분율은 표 1 및 표 2에나타내고 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 76명의 개인의 UPLC 크로마토그램. IgG N-글리칸프로파일은 76명의 개인으로부터 결합되어 방법의 반복성 및 안정성을 입증하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 24개의 초기 IgG 글리칸의 구조. GP: 글리칸 피크; F: 푸코세; A: 코어 서열에 부착된 안테나의 수(2개의 NAcetylglucosamine(GlcNAc) 및 3개의 만노세 잔기의 존재); B: 글락을 이분화; G: 갈락토제; S: 시알레산. 구조 구성표는 다음과 같이 정의됩니다: 파란색 사각형: GlcNac; 녹색 원: 만노스; 빨간색 삼각형 : 코어 푸코스 / 안테나 푸코스; 노란색 원: 갈락토제; 보라색 목자 : 시실산.
| 글리칸 피크 | 평균(SD) | 이력서 (%) | 글리칸 피크 | 평균(SD) | 이력서 (%) |
| GP1 | 0.23 (0.017) | 7.28 | GP13 | 0.50 (0.043) | 8.64 |
| Gp2 | 0.24 (0.034) | 13.97 | GP14 | 19.54 (0.36) | 1.84 |
| GP3 | 0.96 (0.16) | 16.73 | GP15 | 1.16 (0.14) | 11.63 |
| GP4 | 19.52 (0.58) | 2.98 | GP16 | 2.79 (0.19) | 6.93 |
| GP5 | 0.17 (0.024) | 13.86 | GP17 | 1.29 (0.13) | 9.78 |
| GP6 | 3.19 (0.26) | 8.22 | GP18 | 13.16 (0.51) | 3.85 |
| GP7 | 0.29 (0.033) | 11.51 | GP19 | 2.12 (0.21) | 9.76 |
| GP8 | 16.45 (0.62) | 3.77 | GP20 | 0.12 (0.018) | 14.91 |
| GP9 | 8.97 (0.52) | 5.74 | GP21 | 1.05 (0.17) | 16.09 |
| GP10 | 2.97 (0.22) | 7.34 | GP22 | 0.18 (0.025) | 14.16 |
| GP11 | 0.30 (0.041) | 13.82 | GP23 | 2.14 (0.14) | 6.45 |
| GP12 | 1.27 (0.026) | 2.08 | GP24 | 1.43 (0.13) | 9.12 |
표 2: 방법의 정밀도입니다. 표준 샘플은 방법의 반복성과 안정성을 평가하기 위해 6회 병렬로 테스트됩니다. CV: 변형 계수; GP: 글리칸 피크; SD: 표준 편차.
| 유래 글리칸 | 수식 | 유래 글리칸 | 수식 |
| 갈락토실레이션 | 푸코실화 | ||
| G2/G0 | GP12/GP2 | F1/F0 | GP4/GP2 |
| GP14/GP4 | GP6/GP3 | ||
| GP15/GP6 | (GP8+ GP9)/GP7 | ||
| G2/G1 | GP12/GP7 | GP14/FGP12 | |
| GP14/(GP8+ GP9) | GP15/GP13 | ||
| GP15/(GP10+ GP11) | GP18/GP17 | ||
| G1/G0 | GP7/GP2 | GP23/GP21 | |
| (GP8+ GP9)/GP4 | GP24/GP22 | ||
| (GP10+ GP11)/GP6 | |||
| 시알레이션 (동음이의) | 이분질 GlcNAc | ||
| S2/S0 | GP21/GP12 | B1/B0 | GP3/GP2 |
| GP22/GP13 | GP6/GP4 | ||
| GP23/GP14 | (GP10+ GP11)/ (GP8+ GP9) | ||
| GP24/GP15 | GP13/GP12 | ||
| S2/S1 | GP21/GP17 | GP15/GP14 | |
| GP23/GP18 | GP19/GP18 | ||
| GP24/GP19 | GP22/GP21 | ||
| S1/S0 | GP17/GP12 | GP24/GP23 | |
| GP18/GP13 | |||
| GP16/GP14 | |||
| GP19/GP15 | |||
표 3: 유래 글리칸의 계산. GP: 글리칸 피크; F: 푸코세; B: 글락을 이분화; G: 갈락토제; S: 시알레산.
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Discussion
UPLC는 상대정량분석방법5,15. 결과는 UPLC가 좋은 재현성과 상대적인 정량적 정확도를 갖춘 안정적인 검출 기술임을 나타냅니다. 각 피크의 글리칸 양은 상대값인 UPLC를 사용하여 총 통합 영역의 백분율로 표현됩니다. 상대 정량화는 시험 샘플의 비교 가능성을 향상시킵니다. 또한, 96웰 프로틴 G 플레이트는 높은 처리량 검출을 위해 한 번에 96개의 샘플로 IgG를 정화하는 데 사용됩니다. IgG를 결합하는 단백질 G의 능력은 이전 연구15,16에기재된 바와 같이 단백질 A보다 크다.
또한, IgG N-글리칸의 구조는 명확하게 분리된다. 유래 IgG 글리칸은 초기 IgG N-글리칸에 의해 계산되는 갈락토실화, 시알릴레이션, 이등분 GlcNAc 및 코어 푸코실레이션의 수준을 설명합니다. 이전 연구에서는 일부 유래 글리칸 (FBn, FBG0n / G0n, FB n /Fn,Bn / Fn / FBn),FBG2n / FG2n, FG2n / (BG2n + FBG2n),BG2n / (FG2n + FBG2n))은여러 글리시오의 변화를 반영할 수 있었지만 1개의 글리코화 수준을 반영하지 는 않았지만 1개의 글리시오 레벨의 변화를 반영할 수 없었습니다.
최근, 대규모 연구는 IgG 갈락토실화(Gal-ratio라고 도함)가 다중 암 유형17에서암 스크리닝을 위한 유망한 바이오마커로서 작용할 수 있음을 보여주었다. IgG 갈락토실화의 분포는 수식에 따른 아갈락토실화(G0) 대 모노갈락토실화(G1) 및 디갈락토실화(G2) N-글리칸의 상대적 강도를 계산하여 측정된다(G0/[G1 + G2 x 2]). Gal 비율은 GlcNAc를 이분화하지 않고 코어 푸코실레이션으로 갈락토실화 수준을 반영합니다. 따라서, 다중 초기 IgG N-글리칸을 유래 글리칸과 결합하였고, 특정 글리코실화 특성의 수준을 나타낸다. 파생 된 글리칸의 계산은 다른 글리코실화 특성에 고정 된 하나의 글리코실화 특성의 변화를 탐구하는 원리를 따릅니다.
본 프로토콜에서, pH는 IgG 및 글리칸 구조의 안정성을 유지하는 데 중요하며, 특히 말단 시알레이션을 안정화시키는 데 중요하다. 따라서 용액의 pH 값을 엄격하게 제어해야 하며 IgG에 노출된 용액의 pH는 중성 pH 수준으로 유지되는 글리칸뿐만 아니라 복원되어야 합니다. 또한, 글리칸 방출 단계는 이 프로토콜에서 중요하다. 글리칸 방출의 핵심은 PNGase F 효소의 활성을 개선하여 효율성을 극대화하는 것입니다. 예를 들어, 18-20h가 PNGaseF 소화에 최적이라는 것을 발견했습니다. 이 단계는 완전히 반응해야 합니다.
이 기술의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 사용되는 방법은 Fab 및 IgG의 Fc 부분에서 방출된 글리칸을 구별할 수 없습니다. 팹과 Fc의 글리칸들은 다른 것으로 알려져 있다. 글리코프로테오믹스의 발달과 함께, 검출 기술은 질병에서 IgG N-glycans 및 N-glycosylation의 역할을 탐구하기 위하여 N-글리칸을결합하는 IgG의수준을 측정할 수 있습니다. 장비의 비용은 상대적으로 낮다; 그러나 샘플당 비용은 다소 높습니다.
요약하면, 이 프로토콜은 UPLC를 도입하여 널리 사용될 수 있습니다. 대규모 연구에 상당한 시간과 자원을 투자하기 전에 분석 방법의 포괄적인 평가 및 표준화가 필요합니다. UPLC가 더 널리 사용됨에 따라 특정 질병에 대한 IgG N-glycans 및 N-glycosylation의 효과를 보다 정확하게 결정할 수 있으며 글리코실화 바이오마커를 임상 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81673247 및 81872682)과 호주 - 중국 협력 보조금 (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
References
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