Summary
우리는 마우스에 있는 강력한 내림차순 흉부 대동맥류를 일관되게 유도하는 외과 프로토콜을 기술합니다. 절차는 왼쪽 흉부 절제술, 흉부 대동맥 노출, 대동맥 벽에 돼지 췌장 엘라스타제에 담근 스폰지의 배치를 포함한다.
Abstract
질병 통제 센터에 따르면, 대동맥류 (AA)는 1999-2016년의 모든 인종과 남녀 모두에서 주요 사망 원인으로 간주되었습니다. 동맥류는 임계 직경에 도달하면 파열되거나 찢어질 수 있는 대동맥의 점진적인 약화 및 최종 팽창의 결과로 형성됩니다. 가슴에 내림차순 대동맥의 동맥류, 하강 흉부 대동맥류라고 (dTAA), 미국에서 동맥류 케이스의 큰 비율을 구성. 포함되지 않은 dTAA 파열은 거의 보편적으로 치명적이며, 선택적 수리는 사망률과 사망률이 높습니다. 우리의 모형의 목적은 dTAA를 구체적으로 공부하고, dTAA의 병리생리학을 해명하고 성장을 중단하거나 dTAA의 크기를 감소시키기 위하여 분자 표적을 검색하는 것입니다. 흉부 병리학을 정확하게 연구하는 뮤린 모델을 가함으로써, 표적 치료법은 dTAA를 구체적으로 시험하기 위해 개발될 수 있다. 이 방법은 외과 적 노출 후 외부 뮤린 대동맥 벽에 직접 돼지 췌장 엘라스타제 (PPE)의 배치를 기반으로합니다. 이것은 대동맥 벽을 약화시키고 몇 주에서 몇 달에 걸쳐 동맥류 형성을 허용하는 파괴적이고 선동적인 반응을 일으킵니다. 뮤린 모델은 한계가 있지만, 우리의 dTAA 모델은 예측 가능한 크기의 강력한 동맥류를 생성합니다. 더욱이, 이 모형은 dTAA 성장을 체포하거나 파열을 방지할 수 있는 유전과 약제학적 표적을 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다. 인간 적인 환자에서는, 이와 같은 내정간섭은 동맥류 파열, 및 어려운 외과 적 개입을 피하는 것을 도울 수 있었습니다.
Introduction
이 방법의 목적은 대동맥류 형성 동안 유방 내림차순 흉부 대동맥의 발달, 병리생리학 및 구조적 변화를 연구하는 것입니다. 우리의 모형은 다양한 유전과 약리학 억제제의 시험을 허용하는 마우스에 있는 흉부 대동맥류 (dTAA)를 유도하는 재현가능하고 일관된 방법을 제안합니다. 이 일은 dTAA 질병을 가진 인간을 위한 실행 가능한 처리 전략으로 번역될 수 있던 약 과 유전자 치료를 확인하는 것을 도울 수 있습니다.
dTAA는 흉부 대동맥의 벽이 약해지고 찢어지거나 파열될 때 임계 직경에 도달할 때까지 시간이 지남에 따라 팽창할 때 형성됩니다. 임상적으로, dTAA는 대동맥 벽의 구조가 너무 왜곡되어 결국 실패할 때까지 크기가 증가하여 치명적인 결과를 초래할 수 있습니다. 이와 관련하여, 증상은 일반적으로 동맥류가 위험한 크기 (100-150 % 팽창)에 도달하고 해부 또는 파열위험이높은 경우에만 발생합니다 1,2. dTAA 파열은 거의보편적으로 치명적인 3, 및 선택 외과 수리는 상당한 사망률을 운반4,5. 게다가, 대부분의 환자는 외과 수선6,7의앞에 대략 5 년 동안 대동맥류의 진단을 전송합니다. 이 창은 비수술적으로 개입할 수 있는 적절한 시간을 나타냅니다. 따라서, dTAA의 치료 또는 느린 진행을 치료 하는 의료 치료 필요 하 고 동맥 류 연구의 분야에 중요 한 발전을 나타낼 것 이다. dTAA 병인의 불완전한 이해 때문에 현재 유효한 dTAA를 위한 아무 의학 처리도 없습니다.
