Summary
We beschrijven een chirurgisch protocol voor het consequent induceren van robuuste aflopend thoracische aorta aneurysma bij muizen. De procedure omvat linker Thoracotomie, thoracische aorta blootstelling, en plaatsing van een spons gedrenkt in varkens alvleesklier elastase op de aorta wand.
Abstract
Volgens het centrum voor ziektecontrole, aorta aneurysma (AAs) werden beschouwd als een leidende doodsoorzaak in alle rassen en beide geslachten van 1999-2016. Een aneurysma vormt een gevolg van progressieve verzwakking en uiteindelijke verwijding van de aorta, die kan scheuren of scheuren zodra het een kritische diameter bereikt. Aneurysmata van de afdalende aorta in de borst, genaamd dalende thoracale aorta aneurysmata (dtaa), vormen een groot deel van de aneurysma gevallen in de Verenigde Staten. Onopgenomen dTAA ruptuur is bijna universeel dodelijk, en electieve reparatie heeft een hoge mate van morbiditeit en sterfte. Het doel van ons model is om dTAA specifiek te bestuderen, om de pathofysiologie van dTAA te verhelseren en om moleculaire doelen te zoeken om de groei te stoppen of de grootte van dTAA te verkleinen. Door een Murine model te hebben om thoracische pathologie nauwkeurig te bestuderen, kunnen gerichte therapieën worden ontwikkeld om specifiek dTAA te testen. De methode is gebaseerd op de plaatsing van de varkens alvleesklier elastase (PPE) direct op de buitenste muriene aorta wand na chirurgische blootstelling. Dit creëert een destructieve en inflammatoire reactie, die de aorta wand verzwakt en zorgt voor aneurysma vorming gedurende weken tot maanden. Hoewel Murine-modellen beperkingen hebben, produceert ons dTAA-model robuuste aneurysmata van voorspelbare grootte. Bovendien kan dit model worden gebruikt om genetische en farmaceutische doelstellingen te testen die de groei van dTAA kunnen arresteren of ruptuur voorkomen. Bij menselijke patiënten zouden interventies zoals deze kunnen helpen voorkomen dat aneurysmaruptuur, en moeilijke chirurgische interventie.
Introduction
Het doel van deze methode is het bestuderen van de ontwikkeling, pathofysiologie, en structurele veranderingen in de Murine dalende thoracale aorta tijdens aorta aneurysma vorming. Ons model biedt een reproduceerbare en consistente methode om thoracische aorta aneurysma (dTAA) in muizen te induceren, waardoor het testen van verschillende genetische en farmacologische remmers mogelijk is. Dit werk kan helpen bij het identificeren van geneesmiddelen en gentherapieën die kunnen worden vertaald naar een levensvatbare behandelingsstrategie voor mensen met dTAA-ziekte.
dtaas vorm wanneer de wand van de thoracale aorta wordt verzwakt en verwijde na verloop van tijd tot het bereiken van een kritische diameter wanneer scheuren of ruptuur kan dan optreden. Klinisch kan dTAA in stilte vooruitgang boeken, in omvang toenemen totdat de structuur van de aorta wand zo vervormd is dat het uiteindelijk faalt, met catastrofale gevolgen. De symptomen ontwikkelen zich meestal alleen wanneer het aneurysma een gevaarlijke omvang heeft bereikt (100-150% verwijding) en een hoog risico op dissectie of ruptuur1,2. dtaa ruptuur is bijna universeel dodelijk3, en electieve chirurgische reparatie draagt significante morbiditeit4,5. Bovendien, de meeste patiënten dragen de diagnose van een aorta aneurysma voor ongeveer 5 jaar voor chirurgische reparatie6,7. Dit venster geeft een geschikt moment om niet-chirurgisch in te grijpen. Dus, medische therapieën voor de behandeling of trage progressie van dTAA zijn nodig en zou een aanzienlijke vooruitgang op het gebied van aneurysma onderzoek vertegenwoordigen. Er zijn momenteel geen medische behandelingen voor dTAA beschikbaar, vooral vanwege een onvolledig begrip van dTAA-pathogenese.
