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Medicine

Modelo Quirúrgico Murino de Aneurisma aórtico torácico descendente fortuito tópico

Published: August 24, 2019 doi: 10.3791/60105

Summary

Describimos un protocolo quirúrgico para inducir consistentemente aneurismas de la aorta torácica descendentes robustos en ratones. El procedimiento consiste en la toracotomía izquierda, la exposición a la aorta torácica y la colocación de una esponja empapada en elastasa pancreática porcina en la pared aórtica.

Abstract

Según el Centro para el Control de Enfermedades, los aneurismas aórticos (AA) fueron considerados una de las principales causas de muerte en todas las razas y ambos sexos de 1999 a 2016. Se forma un aneurisma como resultado del debilitamiento progresivo y la dilatación eventual de la aorta, que puede romperse o desgarrarse una vez que alcanza un diámetro crítico. Los aneurismas de la aorta descendente en el pecho, llamados aneurismas de la aorta torácica descendente (dTAA), conforman una gran proporción de casos de aneurisma en los Estados Unidos. La ruptura dTAA no contenida es casi universalmente letal, y la reparación electiva tiene una alta tasa de morbilidad y mortalidad. El propósito de nuestro modelo es estudiar dTAA específicamente, dilucidar la fisiopatología de dTAA y buscar dianas moleculares para detener el crecimiento o reducir el tamaño de dTAA. Al tener un modelo murino para estudiar la patología torácica con precisión, se pueden desarrollar terapias dirigidas para probar específicamente la dTAA. El método se basa en la colocación de la elastasa pancreática porcina (EPP) directamente en la pared aórtica murinosexterna después de la exposición quirúrgica. Esto crea una reacción destructiva e inflamatoria, que debilita la pared aórtica y permite la formación de aneurisma durante semanas o meses. Aunque los modelos murinos poseen limitaciones, nuestro modelo dTAA produce aneurismas robustos de tamaño predecible. Además, este modelo se puede utilizar para probar objetivos genéticos y farmacéuticos que pueden detener el crecimiento de dTAA o prevenir la ruptura. En pacientes humanos, intervenciones como estas podrían ayudar a evitar la ruptura del aneurisma y la difícil intervención quirúrgica.

Introduction

El propósito de este método es estudiar el desarrollo, la fisiopatología y los cambios estructurales en la aorta torácica descendente murina durante la formación del aneurisma aórtico. Nuestro modelo ofrece un método reproducible y consistente para inducir aneurismas de la aorta torácica (dTAA) en ratones permitiendo así la prueba de diversos inhibidores genéticos y farmacológicos. Este trabajo puede ayudar a identificar fármacos y terapias génicas que podrían traducirse en una estrategia de tratamiento viable para los seres humanos con enfermedad de dTAA.

los dTAa se forman cuando la pared de la aorta torácica se debilita y se dilata con el tiempo hasta alcanzar un diámetro crítico al rasgarse o romperse. Clínicamente, dTAA puede progresar en silencio, aumentando de tamaño hasta que la estructura de la pared aórtica está tan distorsionada que finalmente falla, con consecuencias catastróficas. En cuanto a todo, los síntomas generalmente se desarrollan sólo cuando el aneurisma ha alcanzado un tamaño peligroso (100-150% dilatación) y está en alto riesgo de disección o ruptura1,2. la ruptura dTAA escasi universalmente letal 3, y la reparación quirúrgica electiva conlleva una morbilidad significativa4,5. Además, la mayoría de los pacientes llevan el diagnóstico de un aneurisma aórtico durante aproximadamente 5 años antes de la reparación quirúrgica6,7. Esta ventana representa un momento oportuno para intervenir no quirúrgicamente. Por lo tanto, se necesitan terapias médicas para tratar o la progresión lenta de la dTAA y representarían un avance significativo en el campo de la investigación del aneurisma. Actualmente no hay tratamientos médicos para dTAA disponibles, principalmente debido a una comprensión incompleta de la patogénesis dTAA.