지난 20 년 동안, 몇몇 dTAA 동물 모형은 개발되었습니다, 그러나 이 모형의 각각은 우리 자신과 구별되고 튼튼한 동맥류를 생성하지 않았습니다. 우리와 가장 유사한 뮤린 dTAA 모델은 대강절에 CaCl 2의 직접 적용을 포함하는 Ikonomidis 등8에의해 개발되었다. 우리의 모델은 이코노미디스에 의해 명시된 많은 기술에서 적응되었지만, 우리의 모델은 세 가지 방법으로 독특합니다. 첫째, 우리의 모델에서 대류는 CaCl2 노출의 15 분에 비해 3-5 분 동안 국소 엘라스타제에 노출됩니다. 둘째, 대동맥 팽창은 CaCl2 모델에서 16 주에 비해 2 주 에서 발생합니다. 마지막으로, 우리의 모델은 지속적으로 약 100 % 팽창의 동맥류를 생산,CaCl에 의해 생성 된 20-30 %의 대동맥 팽창에 비해 (이는 진정으로 동맥류로 정의 될 수 없다 대동맥의 증가로 정의 직경 >50%). angiotensin II의 주입으로 강력한 동맥류를 형성하는 Apo E 녹아웃 마우스와 같은 동맥류 형성의 그밖 비 수술 뮤린 모형이 있습니다. 그러나, 이들 마우스는 내림차순 흉부 대동맥9,10에서특별히 동맥류보다는 상신또는 오름차순 흉부 대동맥류를 개발한다.
이 프로토콜에 대한 합리적 은 murine 모델에서 dTAA를 연구하는 간단하고 저렴하고 시간에 적합한 방법을 가지는 것입니다. 마우스 모형은 그밖 혈관 질병에 있는 충격이 있기 위하여 찾아낸 많은 유전과 세포 특정 녹아웃을 이용하는 유일한 기회를 제공합니다. 우리의 특정 TAA 모델의 사용은 잘 수신되었으며 이를 활용한 실험은 고충격 저널11,12에게재되었습니다. 이 시점까지, 모델은 복부 대동맥류(AAA) 뮤린 모델에 상당한 영향을 미쳤던 가능한 유전적 및 약리학적 치료를 조사하는데 사용되어 왔다; 그러나, 우리의 실험실은 dTAA 모형의 사용을 확장했기 때문에, 우리는 인간에 있는 표적으로 한 치료로 이용될 수 있던 dTAA 대형에 유일한 표적을 찾아내고 있습니다.
이 모델은 뮤린 마이크로 수술 기능이 있는 실험실에 가장 적합합니다. 그것은 기술적으로 도전, 그것은 심지어 이전 수술 경험이 없는 연구원에 의해 일관 되 게 실행할 수 있습니다. 뮤린 수술 경험이없는 연구원의 경우 모델은 약 20 회의 수술 세션 (또는 약 50 마우스)에서 마스터 할 수 있습니다. 이전 수술 경험이있는 연구원의 경우, 모델은 5 회의 수술 세션 (약 20 마우스)에서 마스터 할 수 있습니다. 우리는 고품질의 비디오로 숙달 시간을 더 줄일 수 있다고 믿습니다. 숙련도가 달성되면 수술시 35분, 말기 수확을 위해 20분 안에 수술을 완료할 수 있습니다. 우리 실험실의 외과 의사는 하루에 10-12 번의 전체 수술을 완료 할 수 있으며 수술 사망률은 5-10 %입니다. 사망의 가장 흔한 원인은 가슴에 입력시 폐 부상, 마취 독성, 또는 해부 동안 대동맥의 눈물. dTAA 연구 이외에, 이 모형은 또한 가슴에 있는 그밖 내정간섭을 공부하는 연구원을 위한 흉부 대흉 및 폐 hilum에 안전하고 쉬운 접근을 위한 가이드역할을 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 프로토콜은 버지니아 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (No. 3634)에 의해 승인되었습니다.
1. 마취 및 삽관의 유도
- 8-10주 된 수컷 C57BL/6 마우스를 5% 이소플루란과 산소 혼합물의 연속 흐름이 있는 밀폐된 챔버에 넣고 호흡이 눈에 띄게 느려질 때까지 5분 동안 하십시오.
참고: 실험 프로토콜에 따라 다른 균주, 성별 및 생쥐의 나이를 사용할 수 있습니다. 암컷 마우스는 더 작은 크기 및 이렇게 더 작은 기도 때문에 삽관하기 더 어려울 지도 모릅니다. - Vandivort 외13에의해 설명 된 대로 마우스를 삽관 .
참고: 삽관 단계는 이 모델에서 학습하고 수행하는 데 가장 어려운 부분입니다. 위에서 언급한 저자는 비디오의 단계를 설명하는 훌륭한 작업을 수행합니다.
2. 수술 판에 마우스 고정
- 내측구 (ET) 튜브를 연결하고, 가슴 상승을 확인하고, 오른쪽 측면 방수 위치에 마우스를 놓습니다. 이소플루란을 약 3%로 돌리고 두 눈에 윤활유를 바치십시오. 인공호흡기는 분당 약 200회 호흡과 225μL의 조수량을 제공하도록 설정해야 합니다.