In de afgelopen 20 jaar zijn verschillende dTAA diermodellen ontwikkeld, maar elk van deze modellen waren verschillend van onze eigen en niet produceren robuuste aneurysma. Het meest vergelijkbare Murine dTAA-model is ontwikkeld door Ikonomidis et al.8, met directe toepassing van CACL2 op de adventitia van de aorta. Hoewel ons model is aangepast aan veel van de technieken die door Ikonomidis zijn uiteengezet, is ons model op drie verschillende manieren uniek. Ten eerste, in ons model de aorta wordt blootgesteld aan actuele elastase voor 3-5 minuten, in vergelijking met 15 minuten van CaCl2 blootstelling. Ten tweede, aorta dilatatie treedt op in 2 weken, in vergelijking met 16 weken in de CaCl2 model. Ten slotte produceert ons model consequent aneurysmata van ongeveer 100% dilatatie, in vergelijking met de aorta dilataties van 20-30% geproduceerd door CaCl2 -toepassing (die niet echt als aneurysmata kan worden beschouwd omdat ze worden gedefinieerd als een toename in aorta diameter > 50%). Er zijn andere niet-chirurgische Murine modellen van aneurysma vorming, zoals de APO E knock-out muis, die robuuste aneurysmata vormen met infusie van angiotensine II. Echter, deze muizen ontwikkelen supra-nier of stijgende thoracale aorta aneurysma in plaats van aneurysma specifiek in de dalende thoracale aorta9,10.
Het rationele voor dit protocol is om een eenvoudige, goedkope en tijd geschikte manier te hebben om dTAA in een muriene model te bestuderen. Het muismodel biedt een unieke kans om veel genetische en celspecifieke Knockouts te gebruiken die zijn gevonden om impactvol te zijn in andere vasculaire ziekten. Het gebruik van onze specifieke taa model is goed ontvangen en experimenten met behulp van het zijn gepubliceerd in hoge impact tijdschriften11,12. Op dit punt, het model is gebruikt voor het onderzoeken van mogelijke genetische en farmacologische behandelingen die een significant effect in de abdominale aorta aneurysma (AAA) Murine modellen had; echter, als ons lab heeft uitgebreid gebruik van de dTAA model, we zijn het vinden van doelen die uniek zijn voor dTAA formatie die kan worden gebruikt als gerichte therapieën bij de mens.
Dit model is het meest geschikt voor laboratoria die Murine micro-chirurgische capaciteiten hebben. Hoewel het technisch uitdagend, het kan worden uitgevoerd consequent zelfs door onderzoekers zonder voorafgaande chirurgische ervaring. Voor een onderzoeker zonder muriene chirurgische ervaring kan het model worden beheerst in ongeveer 20 operatieve sessies (of ongeveer 50 muizen). Voor de onderzoeker met voorafgaande chirurgische ervaring, het model kan worden beheerst in 5 operatieve sessies (ongeveer 20 muizen). We geloven met een video van hoge kwaliteit, de tijd tot meesterschap kan verder worden gereduceerd. Nadat de vaardigheid is bereikt, kan de procedure worden voltooid in 35 minuten voor de operatie, en 20 minuten voor de Terminal oogst. De chirurgen in ons laboratorium kunnen 10-12 volledige operaties per dag voltooien, met een operatieve sterfte graad van 5-10%. De meest voorkomende oorzaak van sterfte is long letsel bij binnenkomst op de borst, verdoving toxiciteit, of scheur van de aorta tijdens dissectie. Naast dTAA-onderzoek dient dit model ook als een leidraad voor veilige en gemakkelijke toegang tot de thoracale aorta en Lung Hilum voor onderzoekers die andere interventies in de borstkas bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dieren protocollen zijn goedgekeurd door de Universiteit van Virginia institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (nr. 3634).
1. inductie van anesthesie en intubatie
- Plaats een 8-10-week oude mannelijke C57BL/6-muis in een gesloten kamer met een continue stroom van 5% Isofluraan en zuurstof mengsel gedurende 5 minuten, totdat de ademhaling zichtbaar wordt vertraagd.
Opmerking: afhankelijk van het experimentele protocol kunnen verschillende stammen, geslachten en leeftijden van muizen worden gebruikt. Vrouwelijke muizen zijn mogelijk moeilijker te intuberen vanwege kleinere afmetingen en dus kleinere luchtweg. - Intuberen de muis zoals beschreven door Vandivort et al.13.
Opmerking: de intubatie stap is het moeilijkste deel van dit model om te leren en uit te voeren. De hierboven genoemde auteurs doen uitstekend werk met uitleg over de stappen in hun video.