En los últimos 20 años, se han desarrollado varios modelos animales dTAA, pero cada uno de estos modelos fueron distintos de los nuestros y no produjeron aneurismas robustos. Un modelo dTAA murino más similar al nuestro fue desarrollado por Ikonomidis et al.8, que incluye la aplicación directa de CaCl2 a la adventitia de la aorta. Aunque nuestro modelo fue adaptado de muchas de las técnicas establecidas por Ikonomidis, nuestro modelo es único en tres maneras separadas. En primer lugar, en nuestro modelo la aorta se expone a la elastasa tópica durante 3-5 minutos, en comparación con 15 minutos de exposición a CaCl 2. En segundo lugar, la dilatación aórtica ocurre en 2 semanas, en comparación con 16 semanas en el modelo CaCl 2. Por último, nuestro modelo produce consistentemente aneurismas de aproximadamente 100% de dilatación, en comparación con las dilataciones aórticas de 20-30% producidas por la aplicación CaCl2 (que no pueden considerarse verdaderamente aneurismas como se definen como un aumento de la aórtica diámetro >50%). Existen otros modelos murinos no quirúrgicos de formación de aneurisma, como el ratón noqueador Apo E, que forman aneurismas robustos con infusión de angiotensina II. Sin embargo, estos ratones desarrollan aneurismas de la aorta torácica suprarrenal o ascendenteen lugar de aneurismas específicamente en la aorta torácica descendente 9,10.

La razón de este protocolo es tener una manera simple, económica y adecuada para estudiar dTAA en un modelo murino. El modelo de ratón proporciona una oportunidad única para utilizar muchos knockouts genéticos y celulares específicos que se han encontrado para ser impactantes en otras enfermedades vasculares. El uso de nuestro modelo TAA específico ha sido bien recibido y los experimentos que lo utilizan se han publicado en revistas de alto impacto11,12. Hasta este punto, el modelo se ha utilizado para investigar posibles tratamientos genéticos y farmacológicos que tuvieron un efecto significativo en los modelos de aneurisma de la aorta abdominal (AAA); sin embargo, a medida que nuestro laboratorio ha ampliado el uso del modelo dTAA, estamos encontrando objetivos únicos para la formación de dTAA que podrían ser utilizados como terapias dirigidas en seres humanos.

Este modelo es más adecuado para laboratorios que tienen capacidades microquirúrgicas murinas. Aunque es técnicamente difícil, puede ser ejecutado consistentemente incluso por investigadores sin experiencia quirúrgica previa. Para un investigador sin experiencia quirúrgica murina, el modelo se puede dominar en aproximadamente 20 sesiones operativas (o aproximadamente 50 ratones). Para el investigador con experiencia quirúrgica previa, el modelo se puede dominar en 5 sesiones operativas (aproximadamente 20 ratones). Creemos que con un vídeo de alta calidad, el tiempo de dominio se puede reducir aún más. Después de la competencia, el procedimiento se puede completar en 35 minutos para la cirugía, y 20 minutos para la cosecha terminal. Los cirujanos de nuestro laboratorio pueden completar entre 10 y 12 cirugías completas por día, con una tasa de mortalidad operativa del 5-10%. La causa más común de mortalidad es la lesión pulmonar al entrar en el pecho, toxicidad anestésica o desgarro de la aorta durante la disección. Además de la investigación dTAA, este modelo también sirve como una guía para un acceso seguro y fácil a la aorta torácica y al hilum pulmonar para los investigadores que estudian otras intervenciones en el pecho.

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Protocol

Los protocolos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia (núm. 3634).

1. Inducción de anestesia e intubación

  1. Coloque un ratón C57BL/6 macho de 8-10 semanas de edad en una cámara cerrada con flujo continuo de 5% de isoflurano y mezcla de oxígeno durante 5 minutos, hasta que las respiraciones se desaceleren visiblemente.
    NOTA: Se pueden utilizar diferentes cepas, géneros y edades de los ratones dependiendo del protocolo experimental. Los ratones hembras pueden ser más difíciles de intubar debido a un tamaño más pequeño y, por lo tanto, a las vías respiratorias más pequeñas.
  2. Intubar el ratón como lo describen Vandivort et al.13.
    NOTA: El paso de intubación es la parte más difícil de este modelo para aprender y realizar. Los autores mencionados anteriormente hacen un excelente trabajo explicando los pasos en su video.

