Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Murine Хирургическая модель Томатная Эластаза индуцированной спуск торакальной аортальной аневризмы

Published: August 24, 2019 doi: 10.3791/60105

Summary

Мы описываем хирургический протокол, чтобы последовательно индуцировать надежные нисходящие аневризмы грудной аорты у мышей. Процедура включает в себя левую торакотомию, воздействие грудной аорты и размещение губки, пропитанной свиной эластазой поджелудочной железы на стенке аорты.

Abstract

По данным Центра по контролю заболеваний, аневризмы аорты (АА) считались основной причиной смерти во всех расах и обоих полов в 1999-2016 годах. Аневризма образуется в результате постепенного ослабления и возможного расширения аорты, которая может разрываться или разрываться, как только она достигает критического диаметра. Аневризмы нисходящей аорты в груди, называемые нисходящей аневризма миорфизма грудной аорты (dTAA), составляют большую долю случаев аневризмы в Соединенных Штатах. Несдержанный разрыв dTAA почти повсеместно летальный, и факультативное ремонт имеет высокий уровень заболеваемости и смертности. Целью нашей модели является изучение dTAA специально, чтобы выяснить патофизиологию dTAA и искать молекулярные цели, чтобы остановить рост или уменьшить размер dTAA. Имея модель мурин для изучения грудной патологии точно, целевые терапии могут быть разработаны специально для тестирования dTAA. Метод основан на размещении свиной поджелудочной эластаза (СИЗ) непосредственно на внешней стенке морины после хирургического воздействия. Это создает разрушительную и воспалительную реакцию, которая ослабляет стенку аорты и позволяет образование аневризмы в течение нескольких недель до нескольких месяцев. Хотя модели murine обладают ограничениями, наша модель dTAA производит надежные аневризмы предсказуемого размера. Кроме того, эта модель может быть использована для тестирования генетических и фармацевтических целей, которые могут остановить рост dTAA или предотвратить разрыв. У пациентов с людьми подобные вмешательства могут помочь избежать разрыва аневризмы и сложного хирургического вмешательства.

Introduction

Целью данного метода является изучение развития, патофизиологии и структурных изменений в моринической нисходящей грудной аорте во время формирования аневризмы аорты. Наша модель предлагает воспроизводимый и последовательный метод индуцирования аневризмы грудной аорты (dTAA) у мышей, что позволяет для тестирования различных генетических и фармакологических ингибиторов. Эта работа может помочь определить наркотики и генной терапии, которые могут быть переведены на жизнеспособную стратегию лечения для людей с болезнью dTAA.

dTAAs форме, когда стенка грудной аорты становится ослабленным и охватывает с течением времени до достижения критического диаметра, когда разрыв или разрыв может произойти. Клинически, dTAA может прогрессировать в тишине, увеличивая в размере до тех пор пока структура стены аорты не будет настолько искажена что она окончательно терпит неудачу, с катастрофическими последствиями. Что касается, симптомы обычно развиваются только тогда, когда аневризма достигла опасного размера (100-150% расширение) и находится на высоком риске для вскрытия или разрыв1,2. разрыв dTAA почти повсеместно смертельной3, и факультативного хирургического ремонта несет значительную заболеваемость4,5. Кроме того, большинство пациентов переносят диагноз аневризмы аортыв течение примерно 5 лет до хирургического ремонта 6,7. Это окно представляет собой подходящее время для вмешательства без хирургического вмешательства. Таким образом, медицинские методы лечения или медленного прогрессирования dTAA необходимы и будет представлять собой значительный прогресс в области исследований аневризмы. В настоящее время нет доступных медицинских процедур для dTAA, главным образом из-за неполного понимания патогенеза dTAA.