2. de muis vastzetten op de chirurgische kaart
- Verbind de Endotracheale (ET) buis, bevestig de borst stijging en leg de muis in de juiste laterale decubitus positie. Draai Isofluraan tot ongeveer 3% en breng smering aan op beide ogen. De ventilator moet worden ingesteld om ongeveer 200 ademingen per minuut en 225 μL getij volume te leveren.
Opmerking: toxiciteit is snel als Isofluraan 5% wordt achtergelaten. Echter, de respons op Isofluraan is variabel, dus anestheticum debiet moet zodanig worden getitreerd dat spontane diafragmatische contracties ongeveer elke 10-20 s optreden en oxygenatie voldoende blijkt bij de inspectie van de slijmvliezen en het blootgestelde weefsel. - Bevestig de ET-buis aan het bord met tape. Strek de rechterarm rostrally zodat de voorste poot is in lijn met de neus en bevestig het met tape.
- Trek de staart voorzichtig aan om een spannings lijn te creëren tussen de rechter arm en de staart, waardoor de wervelkolom wordt geproduceerd.
Opmerking: het vastzetten van zowel de staart als de rechterpoot in de lijn voorkomt dat de ET-buis wordt iningevoegd of ontzet. - Plak het linker been in zijn natuurlijke positie. Teken de linker arm ventraal over gerold gaas en tape naar beneden.
3. voorbereiding voor chirurgie
- Scheer de linkerflank van de muis met elektrische Clippers van linker schouder naar linker buik.
- Gebruik een katoen getipt applicator om Betadine oplossing te poetsen over de operatieplaats. Gebruik een nieuwe, met katoen getipt applicator om de 70% ethanol oplossing over de operatieplaats te poetsen. Laat drogen. Plaats een steriele Drape.
- Let op: Zorg ervoor dat alle ethanol volledig is gedroogd voordat u doorgaat als elektrocauterie wordt gebruikt en de ethanol kan ontsteken.
4. intrede in thorax
- Maak een 1 cm laterale incisie op het middelpunt van de hemithorax met behulp van een chirurgische schaar. Gebruik handheld elektrocauterie om spier lagen te verdelen totdat de ribben zichtbaar zijn.
- Direct een 2 mm deel van de rib te cauteriseren.
Let op: bij het gebruik van elektrocauterie op de rib, Let op de spontane ademhaling frequentie. Als de muis een diafragmatische contractie heeft tijdens het cauterie, kan de tip de thorax binnengaan en de longen doorprikken, wat meestal fataal is in dit model. - Gebruik een bevokelde, fijne, met katoen getipt applicator in de rib-ruimte die superieur is aan het dichtgeschroeid gedeelte, draai de punt op het weefsel om in de pleurale ruimte te breken. Plaats de bevoafde 3 mm x 2 mm spons in de thorax om de longen in te klappen.
Opmerking: laat alleen zachte, natte, sponzen contact opnemen met de longen, omdat het uiterst delicaat is. - Gebruik een schaar om langs het bovenste deel van de gecauteriseerde rib te snijden, totdat het diafragma zichtbaar is.
5. aorta blootstelling
- Plaats rib-OPROLMECHANISMEN en gebruik ze om de Thoracotomie incisie te openen. Verwijder voorzichtig de spons van het oppervlak van de longen.
- Plaats bevoafd 6 mm x 4 mm spons, zodat het de longen bedekt, met uiteinden die rostraal en caudally wijzen. Plaats de (brede) Long oprol trekker op de spons en schuif de oprol trekker voorzichtig totdat de aflopend thoracale aorta wordt blootgesteld.
- Gebruik #7 tang om het bindweefsel en vet van de aorta te ontleden voor een gedeelte van ongeveer 5 mm.
Opmerking: kleine aders kunnen dwars door de aorta lopen; Vermijd het scheuren tijdens het dissectie (het gebruik van ten minste 14x vergroting kan helpen om deze complicatie te voorkomen).
6. blootstelling aan elastase
- Verzadigd 0,5 mm x 1 mm spons met 12 μL varkens alvleesklier elastase en plaats het op het blootgestelde oppervlak van de aorta.
Opmerking: laat de spons de contralaterale Long niet aanraken. - Na de vooraf bepaalde tijd (meestal 3-5 min), verwijder de elastase spons met #7 Tang. Verwijder de Long oprol trekker. Irrigeren de borstholte met 1 mL steriele zoutoplossing.