2. Asegurar el ratón a la placa quirúrgica

  1. Conecte el tubo endotraqueal (ET), confirme el aumento del pecho y coloque el ratón en la posición del decúmito lateral derecho. Gire el isoflurano a aproximadamente el 3% y aplique la lubricación en ambos ojos. El ventilador debe ajustarse para proporcionar aproximadamente 200 respiraciones por minuto y 225 ml de volumen de marea.
    NOTA: La toxicidad es rápida si el isoflurano se deja en el 5%. Sin embargo, la respuesta al isoflurano es variable, por lo que el caudal anestésico debe valorarse de tal manera que se produzcan contracciones diafragmáticas espontáneas aproximadamente cada 10-20 s y la oxigenación parezca adecuada en la inspección de las membranas mucosas y el tejido expuesto.
  2. Fije el tubo ET a la placa con cinta adhesiva. Extiende el brazo derecho rostrally para que la pata delantera esté en línea con la nariz y fíjala con cinta adhesiva.
  3. Tire de la cola caudalmente para crear una línea de tensión entre el brazo derecho y la cola, produciendo la extensión de la columna vertebral.
    NOTA: Asegurar tanto la cola como la pata derecha en línea evita la inserción excesiva o desconexión del tubo ET.
  4. Tape la pierna izquierda en su posición natural. Dibuje el brazo izquierdo ventralmente sobre la gasa enrollada y la cinta hacia abajo.

3. Preparación para la cirugía

  1. Afiva el flanco izquierdo del ratón con pinzas eléctricas desde el hombro izquierdo hasta el abdomen izquierdo.
  2. Utilice un aplicador de punta de algodón para cepillar la solución de betadina sobre el sitio quirúrgico. Utilice un nuevo aplicador de punta de algodón para cepillar 70% solución de etanol sobre el sitio quirúrgico. Dejar secar. Coloque una cortina estéril.
  3. ADVERTENCIA: Asegúrese de que todo el etanol esté completamente seco antes de proceder ya que se utiliza la electrocauterización y puede encender el etanol.

4. Entrada en el tórax

  1. Haga una incisión lateral de 1 cm en el punto medio del hemitrastóx con tijeras quirúrgicas. Utilice la electrocauterización de mano para dividir las capas musculares hasta que las costillas sean visibles.
  2. Cauterizar directamente una porción de 2 mm de la costilla.
    NOTA: Cuando utilice electrocauterización en la costilla, observe la frecuencia respiratoria espontánea. Si el ratón tiene una contracción diafragmática durante la cautela, la punta puede entrar en el tórax y perforar el pulmón, que suele ser mortal en este modelo.
  3. Usando un aplicador húmedo con punta de algodón fino en el espacio de las costillas superior a la porción cauterizada, gire la punta sobre el tejido para romper en el espacio pleural. Coloque la esponja humedecida de 3 mm x 2 mm en el tórax para ayudar a colapsar el pulmón.
    NOTA: Deje que las esponjas suaves, húmedas y entren en contacto con el pulmón, ya que es extremadamente delicado.
  4. Utilice tijeras para cortar a lo largo del aspecto superior de la costilla cauterizada, hasta que el diafragma sea visible.

5. Exposición aórtica

  1. Coloque los retractores de costillas y utilícelos para abrir la incisión de toracotomía. Retire cuidadosamente la esponja de la superficie del pulmón.
  2. Coloque la esponja humedecida de 6 mm x 4 mm de modo que quede cubriendo el pulmón, con extremos apuntando de forma rostrally y caudal. Coloque el retractor pulmonar (plano ancho) sobre la esponja y deslice suavemente el retractor ventralmente hasta que la aorta torácica descendente quede expuesta.
  3. Utilice #7 fórceps para diseccionar el tejido conectivo y la grasa de la aorta durante una sección de aproximadamente 5 mm.
    NOTA: Las venas pequeñas pueden estar corriendo transversalmente a través de la aorta; evitar rasgarlos durante la disección (usar al menos 14x aumento puede ayudar a evitar esta complicación).

6. Exposición a elastasa

  1. Saturar la esponja de 0,5 mm x 1 mm con 12 ml de elastasa pancreática porcina y colocarla sobre la superficie expuesta de la aorta.
    NOTA: No deje que la esponja toque el pulmón contralateral.
  2. Después del tiempo predeterminado (generalmente 3-5 min), retire la esponja de elastasa con #7 fórceps. Retire el retractor pulmonar. Irrigar la cavidad torácica con 1 ml de solución salina estéril.
    NOTA: Retire el retractor pulmonar antes de irrigación con solución salina, ya que permitirá que la esponja pulmonar se sature y se descante, lo que facilita su eliminación de la superficie del pulmón.
  3. Utilice una gasa enrollada de 2" x 2" para absorber el riego salino restante. Gire el isoflurano al 2%.

7. Cierre del pecho

  1. Retire la esponja pulmonar. Retire el retractor pulmonar caudal. Retire el retractor de pulmón rostral.
  2. Coloque 3 suturas no absorbibles de 6-0 interrumpidas para oponerse a las costillas, ate un nudo suelto en cada una, pero no ate. Tenga mucho cuidado de no tocar el pulmón con la aguja de sutura.
  3. Vuelva a inflar el pulmón mediante la oclusión del tubo de salida en el ventilador o soplando rápidamente 0,5-1,0 ml de aire a través del tubo ET mediante la utilización de la polla de parada de 3 vías.
    NOTA: Para evitar el barotraumatismo, evite el uso excesivo de la jeringa llena de aire y no utilice más de 1,0 ml de aire.
  4. Ate suturas no absorbibles. Reaproxima las capas musculares con una sutura multifilamento absorbible 5-0. Gire el isoflurano al 1%.
  5. Cierre la piel con 7-10 suturas no absorbibles interrumpidas 5-0. Gire el isoflurano a 0%.

8. Recuperación

  1. Administrar 6 g (0,02 ml de una suspensión de 0,3 mg/ml) de buprenorfina por vía subcutánea. Retire la cinta del pie derecho, la cola y el brazo izquierdo seguido de la cinta del brazo derecho.
  2. Cuando el ratón mueve las extremidades, extubere tirando de ella por su cola para deslizarse fuera del tubo ET. Colocar en la cámara más cálida de alto contenido de oxígeno en la posición supina.
    NOTA: Es seguro mover el ratón de la cámara de oxígeno a la jaula cuando puede girarse a sí mismo a la posición normal de pie. Además, los ratones deben ser monitoreados en busca de signos de dolor, angustia o falta de desarrollo con frecuencia durante las primeras 24-48 horas después de la cirugía y proporcionar analgesia adicional o alimentos blandos como se indica.

9. Exposición del aneurisma aórtico (procedimiento de cosecha terminal)

NOTA: En general, la cosecha de tejido se lleva a cabo a los 14 días, ya que esto representa el período de dilatación máxima. Sin embargo, dependiendo del experimento, el tiempo del procedimiento de cosecha se puede llevar a cabo en cualquier momento entre 3 días y 4+ semanas, dependiendo del experimento.