За последние 20 лет было разработано несколько моделей dTAA животных, но каждая из этих моделей отличалась от наших собственных и не производила надежных аневризм. Модель murine dTAA, наиболее похожая на нашу, быларазработана компанией Ikonomidis et al. 8, которая включает в себя прямое применение CaCl2 к адвенитии аорты. Хотя наша модель была адаптирована из многих методов, изложенных Ikonomidis, наша модель уникальна в трех отдельных направлениях. Во-первых, в нашей модели аорта подвергается воздействию актуальных эластаза в течение 3-5 минут, по сравнению с 15 минут CaCl2 воздействия. Во-вторых, расширение аорты происходит в 2 недели, по сравнению с 16 недель в модели CaCl 2. Наконец, наша модель последовательно производит аневризмы примерно 100% расширения, по сравнению с аорты расширения 20-30% производства CaCl2 приложения (которые не могут быть действительно считаются аневризмы, поскольку они определяются как увеличение аорты диаметра 50%). Существуют и другие нехирургические модерации образования аневризмы, такие как мышь Apo E knockout, которые образуют надежные аневризмы с настоем ангиотензина II. Тем не менее, эти мыши развиваются над-почечной или восходящей грудной аортальной аневризмы, а не аневризмы конкретно в нисходящей грудной аорты9,10.

Рациональным для этого протокола является простой, недорогой, и время подходящий способ изучения dTAA в модели мурин. Мышь модель предоставляет уникальную возможность использовать многие генетические и клеточных нокаутов, которые были найдены, чтобы быть impactful в других сосудистых заболеваний. Использование нашей конкретной модели TAA была хорошо принята и эксперименты с ее использованием были опубликованы в высокоэффективных журналах11,12. К этому моменту модель использовалась для исследования возможных генетических и фармакологических методов лечения, которые оказали значительное влияние на моделя брюшной аневризмы аорты (AAA); однако, поскольку наша лаборатория расширила использование модели dTAA, мы находим цели, уникальные для формирования dTAA, которые могут быть использованы в качестве целевой терапии у людей.

Эта модель наиболее подходит для лабораторий, которые имеют микрохирургические возможности мурина. Хотя это технически сложной задачей, она может быть выполнена последовательно даже исследователями без предварительного хирургического опыта. Для исследователя, не опыт работы с хирургическим опытом, модель может быть освоена примерно в 20 оперативных сеансах (или примерно в 50 мышах). Для исследователя с опытом работы с хирургическим вмешательством, модель может быть освоена в 5 оперативных сессий (примерно 20 мышей). Мы считаем, что с высококачественным видео, время для освоения может быть еще больше сокращена. После достижения квалификации, процедура может быть завершена в течение 35 минут для операции, и 20 минут для конечного урожая. Хирурги в нашей лаборатории могут выполнять 10-12 полных операций в день, с оперативной смертности 5-10%. Наиболее распространенной причиной смертности является повреждение легких при поступлении в грудь, анестетик токсичность или разрыв аорты во время вскрытия. В дополнение к исследованиям dTAA, эта модель также служит в качестве руководства для безопасного и легкого доступа к грудной аорты и легких hilum для исследователей, изучающих другие вмешательства в груди.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протоколы о животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Вирджинии (No 3634).

1. Индукция анестезии и интубации

  1. Поместите 8-10-недельного мужчину C57BL/6 мышь в закрытой камере с непрерывным потоком 5% изофлуран и кислородной смеси в течение 5 минут, пока дыхание заметно не замедлилось.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные штаммы, пол и возраст мышей могут быть использованы в зависимости от экспериментального протокола. Самки мышей может быть труднее интубировать из-за меньшего размера и, следовательно, меньше дыхательных путей.
  2. Интубировать мышь, как описано Vandivort и др.13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг интубации является наиболее сложной частью этой модели, как учиться, так и выполнять. Вышеупомянутые авторы делают отличную работу, объясняя шаги в их видео.