Opmerking: Verwijder de Long oprol trekker voor irrigatie met zoutoplossing, omdat het de Long spons verzadigd en zacht kan maken, waardoor het gemakkelijker wordt om te verwijderen van het oppervlak van de longen. - Gebruik gerold 2 "x 2" gaas om de resterende zout irrigatie te absorberen. Draai Isofluraan tot 2%.
7. sluiting van de borst
- Verwijder de Long spons. Verwijder de caudal Lung retractor. Verwijder de rostrale migratoire Lung retractor.
- Plaats 3 onderbroken 6-0 niet-absorbabele hechtingen om de ribben te verzetten, binden een losse knoop in elk, maar niet vastbinden. Neem grote zorg om de longen niet met de hecht naald te raken.
- Blaas de longen opnieuw op door de uitstroom buis op de ventilator te occluderen of door snel 0,5-1,0 mL lucht door de ET-buis te blazen door de 3-Way stop haan te maken.
Let op: om Barotrauma te voorkomen, vermijd overmatig gebruik van de met lucht gevulde spuit en gebruik niet meer dan 1,0 mL lucht. - Binden niet-absorbabele hechtingen. Herbenadering van de spier lagen met een lopende 5-0 absorbabele multifilament hecht. Schakel Isofluraan uit tot 1%.
- Nauwe huid met 7-10 onderbroken 5-0 niet-absorbabele hechtingen. Schakel Isofluraan in op 0%.
8. herstel
- Toedienen van 6 μg (0,02 mL van een 0,3 mg/mL suspensie) van buprenorfine subcutaan. Verwijder de tape van de rechter voet, de staart en de linkerarm, gevolgd door de rechter armband.
- Wanneer de muis ledematen beweegt, extubate door hem aan de staart te trekken om van de ET-buis te glijden. Plaats in de hoge zuurstofgehalte warmere kamer in rugligging.
Opmerking: het is veilig om de muis van de zuurstof kamer naar de kooi te verplaatsen wanneer deze zich naar de normale staande positie kan wenden. Bovendien moeten muizen worden gecontroleerd op tekenen van pijn, nood, of het niet vaak gedijen voor de eerste 24-48 uur na de operatie en extra analgesie of zacht voedsel zoals aangegeven.
9. blootstelling aan aorta aneurysma (terminale oogst procedure)
Opmerking: in het algemeen wordt weefsel oogst uitgevoerd op 14 dagen, omdat dit de periode van maximale dilatatie vertegenwoordigt. Afhankelijk van het experiment kan de timing van de oogst procedure echter op elk moment tussen 3 dagen en 4 + weken worden uitgevoerd, afhankelijk van het experiment.
- Intuberen en beveilig de muis naar het operatieve veld zoals hierboven beschreven (secties 1-3). Gebruik een schaar om de huid mediaal te verdrijven vanaf de linker flank naar de centrale buik en zorg dat het peritoneum niet binnenkomt.
- Incise de huid van dorsale linker flank rostrally naar het niveau van de linker schouder. Dan in een hoek van 90 ° door de oksel naar het borstbeen.
Opmerking: deze incisie moet volledig omcirkelen de oorspronkelijke huid incisie. - Met behulp van cauterie, ontleden huid flap naar het ventrale aspect van de muis, het blootstellen van de linker hemithorax. Gebruik een schaar om de buik binnen te gaan en de linker ribben marge van ventrale naar rugvin in te voeren om de onderzijde van het linker diafragma bloot te leggen. De laterale rand van het diafragma kan openen die gewenst is.
- Indien niet gemaakt met de voorgaande stap, insnijden van het diafragma op de meest laterale rand. Plaats de punt van het cauterie in dit gat en cauteriseren het diafragma van de ribben marge naar de xyphoid proces. Met behulp van een vochtige fijngetipt katoen-getipt applicator, zachtjes vrij de longen van verklevingen aan de borstwand en duw Long medially.
Opmerking: als verklevingen niet gemakkelijk uit de borstwand komen, gebruik cauterie om ze te verwijderen; Dit helpt voorkomen dat de longen scheuren die zware bloedingen kunnen veroorzaken. - Cauterize de binnenkant van de borstwand van RIB één aan de ribben marge, rugvin naar de mid axillaire lijn, maar ten minste 2 mm van de aorta. Snijd de borstwand langs de gecauteriseerde lijn.
