Summary
Farelerde sürekli olarak alçalan torasik aort anevrizmalarını tetikleyen bir cerrahi protokol uyguluyoruz. Prosedür sol torakotomi içerir, torasik aort maruzkalma, ve aort duvarında domuz pankreas elastaz batırılmış bir sünger yerleştirme.
Abstract
Hastalık Kontrol Merkezi'ne göre, 1999-2016 yılları arasında tüm ırklarda ve her iki cinste de aort anevrizmaları (AAs) önde gelen ölüm nedeni olarak kabul edildi. Anevrizma, kritik bir çapa ulaştığında yırtılma veya yırtılma yapabilen aortun ilerleyici zayıflaması ve nihai genişlemesi sonucu oluşur. Göğüste alçalan aort anevrizmaları, inen torasik aort anevrizmaları denir (dTAA), Amerika Birleşik Devletleri'nde anevrizma vakalarının büyük bir kısmını oluşturan. Kontrolsüz dTAA rüptürü neredeyse evrensel olarak ölümcüldür ve elektif onarım yüksek oranda morbidite ve mortaliteye sahiptir. Modelimizin amacı özellikle dTAA'yı incelemek, dTAA'nın patofizyolojisini açıklamak ve büyümeyi durdurmak veya dTAA'nın boyutunu küçültmek için moleküler hedefler aramaktır. Torasik patolojiyi tam olarak incelemek için bir murine modeline sahip olarak özellikle dTAA'yı test etmek için hedefli tedaviler geliştirilebilir. Yöntem, cerrahi maruziyet sonrası domuz pankreatik elastazın (PPE) doğrudan dış mürin aort duvarına yerleştirilmesine dayanmaktadır. Bu yıkıcı ve inflamatuar reaksiyon oluşturur, hangi aort duvarı zayıflatır ve aylara haftalar boyunca anevrizma oluşumunu sağlar. Murine modelleri sınırlamalara sahip olsa da, dTAA modelimiz öngörülebilir boyutta sağlam anevrizmalar üretir. Ayrıca, bu model dTAA büyümesini durdurabilecek veya yırtılmayı önleyebilecek genetik ve farmasötik hedefleri test etmek için kullanılabilir. İnsan hastalarda, bu gibi müdahaleler anevrizma rüptürü ve zor cerrahi müdahale önlemeye yardımcı olabilir.
Introduction
Bu yöntemin amacı aort anevrizması oluşumu sırasında inen torasik aortun gelişimi, patofizyolojisi ve yapısal değişikliklerini incelemektir. Modelimiz farelerde torasik aort anevrizmalarını (dTAA) indüklemek için tekrarlanabilir ve tutarlı bir yöntem sunarak çeşitli genetik ve farmakolojik inhibitörlerin test edilmesine olanak sağlamaktadır. Bu çalışma, dTAA hastalığı olan insanlar için uygulanabilir bir tedavi stratejisine çevrilebilecek ilaçların ve gen terapilerinin belirlenmesine yardımcı olabilir.
torasik aort duvarı zayıfladığında ve zaman içinde genişlediğinde yırtılma veya yırtılma meydana geldiğinde kritik bir çapa ulaşıncaya kadar dTA'lar oluşur. Klinik olarak, dTAA sessizlik içinde ilerleyebilir, aort duvarının yapısı o kadar bozulmuş ki sonunda başarısız olana kadar boyutu artmaktadır, yıkıcı sonuçlara yol açabilir. Bununla ilgili olarak, semptomlar genellikle sadece anevrizma tehlikeli bir boyuta ulaştığında gelişir (100-150% genişleme) ve diseksiyon veya rüptür için yüksek risk altındadır1,2. dTAA rüptürü neredeyse evrensel olarak ölümcüldür 3, ve elektif cerrahi onarım önemli morbidite taşır4,5. Ayrıca, çoğu hasta cerrahionarım6 ,7önce yaklaşık 5 yıl boyunca bir aort anevrizması tanısı taşımak . Bu pencere, cerrahi olmayan müdahale için uygun bir zamanı temsil eder. Bu nedenle, dTAA'nın tedavisi veya yavaş ilerlemesi için tıbbi tedavilere ihtiyaç duyulmaktadır ve anevrizma araştırmaları alanında önemli bir ilerleme yitirmeolacaktır. Şu anda dTAA patogenezinin eksik anlaşılması nedeniyle dTAA için tıbbi tedavi bulunmamaktadır.