2. Обеспечение мыши к хирургической доске

  1. Подключите эндотрахеальную трубку (ET), подтвердите рост груди и положите мышь в нужное боковое положение декубита. Поверните изофлюран примерно до 3% и нанесите смазку на оба глаза. Вентилятор должен быть установлен, чтобы обеспечить примерно 200 вдохов в минуту и 225 л приливного объема.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Токсичность быстро, если изофлуран остается на 5%. Тем не менее, ответ на изофлуран является переменной, поэтому анестезирующего потока скорость должна быть титра таким образом, что спонтанные диафрагмические сокращения происходят примерно каждые 10-20 с и кислородная система представляется адекватной при осмотре слизистых оболочек и подвергаются ткани.
  2. Закрепите ET трубку к доске с лентой. Вытяните правую руку ростралли, чтобы передняя лапа была в соответствии с носом и закрепите ее лентой.
  3. Потяните хвост caudally для того, чтобы создать линию напряженности между правой рукой и хвостом, производя расширение позвоночника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечение как хвоста, так и правой лапы в линии предотвращает вставку или выбивание ET трубки.
  4. Лента левой ноги в ее естественном положении. Нарисуйте левую руку вентрально над прокатной марлей и лентой вниз.

3. Подготовка к операции

  1. Бритье левый фланг мыши с электрическими клиперами от левого плеча до левого живота.
  2. Используйте хлопок наконечником аппликатор аппликатор щеткой бетадин решение над хирургическим сайтом. Используйте новый хлопок наконечником аппликатор аппликатор щеткой 70% этанола раствор над хирургическим сайтом. Дайте высохнуть. Поместите стерильную драпировку.
  3. ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что весь этанол полностью высушивается перед началом работы в качестве электрокаутерии используется и может воспламенить этанол.

4. Вступление в грудную клетку

  1. Сделайте боковой разрез 1 см в середине гемиторакса с помощью хирургических ножниц. Используйте портативный электрокаутер, чтобы разделить мышечные слои, пока ребра не видны.
  2. Непосредственно прижмете 2 мм части ребра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании электрокаутерии на ребре, наблюдать за спонтанной частотой дыхания. Если мышь имеет диафрагмическое сокращение во время каутерии, наконечник может войти в грудную клетку и прокол легких, которые, как правило, фатальным в этой модели.
  3. Использование смачивается, штраф хлопка наконечником аппликатора в пространстве ребра превосходит прижигают часть, поверните кончик на ткани, чтобы ворваться в плеврального пространства. Поместите смачиваемые 3 мм х 2 мм губки в грудную клетку, чтобы помочь крах легких.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только пусть мягкие, влажные, губки контакт легких, как это очень деликатный.
  4. Используйте ножницы, чтобы разрезать вдоль верхнего аспекта прижига, пока диафрагма не видна.

5. Воздействие аорты

  1. Поместите ребра ребра и использовать их, чтобы открыть разрез торакотомии. Аккуратно снимите губку с поверхности легких.
  2. Место смачивается 6 мм х 4 мм губка так, что он лежит покрытие легких, с концами, указывающими на ростии и caudally. Поместите (широкий плоский) легких ретрактор на губку и осторожно слайд ретрактор ventrally до нисходящего грудной аорты подвергается.
  3. Используйте #7 щипцдляем, чтобы вскрыть соединительную ткань и жир от аорты для примерно 5 мм раздела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Малые вены могут работать поперечно через аорту; избегать разрыва их во время вскрытия (использование по крайней мере 14x увеличение может помочь избежать этого осложнения).

6. Воздействие эластаза

  1. Насыщайте губку 0,5 мм х 1 мм 1 л с 12 л свиной эластази поджелудочной железы и поместите ее на обнажённую поверхность аорты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте губке коснуться контралатерального легкого.
  2. После заданного времени (обычно 3-5 мин) удалите губку эластаза #7 щипками. Удалите легкий ретрактор. Орошать грудную полость с 1 мл стерильного солья.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удалить легких ретрактор перед орошением с сольнием, как это позволит губки легких, чтобы стать насыщенным и мягким, что делает его легче удалить с поверхности легких.
  3. Используйте прокат 2 "х 2" марли, чтобы поглотить оставшиеся солевой орошения. Поверните изолюран до 2%.