Opmerking: deze techniek vermijdt bloeden uit de intercostale slagaders. - Snijd langs de superieure marge van RIB One en vervolgens caudally langs de laterale rand van het borstbeen, het verwijderen van de linker ribbenkast. Plaats OPROLMECHANISMEN op de longen en trek mediaal. Plaats oprolmechanisme op diafragma en trek de caudally aan om zo veel mogelijk aorta bloot te leggen.
- Gebruik een droge, met katoen getipt applicator om adhesies te verwijderen uit aorta aneurysma en een onaangetast distale segment. Meet de diameter van het onbeïnvloedde controle segment en het breedste deel van het elastase behandelde aneurysma met behulp van video micrometrie.
Opmerking: de video micrometrie metingen worden gebruikt om de procentuele verwijding van het aneurysmale segment te berekenen in vergelijking met een controle segment met vergelijking 1. Een controle segment dat 0,5 mm distale naar het aneurysmale segment 1 is geselecteerd.
Vergelijking 1
- Pak aorta met Harms Tang, gewoon distale naar het behandelde segment. Gebruik een schaar om het distale naar de Tang te snijden en vervolgens de aorta uit de wervelkolom te ontleden. Snijd aorta proximale naar behandelde segment en verwijder aneurysmaal aorta.
- Met behulp van een tuberculine spuit en naald, wassen van de aorta lumen met zoutoplossing en proces weefsel naar wens.
Vergelijking 1Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De toepassing van ons protocol resulteert in robuuste dTAA bij muizen in vergelijking met zout regelaars. De ontwikkelde TAAs zijn fusiform in vorm en komen alleen voor in het behandelde deel van de aorta (Figuur 1 en Figuur 2)11. Figuur 2 toont een voorbeeld van een video micrometrie meting bij weefsel oogst. Met behulp van vergelijking 1, de aorta-verwijding is 130% in dit voorbeeld.
De originele studie van Johnston et al.11 met een beschrijving van het model toonde een significante toename van aorta dilatatie bij wild type elastase behandelde muizen (WT taa) op 3, 7, 14 en 21 dagen in vergelijking met besturingselementen in wild type muizen (WT Controls). Maximale aorta dilatatie vond plaats op dag 14 (WT TAA: 99,6 ± 24,7% versus WT controle: 14,4 ± 8,2%; p < 0,0001) (Figuur 3)11. Een apart experiment van paus et al.12 toont vergelijkbare verwijding op 14 dagen.
Bij het onderzoeken van histologie hebben WT TAAs elastinevezels die verdund en gefragmenteerd zijn. Er is ook minder gladde spiercellen (SMαA) kleuring, terwijl macrofagen (Mac2) en Interleukine-1β (IL-1β) expressie worden verhoogd (Figuur 4).
Figuur 1 : Voorbeeld foto's van het thoracale aorta aneurysma (TAA) model en de installatie van de apparatuur. Van links naar rechts, (1) initiële blootstelling van de thoracische aorta door middel van een linker Thoracotomie, (2) dissectie van de pleura, (3) toepassing van een elastase-geweekte spons, en (4) verwijdering van de spons. Voor aorta oogst (5) werd de Thoracotomie heropend, en werd thoracale aorta ontleed vrij en gemeten. (6) afbeelding rechts toont relatieve associatie van aorta met slokdarm, Long, en hemiazygos ader. Dit cijfer is aangepast van Johnston et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Sample video micrometrie meting van TAA. C = onbelicht controle segment, A = elastase behandeld aneurysmale segment, RL = rechter long, E = slokdarm, T = staart, H = kop. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Aorta diameter na verloop van tijd tijdens TAA-vorming. Gemiddelde aorta diameter (mm ± SD) in WT muizen blootgesteld aan elastase (WT TAA, grijs) of blootgesteld aan zoutoplossing (WT controle, groen) na verloop van tijd. Er zijn significante verschillen opgetreden tussen WT TAA en WT Control op alle tijdstippen gemarkeerd met een sterretje (p < 0,05). Maximale aorta dilatatie vindt plaats op dag 14 (WT TAA: 99,6 ± 24,7% versus WT controle: 14,4 ± 8,2%; p < 0,0001). Foutbalken staan voor standaarddeviatie. Dit cijfer is aangepast van Johnston et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Histologisch onderzoek van WT elastase TAA en WT Saline controle weefsel. Monster aorta dwarsdoorsneden van WT controle (zout spons) en WT TAAs (elastase spons) op dag 14. Kleuring voor Elastin, gladde spiercellen (SMαA), macrofagen (Mac2), en Interleukine-1β (IL-1β). Schaalbalk = 50 μm. Dit cijfer is aangepast van Johnston et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Dosis-respons onderzoek van individuele elastase-fles. Elke groep punten vertegenwoordigt een vooraf gespecificeerde tijd wanneer de elastase-geweekte spons mag stilstaan. Deze gegevens worden gebruikt om de ideale digestie tijd te schatten voor 100-130% verwijding. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De thoracale en abdominale aorta zijn cellullair en embryologisch verschillend, wat relevant is voor aneurysmaal ziekte14,15,16. Daarom is een specifiek diermodel nodig om TAA te bestuderen. Hoewel andere Murine dTAA modellen zijn gepubliceerd8, onze is het enige model om dalende thoracale aorta dilatatie die kan worden beschouwd als echt aneurysmatische (meer dan 50% verwijding). Bovendien, ons model is relatief snel uit te voeren en resulteert in maximale verwijding op 14 dagen in tegenstelling tot 16 weken in de CaCl2 model8. Deze efficiëntie heeft de studie van specifieke farmacologische interventies vergemakkelijkt die mogelijk kunnen worden translaterbaar voor menselijke proeven11,12. Dit protocol heeft echter verschillende uitdagende aspecten en beperkingen.