참고: 이소플루란이 5%로 방치되면 독성이 빠를 수 있습니다. 그러나, 이소플루란에 대한 반응은 가변적이기 때문에 마취 유량은 약 10-20s마다 자연적인 횡격막 수축이 발생하고 산소화가 점막과 노출된 조직의 검사에 적절히 나타나는 등 적정되어야 한다. - ET 튜브를 테이프로 보드에 고정합니다. 앞발이 코와 일렬로 맞서 오른쪽 팔을 장밋빛으로 확장하고 테이프로 고정합니다.
- 오른쪽 팔과 꼬리 사이의 장력 선을 만들기 위해 꼬리를 꼬리를 꼬리를 잡아 당겨 척추의 확장을 생성합니다.
참고: 꼬리와 오른쪽 발을 일렬로 고정하면 ET 튜브의 삽입 또는 이탈을 방지할 수 있습니다. - 왼쪽 다리를 자연스러운 위치에 테이프로 가보자. 왼쪽 팔을 구르게 하고 테이프를 아래로 굴절시로 그립니다.
3. 수술 준비
- 마우스의 왼쪽 측면을 왼쪽 어깨에서 왼쪽 복부까지 전기 클리퍼로 면도합니다.
- 면 팁 어플리케이터를 사용하여 수술 부위에 베타딘 용액을 브러쉬하십시오. 새로운 면 팁 어플리케이터를 사용하여 수술 부위에 70% 에탄올 용액을 브러시하십시오. 건조시키십시오. 멸균 드레이프를 놓습니다.
- 주의: 전기 캐터링이 사용되고 에탄올을 점화할 수 있는 경우 모든 에탄올이 완전히 건조되었는지 확인하십시오.
4. 흉부 입력
- 수술 용 가위를 사용하여 헴쇼락스의 중간점에서 1cm 측면 절개를합니다. 핸드헬드 일렉트로카우터를 사용하여 갈비뼈가 보일 때까지 근육 층을 나눕니다.
- 갈비뼈의 2mm 부분을 직접 소작시하십시오.
참고 : 갈비뼈에 전기 캐터를 사용할 때, 자발적호흡 주파수를 관찰하십시오. 마우스가 소작 도중 횡격막 수축이 있는 경우에, 끝은 흉부로 들어가고 이 모형에서 일반적으로 치명적인 폐를 뚫을 수 있습니다. - 젖고 미세한 면 팁 어플리케이터를 사용하여 소작 된 부분보다 우수한 리브 공간에 팁을 회전하여 조직에 팁을 회전시 흉막 공간으로 침입합니다. 젖은 3mm x 2mm 스폰지를 흉부에 넣고 폐를 붕괴시도록 합니다.
참고 : 부드럽고 젖은 스폰지만 매우 섬세하기 때문에 폐에 닿습니다. - 가위를 사용하여 소작 된 갈비뼈의 상단 측면을 따라 다이어프램이 보일 때까지 잘라냅니다.
5. 대동맥 노출
- 늑골 리트랙터를 놓고 흉부 절개를 여는 데 사용합니다. 조심스럽게 폐 표면에서 스폰지를 제거하십시오.
- 젖은 6mm x 4mm 스폰지를 놓고 폐를 덮고 끝끝을 rostally 및 caudally로 가리키게합니다. 스폰지에 (넓은 평평한) 폐 리트랙터를 놓고 내림차순 흉부 대원이 노출 될 때까지 리트랙터를 통풍구로 부드럽게 밀어 놓습니다.
- #7 포셉을 사용하여 약 5mm 섹션동안 대동맥에서 결합 조직과 지방을 해부하십시오.
참고: 작은 정맥이 대역을 가로질러 횡단적으로 실행될 수 있습니다. 해부 중에 찢어지지 마십시오 (적어도 14 배율을 사용하면이 합병증을 피하는 데 도움이 될 수 있습니다).
6. 엘라타아제 노출
- 12 μL의 돼지 췌장 엘라스타아제로 0.5 mm x 1mm 스폰지를 포화시키고 대동맥의 노출 된 표면에 놓습니다.
참고 : 스폰지가 반대쪽 폐를 만지지 않도록하십시오. - 소정의 시간(보통 3-5분) 후, #7 포셉으로 엘라타아제 스폰지를 제거합니다. 폐 리트랙터를 제거합니다. 멸균 식염수 1mL로 흉강을 관개합니다.