7. Закрытие грудной клетки

  1. Удалите губку для легких. Удалите каудальный втягиватель легких. Удалите ростральный втягиватель легких.
  2. Место 3 прервано 6-0 непоглощаемых швов, чтобы противостоять ребрам, связать свободный узел в каждом, но не связать. Примите большое внимательность для того чтобы не коснуться легкя с иглой швы.
  3. Повторно надуть легкие, окклюзии из-за трубки оттока на вентилятор евлю или быстро дует 0,5-1,0 мл воздуха через ET трубки, используя 3 способ остановить петух.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать баротравмы, избегайте чрезмерного использования заполненного воздухом шприца и используйте не более 1,0 мл воздуха.
  4. Завяжите непоглощаемые швы. Повторное приближение мышечных слоев с бегущим 5-0 абсорбируемым многофиламентным швом. Поверните изолюран до 1%.
  5. Закройте кожу с 7-10 прерванными 5-0 непоглощаемыми швами. Поверните изофлюран до 0%.

8. Восстановление

  1. Администрирование 6 мкг (0,02 мл 0,3 мг/мл суспензии) бупренорфина подкожно. Снимите ленту с правой ноги, хвоста и левой руки с последующей лентой правой руки.
  2. Когда мышь перемещает конечности, extubate, потянув его за хвост, чтобы соскользнуть с et трубки. Место в высоком содержании кислорода теплее камеры в положении на спине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасно перемещать мышь из кислородной камеры в клетку, когда она может перевернуться в нормальное положение стоя. Кроме того, мышей следует контролировать на наличие признаков боли, бедствия или неспособности процветать часто в течение первых 24-48 часов после операции и при условии, дополнительные обезболивания или мягкой пищи, как указано.

9. Воздействие аневризмы аорты (терминальная процедура сбора урожая)

ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, сбор тканей проводится в течение 14 дней, так как это представляет собой период максимального расширения. Однако, в зависимости от эксперимента, время проведения процедуры сбора урожая может быть проведено в любое время от 3 дней до 4 недель, в зависимости от эксперимента.

  1. Интубировать и защищать мышь в оперативное поле, как описано выше (разделы 1-3). Используйте ножницы, чтобы вырезовать кожу медиально от левого фланга до центрального живота, заботясь, чтобы не войти в брюшную полость.
  2. Разрезайте кожу с торцевого левого фланга ростально до уровня левого плеча. Затем прорезывайте под углом 90 градусов через аксилку к грудине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот разрез должен полностью окружить оригинальный разрез кожи.
  3. Используя каутерию, вскрыть кожу лоскут к брюшной аспект мыши, подвергая левый гемиторакс. Используйте ножницы, чтобы войти в живот и резцы вдоль левой дорогостоящей маржи от брюшной до вдовы подвергать нижней левой диафрагмы. Боковой самый край диафрагмы может открыться, который является желательным.
  4. Если не создан с предыдущим шагом, резцедить диафрагмы на ее самый боковой край. Поместите кончик каутерии в это отверстие и прижигайте диафрагму от дорогостоящего края к процессу ксифоида. Использование влажной тонкой наконечником хлопка наконечником аппликатор, мягко освободить легкое от спаек к груди стенки и нажмите легких медиально.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если спайки не легко оторваться от грудной стенки, используйте каутери, чтобы удалить их; это помогает избежать разрыва легких, которые могут вызвать сильное кровотечение.
  5. Прижтените внутреннюю часть грудной стенки от ребра один до костлявого края, в доиоты до середины подмышечной линии, но по крайней мере 2 мм от аорты. Вырезать грудную стенку вдоль прикожной линии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод позволяет избежать кровотечения из межреберных артерий.
  6. Вырезать вдоль верхнего края ребра один, а затем caudally вдоль бокового края грудины, удалив левую грудную клетку. Поместите втягивания в легкие и потяните посредничьно. Поместите ретрактор на диафрагму и нарисуйте caudally, чтобы разоблачить как можно больше аорты, как это возможно.
  7. Используйте сухой хлопчатобумажный аппликатор для удаления спаек из аневризмы аорты и нетронутого дистального сегмента. Измерьте диаметр незатронутого сегмента управления и широчайшую часть эластазной обработанной аневризмы с помощью видеомикрометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения микрометрии видео используются для расчета процентного расширения сегмента аневризмы по сравнению с контрольным сегментом с Equation 1. Выбран сегмент управления, который составляет 0,5 мм дистального к аневризму сегмента 1.