Son 20 yıl içinde, birkaç dTAA hayvan modelleri geliştirilmiştir, ancak bu modellerin her biri bizimkinden farklı ydı ve sağlam anevrizmalar üretmedi. Bizimkine en çok benzeyen bir murine dTAA modeli, CaCl 2'nin aort adventisine doğrudan uygulanmasını içeren Ikonomidis ve ark.8tarafından geliştirilmiştir. Modelimiz Ikonomidis tarafından belirlenen tekniklerin çoğundan uyarlanmış olsa da, modelimiz üç ayrı şekilde benzersizdir. İlk olarak, modelimizde aort 3-5 dakika topikal elastaza maruz kalır, CaCl2 pozlama 15 dakika ile karşılaştırıldığında. İkinci olarak, aort genişlemesi 2 hafta içinde oluşur, CaCl 16 hafta ile karşılaştırıldığında2 model. Son olarak, modelimiz sürekli olarak yaklaşık %100 dilatasyon anevrizmaları üretir, CaCl2 uygulaması tarafından üretilen %20-30 aort dilatasyonlarına göre (aort artışı olarak tanımlandıkları için gerçekten anevrizma olarak kabul edilemezler). çapı >%50). Anevrizma oluşumunun diğer cerrahi olmayan murine modelleri vardır, Apo E nakavt fare gibi, anjiyotensin infüzyonu ile sağlam anevrizmalar oluşturan II. Ancak, bu fareler özellikle alçalan torasik aort9,10anevrizma yerine supra-renal veya yükselen torasik aort anevrizmaları geliştirmek .
Bu protokol için rasyonel basit, ucuz ve bir murine modelinde dTAA çalışma için uygun bir yol olmasıdır. Fare modeli diğer damar hastalıklarında etkili olduğu tespit edilmiştir birçok genetik ve hücreye özgü nakavt kullanmak için eşsiz bir fırsat sağlar. Bizim özel TAA modelinin kullanımı iyi kabul edilmiş ve deneyler yüksek etkili dergilerde yayınlanmıştır11,12. Bu noktada, model abdominal aort anevrizması (AAA) mürin modellerinde önemli bir etkiye sahip olası genetik ve farmakolojik tedavileri araştırmak için kullanılmıştır; ancak laboratuvarımız dTAA modelinin kullanımını genişlettikçe, insanlarda hedefli tedaviler olarak kullanılabilecek dTAA oluşumuna özgü hedefler buluyoruz.
Bu model en çok murine mikro-cerrahi yetenekleri olan laboratuvarlar için uygundur. Teknik olarak zor olsa da, daha önce hiçbir cerrahi deneyimi olmayan araştırmacılar tarafından bile sürekli olarak yürütülebilir. Hiçbir murine cerrahi deneyimi olan bir araştırmacı için model yaklaşık 20 ameliyat seans (veya yaklaşık 50 fare) hakim olabilir. Önceki cerrahi deneyimi olan araştırmacı için, model 5 ameliyat seanslarında (yaklaşık 20 fare) hakim olabilir. Biz yüksek kaliteli bir video ile, ustalık için zaman daha da azaltılabilir inanıyoruz. Yeterlilik sağlandıktan sonra ameliyat için 35 dakika, terminal hasat için 20 dakika içinde işlem tamamlanabilir. Laboratuvarımızdaki cerrahlar günde 10-12 tam ameliyat yapabilirler ve ameliyat mortalite oranı %5-10'dur. Mortalitenin en sık nedeni göğüse girişte akciğer hasarı, anestezik toksisite veya diseksiyon sırasında aort un yırtılmasıdır. DTAA araştırmaek, bu model aynı zamanda göğüs diğer müdahaleler ilerleyen araştırmacılar için torasik aort ve akciğer hilum güvenli ve kolay erişim için bir rehber olarak hizmet vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan protokolleri Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (No. 3634) tarafından onaylanmıştır.
1. Anestezi indüksiyonu ve entübasyon
- 8-10 haftalık erkek C57BL/6 fareyi kapalı bir odaya %5 izofluran ve oksijen karışımı ile solunumlar gözle görülür şekilde yavaşlayıncaya kadar 5 dakika boyunca yerleştirin.
NOT: Deneysel protokole bağlı olarak farelerin farklı suşları, cinsiyetleri ve yaşları kullanılabilir. Dişi farelerin entübe edilmesi daha zor olabilir çünkü daha küçük boyut ve dolayısıyla daha küçük hava yolu. - Vandivort ve ark.13tarafından açıklandığı gibi fare entübe .
NOT: Entübasyon adımı, bu modelin hem öğrenmek hem de gerçekleştirmek için en zor kısmıdır. Yukarıda başvurulan yazarlar kendi video adımları açıklayan mükemmel bir iş yok.