참고 : 폐 스폰지가 포화되고 부드러워지므로 식염수로 관개하기 전에 폐 리트랙터를 제거하여 폐 표면에서 쉽게 제거 할 수 있습니다. - 압연 2" x 2" 거즈를 사용하여 남은 식염수 관개를 흡수하십시오. 이소플루란을 2%로 돌립니다.
7. 가슴의 폐쇄
- 폐 스폰지를 제거합니다. 꼬리 폐 리트랙터를 제거합니다. 로스트랄 폐 리트랙터를 제거합니다.
- 3 을 방해 하여 6-0 비 흡수성 봉합사를 놓아 갈비뼈를 반대하고 각각 느슨한 매듭을 묶지만 묶지 마십시오. 봉합사 바늘로 폐를 만지지 않도록주의하십시오.
- 환기기구에서 유출관을 폐로 막거나 ET 튜브를 통해 0.5-1.0 mL의 공기를 빠르게 분사하여 폐를 재팽창시켜 3방향 스톱 콕을 활용한다.
참고: 기압외상을 피하려면 공기가 채워진 주사기를 과도하게 사용하지 말고 1.0mL 이하의 공기를 사용하십시오. - 흡수할 수 없는 봉합사를 묶습니다. 5-0 의 흡수성 멀티 필라멘트 봉합사를 실행하여 근육 층을 재흡수하십시오. 이소플루란을 1%로 돌립니다.
- 7-10으로 피부를 닫아 5-0 흡수성 봉합사를 중단했습니다. 이소플루란을 0%로 돌립니다.
8. 복구
- 피하의 부프레노르핀 6 μg (0.3 mg/mL 현탁액0.02 mL)를 투여하십시오. 오른쪽 발, 꼬리 및 왼쪽 팔에서 테이프를 제거한 다음 오른쪽 팔 테이프를 제거합니다.
- 마우스가 사지를 움직일 때 꼬리를 당겨 ET 튜브에서 미끄러져 나갑니다. 높은 산소 함량의 따뜻한 챔버에 소핀 위치에 놓습니다.
참고 : 산소 챔버에서 케이지로 마우스를 이동하는 것이 안전합니다. 게다가, 마우스는 고통의 표시를 위해 감시되어야 합니다, 고민, 또는 수술 후에 첫번째 24-48 시간 동안 빈번하게 번창하는 실패및 지시된 대로 추가 진통 또는 연약한 음식을 제공하.
9. 대동맥류 의 노출 (말기 수확 절차)
참고 : 일반적으로 조직 수확은 최대 팽창 기간을 나타내기 때문에 14 일에서 수행됩니다. 그러나, 실험에 따라, 수확 절차 타이밍은 실험에 따라 3 일 및 4 + 주 사이에 언제든지 수행 될 수있다.
- 전술한 바와 같이 수술 장에 마우스를 삽관하고 고정한다(섹션 1-3). 가위를 사용하여 왼쪽 측면에서 중앙 복부까지 피부 내측으로 절개하여 복막에 들어가지 않도록 주의하십시오.
- 등지 왼쪽 에서 피부를 절개 왼쪽 어깨의 수준으로 장대하게. 그런 다음 겨드랑이에서 흉골까지 90° 각도로 절개합니다.
참고 : 이 절개는 완전히 원래피부 절개를 둘러싸야한다. - 소작을 사용하여 마우스의 복부 측면을 향해 피부 플랩을 해부하여 왼쪽 헴쇼락스를 노출시하십시오. 가위를 사용하여 복부에 들어가 복부에서 등쪽으로 왼쪽 늑골 여백을 따라 절개를하여 왼쪽 횡격막의 밑면을 노출시하십시오. 다이어프램의 측면 최단 가장자리가 원하는 개방될 수 있습니다.
- 이전 단계로 작성하지 않은 경우 다이어프램을 가장 측면 가장자리로 절개합니다. 이 구멍에 소작 의 끝을 놓고 자피드 공정에 비용 마진떨어져 다이어프램을 소작. 젖은 미세 한 팁 면 팁 어플리케이터를 사용하여, 부드럽게 가슴 벽에 접착에서 폐를 해제하고 폐를 내측밀어 밀어.
참고 : 유착이 흉벽에서 쉽게 떨어지지 않으면 소작을 사용하여 제거하십시오. 이렇게 하면 무거운 출혈을 일으킬 수 있는 폐 찢 어 하지 않도록 하는 데 도움이. - 늑골 하나에서 늑골 마진까지 가슴 벽의 내부를 소작하고, 등쪽에서 중간 겨드랑이 선까지 는 대동맥에서 적어도 2mm. 소작 된 라인을 따라 가슴 벽을 잘라.