    Equation 1Уравнение 1
     
  8. Возьмите аорту с щипцы Хармс, просто дистальный к обработанному сегменту. Используйте ножницы, чтобы сократить дисталь ные щипцы, а затем вскрыть аорту от позвоночника. Вырезать аорты проксимал для лечения сегмента и удалить аневризмальной аорты.
  9. Используя трубачиновый шприц и иглу, промойте просвет аорты сольником и обработайте ткани по желанию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Применение нашего протокола приводит к надежному dTAA у мышей по сравнению с сольным управлением. Разработанные TAAs являются fusiform в форме и происходят только в обработанной части аорты(Рисунок 1 и Рисунок 2)11. На рисунке 2 показан пример измерения микрометрии видео при сборе тканей. Используя уравнение 1, расширение аорты составляет 130% в этом примере.

Оригинальное исследование Johnston et al.11, описывающее модель, показало значительное увеличение расширения аорты у обработанных мышей дикого типа (WT TAA) на 3, 7, 14 и 21 дней по сравнению с элементами управления у диких мышей типа (WT управления). Максимальное расширение аорты произошло на 14-й день (WT TAA: 99,6 и 24,7% против управления WT: 14,4 и 8,2%; стр. 0,0001) (Рисунок 3)11. Отдельный эксперимент Папы Римского и др.12 показывает аналогичное расширение в 14 дней.

При изучении гистологии, WT TAAs имеют эластин волокна, которые истончены и фрагментированы. Существует также менее гладкая мышечная клетка (СМЗА) окрашивание, в то время как макрофаги (Mac2) и интерлейкин-1 "(IL-1 ") выражение увеличивается (Рисунок 4).

Figure 1
Рисунок 1 : Образцы фотографий грудной аортальной аневризмы (TAA) модели иустановки оборудования. Слева направо, (1) начальное воздействие грудной аорты через левую торакотомию, (2) вскрытие плевры, (3) применение пропитанной эластазой губкой и (4) удаление губки. Для аортального урожая (5) торакотомия была вновь открыта, а торакальная аорта была расчленена бесплатно и измерена. (6) Иллюстрация справа демонстрирует относительную связь аорты с пищеводом, легким и гемиазигосом вены. Эта цифра была адаптирована из Johnston et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Пример видео микрометрии измерения TAA. C - неэкспонированный контрольный сегмент, а эластаза, обработанная аневризма, RL - правое легкое, эзофаг, Т й хвост, H и голова. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Диаметр аорты с течением времени во время формирования TAA. Средний диаметр аорты (мм и SD) у мышей WT, подвергшихся воздействию эластазы (WT TAA, серый) или подвергающихся воздействию солья (WT control, зеленый) с течениемвремени. Значительные различия произошли между Управлением WT TAA и WT во все временные точки, отмеченные звездочкой (p qlt; 0.05). Максимальное расширение аорты происходит в день 14 (WT TAA: 99,6 и 24,7% против управления WT: 14,4 и 8,2%; стр. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение. Эта цифра была адаптирована из Johnston et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : Гистологическое исследование WT эластаза TAA и WT солиновый контроль ткани. Пример аорты поперечных сечений управления WT (солин губка) и WT TAAs (elastase губка) на 14-й день. Окрашивание эластина, гладких мышечных клеток (СМЗ), макрофагов (Mac2) и интерлейкина-1 з (ИЛ-1"). Шкала бар 50 мкм. Эта цифра была адаптирована из Johnston et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5 : Доз-ответное обследование отдельной бутылки эластазы. Каждая группа точек представляет собой заранее указанное время, когда пропитанная эластазой губка может ожить. Эти данные используются для оценки идеального времени пищеварения для 100-130% расширения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Торакальная и брюшная аорта клеточно и эмбрионально отличаются, что имеет отношение к аневризмальной болезни14,15,16. Поэтому необходима конкретная модель животных для изучения TAA. Хотя другие модели murine dTAA были опубликованы8,наша единственная модель для создания нисходящей грудной аортальной расширительной, которая может считаться действительно аневризма (более 50% расширения). Кроме того, наша модель относительно быстро выполняется и приводит к максимальному расширению на 14 дней, в отличие от 16 недель вмоделиCaCl2 . Эта эффективность способствовала изучению конкретных фармакологических вмешательств, которые потенциально могут быть переводимы для человеческих испытаний11,12. Однако этот протокол имеет несколько сложных аспектов и ограничений.