  1. Intubar y asegurar el ratón al campo operativo como se describió anteriormente (secciones 1-3). Use tijeras para inciser la piel medialmente desde el flanco izquierdo hasta el abdomen central teniendo cuidado de no entrar en el peritoneo.
  2. Incise la piel desde el flanco izquierdo dorsal rostrally hasta el nivel del hombro izquierdo. A continuación, incise en un ángulo de 90o a través de la axila al esternón.
    NOTA: Esta incisión debe rodear completamente la incisión cutánea original.
  3. Usando cauterio, disecciona la solapa de la piel hacia el aspecto ventral del ratón, exponiendo el hemitórax izquierdo. Usa tijeras para entrar en el abdomen e inciso a lo largo del margen costalista izquierdo de ventral a dorsal para exponer la parte inferior del diafragma izquierdo. El borde lateral más lateral del diafragma puede abrirse y se desea.
  4. Si no se crea con el paso anterior, incise el diafragma en su borde más lateral. Coloque la punta de la cauterización en este agujero y cauterice el diafragma fuera del margen costal al proceso de la ciifoidea. Usando un aplicador húmedo con punta fina de algodón, libere suavemente el pulmón de las adherencias a la pared torácica y empuje el pulmón medialmente.
    NOTA: Si las adherencias no salen fácilmente de la pared torácica, utilice cautery para eliminarlas; hacerlo ayuda a evitar el desgarro del pulmón que puede causar sangrado abundante.
  5. Cauterizar el interior de la pared torácica desde la costilla uno hasta el margen costal, dorsal a la línea axilar media pero al menos 2 mm de la aorta. Corte la pared torácica a lo largo de la línea cauterizada.
    NOTA: Esta técnica evita el sangrado de las arterias intercostales.
  6. Corte a lo largo del margen superior de la costilla uno y luego caudalmente a lo largo del borde lateral del esternón, retirando la caja torácica izquierda. Coloque los retractores en el pulmón y tire de la media. Coloque el retractor en el diafragma y dibuje caudalmente para exponer la mayor cantidad de aorta posible.
  7. Utilice un aplicador seco con punta de algodón para eliminar las adherencias del aneurisma aórtico y un segmento distal no afectado. Mida el diámetro del segmento de control no afectado y la porción más ancha del aneurisma tratado por elastasa utilizando micrometría de vídeo.
    NOTA: Las mediciones de micrometría de vídeo se utilizan para calcular el porcentaje de dilatación del segmento aneurisma en comparación con un segmento de control con la ecuación 1. Se selecciona un segmento de control de 0,5 mm distal al segmento aneurisma 1.

    Equation 1Ecuación 1
     
  8. Agarre la aorta con fórceps de daño, simplemente distal al segmento tratado. Usa tijeras para cortar el distal a los fórceps, luego disecciona la aorta de la columna vertebral. Cortar la aorta proximal al segmento tratado y eliminar la aorta aneurisma.
  9. Con una jeringa y una aguja de tuberculina, lave el lumen aórtico con salina y procese el tejido como desee.

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Representative Results

La aplicación de nuestro protocolo da como resultado un dTAA robusto en ratones en comparación con los controles salinos. Los TAA desarrollados tienen forma fusiforme y se producen únicamente en la parte tratada de la aorta (Figura1 y Figura 2)11. La Figura 2 muestra un ejemplo de una medición de micrometría de vídeo en la cosecha de tejidos. Usando la Ecuación 1, la dilatación aórtica es 130% en este ejemplo.

El estudio original de Johnston et al.11 que describe el modelo mostró un aumento significativo en la dilatación aórtica en ratones tratados con elastasa de tipo salvaje (WT TAA) a los 3, 7, 14 y 21 días en comparación con los controles en ratones de tipo salvaje (controles WT). La dilatación aórtica máxima se produjo en el día 14 (WT TAA: 99,6 á 24,7% frente al control WT: 14,4 a 8,2%; p < 0,0001) (Figura3)11. 12 muestra una dilatación similar a los 14 días.

Al examinar la histología, los TAA WT tienen fibras de elastina que se adelgazan y fragmentan. También hay una tinción de células musculares menos lisas (SM-A), mientras que la expresión de macrófagos (Mac2) e interleucina-1 ( IL-1o) se incrementan (Figura4).

Figure 1
Figura 1 : Muestra fotografías del modelo y equipamiento del aneurisma de la aorta torácica (TAA). De izquierda a derecha, (1) exposición inicial de la aorta torácica a través de una toracotomía izquierda, (2) disección de la pleura, (3) aplicación de una esponja empapada por elastasa y (4) eliminación de la esponja. Para la cosecha aórtica (5), la toracotomía se reabrió, y la aorta torácica se diseccionó libre y se midió. (6) La ilustración a la derecha demuestra la asociación relativa de la aorta con el esófago, el pulmón y la vena hemiazygos. Esta figura ha sido adaptada de Johnston et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Medición de micrometría de vídeo de muestra de TAA. C - Segmento de control no expuesto, A - segmento aneurisma tratado con elastasa, RL - pulmón derecho, E - esófago, T - cola, H - cabeza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Diámetro aórtico a lo largodel tiempo durante la formación de TAA . Diámetro aórtico medio (mm a SD) en ratones WT expuestos a elastasa (WT TAA, gris) o expuestos a salina (control WT, verde) a lo largo del tiempo. Se produjeron diferencias significativas entre el control WT TAA y WT en todos los puntos de tiempo marcados con asterisco (p < 0.05). La dilatación aórtica máxima se produce en el día 14 (WT TAA: 99,6 á 24,7% frente al control WT: 14,4 a 8,2%; p < 0,0001). Las barras de error representan la desviación estándar. Esta figura ha sido adaptada de Johnston et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Examen histológico del tejido de control de la elastasa WT TAA y WT. Muestra las secciones transversales aórticas del control WT (esponja salina) y los TAA WT (esponja de elastasa) el día 14. Tinción para elastina, células musculares lisas (SM-A), macrófagos (Mac2) e interleucina-1o (IL-1o). Barra de escala a 50 m. Esta figura ha sido adaptada de Johnston et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Examen dosis-respuesta del frasco de elastasa individual. Cada grupo de puntos representa un tiempo especificado previamente cuando se permite que la esponja empapada por elastasa se demore. Estos datos se utilizan para estimar el tiempo de digestión ideal para 100-130% dilatación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La aorta torácica y abdominal son celular y embrionariamente distintas, lo que es relevante para la enfermedad aneurisma14,15,16. Por lo tanto, se necesita un modelo animal específico para estudiar TAA. Aunque otros modelos de dTAA murinos se han publicado8, el nuestro es el único modelo para crear dilatación aórtica torácica descendente que puede considerarse verdaderamente aneurisma (más del 50% de dilatación). Además, nuestro modelo es relativamente rápido de ejecutar y resulta en la dilatación máxima a los 14 días en comparación con 16 semanas en el CaCl2 modelo8. Esta eficiencia ha facilitado el estudio de intervenciones farmacológicas específicas que podrían traducirse a ensayos en humanos11,12. Sin embargo, este protocolo tiene varios aspectos desafiantes y limitaciones.

Nuestro modelo utiliza elastasa pancreática porcina purificada, que se ha utilizado en varios modelos AAA anteriores. Se cree que el mecanismo de acción es la descomposición de la elastina en los medios de la aorta y la creación de una respuesta inflamatoria robusta, lo que conduce a una pared menos obediente y eventualmente más débil. El efecto digestivo de la elastasa varía de una botella a otra. Para garantizar un efecto digestivo constante, se debe realizar una curva dosis-respuesta para cada nueva botella de elastasa. La dosis corresponde al tiempo durante el cual se permite la quema la gasa empapada por elastasa. En la Figura 5se muestra un ejemplo de dicha curva. Los tiempos específicos de exposición a la esponja de elastasa se examinan con el objetivo de encontrar una duración de exposición que crea aneurismas de 100-130% de dilatación a los 14 días. En esta curva de ejemplo, se designa un tiempo de digestión de 4 minutos para esta botella de elastasa (por ejemplo, la menor cantidad de elastasa disponible es de 10 ml, lo que es suficiente para aproximadamente 830 ratones individuales). La digestión excesiva de la elastasa puede causar sangrado intraoperatorio o ruptura prematura y una exposición insuficiente puede no causar suficiente digestión y dilatación aneurisma.

Debido a que este modelo implica la apertura de la cavidad torácica, el uso de ventilación de presión positiva es obligatorio. Inicialmente utilizamos una disección anterior del cuello y una intubación orotraqueal bajo visión directa, pero este método llevaba mucho tiempo, ya que requería una incisión y cierre adicionales. Ahora utilizamos una intubación orotraqueal directa según lo detallado por Vandivort et al.13. Al entrenar nuevos cirujanos en este modelo, recomendamos practicar la técnica de intubación extensamente para dominarlo antes de pasar a la cirugía real. Una vez que el ratón está intubado con éxito, se debe tener mucho cuidado de no desalojar el tubo a medida que el edema aumenta con cada intento de intubación, disminuyendo sucesivamente las posibilidades de éxito y aumentando las posibilidades de una lesión fatal en las vías respiratorias. También se debe tener mucho cuidado para minimizar el riesgo de extubación durante la cirugía, ya que el tiempo necesario para la reintubación es casi invariablemente fatal. Como se detalla en nuestro protocolo, asegurar el brazo derecho y la cola bajo una pequeña cantidad de tensión evitará el desplazamiento rostral o caudal durante la cirugía y por lo tanto minimizará el riesgo de extubación.

El control de la anestesia es vital en este modelo. 13 discutidos en su estudio sobre la intubación, es necesario un nivel profundo de sedación. Si el ratón está consciente durante el procedimiento de intubación, la resistencia a la inserción del tubo ET puede causar lesiones traqueales e intubación esofágica. Para reducir el riesgo de toxicidad por isoflurano, una vez confirmada la colocación traqueal del tubo ET, el porcentaje de mezcla de isoflurano debe reducirse aproximadamente a la mitad del de utilización para la inducción. Para lograr el porcentaje ideal de isoflurano, el ratón debe tener una contracción diafragmática espontánea cada 10-20 segundos. A medida que la cirugía progresa, el isoflurano debe reducirse progresivamente y apagarse completamente después de colocar la última puntada de cierre de la piel. Los restricciones de cinta deben ser retirados mientras el ratón todavía se está recuperando de la anestesia como la extracción mientras el ratón está despierto puede ser traumático. Para ayudar con la recuperación y disipación de isoflurano residual recientemente modificamos el procedimiento de tal manera que el ratón se recupera en un ambiente de alto calentamiento de oxígeno inmediatamente después de la extubación.

El pulmón del ratón es extremadamente delicado y las lesiones por punción, manejo inapropiado o exposición a elaslas casi siempre resultan en la muerte. El punto más común de lesión pulmonar es la entrada inicial en la pleura. Cuando se utiliza cautery en las costillas (paso 4.2), recomendamos prestar mucha atención a la frecuencia de respiración espontánea y sólo activar la cautela durante unos segundos inmediatamente después de una respiración. Esto ayuda a prevenir una expansión inesperada de la caja torácica que puede conducir la punta de la cauterización a través de la pared torácica y hacia el pulmón. El uso del aplicador de punta de algodón humedecido en el siguiente paso para romper suavemente los tejidos y la membrana pleural también ayudó a minimizar nuestra tasa de lesiones pulmonares ya que los instrumentos afilados no están cumpliendo con la superficie pulmonar. Por último, si la esponja empapada por elastasa entra en contacto con cualquiera de los pulmones directamente, puede producirse un daño grave. Esto se puede evitar al no entrar en el espacio pleural contralateral durante la disección aórtica y preparar la esponja para que pueda ser colocada directamente sobre la aorta con poco reposicionamiento. Al final de la cirugía, se debe intentar volver a inflar el pulmón izquierdo ocluyendo el tubo de salida del respirador. Si eso no tiene éxito, la inyección directa de 0,5 a 1,0 ml de aire a través de la parada de 3 vías puede volver a expandir el pulmón. Si ambos métodos no funcionan, el cierre debe continuar con normalidad. Hemos encontrado que si no hay una lesión pulmonar importante, los ratones toleran un pulmón parcialmente inflado relativamente bien y el pulmón casi siempre se infla en la cosecha de tejido.