2. Fareyi cerrahi tahtaya securing etmek
- Endotrakeal (ET) tüpünü bağlayın, göğüs teki yükselmeyi onaylayın ve fareyi sağ lateral dekübitus pozisyonuna getirin. Isoflurane'yi yaklaşık %3'e çevirin ve her iki göze de yağlama uygulayın. Ventilatör dakikada yaklaşık 200 nefes ve 225 μL gelgit hacmi sağlayacak şekilde ayarlanmalıdır.
NOT: Isofluran %5'te bırakılırsa toksisite hızlıdır. Ancak, izoflurana yanıt değişkendir, bu nedenle anestezik akış hızı, spontan diyafragmatik kasılmalar yaklaşık her 10-20'de bir meydana gelecek ve mukoza ve maruz kalan dokunun incelenmesinde oksijenasyon yeterli görünmektedir. - ET tüpünü bantla tahtaya sabitleyin. Ön pençe burun ile hizada ve bant ile güvenli böylece sağ kol rostrally genişletin.
- Sağ kol ve kuyruk arasında gerginlik bir çizgi oluşturmak için kuyruk caudally çekin, omurganın uzantısı üreten.
NOT: Hem kuyruğun hem de sağ pençenin hizaya getirilmesi, ET tüpünün takılmasını veya yerinden çıkarmasını önler. - Sol bacağı doğal konumuna getirin. Sol kol ventrally haddelenmiş gazlı bez ve bant aşağı çizin.
3. Ameliyata hazırlık
- Farenin sol kanadını sol omuzdan sol karnına kadar elektrikli makaslarla tıraş edin.
- Betadine çözeltisini cerrahi bölge üzerinde fırçalamak için pamuk uçlu aplikatör kullanın. Cerrahi site üzerinde% 70 etanol çözeltisi fırçalamak için yeni bir pamuk uçlu aplikatör kullanın. Kurumasını bekleyin. Steril bir perde yerleştirin.
- DİkKAT: Elektrokoter kullanılmadan önce tüm etanolün tamamen kurutulduğundan ve etanolün tutuşturduğundan emin olun.
4. Toraksa giriş
- Cerrahi makas kullanarak hemithorax orta noktasında 1 cm lateral kesi yapın. Kaburga görünür olana kadar kas katmanları bölmek için el elektrokoter kullanın.
- Doğrudan kaburga 2 mm kısmını cauterize.
NOT: Kaburgaüzerinde elektrokoter kullanırken spontan solunum frekansını gözlemleyin. Farenin kateterlik sırasında diyafram daralması varsa, uç toraksa girebilir ve akciğeri delebilir, bu modelde genellikle ölümcüldür. - Kaburga boşluğunda, koterize kısımdan daha üstün ıslak, ince pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak, plevral alana girmek için ucu dokunun üzerine döndürün. Akciğerçökmesine yardımcı olmak için toraks içine ıslak 3 mm x 2 mm sünger yerleştirin.
NOT: Sadece son derece hassas olduğu için yumuşak, ıslak, süngerler akciğertemas sağlar. - Diyafram görünür olana kadar, koterize kaburga üst yönü boyunca kesmek için makas kullanın.
5. Aort maruziyeti
- Kaburga retraktörleri yerleştirin ve torakotomi kesisini açmak için kullanın. Süngeri akciğer yüzeyinden dikkatlice çıkarın.
- Islak 6 mm x 4 mm sünger yerleştirin, böylece akciğeri kaplayan, uçları rostrally ve caudally işaret ile yatıyor. (Geniş düz) akciğer retraktörü süngerin üzerine yerleştirin ve azalan torasik aort açığa çıkana kadar retraktör ventrally'yi yavaşça kaydırın.
- Yaklaşık 5 mm'lik bir kesit için bağ dokusunu ve aorttaki yağı incelemek için #7 forseps kullanın.
NOT: Küçük damarlar aort boyunca enine çalışıyor olabilir; diseksiyon sırasında yırtılma önlemek (en az 14x büyütme kullanarak bu komplikasyonu önlemek için yardımcı olabilir).
6. Elastaz maruziyeti
- 0,5 mm x 1 mm süngeri 12 μL domuz pankreas elastazı ile doygunlaştırın ve aort yüzeyine yerleştirin.
NOT: Süngerin kontralateral akciğere dokunmasına izin vermeyin. - Önceden belirlenen süreden sonra (genellikle 3-5 dk), #7 forceps ile elastaz süngeri çıkarın. Akciğer retraktörü çıkarın. Göğüs boşluğunu 1 mL steril salin ile sulandırın.
NOT: Akciğer süngerinin doymuş ve yumuşak olmasını sağlayarak akciğer yüzeyinin çıkarılmasını kolaylaştıracağı için, sulamadan önce akciğer retraktörü tuzlu sula çıkarın. - Kalan tuzlu sulama emmek için haddelenmiş 2 "x 2" gazlı bez kullanın. Isoflurane%2'ye düştü.
7. Göğüs kapanması
- Akciğer süngerini çıkar. Kaudal akciğer retraktörü çıkarın. Rostral akciğer retraktörü çıkarın.
- Kaburga karşı 3 kesildi 6-0 emilemez dikişler, her gevşek bir düğüm kravat ama aşağı kravat yok. Dikiş iğnesi ile akciğerdokunmamaya özen.
- Çıkış tüpünü ventilatöre tıkarak veya et tüpünden 0,5-1,0 mL havayı hızla üfleyerek 3 şekilde dur musluğunu kullanarak akciğeri yeniden şişirin.
NOT: Barotravmayı önlemek için, hava dolu şırınganın aşırı kullanımından kaçının ve en fazla 1,0 mL hava kullanın. - Emilemez dikişleri bağlayın. Çalışan 5-0 emilebilir multifilament sütür ile kas tabakalarını yeniden approximate. Isoflurane%1'e düştü.
- 7-10 kesilen 5-0 emilemez dikişler ile yakın cilt. Isoflurane%0'a dönün.
8. Kurtarma
- Buprenorfinin 6 μg (0.02 mL 0.3 mg/mL süspansiyon) kısmını subkutan olarak uygulayın. Bandı sağ ayak, kuyruk ve sol koldan ve ardından sağ kol bandından çıkarın.
- Fare ekstremiteleri hareket ettirdiğinde, ET tüpünden kaymak için kuyruğundan çekerek ektübate edin. Supine pozisyonda yüksek oksijen içeriği ısıtıcı odasında yerleştirin.
NOT: Fareyi oksijen odasından kafese taşımak, kendini normal duruş pozisyonuna çevirebildiği zaman güvenlidir. Ayrıca, fareler ağrı belirtileri için izlenmeli, sıkıntı, ya da ameliyattan sonra ilk 24-48 saat boyunca sık gelişmek için başarısızlık ve belirtildiği gibi ek analjezi veya yumuşak gıda sağlanan.
9. Aort anevrizması maruziyeti (terminal hasat prosedürü)
NOT: Genel olarak doku hasadı 14 günde yapılır, çünkü bu maksimal dilatasyon dönemini temsil eder. Ancak, deneye bağlı olarak, hasat işleminin zamanlaması deneye bağlı olarak 3 gün ile 4+ hafta arasında herhangi bir zamanda gerçekleştirilebilir.
- Yukarıda açıklandığı gibi ameliyat alanına entübasyon ve güvenli fare (bölüm 1-3). Periton girmemeye özen alarak sol kanadından orta karına kadar orta derecede deri incise makas kullanın.
- Dorsal sol kanadından sol omuz seviyesine doğru eğimli deri. Daha sonra 90° açıyla aksilladan göğüs kafesine doğru eğilin.
NOT: Bu kesi orijinal deri kesisini tamamen çevrelemelidir. - Kateter kullanarak, farenin ventral yönü doğru deri flep incelemek, sol hemithorax açığa. Karın girmek için makas kullanın ve sol diyafram alt ortaya çıkarmak için ventral dorsal için sol costal marjı boyunca eğim. Diyaframın lateral kenarı istenilen açılabilir.
- Önceki adımla oluşturulmazsa, diyaframı en yanal kenarına doğru bükün. Bu deliğe katutery ucu yerleştirin ve ksifoid sürecine costal marjı kapalı diyafram cauterize. Nemli ince uçlu pamuk uçlu aplikatör kullanarak, akciğeri göğüs duvarına yapışıklıklardan hafifçe kurtarın ve akciğeri medial olarak itin.
NOT: Yapışmalar göğüs duvarından kolayca çıkamazsa, bunları çıkarmak için katüllik kullanın; bunu yapmak ağır kanamaya neden olabilir akciğer yırtılma önlemeye yardımcı olur. - Kaburga bir den maliyet marjı göğüs duvarının iç cauterize, orta aksiller çizgi ye dorsal ama aort en az 2 mm. Küretilmiş çizgi boyunca göğüs duvarını kesin.
NOT: Bu teknik interkostal arterlerden kanamayı önler. - Kaburga bir üstün marjı boyunca kesilmiş ve daha sonra göğüs kafesi lateral kenarı boyunca caudally, sol göğüs kafesi kaldırarak. Akciğer üzerine retractors yerleştirin ve medially çekin. Diyafram üzerine retraktör yerleştirin ve mümkün olduğunca çok aort ortaya çıkarmak için caudally çizin.
- Aort anevrizması ve etkilenmemiş distal segmentteki yapışıklıkları gidermek için kuru pamuk uçlu aplikatör kullanın. Etkilenmemiş kontrol segmentinin çapını ve elastazın en geniş kısmını video mikrometrisi kullanarak anevrizma ile ölçün.
NOT: Video mikrometri ölçümleri, anevrizmal segmentin yüzde genişlemesini denklem 1'li bir kontrol segmentine göre hesaplamak için kullanılır. Anevrizmal segment 1'e 0,5 mm distal olan bir kontrol segmenti seçilir.
Denklem 1
- Harms forceps ile aort kavramak, sadece tedavi segmentine distal. Forceps distal kesmek için makas kullanın, sonra omurilik kapalı aort incelemek. Tedavi segmentine aort proksimal kesin ve anevrizmal aort kaldırın.
- Bir tüberkülin şırınga ve iğne kullanarak, aort lülesini istediğiniz gibi tuzlu ve proses dokusu ile yıkayın.
Denklem 1Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolümüzün uygulanması, farelerde tuzlu kontrollere kıyasla sağlam dTAA ile sonuçlanır. Geliştirilen TAA'lar fusiform şeklindedir ve sadece aortun tedavi edilen kısmında görülür (Şekil 1 ve Şekil 2)11. Şekil 2 doku hasat bir video mikrometri ölçüm bir örnek gösterir. Denklem 1'i kullanarak, aort genişlemesi bu örnekte %130'dur.
Johnston ve ark.11'in modeli tanımlayan orijinal çalışmasında, yabani tip farelerdeki kontrollere kıyasla 3, 7, 14 ve 21 gün boyunca yabani tip elastaz tedavi edilen farelerde (WT TAA) aort genişlemesinde anlamlı bir artış saptadı (WT kontrolleri). Maksimal aort genişlemesi 14. günde meydana geldi (WT TAA: 99.6 ± %24.7 wt kontrolüne karşı: 14.4 ± %8.2; p < 0.0001) (Şekil 3)11. Papa ve ark.12 tarafından yapılan ayrı bir deney, 14 günde benzer bir genişleme yi gösteriyor.
Histoloji yi incelerken, WT TAA'larda inceltilmiş ve parçalanmış elastin lifleri vardır. Makrofajlar (Mac2) ve interlökin-1β (IL-1β) ekspresyonu artarken, daha az düz kas hücresi (SMαA) boyama da vardır (Şekil4).
Şekil 1 : Torasik aort anevrizması (TAA) modeli ve ekipman kurulumuörnek fotoğrafları. Soldan sağa, (1) torasik aortun sol torakotomi yoluyla ilk maruziyeti, (2) plevranın diseksiyonu, (3) elastaz ile ıslatılmış sünger uygulaması ve (4) sünger çıkarılması. Aort hasadı için (5), torakotomi yeniden açıldı ve torasik aort serbest çesitlenmis ve ölçüldü. (6) Sağa doğru illüstrasyon yemek borusu, akciğer ve hemiazygos damar ile aort göreceli ilişki gösterir. Bu rakam Johnston ve ark.11'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : TAA örnek video mikrometri ölçümü. C = maruz kalan kontrol segmenti, A = elastaz tedavi anevrizmal segment, RL = sağ akciğer, E = özofagus, T = kuyruk, H = baş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 : TAA oluşumu sırasında zaman içinde aort çapı. Ortalama aort çapı (mm ± SD) WT farelerde elastaz (WT TAA, gri) maruz kalan veya tuzlu maruz (WT kontrolü, yeşil) zaman içinde. Yıldız işareti (p < 0.05) ile işaretlenmiş tüm zaman noktalarında WT TAA ve WT kontrolü arasında önemli farklar oluştu. Maksimal aort genişlemesi 14. günde gerçekleşir (WT TAA: 99.6 ± %24.7 wt kontrolüne karşı: 14.4 ± %8.2; p < 0.0001). Hata çubukları standart sapmayı temsil ediyor. Bu rakam Johnston ve ark.11'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4 : WT elastmaz TAA ve WT tuzlu kontrol dokusunun histolojik incelemesi. 14. günde WT kontrolü (tuzlu sünger) ve WT TAA'ların (elastaz sünger) aort kesitlerini örnekleyin. Elastin, düz kas hücreleri (SMαA), makrofajlar (Mac2) ve interlökin-1β (IL-1β) için boyama. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam Johnston ve ark.11'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5 : Bireysel elastaz şişesinin doz-yanıt muayenesi. Her puan grubu, elastazla ıslatılmış süngerin yatsın diye izin verildiğinde önceden belirlenmiş bir zamanı temsil eder. Bu veriler% 100-130 genişleme için ideal sindirim süresini tahmin etmek için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Torasik ve abdominal aort hücresel ve embriyolojik olarak farklı, hangi anevrizmal hastalık ile ilgili14,15,16. Bu nedenle, TAA çalışmak için belirli bir hayvan modeli gereklidir. Diğer murine dTAA modelleri8yayınlanmış olmasına rağmen , bizim gerçekten anevrizmal olarak kabul edilebilir inen torasik aort dilatasyonu oluşturmak için tek modeldir (üzerinde 50% dilatasyon). Ayrıca, bizim model yürütmek için nispeten hızlı vecacl 16 hafta aksine 14 gün maksimal genişleme sonuçları8. Bu verimlilik potansiyel insan deneyleri11,12geçirilebilir olabilir belirli farmakolojik müdahalelerin çalışmasını kolaylaştırmıştır. Ancak, bu protokol birkaç zorlu yönleri ve sınırlamaları vardır.
Bizim model saflaştırılmış domuz pankreatik elastaz kullanır, hangi birkaç önceki AAA modellerinde kullanılmıştır. Etki mekanizması nın aort medyasında elastin inanılması ve sağlam bir inflamatuar yanıt yaratılması olduğuna inanılmaktadır, bu da daha az uyumlu ve sonunda daha zayıf bir duvara yol açar. Elastazın sindirim etkisi şişeden şişeye değişir. Tutarlı bir sindirim etkisi sağlamak için, bir doz-yanıt eğrisi elastaz her yeni şişe için üstlenilmelidir. Doz, elastazla ıslatılmış gazlı bezin yatsınca yaslandığı zamana karşılık gelir. Böyle bir eğrinin bir örneği Şekil5'te gösterilmiştir. 14 günde %100-130 dilatasyon anevrizması oluşturan bir pozlama süresi bulmak amacıyla spesifik elastaz sünger maruzkalma süreleri incelenir. Bu örnek eğride, bu elastaz şişesi için 4 dakikalık bir sindirim süresi belirlenmiştir (nota, mevcut en küçük elastaz miktarı yaklaşık 830 fare için yeterli olan 10 mL'dir). Aşırı elastaz sindirim intraoperatif kanama veya erken rüptür ekibe neden olabilir ve yetersiz maruz kalma yeterli sindirim ve anevrizmal genişlemeneden başarısız olabilir.
Bu model torasik boşluğun açılmasını içerdiğinden pozitif basınçlı ventilasyon kullanımı zorunludur. Başlangıçta doğrudan görme altında bir ön boyun diseksiyonu ve orotracheal entübasyon kullanılan, ancak ek bir kesi ve kapatma gerekli olarak bu yöntem zaman alıcı oldu. Şimdi Vandivort ve ark.13tarafından ayrıntılı olarak doğrudan orotracheal entübasyon kullanmak . Bu model üzerinde yeni cerrahlar eğitirken, gerçek cerrahiye geçmeden önce entübasyon tekniğini kapsamlı bir şekilde uygulamanızı öneririz. Fare başarılı bir şekilde entübe edildikten sonra, ödem her entübasyon denemesinde arttıkça tüpü yerinden çıkarmamaya, başarı şansını artarda azaltarak ve ölümcül bir hava yolu yaralanması olasılığını artırarak büyük özen izlenmelidir. Reentübasyon için gerekli zaman neredeyse her zaman ölümcül olduğundan büyük özen de ameliyat sırasında ekstübasyon riskini en aza indirmek için alınmalıdır. Protokolümüzde de belirtildiği gibi, sağ kol ve kuyruğun az miktarda gerginlik altında sabitlmesi ameliyat sırasında rostral veya kaudal kaymayı önler ve bu nedenle ekstübasyon riskini en aza indirir.
Bu modelde anestezinin kontrolü hayati önem taşımaktadır. Vandivort ve ark.13 entübasyon üzerine yaptıkları çalışmada ele alındığı gibi, derin bir sedasyon düzeyi gereklidir. Entübasyon işlemi sırasında fare bilinçliyse, ET tüpü takılmasına karşı direnç trakeal yaralanmaya ve özofagus entübasyonuna neden olabilir. Izofluran toksisitesi riskini azaltmak için, ET tüpünün trakeal yerleşimi doğrulandıktan sonra, isofluran karışımının yüzde karışımı indüksiyon için kullanılanın yaklaşık yarısı kadar azaltılmalıdır. Isofluran ideal yüzdesi elde etmek için, fare her 10-20 saniyede bir spontan diyafragmatik kasılma olmalıdır. Ameliyat ilerledikçe, izofluran e-giderek alçaltılmalıdır ve son cilt kapatma dikiş yerleştirildikten sonra tamamen kapatılmalıdır. Fare uyanıkken fare hala anesteziden kurtulurken bant bağları kaldırılmalıdır. Geri kalan izofluranların geri kazanımı ve dağılmasına yardımcı olmak için, farenin ekstübasyondan hemen sonra yüksek oksijenli ısınma ortamında kurtarılabilen prosedürü yakın zamanda değiştirdik.
Fare akciğeri son derece hassas ve delinme, uygunsuz kullanım veya elastaz maruz kalma hemen hemen her zaman ölümle sonuçlanır yaralanma. Akciğer hasarının en sık rastlanan noktası plevraya ilk giriştir. Kaburgalarda kateter kullanırken (adım 4.2), spontan solunum sıklığına dikkat etmenizi ve nefes aldıktan hemen sonra sadece birkaç saniye liğine kateteri aktive etmeyi tavsiye ederiz. Bu göğüs duvarı ve akciğer içine cautery ucu sürücü olabilir göğüs kafesi beklenmedik bir genişleme önlemeye yardımcı olur. Dokuları ve plevral membranı nazikçe kırmak için bir sonraki adımda ıslak pamuk uçlu aplikatör kullanımı da keskin aletler akciğer yüzeyine toplantı olmadığı için akciğer hasarı oranımızı en aza indirmeye yardımcı oldu. Son olarak, elastaz ıslatılmış sünger doğrudan akciğer temas ederse, ciddi hasar oluşabilir. Bu aort diseksiyonu sırasında kontralateral plevral alana girmeden ve çok az yeniden konumlandırma ile aort üzerine doğrudan yerleştirilebilir böylece sünger hazırlayarak önlenebilir. Ameliyatın sonunda, sol akciğeri yeniden şişirme girişimi ventilatörün çıkış tüpünün tıkanması ile yapılmalıdır. Bu başarısız olursa, 3 yönlü stopcock ile hava 0.5 ila 1.0 mL doğrudan enjeksiyon akciğer yeniden genişletebilirsiniz. Bu yöntemlerin her ikisi de işe yaramazsa, kapatma normal olarak devam etmelidir. Biz büyük bir akciğer hasarı mevcut ise, fareler nispeten iyi kısmen şişirilmiş akciğer tolere ve akciğer hemen hemen her zaman doku hasat şişirilir bulduk.
Bu modelin çeşitli sınırlamaları vardır. Deneysel modeller insan aort hastalığını tam olarak modellemez. dTAA modelimizde elastaz bir uygulamadan sonra 14 gün içinde oluşur, insan TAA oluşumu multifaktöriyel ve yıllar içinde değil de yıllar içinde oluşur. Ancak, anevrizma geliştirmek için aylar süren bir fare modeli bir araştırma kapasitesi yararlı değildir. İnsan hastalığının aksine, modelimizde elastaza bağlı anevrizmalar ameliyat sonrası iki hafta içinde maksimal dilatasyona ulaştıklarında boyut olarak azalmaya başlar. Bu regresyon, farenin diyetinde postoperatif olarak desteklenen β-aminopropionitril (BAPN) kullanımı ile aşılabilir. Elastaz maruziyet modeli ile kombine edildiğinde, BAPN takviyesi sürekli büyüme ve sonunda rüptür sağlar, daha iyi insan hastalığının kronikliği taklit. Laboratuvarımız daha önce AAA17'de BAPN üzerinde çalışmıştır ve şu anda protokolümüzün daha da rafine etmek için dTAA modelinde kullanıyoruz. DTAA modeli ile yapılan birincil deneylerde 28 günde yaklaşık %30 kopma oranları gösterilmiştir.