Наша модель использует очищенную свиную эластазную поджелудочную железу, которая использовалась в нескольких предыдущих моделях AAA. Механизм действия, как полагают, распад эластина в средствах массовой информации аорты и создание надежной воспалительной реакции, что приводит к менее совместимым и в конечном итоге слабее стены. Пищеварительный эффект эластаза варьируется от бутылки к бутылке. Для обеспечения последовательного пищеварительного эффекта, кривая реакции дозы должна быть предпринята для каждой новой бутылки эластазы. Доза соответствует времени, в течение которого пропитанная эластаза марлей может ожить. Пример такой кривой показан на рисунке 5. Специфические время экспозиции губки эластаза исследуются с целью найти продолжительность экспозиции, которая создает аневризмы 100-130% расширения на 14 дней. В этом примере кривая, 4-минутное время пищеварения предназначендля для этой бутылки эластазы (примечательно, что наименьшее количество эластазы доступно в 10 мл, что достаточно для примерно 830 отдельных мышей). Чрезмерное пищеварение эластаза может вызвать внутриоперационное кровотечение или преждевременный разрыв и недостаточное воздействие может не вызвать достаточного пищеварения и аневризмального расширения.

Поскольку эта модель предполагает открытие грудной полости, использование вентиляции положительного давления является обязательным. Первоначально мы использовали передней шеи вскрытия и orotracheal интубации под прямым зрением, но этот метод занимает много времени, поскольку она требует дополнительного разреза и закрытия. Теперь мы используем прямую интубацию orotracheal, как подробно Vandivort и др.13. При обучении новых хирургов на этой модели, мы рекомендуем практиковать технику интубации широко освоить его, прежде чем перейти к фактической хирургии. После того, как мышь успешно интубирована, следует проделать большую осторожность, чтобы не выбить трубку, как отек увеличивается с каждой попытки интубации, последовательно уменьшая шансы на успех и увеличивая шансы на фатальную травму дыхательных путей. Большой осторожностью следует также предпринять, чтобы свести к минимуму риск экстубации во время операции, так как время, необходимое для реинтубации почти всегда фатальным. Как описано в нашем протоколе, обеспечение правой руки и хвоста при небольшом количестве напряжения предотвратит ростальный или хвостовой сдвиг во время операции и, следовательно, свести к минимуму риск экстубации.

Контроль анестезии имеет жизненно важное значение в этой модели. Как Вандиворт и др.13 обсуждали в своем исследовании по интубации, глубокий уровень седативных необходимо. Если мышь находится в сознании во время процедуры интубации, сопротивление et трубки вставки может привести к травме трахеи и интубации пищевода. Чтобы уменьшить риск изолюрантостии, как только трахея размещения ET трубки было подтверждено, процент смеси изофруран должен быть уменьшен примерно в два раза, что используется для индукции. Для достижения идеального процента изофлурана, мышь должна иметь спонтанное диафрагмическое сокращение каждые 10-20 секунд. По мере того как хирургия развивает, изофлуран должен быть прогрессивно понизито и вполне повернут после того как последний стежок замыкания кожи помещен. Лента ограничения должны быть удалены в то время как мышь все еще восстанавливается после анестезии, как удаление в то время как мышь проснулась может быть травматичным. Чтобы помочь с восстановлением и рассеиванием остаточного изолюрания, мы недавно изменили процедуру так, что мышь восстанавливается в среде высокого потепления кислорода сразу после экстубации.