참고 :이 기술은 늑간 동맥에서 출혈을 방지합니다. - 갈비뼈의 우수한 여백을 따라 잘라 낸 다음 흉골의 측면 가장자리를 따라 좌측 갈비뼈 케이지를 제거합니다. 폐에 리트랙터를 놓고 중간으로 당깁니다. 다이어프램에 리트랙터를 놓고 가능한 한 많은 대반을 노출시키기 위해 가시적으로 그립니다.
- 마른 면 팁 어플리케이터를 사용하여 대동맥류와 영향을 받지 않는 말단의 유착을 제거하십시오. 비디오 미세 측정을 사용하여 영향을 받지 않는 대조군 세그먼트의 직경과 엘라스타아제 처리 동맥류의 가장 넓은 부분을 측정합니다.
참고: 비디오 미세 측정값은 수학식 1을 사용하는 대조군 세그먼트와 비교하여 동맥류 세그먼트의 퍼센트 팽창을 계산하는 데 사용됩니다. 동맥류 분절 1에 대한 0.5 mm 말단인 대조군 세그먼트가 선택된다.
방정식 1
- 해의 집게로 대위를 잡고, 처리 된 세그먼트에 말단. 가위를 사용하여 집안말기를 절단한 다음 대인척을 척추에서 해부합니다. 대동맥을 처리된 세그먼트로 근위를 절단하고 동맥류 대동맥을 제거합니다.
- 결핵 주사기와 바늘을 사용하여, 식염수로 대동맥 루멘을 씻고 원하는대로 조직을 처리하십시오.
방정식 1Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
우리의 프로토콜의 응용 은 식염수 컨트롤에 비해 마우스에서 강력한 dTAA 결과. 개발된 TAA는 대불의 처리된 부분에서만 발생하며 형태가 퍼지포름(도1 및 도2)11이다. 도 2는 조직 수확시 비디오 미세 측정 측정의 예를 나타낸다. 방정식 1을 사용하면 이 예제에서 대동맥 팽창이 130%입니다.
Johnston et al.11에 의한 본래 연구는 야생형 마우스(WT 대조군)의 대조군과 비교하여 3, 7, 14 및 21일에서 야생형 엘라스타제 처리 마우스(WT TAA)에서 대동맥 팽창이 현저한 증가를 보였다.WT 대조군(WT 대조군). 최대 대동맥 팽창은 14일째에 발생하였다(WT TAA: 99.6±24.7% 대 WT 대조군: 14.4±8.2%; p< 0.0001) (그림3)11. 교황 외12에 의해 별도의 실험은 14 일에 유사한 팽창을 보여줍니다.
군과학을 검사할 때 WT TAA에는 얇아지고 단편화된 엘라스틴 섬유가 있습니다. 또한 평활근 세포(SMαA) 염색이 적고, 대식세포(Mac2) 및 인터류핀-1β(IL-1β)발현이 증가한다(도 4).
그림 1 : 흉부 대동맥류(TAA) 모델 및 장비 설정의 샘플사진. 왼쪽에서 오른쪽으로, (1) 왼쪽 흉부 절제술을 통해 흉부 대동맥의 초기 노출, (2) 흉막의 해부, (3) 엘라스타제 에 젖은 스폰지의 적용, 및 (4) 스폰지 제거. 대동맥 수확 (5)의 경우 흉부 절제술이 다시 열렸고 흉부 대동맥을 무료로 해부하고 측정했습니다. (6) 오른쪽 그림은 식도, 폐 및 헤미아지고스 정맥과 대공의 상대적 연관성을 보여줍니다. 이 그림은 존스턴 외11에서적응되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : TAA의 샘플 비디오 미세 측정 측정. C = 노출되지 않은 대조군 세그먼트, A=엘라스타제 처리 동맥류 세그먼트, RL = 오른쪽 폐, E = 식도, T = 꼬리, H = 머리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : TAA 형성 시 시간이 지남에따라 대동맥 직경. Elastase (WT TAA, 회색)에 노출되거나 시간이 지남에 따라 식염수 (WT 제어, 녹색)에 노출된 WT 마우스에서 대동맥 직경 (mm ± SD)을 의미한다. 별표(p< 0.05)로 표시된 모든 시점에서 WT TAA와 WT 컨트롤 간에 상당한 차이가 발생했습니다. 최대 대동맥 팽창은 14일째에 발생합니다(WT TAA: 99.6±24.7% 대 WT 대조군: 14.4±8.2%; p & 0.0001). 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림은 존스턴 외11에서적응되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : WT 엘라스타제 TAA 및 WT 식염수 대조조직에 대한 조직학적 검사. 14일째에는 WT 대조군(식염수 스폰지)과 WT TAA(엘라스타제 스폰지)의 대동맥 단면을 샘플링합니다. 엘라스틴, 평활근 세포 (SMαA), 대식세포 (Mac2) 및 인터류키핀-1β (IL-1β)에 대한 염색. 배율 막대 = 50 μm. 이 그림은 존스턴 외11에서적응되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 개별 엘라스타제 병의 용량-반응 검사. 각 점 그룹은 엘라스타제에 담근 스폰지가 거주할 수 있는 미리 지정된 시간을 나타냅니다. 이러한 데이터는 100-130% 팽창에 대한 이상적인 소화 시간을 추정하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
흉부 및 복부 대동맥은 세포적으로 배아적으로 구별되며, 이는 동맥류 질환14,15,16과관련이 있다. 따라서 TAA를 연구하기 위한 특정 동물 모델이 필요합니다. 다른 murine dTAA 모델이8에 게시되었지만, 우리의 진정한 동맥류 (50 % 이상 팽창)로 간주 될 수있는 내림차순 흉부 대동맥 팽창을 만들 수있는 유일한 모델입니다. 또한, 우리의 모델은 상대적으로 실행 하 고 최대 팽창에 결과 14 일 반대로 16 CaCl2 모델8에서주. 이 효율성은 잠재적으로 인체 실험에 번역 될 수있는 특정 약리학적 개입의 연구를 촉진했다11,12. 그러나 이 프로토콜에는 몇 가지 까다로운 측면과 제한 사항이 있습니다.
당사의 모델은 이전의 여러 AAA 모델에서 사용되어 온 정제된 돼지 췌장 엘라스타제를 활용합니다. 행동의 메커니즘은 대뇌의 매체에서 엘라스틴의 분해와 강력한 염증 반응의 생성으로 믿어지며, 덜 준수하고 결국 약한 벽으로 이어집니다. 엘라스타아제의 소화 효과는 병마다 다릅니다. 일관된 소화 효과를 보장하기 위해, 용설기의 각 새로운 병에 대한 용량 반응 곡선을 수행해야합니다. 복용량은 엘라다아제에 젖은 거즈가 거드려 있는 시간에 해당합니다. 이러한 곡선의 예는 그림5에 나와 있습니다. 특정 엘라다제 스폰지 노출 시간은 14 일에 100-130 % 팽창의 동맥류를 생성하는 노출 기간을 찾는 목표로 검사됩니다. 이 예제 곡선에서는 이 엘라스타아제 병에 대해 4분의 소화 시간이 지정됩니다(사용 가능한 가장 적은 양의 엘라스타아제는 10 mL로 약 830개의 개별 마우스에 충분합니다). 과도한 엘라스타제 소화는 수술 중 출혈이나 조기 파열을 유발할 수 있으며 노출이 부족하면 충분한 소화와 동맥류 팽창을 유발할 수 있습니다.
이 모델은 흉강을 여는 것을 포함하기 때문에 양압 환기의 사용은 필수입니다. 처음에 우리는 직접적인 비전의 밑에 전방 목 해부 및 orotracheal 삽관을 이용했습니다, 그러나 이 방법은 추가 절개 및 폐쇄를 요구했기 때문에 시간이 많이 걸렸습니다. 우리는 지금 반디보르트 외13에의해 상세한 대로 직접 orotracheal 삽관을 이용합니다 . 이 모델에 새로운 외과 의사를 훈련 할 때, 우리는 실제 수술로 이동하기 전에 그것을 마스터하기 위해 광범위하게 삽관 기술을 연습하는 것이 좋습니다. 일단 마우스가 성공적으로 삽관되면, 각 삽관 시도마다 부종이 증가함에 따라 튜브를 빼내지 않도록 세심한 주의를 기울여야하며, 연속적으로 성공 의 기회를 감소시키고 치명적인 기도 손상의 기회를 증가시켜야합니다. 또한 재관에 필요한 시간이 거의 변함없이 치명적이기 때문에 수술 중 절제의 위험을 최소화하기 위해 세심한주의를 기울여야합니다. 우리의 프로토콜에 자세히 설명 된 바와 같이, 소량의 장력 하에서 오른팔과 꼬리를 고정하면 수술 중 로스트랄 또는 꼬리 이동을 방지하고 따라서 퇴출의 위험을 최소화할 수 있습니다.