Ons model maakt gebruik van gezuiverde varkens alvleesklier elastase, die is gebruikt in verschillende vorige AAA-modellen. Het werkingsmechanisme wordt verondersteld te zijn afbraak van elastine in de media van de aorta en de creatie van een robuuste ontstekingsreactie, wat leidt tot een minder compliant en uiteindelijk zwakkere muur. Het spijsverterings effect van elastase varieert van fles tot fles. Om een consistent spijsverterings effect te garanderen, moet voor elke nieuwe fles elastase een dosis-responscurve worden uitgevoerd. De dosis komt overeen met de tijd gedurende welke het elastase-geweekte gaas mag wonen. Een voorbeeld van een dergelijke curve wordt weergegeven in Figuur 5. Specifieke elastase-spons blootstellings tijden worden onderzocht met als doel een blootstellingsduur te vinden die aneurysmata van 100-130% verwijding op 14 dagen creëert. In dit voorbeeld kromme, een 4-minuten digestie tijd is aangewezen voor deze fles elastase (van noot, de kleinste hoeveelheid elastase beschikbaar is in 10 mL, dat is genoeg voor ongeveer 830 individuele muizen). Overmatige vertering van elastase kan leiden tot intraoperatieve bloedingen of voortijdige ruptuur en onvoldoende blootstelling kan falen om voldoende spijsvertering en aneurysmale verwijding veroorzaken.
Omdat dit model het openen van de thoracische holte inhoudt, is het gebruik van een positieve druk ventilatie verplicht. Aanvankelijk gebruikten we een anterieure nek dissectie en orotracheale intubatie onder direct zicht, maar deze methode was tijdrovend omdat het een extra incisie en sluiting vereist. We gebruiken nu een directe orotracheale intubatie zoals beschreven door Vandivort et al.13. Bij het trainen van nieuwe chirurgen op dit model, raden we aan om de intubatie techniek uitvoerig te beoefenen om deze te beheersen voordat je doorgaat naar de eigenlijke operatie. Zodra de muis met succes is geintubeerd, moet er veel zorg voor worden genomen om de buis niet te verdoen als oedeem toeneemt bij elke intubatie poging, waarbij achtereenvolgens de kans op succes afneemt en de kans op een fatale luchtweg letsel toeneemt. Er moet ook veel zorg worden besteed aan het minimaliseren van het risico van extubatie tijdens de operatie, aangezien de tijd die nodig is voor reintubatie bijna altijd fataal is. Zoals beschreven in ons protocol, zal het beveiligen van de rechterarm en staart onder een kleine hoeveelheid spanning voorkomen dat rostrale migratoire of caudal verschuiven tijdens een operatie en daarom het risico van extubatie minimaliseren.
Controle van anesthesie is van vitaal belang in dit model. Als Vandivort et al.13 besproken in hun studie over intubatie, een diepe sedatie is noodzakelijk. Als de muis tijdens de intubatie procedure bewust is, kan de weerstand tegen ET buis inbrengen leiden tot tracheale letsel en oesofageale intubatie. Om het risico op Isofluraan toxiciteit te verminderen, moet zodra de tracheale plaatsing van de et-buis is bevestigd, het procentuele mengsel van Isofluraan met ongeveer de helft worden verlaagd dat van gebruikt voor inductie. Om het ideale percentage van isoflurane te bereiken, moet de muis elke 10-20 seconden een spontane diafragmatische contractie hebben. Naarmate de operatie vordert, moet de Isofluraan geleidelijk worden verlaagd en volledig worden uitgeschakeld nadat de laatste huid sluiting steek is geplaatst. De tape beperkingen moeten worden verwijderd terwijl de muis nog steeds herstelt van anesthesie als verwijdering terwijl de muis wakker is kan traumatisch zijn. Om te helpen bij het herstel en dissipatie van de resterende Isofluraan hebben we onlangs de procedure zodanig gewijzigd dat de muis onmiddellijk na extubatie in een hoge zuurstofverwarmende omgeving wordt teruggewonnen.
De muis Long is uiterst delicaat en letsel door punctie, ongepaste behandeling of elastase blootstelling resulteert bijna altijd in de dood. Het meest voorkomende punt van long letsel is de eerste binnenkomst in de pleura. Bij het gebruik van cauterie op de ribben (stap 4,2), adviseren wij aandacht te besteden aan de spontane ademhaling frequentie en alleen het cauterie te activeren voor een paar seconden onmiddellijk na een adem. Dit helpt om een onverwachte expansie van de ribbenkast te voorkomen die de oordopje door de borstwand en in de longen kan rijden. Het gebruik van de bevokelde katoen-getipt applicator in de volgende stap om zachtjes breken de weefsels en het pleura membraan hielp ook minimaliseren ons tempo van long letsel omdat scherpe instrumenten niet voldoen aan het Long oppervlak. Tot slot, als de elastase-geweekte spons contacten ofwel Long direct, ernstige schade kan optreden. Dit kan worden vermeden door de contralaterale pleurale ruimte tijdens aorta dissectie niet in te voeren en de spons op te nemen, zodat deze direct op de aorta kan worden geplaatst met weinig herpositionering. Aan het einde van de operatie moet een poging om de linker long opnieuw op te blazen worden gemaakt door de uitstroom buis van de ventilator te occluderen. Als dat niet lukt, kan directe injectie van 0,5 tot 1,0 ml lucht via de 3-weg kraantje de longen opnieuw uitbreiden. Als beide methoden niet werken, moet de sluiting normaal verlopen. We hebben geconstateerd dat als er geen grote long letsel aanwezig is, muizen relatief goed een gedeeltelijk opgeblazen Long tolereren en de longen bijna altijd opgeblazen worden bij weefsel oogst.
Dit model heeft verschillende beperkingen. Experimentele modellen niet volledig modelleren menselijke aorta ziekte. dTAA treedt op in 14 dagen na één toepassing van elastase in ons model, terwijl de menselijke TAA-formatie multifactoriaal is en in de loop der jaren als geen decennia optreedt. Een muismodel dat maanden tot jaren duurt om aneurysmata te ontwikkelen, is echter niet nuttig in onderzoekscapaciteit. In tegenstelling tot de menselijke ziekte, elastase geïnduceerde aneurysma in ons model beginnen te verkleinen in grootte wanneer ze bereiken maximale dilatatie na twee weken post-operatief. Deze regressie kan worden overwonnen met het gebruik van β-aminopropionitril (BAPN) aangevuld in het dieet van de muis postoperatief. In combinatie met de elastase exposure model, BAPN suppletie maakt voortdurende groei en uiteindelijk scheuren, beter nabootsen van de kroning van menselijke ziekte. Ons lab heeft eerder BAPN in AAA17 bestudeerd en we gebruiken het momenteel in het dTAA-model om ons Protocol verder te verfijnen. Primaire experimenten met het dTAA-model hebben een breuk snelheid van ongeveer 30% aangetoond na 28 dagen.