Мышь легких является чрезвычайно деликатным и травмы от прокола, ненадлежащее обращение, или эластаза воздействия почти всегда приводит к смерти. Наиболее распространенной точкой травмы легких является первоначальный вход в плевру. При использовании каутерии на ребрах (шаг 4.2) мы советуем обратить пристальное внимание на спонтанную частоту дыхания и только активировать каутерию в течение нескольких секунд сразу после вдоха. Это помогает предотвратить неожиданное расширение грудной клетки, которая может управлять кончиком каутерии через грудную стенку и в легкие. Использование смачиваемых хлопчатобумажных аппликатора в следующем шаге, чтобы мягко сломать ткани и плевральной мембраны также помогли свести к минимуму нашу скорость травмы легких, поскольку острые инструменты не отвечают поверхности легких. Наконец, если пропитанная эластазой губка контактирует либо легких непосредственно, серьезные повреждения могут произойти. Этого можно избежать, не вводя в контралатеральный плеврального пространства во время рассечения аорты и готовя губку, так что она может быть помещена непосредственно на аорту с небольшим перепозиционированием. В конце операции, попытка повторно раздувать левое легкое должно быть сделано путем окклавирования изводной трубки вентилятора. Если это не удается, прямое введение от 0,5 до 1,0 мл воздуха через 3-путь стопкок может повторно расширить легких. Если оба этих метода не работают, закрытие должно осуществляться в обычном режиме. Мы обнаружили, что если нет серьезных травм легких присутствует, мыши терпеть частично завышенные легкие относительно хорошо и легких почти всегда завышены на урожай тканей.

Эта модель имеет несколько ограничений. Экспериментальные модели не полностью моделируют болезнь аорты человека. dTAA происходит через 14 дней после одного применения эластаза в нашей модели, в то время как формирование TAA человека является многофакторным и происходит в течение многих лет, если не десятилетий. Тем не менее, мышь модель, которая занимает от нескольких месяцев до нескольких лет, чтобы разработать аневризмы не полезно в следственных потенциала. В отличие от болезней человека, эластаза индуцированных аневризм в нашей модели начинают уменьшаться в размерах, когда они достигают максимального расширения в течение двух недель после операции. Эта регрессия может быть преодолена с помощью -аминопропионитрила (BAPN), дополненного в диете мыши после операции. В сочетании с моделью воздействия эластаза, BAPN добавок позволяет непрерывный рост и в конечном итоге разрыв, лучше имитируя хронику болезни человека. Наша лаборатория ранее изучала BAPN в AAA17, и в настоящее время мы используем его в модели dTAA для дальнейшего уточнения нашего протокола. Первичные эксперименты с моделью dTAA показали, что скорость разрыва составляет примерно 30% в 28 дней.