마취의 통제는 이 모형에서 생명입니다. Vandivort 등13 삽관에 대한 연구에서 논의한 바와 같이, 깊은 수준의 신분이 필요합니다. 마우스가 삽관 절차 도중 의식이 있는 경우에, ET 관 삽입에 저항은 기관 상해 및 식도 삽관을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 이소플루란 독성의 위험을 줄이기 위해 ET 튜브의 기관 배치가 확인되면 이소플루란의 백분율 혼합물을 유도에 사용되는 약 절반으로 줄여야합니다. 이소플루란의 이상적인 비율을 달성하려면 마우스는 10-20초마다 자발적인 횡격막 수축을 가져야 합니다. 수술이 진행됨에 따라 이소플루란은 점진적으로 낮추고 마지막 피부 폐쇄 스티치가 배치 된 후 완전히 꺼져야합니다. 마우스가 깨어있는 동안 마우스가 여전히 마취에서 회복하는 동안 테이프 구속을 제거해야합니다. 잔류 이소플루란의 회수 및 소산을 돕기 위해 최근에 는 마우스가 절착 직후 높은 산소 온난화 환경에서 회수되도록 절차를 수정했습니다.
마우스 폐는 매우 섬세하고 펑크, 부적절한 취급 또는 엘라스타제 노출로 인해 거의 항상 사망을 초래합니다. 폐 손상의 가장 일반적인 점은 흉막에 초기 항목입니다. 갈비뼈에 소작을 사용할 때 (단계 4.2), 우리는 자발적인 호흡 주파수에주의를 기울이고 호흡 직후 몇 초 동안 소작을 활성화하는 것이 좋습니다. 이것은 흉벽을 통해폐로 소작 끝을 구동할 수 있는 흉곽의 예기치 않은 확장을 방지하는 것을 돕습니다. 다음 단계에서 젖은 면 팁 어플리케이터를 사용하여 조직과 흉막막을 부드럽게 부러 뜨리면 날카로운 기구가 폐 표면을 충족시키지 못하기 때문에 폐 손상의 비율을 최소화하는 데 도움이되었습니다. 마지막으로, 엘라다아제에 젖은 스폰지가 폐와 직접 접촉하면 심각한 손상이 발생할 수 있습니다. 이것은 대동맥 해부 도중 반대편 흉막 공간을 입력하고 작은 재배치와 대동맥에 직접 배치될 수 있도록 스폰지를 준비해서 피할 수 있습니다. 수술이 끝나면 왼쪽 폐를 다시 팽창시키려는 시도는 인공 호흡기의 유출 관을 가려서 만들어야합니다. 이것이 실패하는 경우, 3방향 스톱콕을 통해 0.5~ 1.0 mL의 공기를 직접 주입하면 폐를 다시 확장할 수 있다. 두 메서드가 모두 작동하지 않으면 닫기는 정상적으로 진행되어야 합니다. 우리는 큰 폐 손상이 나타나지 않는 경우에, 마우스가 부분적으로 팽창한 폐를 상대적으로 잘 용납하고 폐는 조직 수확에 거의 항상 팽창된다는 것을 것을을 발견했습니다.
이 모델에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 실험 모델은 인간의 대동맥 질환을 완전히 모델링하지 않습니다. dTAA는 인간 TAA 형성이 다인성이고 수십 년이 아니라면 수년에 걸쳐 발생하는 동안 우리의 모델에서 엘라스타아제의 한 응용 프로그램 후 14 일 에서 발생합니다. 그러나 동맥류를 개발하는 데 몇 달에서 몇 년이 걸리는 마우스 모델은 조사 능력에 유용하지 않습니다. 인간의 질병과는 달리, 우리의 모델에서 엘라타아제 유도 동맥류는 수술 후 2 주에 최대 팽창에 도달할 때 크기가 감소하기 시작합니다. 이 회귀는 수술 후 마우스의 식단에서 보충된 β-아미노프로피온리트릴(BAPN)을 사용하여 극복할 수 있습니다. 엘라타아제 노출 모델과 결합하면, BAPN 보충제는 지속적인 성장과 결국 파열을 허용, 더 나은 인간의 질병의 만성을 모방. 우리 실험실은 이전에 AAA17에서 BAPN을 연구했으며 현재 dTAA 모델에서 프로토콜을 더욱 구체화하기 위해 이를 사용하고 있습니다. dTAA 모델을 가진 1 차적인 실험은 28 일에 대략 30%의 파열 비율을 보여주었습니다.
미래에, 우리는 인간에 있는 동맥류 처리에 번역될 수 있는 그밖 유전과 약리학 처리를 평가하기 위하여 이 모형을 사용할 계획입니다. 이 프로토콜은 흉부 대인에 액세스하는 쉽고 안전한 방법을 설명하기 때문에 흉부 대인에 대한 내정간섭을 테스트하려는 다른 실험실에서 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 AHA 과학자 개발 보조금 14SDG18730000 (M.S.), NIH K08 HL098560 (G.A.) 및 RO1 HL081629 (G.R.U.) 보조금에 의해 지원되었다. 이 프로젝트는 연구 및 교육을위한 흉부 수술 재단에 의해 지원되었다 (TSFRE) 연구 보조금 (PI: G. Ailawadi). 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NHLBI 또는 TSFRE의 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 우리는 그들의 지식과 기술 적 전문 지식에 대한 앤서니 청어와 신디 도슨 에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiocatheter (22G) | Used for ET Tube | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #7 x2 | Roboz | RS-4982 | |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz | RS-5158 | |
| Harms Forceps x2 | Roboz | RS-5097 | |
| Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length | Roboz | RS-7800 | |
| KL 1500 LED Light Source | Leica | 150-400 | |
| M205A Dissction Microscope | Leica | CH 94-35 | |
| Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 500216-G | |
| Metal Clip board | Use with the Mouse Retractor Set | ||
| Mouse Retractor Set | Kent | SURGI-5001 | Need 2 short and 1 tall fixators |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector | Harvard Apparatus | 73-0043 | MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled |
| Sigma Aldrich | Elastase from porcine pancreas | E0258-50MG | Can be purchased in various size bottles |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | Recommend using rechargable AA batteries |
| Spring Scissors, 10.5cm | World Precision Instruments | 14127 | |
| Steril Swabs (Sponges) | Sugi | 31603 | Can be cut to size |
| Surgi Suite Surgical Platform | Kent | Attach to clip board | |
| Tech IV Isoflurane Vap | Jorgensen Laboratories | J0561A | Anesthesia vaporizer |
References
- Coady, M. A., et al. What is the appropriate size criterion for resection of thoracic aortic aneurysms. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 113 (3), 489-491 (1997).
- Aggarwal, S., Qamar, A., Sharma, V., Sharma, A. Abdominal aortic aneurysm: A comprehensive review. Experimental and Clinical Cardiology. 16 (1), 11-15 (2011).
- Bickerstaff, L. K., et al. Thoracic aortic aneurysms: a population-based study. Surgery. 92 (6), 1103-1108 (1982).
- Cheng, D., et al. Endovascular aortic repair versus open surgical repair for descending thoracic aortic disease a systematic review and meta-analysis of comparative studies. Journal of the American College of Cardiology. 55 (10), 986-1001 (2010).
- Walsh, S. R., et al. Endovascular stenting versus open surgery for thoracic aortic disease: systematic review and meta-analysis of perioperative results. Journal of Vascular Surgery. 47 (5), 1094-1098 (2008).
- Absi, T. S., et al. Altered patterns of gene expression distinguishing ascending aortic aneurysms from abdominal aortic aneurysms: complementary DNA expression profiling in the molecular characterization of aortic disease. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 126 (2), 344-357 (2003).
- Ailawadi, G., Eliason, J. L., Upchurch, G. R. Current concepts in the pathogenesis of abdominal aortic aneurysm. Journal of Vascular Surgery. 38 (3), 584-588 (2003).
- Ikonomidis, J. S., et al. A murine model of thoracic aortic aneurysms. Journal of Surgical Research. 115 (1), 157-163 (2003).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
- Trachet, B., et al. Ascending Aortic Aneurysm in Angiotensin II-Infused Mice: Formation, Progression, and the Role of Focal Dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 673-681 (2016).
- Johnston, W. F., et al. Inhibition of interleukin-1beta decreases aneurysm formation and progression in a novel model of thoracic aortic aneurysms. Circulation. 130 (11), Suppl 1 51-59 (2014).
- Pope, N. H., et al. Interleukin-6 Receptor Inhibition Prevents Descending Thoracic Aortic Aneurysm Formation. Annals of Thoracic Surgery. 100 (5), 1620-1626 (2015).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Ailawadi, G., et al. A nonintrinsic regional basis for increased infrarenal aortic MMP-9 expression and activity. Journal of Vascular Surgery. 37 (5), 1059-1066 (2003).
- Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta: relevance to aneurysm disease. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (5), 1123-1130 (2008).
- Trigueros-Motos, L., et al. Embryological-origin-dependent differences in homeobox expression in adult aorta: role in regional phenotypic variability and regulation of NF-kappaB activity. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1248-1256 (2013).
- Lu, G. S. G., Davis, J. P., Schaheen, B., Downs, E., Roy, R. J., Ailawadi, G., Upchurch, G. R. A novel chronic advanced staged abdominal aortic aneurysm murine model. Journal of Vascular Surgery. 66 (1), 232-242 (2017).