Gelecekte bu modeli, insanlarda anevrizma tedavisine geçirilebilen diğer genetik ve farmakolojik tedavileri değerlendirmek için kullanmayı planlıyoruz. Bu protokol torasik aort aort erişmek için kolay ve güvenli bir yol açıkladığı için, torasik aort üzerinde müdahaleler test etmek isteyen diğer laboratuvarlar tarafından kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma AHA Scientist Development Grant 14SDG18730000 (Yüksek Lisans), NIH K08 HL098560 (G.A.) ve RO1 HL081629 (G.R.U.) hibeleri ile desteklenmiştir. Bu proje Torasik Cerrahi Araştırma ve Eğitim Vakfı (TSFRE) Araştırma Bursu (PI: G. Ailawadi) tarafından desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve MUTLAKA NHLBI veya TSFRE görüşlerini temsil etmez. Anthony Herring ve Cindy Dodson'a bilgi ve teknik uzmanlıkları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiocatheter (22G) | Used for ET Tube | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #7 x2 | Roboz | RS-4982 | |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz | RS-5158 | |
| Harms Forceps x2 | Roboz | RS-5097 | |
| Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length | Roboz | RS-7800 | |
| KL 1500 LED Light Source | Leica | 150-400 | |
| M205A Dissction Microscope | Leica | CH 94-35 | |
| Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 500216-G | |
| Metal Clip board | Use with the Mouse Retractor Set | ||
| Mouse Retractor Set | Kent | SURGI-5001 | Need 2 short and 1 tall fixators |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector | Harvard Apparatus | 73-0043 | MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled |
| Sigma Aldrich | Elastase from porcine pancreas | E0258-50MG | Can be purchased in various size bottles |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | Recommend using rechargable AA batteries |
| Spring Scissors, 10.5cm | World Precision Instruments | 14127 | |
| Steril Swabs (Sponges) | Sugi | 31603 | Can be cut to size |
| Surgi Suite Surgical Platform | Kent | Attach to clip board | |
| Tech IV Isoflurane Vap | Jorgensen Laboratories | J0561A | Anesthesia vaporizer |
References
- Coady, M. A., et al. What is the appropriate size criterion for resection of thoracic aortic aneurysms. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 113 (3), 489-491 (1997).
- Aggarwal, S., Qamar, A., Sharma, V., Sharma, A. Abdominal aortic aneurysm: A comprehensive review. Experimental and Clinical Cardiology. 16 (1), 11-15 (2011).
- Bickerstaff, L. K., et al. Thoracic aortic aneurysms: a population-based study. Surgery. 92 (6), 1103-1108 (1982).
- Cheng, D., et al. Endovascular aortic repair versus open surgical repair for descending thoracic aortic disease a systematic review and meta-analysis of comparative studies. Journal of the American College of Cardiology. 55 (10), 986-1001 (2010).
- Walsh, S. R., et al. Endovascular stenting versus open surgery for thoracic aortic disease: systematic review and meta-analysis of perioperative results. Journal of Vascular Surgery. 47 (5), 1094-1098 (2008).
- Absi, T. S., et al. Altered patterns of gene expression distinguishing ascending aortic aneurysms from abdominal aortic aneurysms: complementary DNA expression profiling in the molecular characterization of aortic disease. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 126 (2), 344-357 (2003).
- Ailawadi, G., Eliason, J. L., Upchurch, G. R. Current concepts in the pathogenesis of abdominal aortic aneurysm. Journal of Vascular Surgery. 38 (3), 584-588 (2003).
- Ikonomidis, J. S., et al. A murine model of thoracic aortic aneurysms. Journal of Surgical Research. 115 (1), 157-163 (2003).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
- Trachet, B., et al. Ascending Aortic Aneurysm in Angiotensin II-Infused Mice: Formation, Progression, and the Role of Focal Dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 673-681 (2016).
- Johnston, W. F., et al. Inhibition of interleukin-1beta decreases aneurysm formation and progression in a novel model of thoracic aortic aneurysms. Circulation. 130 (11), Suppl 1 51-59 (2014).
- Pope, N. H., et al. Interleukin-6 Receptor Inhibition Prevents Descending Thoracic Aortic Aneurysm Formation. Annals of Thoracic Surgery. 100 (5), 1620-1626 (2015).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Ailawadi, G., et al. A nonintrinsic regional basis for increased infrarenal aortic MMP-9 expression and activity. Journal of Vascular Surgery. 37 (5), 1059-1066 (2003).
- Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta: relevance to aneurysm disease. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (5), 1123-1130 (2008).
- Trigueros-Motos, L., et al. Embryological-origin-dependent differences in homeobox expression in adult aorta: role in regional phenotypic variability and regulation of NF-kappaB activity. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1248-1256 (2013).
- Lu, G. S. G., Davis, J. P., Schaheen, B., Downs, E., Roy, R. J., Ailawadi, G., Upchurch, G. R. A novel chronic advanced staged abdominal aortic aneurysm murine model. Journal of Vascular Surgery. 66 (1), 232-242 (2017).