Este modelo tiene varias limitaciones. Los modelos experimentales no modelan completamente la enfermedad aórtica humana. dTAA se produce en 14 días después de una aplicación de elastasa en nuestro modelo, mientras que la formación de TAA humano es multifactorial y ocurre a lo largo de años, si no décadas. Sin embargo, un modelo de ratón que tarda meses o años en desarrollar aneurismas no es útil en una capacidad de investigación. A diferencia de la enfermedad humana, los aneurismas inducidos por elaslos en nuestro modelo comienzan a disminuir de tamaño cuando alcanzan la máxima dilatación a las dos semanas posteriores a la operación. Esta regresión se puede superar con el uso de -aminopropionitrilo (BAPN) suplementado en la dieta del ratón postoperatoria. Cuando se combina con el modelo de exposición a elastasa, la suplementación de BAPN permite el crecimiento continuo y, finalmente, la ruptura, imitando mejor la cronicidad de la enfermedad humana. Nuestro laboratorio ha estudiado previamente BAPN en AAA17 y actualmente lo estamos usando en el modelo dTAA para perfeccionar aún más nuestro protocolo. Los experimentos primarios con el modelo dTAA han demostrado tasas de ruptura de aproximadamente el 30% a los 28 días.

En el futuro, planeamos utilizar este modelo para evaluar otros tratamientos genéticos y farmacológicos que pueden ser traducibles al tratamiento del aneurisma en humanos. Debido a que este protocolo describe una manera fácil y segura de acceder a la aorta torácica, puede ser utilizado por otros laboratorios que deseen probar intervenciones en la aorta torácica.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la Subvención de Desarrollo Científico de la AHA 14SDG18730000 (M.S.), NIH K08 HL098560 (G.A.) y RO1 HL081629 (G.R.U.). Este proyecto fue apoyado por la Beca de Investigación de la Fundación de Cirugía Torácica para la Investigación y la Educación (TSFRE) (PI: G. Ailawadi). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones de la NHLBI o del TSFRE. Agradecemos a Anthony Herring y Cindy Dodson por su conocimiento y experiencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiocatheter (22G) Used for ET Tube
Dumont Tweezers; Pattern #7 x2 Roboz RS-4982
Graefe Tissue Forceps Roboz RS-5158
Harms Forceps x2 Roboz RS-5097
Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length Roboz RS-7800
 KL 1500 LED Light Source Leica 150-400
 M205A Dissction Microscope Leica CH 94-35
Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide World Precision Instruments 500216-G
Metal Clip board Use with the Mouse Retractor Set 
Mouse Retractor Set Kent SURGI-5001 Need 2 short and 1 tall fixators
Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector Harvard Apparatus 73-0043 MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled
Sigma Aldrich Elastase from porcine pancreas E0258-50MG Can be purchased in various size bottles
Small Vessel Cauterizer Kit Fine Science Tools 18000-00 Recommend using rechargable AA batteries
Spring Scissors, 10.5cm World Precision Instruments 14127
Steril Swabs (Sponges) Sugi 31603 Can be cut to size
Surgi Suite Surgical Platform Kent Attach to clip board 
Tech IV Isoflurane Vap Jorgensen Laboratories  J0561A Anesthesia vaporizer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Medicina Número 150 aneurisma de la aorta torácica modelo murino elastasa cirugía cardíaca aorta inflamación
Modelo Quirúrgico Murino de Aneurisma aórtico torácico descendente fortuito tópico
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Tyerman, Z., Dahl, J., Shannon, A.,More

Tyerman, Z., Dahl, J., Shannon, A., Johnston, W. F., Pope, N. H., Lu, G., Upchurch Jr., G. R., Ailawadi, G., Salmon, M. Murine Surgical Model of Topical Elastase Induced Descending Thoracic Aortic Aneurysm. J. Vis. Exp. (150), e60105, doi:10.3791/60105 (2019).

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