In de toekomst, we zijn van plan om dit model te gebruiken om te evalueren van andere genetische en farmacologische behandelingen die kunnen worden vertaalbare tot aneurysma behandeling bij de mens. Omdat dit protocol een gemakkelijke en veilige manier beschrijft om toegang te krijgen tot de thoracale aorta, kan het worden gebruikt door andere laboratoria die interventies willen testen op de thoracische aorta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door AHA Scientist Development Grant 14SDG18730000 (M.S.), NIH K08 HL098560 (G.A.) en RO1 HL081629 (G.R.U.) subsidies. Dit project werd gesteund door de thoracic surgery Foundation for Research & Education (TSFRE) Research Grant (PI: G. Ailawadi). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de NHLBI of de TSFRE. We bedanken Anthony Herring en Cindy Dodson voor hun kennis en technische expertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiocatheter (22G) | Used for ET Tube | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #7 x2 | Roboz | RS-4982 | |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz | RS-5158 | |
| Harms Forceps x2 | Roboz | RS-5097 | |
| Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length | Roboz | RS-7800 | |
| KL 1500 LED Light Source | Leica | 150-400 | |
| M205A Dissction Microscope | Leica | CH 94-35 | |
| Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 500216-G | |
| Metal Clip board | Use with the Mouse Retractor Set | ||
| Mouse Retractor Set | Kent | SURGI-5001 | Need 2 short and 1 tall fixators |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector | Harvard Apparatus | 73-0043 | MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled |
| Sigma Aldrich | Elastase from porcine pancreas | E0258-50MG | Can be purchased in various size bottles |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | Recommend using rechargable AA batteries |
| Spring Scissors, 10.5cm | World Precision Instruments | 14127 | |
| Steril Swabs (Sponges) | Sugi | 31603 | Can be cut to size |
| Surgi Suite Surgical Platform | Kent | Attach to clip board | |
| Tech IV Isoflurane Vap | Jorgensen Laboratories | J0561A | Anesthesia vaporizer |
References
- Coady, M. A., et al. What is the appropriate size criterion for resection of thoracic aortic aneurysms. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 113 (3), 489-491 (1997).
- Aggarwal, S., Qamar, A., Sharma, V., Sharma, A. Abdominal aortic aneurysm: A comprehensive review. Experimental and Clinical Cardiology. 16 (1), 11-15 (2011).
- Bickerstaff, L. K., et al. Thoracic aortic aneurysms: a population-based study. Surgery. 92 (6), 1103-1108 (1982).
- Cheng, D., et al. Endovascular aortic repair versus open surgical repair for descending thoracic aortic disease a systematic review and meta-analysis of comparative studies. Journal of the American College of Cardiology. 55 (10), 986-1001 (2010).
- Walsh, S. R., et al. Endovascular stenting versus open surgery for thoracic aortic disease: systematic review and meta-analysis of perioperative results. Journal of Vascular Surgery. 47 (5), 1094-1098 (2008).
- Absi, T. S., et al. Altered patterns of gene expression distinguishing ascending aortic aneurysms from abdominal aortic aneurysms: complementary DNA expression profiling in the molecular characterization of aortic disease. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 126 (2), 344-357 (2003).
- Ailawadi, G., Eliason, J. L., Upchurch, G. R. Current concepts in the pathogenesis of abdominal aortic aneurysm. Journal of Vascular Surgery. 38 (3), 584-588 (2003).
- Ikonomidis, J. S., et al. A murine model of thoracic aortic aneurysms. Journal of Surgical Research. 115 (1), 157-163 (2003).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
- Trachet, B., et al. Ascending Aortic Aneurysm in Angiotensin II-Infused Mice: Formation, Progression, and the Role of Focal Dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 673-681 (2016).
- Johnston, W. F., et al. Inhibition of interleukin-1beta decreases aneurysm formation and progression in a novel model of thoracic aortic aneurysms. Circulation. 130 (11), Suppl 1 51-59 (2014).
- Pope, N. H., et al. Interleukin-6 Receptor Inhibition Prevents Descending Thoracic Aortic Aneurysm Formation. Annals of Thoracic Surgery. 100 (5), 1620-1626 (2015).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Ailawadi, G., et al. A nonintrinsic regional basis for increased infrarenal aortic MMP-9 expression and activity. Journal of Vascular Surgery. 37 (5), 1059-1066 (2003).
- Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta: relevance to aneurysm disease. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (5), 1123-1130 (2008).
- Trigueros-Motos, L., et al. Embryological-origin-dependent differences in homeobox expression in adult aorta: role in regional phenotypic variability and regulation of NF-kappaB activity. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1248-1256 (2013).
- Lu, G. S. G., Davis, J. P., Schaheen, B., Downs, E., Roy, R. J., Ailawadi, G., Upchurch, G. R. A novel chronic advanced staged abdominal aortic aneurysm murine model. Journal of Vascular Surgery. 66 (1), 232-242 (2017).