В будущем мы планируем использовать эту модель для оценки других генетических и фармакологических методов лечения, которые могут быть переводимы для лечения аневризмы у людей. Поскольку этот протокол описывает простой и безопасный способ доступа к грудной аорте, он может быть использован другими лабораториями, которые хотят проверить вмешательства на грудной аорте.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана AHA Scientist Development Grant 14SDG18730000 (M.S.), NIH K08 HL098560 (G.A.) и RO1 HL081629 (G.R.U.) грантами. Этот проект был поддержан Торакальной хирургии Фонд исследований и образования (TSFRE) научно-исследовательский грант (PI: Г. Ailawadi). Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает мнение NHLBI или TSFRE. Мы благодарим Энтони Херринга и Синди Додсон за их знания и технический опыт.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiocatheter (22G) Used for ET Tube
Dumont Tweezers; Pattern #7 x2 Roboz RS-4982
Graefe Tissue Forceps Roboz RS-5158
Harms Forceps x2 Roboz RS-5097
Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length Roboz RS-7800
 KL 1500 LED Light Source Leica 150-400
 M205A Dissction Microscope Leica CH 94-35
Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide World Precision Instruments 500216-G
Metal Clip board Use with the Mouse Retractor Set 
Mouse Retractor Set Kent SURGI-5001 Need 2 short and 1 tall fixators
Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector Harvard Apparatus 73-0043 MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled
Sigma Aldrich Elastase from porcine pancreas E0258-50MG Can be purchased in various size bottles
Small Vessel Cauterizer Kit Fine Science Tools 18000-00 Recommend using rechargable AA batteries
Spring Scissors, 10.5cm World Precision Instruments 14127
Steril Swabs (Sponges) Sugi 31603 Can be cut to size
Surgi Suite Surgical Platform Kent Attach to clip board 
Tech IV Isoflurane Vap Jorgensen Laboratories  J0561A Anesthesia vaporizer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coady, M. A., et al. What is the appropriate size criterion for resection of thoracic aortic aneurysms. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 113 (3), 489-491 (1997).
  2. Aggarwal, S., Qamar, A., Sharma, V., Sharma, A. Abdominal aortic aneurysm: A comprehensive review. Experimental and Clinical Cardiology. 16 (1), 11-15 (2011).
  3. Bickerstaff, L. K., et al. Thoracic aortic aneurysms: a population-based study. Surgery. 92 (6), 1103-1108 (1982).
  4. Cheng, D., et al. Endovascular aortic repair versus open surgical repair for descending thoracic aortic disease a systematic review and meta-analysis of comparative studies. Journal of the American College of Cardiology. 55 (10), 986-1001 (2010).
  5. Walsh, S. R., et al. Endovascular stenting versus open surgery for thoracic aortic disease: systematic review and meta-analysis of perioperative results. Journal of Vascular Surgery. 47 (5), 1094-1098 (2008).
  6. Absi, T. S., et al. Altered patterns of gene expression distinguishing ascending aortic aneurysms from abdominal aortic aneurysms: complementary DNA expression profiling in the molecular characterization of aortic disease. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 126 (2), 344-357 (2003).
  7. Ailawadi, G., Eliason, J. L., Upchurch, G. R. Current concepts in the pathogenesis of abdominal aortic aneurysm. Journal of Vascular Surgery. 38 (3), 584-588 (2003).
  8. Ikonomidis, J. S., et al. A murine model of thoracic aortic aneurysms. Journal of Surgical Research. 115 (1), 157-163 (2003).
  9. Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
  10. Trachet, B., et al. Ascending Aortic Aneurysm in Angiotensin II-Infused Mice: Formation, Progression, and the Role of Focal Dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 673-681 (2016).
  11. Johnston, W. F., et al. Inhibition of interleukin-1beta decreases aneurysm formation and progression in a novel model of thoracic aortic aneurysms. Circulation. 130 (11), Suppl 1 51-59 (2014).
  12. Pope, N. H., et al. Interleukin-6 Receptor Inhibition Prevents Descending Thoracic Aortic Aneurysm Formation. Annals of Thoracic Surgery. 100 (5), 1620-1626 (2015).
  13. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
  14. Ailawadi, G., et al. A nonintrinsic regional basis for increased infrarenal aortic MMP-9 expression and activity. Journal of Vascular Surgery. 37 (5), 1059-1066 (2003).
  15. Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta: relevance to aneurysm disease. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (5), 1123-1130 (2008).
  16. Trigueros-Motos, L., et al. Embryological-origin-dependent differences in homeobox expression in adult aorta: role in regional phenotypic variability and regulation of NF-kappaB activity. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1248-1256 (2013).
  17. Lu, G. S. G., Davis, J. P., Schaheen, B., Downs, E., Roy, R. J., Ailawadi, G., Upchurch, G. R. A novel chronic advanced staged abdominal aortic aneurysm murine model. Journal of Vascular Surgery. 66 (1), 232-242 (2017).

Tags

Медицина Выпуск 150 аневризма грудной аорты моринная модель эластаза кардиохирургия аорта воспаление
Murine Хирургическая модель Томатная Эластаза индуцированной спуск торакальной аортальной аневризмы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tyerman, Z., Dahl, J., Shannon, A.,More

Tyerman, Z., Dahl, J., Shannon, A., Johnston, W. F., Pope, N. H., Lu, G., Upchurch Jr., G. R., Ailawadi, G., Salmon, M. Murine Surgical Model of Topical Elastase Induced Descending Thoracic Aortic Aneurysm. J. Vis. Exp. (150), e60105, doi:10.3791/60105 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter